WO2014088205A1 - 양성 연골종양세포를 이용하여 제조한 연골기질 및 이의 제조방법 - Google Patents

양성 연골종양세포를 이용하여 제조한 연골기질 및 이의 제조방법 Download PDF

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chondrocytes
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tumor cells
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서성욱
박한수
신승한
이혜원
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사회복지법인 삼성생명공익재단
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Definitions

  • the present invention relates to a cartilage matrix prepared using benign cartilage tumor cells and a method of manufacturing the same, specifically a method for producing cartilage matrix by culturing benign cartilage tumor cells, separating tumor cells, and extracting cartilage substrate.
  • Cartilage lacks blood vessels, nerves, and lymphatic vessels, so there is a very limited way to replenish cells after injury.
  • Cells that can be supplied to cartilage defects include chondrocytes migrating from nearby cartilage, stem cells present in bone marrow and synovial membranes and adipose tissue. Chondrocytes migrated from the double surrounding cartilage are not sufficient for cartilage regeneration because of their very limited speed and distance.
  • stem cells of the bone marrow can participate in the regeneration of cartilage in the case of a full layer cartilage defect, while in the case of a partial layer defect, it is difficult to participate in the regeneration of cartilage.
  • cartilage debris damage the cartilage by providing a cause for inflammation, and as a result osteoarthritis can progress rapidly. Therefore, it is very important to regenerate damaged cartilage at an early stage.
  • various methods for regeneration of cartilage defects have been proposed, but have not yet reached the regeneration of normal hyaline cartilage.
  • the method of regeneration of cartilage by cell transplantation is a method of supplying cells to a defective site or implanting artificially cultured articular cartilage.
  • cartilage substrates There have been attempts to obtain cartilage substrates in vitro, but the production of cartilage substrates produced under conditions that culture human chondrocytes or differentiate stem cells into chondrocytes is possible, but the amount is very limited. To this end, there is a need to extract chondrocytes or stem cells from the human body. Therefore, a method for collecting substrate from animal cartilage is performed, but the cartilage matrix obtained from the animal can be used for research, but there is a risk of transplant rejection and infection by common infectious agents. Can't.
  • the present inventors have made intensive studies to obtain cartilage substrates, which are mediators for engraftment and efficient in vivo delivery of differentiated cells, and especially human-like cartilage substrates applicable to clinical trials. It was confirmed that a large amount of cartilage substrate can be separated and completed the present invention.
  • the cartilage tumor cells were separated and removed from the cartilage tumor cell culture to extract pure cartilage substrate and aseptic treatment to confirm that cartilage substrates that are harmless to the human body without fear of contamination of residual cancer cells and bacteria can be separated in large quantities.
  • One object of the present invention is to (a) culturing benign chondroma cells, (b) separating and removing tumor cells from the culture medium, and (c) extracting cartilage matrix from the filtrate from which the tumor cells have been removed It provides a method for producing cartilage substrate from benign cartilage tumor cells comprising a.
  • Another object of the present invention is to provide a cartilage matrix prepared from benign chondroma cells.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing chondrocytes comprising the step of differentiating cells into chondrocytes using chondrocytes prepared from benign chondrocytes.
  • Another object of the present invention is cartilage substrate prepared from benign chondroma cells; Chondrocytes prepared using the cartilage substrate; Or it provides a composition for cartilage regeneration comprising a combination of the cartilage substrate and chondrocytes or cells that can differentiate into chondrocytes as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide an injection for cartilage regeneration comprising the composition for cartilage regeneration as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is cartilage substrate prepared from benign chondroma cells; Chondrocytes prepared using the cartilage substrate; Or it provides a cartilage regeneration implant in which a combination of the cartilage substrate and chondrocytes or cells that can differentiate into chondrocytes is loaded into the scaffold.
  • Another object of the present invention is cartilage substrate prepared from benign chondroma cells; Chondrocytes prepared using the cartilage substrate; A combination of the cartilage matrix and cells that can differentiate into chondrocytes or chondrocytes; Or to provide a method for regenerating cartilage using the cartilage regeneration implant.
  • Still another object of the present invention is to administer the cartilage regeneration injection to an individual in need thereof, or the cartilage disease comprising the step of transplanting the cartilage regeneration implant to an individual in need thereof (chondropathy aka diseases of the It is to provide a method of treating cartilage.
  • Cartilage cells prepared from the positive cartilage tumor cells of the present invention or chondrocytes prepared by adding the cartilage substrate to the chondrogenic differentiation medium are variously formulated in the form of injections or implants to be effectively used for regeneration of damaged cartilage.
  • the cartilage matrix of the present invention is a humanoid cartilage matrix prepared using benign chondroma cells obtained from human patients. Therefore, the cartilage substrate and the common infectious agents that may be involved when using the cartilage matrix of the animal used in the existing research are used. It is possible to provide a composition for cartilage regeneration that is clinically applicable by excluding risks such as infection.
  • FIG. 1 is a view showing a method for producing cartilage substrate and various applications thereof according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a diagram showing the overexpression of type II collagen and aggrecan (aggrecan) of cartilage tumor cells cultured in vitro in accordance with an embodiment of the present invention.
  • type II collagen and aggrecan aggrecan
  • mesenchymal stem cells cultured under normal culture conditions and chondrocyte differentiation conditions were used.
  • Figure 3 is a diagram showing the degree of cartilage substrate expression of various cells according to an embodiment of the present invention. Fibroblasts, chondroma and osteosarcoma cells were analyzed, and it was confirmed that the type 2 collagen and aggrecan were specifically expressed in the chondroma cells, and high levels of SOX9 were observed.
  • Figure 4 is a diagram showing the expression of parathyroid hormone-related protein (parathyroid-hormone-related protein (PTHrP)) involved in the chondrogenic differentiation of stem cells in various cells according to an embodiment of the present invention.
  • parathyroid hormone-related protein parathyroid-hormone-related protein (PTHrP)
  • Figure 5 is a diagram showing the cartilage matrix expression of chondrocytes cultured in three-dimensional culture in hyaluronic acid gel according to an embodiment of the present invention. After culturing, the cell-substrate mass formed was fixed with formalin and then made into a paraffin block to make a section and stained with Alcian blue.
  • Figure 6 is a diagram showing the cartilage matrix expression of chondrocytes cultured in three-dimensional culture in hyaluronic acid gel according to an embodiment of the present invention. After culture, the cell-substrate mass formed into frozen sections was subjected to immunochemical staining using an anti-collagen antibody (anti-collagen Ab).
  • anti-collagen Ab an anti-collagen antibody
  • the present invention provides a method for culturing benign chondroma cells, (b) separating and removing tumor cells from the culture medium, and (c) filtrate from which tumor cells have been removed. It provides a method for producing cartilage substrate comprising the step of extracting cartilage substrate from.
  • Cartilage is a flexible connective tissue found in various parts of the human and animal body and includes the junction between bone, rib cage, ear, nose, bronchus and intervertebral disc. Unlike bones, they are not hard and rigid, but they are stiffer and less flexible than muscles. Cartilage is a chondrocyte that produces a large amount of extracellular matrix composed of collagen fibers, proteoglycan-rich ground substances, and elastin fibers. It is composed of specialized cells called. Cartilage is classified into three types according to the relative content of the three main elements: elastic cartilage, hyaline cartilage and fibrocartilage.
  • chondrocytes trapped within the matrix are called chondrocytes, which are located in a space called the lumen. One space can hold up to eight chondrocytes.
  • Cartilage unlike other connective tissue, does not contain blood vessels, and chondrocytes are provided by diffusion by pumping action generated by compression of articular cartilage or bending of elastic cartilage. Thus, cartilage is very slow in growth and recovery compared to other connective tissues.
  • benign tumor is faster growth than normal cells, but the growth rate is relatively slow, there is a limit to growth, the boundary with the surroundings, does not metastasize to other tissues, invasion or metastasis It means a tumor that does not cause. Thus, the presence of benign tumors does not primarily threaten the life of the host.
  • Prositive cartilage tumor cells are cells constituting tumors that occur in cartilage, and unlike malignant, it refers to tumor cells that grow rapidly and destroy cartilage tissue without threat to life. Depending on the location of the cartilage occurs in the cartilage (chondroma) is located in the center of the bone is called chondroma (enchondroma). Benign tumors derived from mesodermal cells forming cartilage may remain in cartilage or bone material or develop on the surface of cartilage, which is called ecchondroma or osteochondroma. In addition, benign cartilage tumors formed in the synovial membrane (articular membrane) are called synovial chondromatosis.
  • the benign chondroma cells harvested from the patient are cultured in vitro, and the chondrocytes are differentiated from mesenchymal stem cells, chondrocytes differentiated from the stem cells, and other cell lines in culture conditions in vitro. It was confirmed that can be expressed in excess (Fig. 2 to 4).
  • Cartilage tumor cells of the present invention may be human cartilage tumor cells.
  • a large amount of cartilage substrate can be produced from benign chondroma cells obtained from animals, but when transplanted into humans, it is difficult to be used for practical clinical application due to the risk of rejection of transplantation and infection by common infectious agents. It is preferable to use cartilage tumor cells collected from.
  • culture medium refers to a material comprising a medium and cells cultured for a certain period of time in a medium that can supply nutrients to support in vitro growth and survival of benign chondrocytes, and during the culture period Substrates secreted from the cells and the like and nutrients consumed in the cell culture are also included.
  • the medium includes all conventional media used in the art suitable for culturing cartilage tumor cells.
  • it may be a medium containing non-essential amino acids, buffers, pyruvates, antibiotics (antibiotics) and FBS (fetal bovine serum). More preferably, the buffer may be HEPES, pyruvate sodium pyruvate, and the antibiotic may be penicillin-streptomycin, but is not limited thereto.
  • Cartilage substrates prepared from benign chondroma cells by the method of the present invention are collagen type 2, aggrecan, glycosaminoglycan, or parathyroid-hormone-related protein (PTHrP). ) May be included.
  • collagen type 2, aggrecan and glycosaminoglycan are the main components that constitute the extracellular matrix (ECM) of cartilage.
  • ECM extracellular matrix
  • the extracellular matrix of the cartilage is a substance secreted from the chondrocytes and at the same time is an important factor for promoting cartilage growth.
  • the parathyroid hormone-related protein inhibits excessive formation of chondrocytes, thereby inhibiting ossification and inducing balanced cartilage production.
  • chondrocytes cultured in a laboratory environment secrete or express large amounts of type 2 collagen, aggrecan, glycosaminoglycan, and / or parathyroid hormone-related proteins (FIG. 2). To 5)
  • cartilage tumor cells can promote the production of cartilage substrate by three-dimensional culture using a scaffold (scaffold).
  • the "scaffold” that can be used in the three-dimensional culture means a solid support having a certain skeleton to provide an environment in which the benign chondrocyte cells of the present invention can be attached and cultured inside and outside the scaffold.
  • the scaffold is a natural support or polyglycolic acid (PGA), such as hyaluronic acid gel, alginate, agarose, fibrin, collagen, or the like.
  • PGA polyglycolic acid
  • PLA polylactic acid
  • poly lactic-co-glycolide acid
  • Cartilage substrate manufacturing method of the present invention comprises the step of separating the tumor cells from the cartilage substrate produced in order to obtain a harmless cartilage substrate in humans by excluding the possibility of contamination by the remaining tumor cells. Separating tumor cells from the cartilage substrate may be performed by mixing the culture with distilled water and centrifuging to remove the sunken cell layer.
  • the method for producing cartilage substrate of the present invention includes the step of extracting cartilage substrate from the filtrate from which tumor cells have been removed to provide pure cartilage substrate. Extracting the cartilage substrate may be performed by treating 90% ethanol in the filtrate from which tumor cells are removed from the benign chondrocyte culture medium and separating the precipitated cartilage substrate by centrifugation.
  • Lyophilizing the separated cartilage substrate may be further performed for the convenience of long-term storage and storage of the cartilage substrate prepared by the method of the present invention.
  • the manufacturing method of the present invention may further comprise the step of washing the lyophilized cartilage substrate with 70% ethanol.
  • Cartilage substrate prepared by the method of the present invention can be stored at -80 ° C after sterile treatment of the washed cartilage substrate in order to exclude bacterial contamination.
  • the present invention provides a cartilage substrate produced by the above method.
  • the method may be prepared by culturing the benign chondroma cells as described above, separating and removing the tumor cells from the culture solution, and extracting the cartilage matrix from the filtrate from which the tumor cells are removed.
  • Lyophilized cartilage substrate obtained for long-term storage, convenience of storage and bacterial contamination can be prepared by further performing the step of rinsing it with 70% ethanol and aseptically powdered.
  • Cartilage substrate can preferably be stored at -80 °C.
  • Cartilage substrate prepared by the method of the present invention can be secured in a large amount by a simple method because it uses fast cartilage tumor cells, which is not only for research but also as an injection, coating agent and implant for cartilage regeneration described below. It may be usefully used (FIG. 1).
  • FOG. 1 fast cartilage tumor cells
  • FIG. 1 by producing a human-like cartilage substrate from the positive cartilage tumor cells collected from the patient to obtain a cartilage substrate without the risk of infection rejection and infection by common infectious agents, and the possibility of tumor formation through the remaining cancer cell test It is confirmed that it is harmless to the human body and can be used to treat cartilage regeneration.
  • the present invention provides a method for producing chondrocytes comprising the step of differentiating cells into chondrocytes using the chondrocytes prepared by the above method.
  • the step of differentiating into chondrocytes can be carried out by adding to the medium containing TGF- ⁇ 1, a known chondrocyte differentiation condition, by adding a chondrogenic substrate prepared from benign chondrocytes by the method of the present invention.
  • the cartilage substrate prepared by the method of the present invention contains abundantly the type 2 collagen, aggrecan and glycosaminoglycan, which are the main components of the extracellular matrix of cartilage.
  • type 2 collagen aggrecan and glycosaminoglycan
  • Dr. Byung-Hyun Min, Ajou University, etc. when a support was prepared using extracellular matrix, and inoculated with undifferentiated stem cells on the support to differentiate into chondrocytes, the protein and glycosamino were similar to normal cartilage. The content of glycans was increased and the expression of type 2 collagen was also reported.
  • PGA which is a typical synthetic polymer
  • PGA promotes bone formation as the incubation period lasts, while cartilage formation ability can be maintained for a long time when a support including extracellular matrix secreted from chondrocytes is used.
  • the cartilage substrate according to the present invention includes the main components of the extracellular matrix, not only can promote differentiation into cartilage cells through this, but also maintain the cartilage forming ability without causing bone formation over time, Chondrocyte formation can be promoted by adding and culturing the cartilage substrate of the present invention to the chondrocyte differentiation condition of.
  • it contains parathyroid hormone-related proteins, thereby inhibiting excessive formation of chondrocytes, thereby inhibiting ossification and inducing balanced cartilage production.
  • the cells that differentiate into chondrocytes are bone marrow-derived stem cells, adipose tissue-derived stem cells, umbilical cord blood stem cells, synovial stem cells, muscle stem cells, dermal fibroblasts, umbilical cord-derived mesenchymal adult stem cells such as stromal cells, embryonic stem cells, and autologous chondrocytes.
  • the method for obtaining the adult stem cells, embryonic stem cells and autologous chondrocytes can be carried out by methods known in the art without limitation.
  • the present invention is a cartilage substrate produced by the above method; Chondrocytes prepared using the cartilage substrate; Or it provides a composition for cartilage regeneration comprising a combination of the cartilage substrate and chondrocytes or cells that can differentiate into chondrocytes as an active ingredient.
  • the cartilage substrate prepared by the method according to the present invention may promote the differentiation of cells capable of differentiating into chondrocytes into chondrocytes. Therefore, cartilage regeneration can be induced by creating an atmosphere that promotes cartilage cell differentiation and cartilage growth at the site even when the cartilage substrate is injected into the cartilage box.
  • the cartilage substrate has the advantage that does not cause an immune response when administered in the body.
  • the composition for cartilage regeneration of the present invention may include cartilage substrate prepared by the method of the present invention as such, but is not limited thereto.
  • cartilage substrate prepared by the method of the present invention such as chondrocytes prepared by using the cartilage substrate or a combination of the cartilage substrate and the cells that can differentiate into cartilage cells, all manufactured in various forms applying the cartilage substrate Include.
  • regeneration of the present invention generally refers to an action in which an organism rebuilds or restores its function when a part or function of a body is lost. This regenerative capacity is stronger when the system is simpler and the degree of evolution is lower systematically.
  • Cells that can be differentiated into chondrocytes that can be used in the composition for cartilage regeneration of the present invention are bone marrow-derived stem cells, adipose tissue-derived stem cells, umbilical cord blood stem cells, synovial stem cells, muscle stem cells, dermal fibroblasts, umbilical cord Stem cells (umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells), embryonic stem cells or autologous chondrocytes, and differentiation into chondrocytes as described above in the medium containing TGF- ⁇ 1, which is a general cartilage differentiation condition of the present invention
  • Cartilage substrate can be added to incubation.
  • composition for cartilage regeneration of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • “Pharmaceutically acceptable” means that the cells or humans exposed to the composition are not toxic.
  • the carrier can be used without limitation so long as it is known in the art such as buffers, preservatives, analgesics, solubilizers, isotonic agents, stabilizers, bases, excipients, lubricants, preservatives and the like.
  • the composition for cartilage regeneration of the present invention can be prepared according to techniques commonly used in the form of various formulations.
  • the composition for cartilage regeneration of the present invention can be administered through any route as long as it can induce migration to the disease site.
  • compositions of the present invention may be used for topical (buccal, sublingual, skin and intraocular administration), parenteral (subcutaneous, intradermal, intramuscular, instillation, intravenous, intraarterial, intraarticular and cerebrospinal fluid, etc.) or transdermal administration.
  • Administration can be via several routes, including parenteral, and more preferably direct to the site of injury.
  • the cartilage substrate of the present invention, the chondrocytes differentiated using the cartilage substrate, or a combination thereof may be administered to a subject by suspending it in a suitable diluent at a concentration of 100 to 200 ⁇ g / ml. And / or to protect and maintain cells and to facilitate their use upon infusion into a desired tissue.
  • the diluent may be a saline solution, a phosphate buffer solution, a buffer solution such as HBSS, plasma, cerebrospinal fluid or a blood component.
  • the composition may be administered by any device such that the active substance can migrate to the target tissue.
  • the present invention provides an injection for cartilage regeneration comprising the composition for cartilage regeneration as an active ingredient.
  • One of the preferred modes of administration and preparation of cartilage regeneration composition comprising the composition for cartilage regeneration of the present invention as an active ingredient is an injection.
  • injectables include aqueous solvents such as physiological saline solution, ring gel solution, Hank's solution or sterilized aqueous solution, vegetable oils such as olive oil, higher fatty acid esters such as ethyl oleic acid and non-aqueous solvents such as ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol, polyethylene glycol or glycerin
  • non-invasive agents known in the art suitable for the barrier to pass through, for mucosal permeation, and ascorbic acid, sodium hydrogen sulfite, BHA, tocopherol, EDTA as stabilizers for prevention of alteration.
  • an emulsifier a buffer for pH adjustment, phenyl mercury nitrate, chimerosal, benzalkonium chloride, phenol, cresol, benzyl alcohol, and the like, and a pharmaceutically acceptable carrier such as a preservative for preventing the growth of microorganisms.
  • the present invention provides a cartilage substrate prepared from benign chondroma cells; Chondrocytes prepared using the cartilage substrate; Or it provides a cartilage regeneration implant in which the composition for cartilage regeneration comprising a combination of the cartilage substrate and chondrocytes or cells that can differentiate into chondrocytes loaded on the scaffold.
  • transplantation generally refers to the process of transferring a donor's cells, tissues, or organs to a recipient's damaged tissue or organ.
  • Autograft which transplants its cells or tissue elsewhere, depending on the type of donor, allograft (eg, human to human) transplantation of cells, tissues, organs, etc., from the same species as the recipient It can be classified as xenograft for transplanting organs or the like from a species (such as animal organs to humans).
  • the subject of transplantation includes, without limitation, any substance that can aid the regeneration of the donor's cells, tissues or organs as well as the recipient's damaged tissue.
  • Transplantation can be performed by methods known in the art and are not limited to the embodiments of the present invention. For example, it may be performed surgically, and substances such as cells may be injected directly into the affected area.
  • the scaffold is a structure that serves to hold the material to be implanted as a structure to be implanted with the material to be implanted. Therefore, the material must be biocompatible and the engraftment rate of cells or tissues must be high.
  • the implantable scaffold may be a biodegradable material, more preferably hyaluronic acid gel, alginate, agarose, fibrin, collagen, or the like.
  • Biodegradable polymeric synthetic supports such as natural support or polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), poly (lactic-glycolide acid) (poly- (lactic-co-glycolide acid); PGA) Can be.
  • loading refers to the process of containing a therapeutically effective material in the implantation scaffold. Any method that satisfies such a function can be used without limitation, and in the present invention, the cartilage substrate prepared from the benign cartilage tumor cells by the method of the present invention having an effect on cartilage tissue regeneration, the chondrocytes prepared using the cartilage substrate or the above. Combinations of chondrocytes and cells that can differentiate into chondrocytes or chondrocytes were taken up into biodegradable scaffolds.
  • graft of the present invention is a support for isolating a damaged site from the outside or containing a transplanted cell or secreted therapeutic material and allowing the cell or therapeutic material to remain, and refers to a substance that can be implanted in a human body or a mammal. it means.
  • implants include, without limitation, various materials used in the art, such as synthetic polymers and natural materials having biodegradability as a support for tissue engineering.
  • a natural support such as hyaluronic acid gel, alginate, agarose, fibrin, collagen, or polyglycolic acid (PGA), polylactic acid ( It may be a biodegradable polymer synthetic support such as polylactic acid (PLA), poly (lactic-co-glycolide acid);
  • the implant of the present invention is a cartilage substrate of the present invention that can promote differentiation into chondrocytes in a biodegradable scaffold, cells differentiated into chondrocytes in vitro using the cartilage substrate, or the cartilage substrate and the cartilage. It may be prepared by simultaneously loading cells differentiated into cells or cells capable of differentiating into chondrocytes. Implants loaded with allogeneic cells other than autologous cells may be prepared by loading immunorejection inhibitors or anti-inflammatory agents to suppress immunorejection or inflammatory reactions that may occur when transplanted into the body.
  • Cells that can be differentiated into chondrocytes and differentiation methods that can be used in the implant of the present invention are as described above.
  • the present invention is a cartilage substrate produced by the above method; Chondrocytes prepared using the cartilage substrate; A combination of the cartilage matrix and cells that can differentiate into chondrocytes or chondrocytes; Or it provides a method for regenerating cartilage using the cartilage regeneration implant.
  • the method for producing cartilage substrate the method for producing chondrocytes using the prepared cartilage substrate and the implant are the same as described above.
  • the present invention comprises administering the cartilage regeneration injection to an individual in need thereof or transplanting the cartilage regeneration implant to an individual in need thereof (chondropathy aka diseases It provides a method of treatment of the cartilage.
  • Cartilage unlike other connective tissue is characterized by not containing blood vessels. Therefore, when administering a drug for treating cartilage disease, it is preferable to administer directly to the affected part for efficient delivery. Therefore, it is preferable that the injection for cartilage regeneration and the cartilage regeneration implant according to the present invention are directly administered and transplanted to the site where cartilage disease occurs.
  • treatment of the present invention refers to any action that causes the suspicion of cartilage disease and the symptoms of the affected individual to be improved or advantageously changed by administration of the above-described injection for cartilage regeneration or transplantation of a cartilage regeneration implant.
  • the term "individual” means all animals, such as rats, mice, and livestock, including humans, which may or may have cartilage disease. Preferably, it may be a mammal including a human.
  • the cartilage disease may be a disease in which cartilage is not formed, cartilage formation is impaired, or cartilage is worn or damaged or deficient.
  • the cartilage disease include chondromacia (chondromalacia), polychondritis, relapsing polychondritis, chondrodysplasia, achondroplasia, chochondroplasia (costonondritis) and Osteoarthritis and the like.
  • a positive chondroma isolated from the patient was chopped to a size of about 1 mm 3 , and then DMEM containing 1.5 mg / ml of type II collagenase (type II collagenase; Invitrogen / Gibco, Burlington, ON) After incubation at 37 ° C. for 16 hours using Dulbecco's modified Eagle's medium), the isolated cells were filtered using a 70 ⁇ m filter.
  • type II collagenase type II collagenase
  • chondrocyte growth medium of the following composition; 0.1 mM nonessential amino acids, 10 mM HEPES, 1 mM sodium pyruvate, 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin-glycine (penicillin-streptomycin- High glucose DMEM medium containing a glycine solution.
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin-streptomycin-glycine penicillin-streptomycin- High glucose DMEM medium containing a glycine solution.
  • Cells were cultured in the following three forms for comparison. First, in a hydrogel, 1.5 ⁇ 10 6 cells were centrifuged at 6 rpm in a 6-well plate, and the pellets were collected by pelleting 1.5 ⁇ 10 8 cells in a 50 ml conical tube.
  • the obtained supernatant was treated with 90% ethanol for 5 minutes to precipitate, centrifuged at 200 rpm for 3 minutes, and the cartilage substrate precipitated in the lower layer was taken and lyophilized.
  • the lyophilisate was washed twice with 70% ethanol and then dried for 8 hours in a dry oven at 37 ° C. and then stored at -80 ° C. in powder form. For aseptic treatment, it was treated with ⁇ -ray of 2.0 Mrad intensity.
  • DMEM medium containing 10% FBS after applying mesenchymal stem cells isolated from synovial stromal cells taken from the patient's knee at a concentration of 3 ⁇ 10 5 cells / 6-well plate Incubated for 16 hours at. The next day TGF- ⁇ was exchanged with 1% FBS DMEM medium added at a concentration of 10 ng / ml. The medium to which TGF- ⁇ was added was incubated in a general cell incubator for two weeks while changing at two-day intervals.
  • RT-PCR was performed by extracting mRNA from cultured cells to confirm the expression level of cartilage matrix components.
  • Primers with the following sequences were used for the RT-PCR: Aggrecan; F-ggaagccaatgagtgcc SEQ ID NO: 1 and R-ggttggcatgcacgtagacg SEQ ID NO: 2, Sox9; F-gagcgaggaggacaagttcc SEQ ID NO: 3 and R-ctcgctctcgttcagaagtc SEQ ID NO: 4, Runx2; F-gagtggacccttccagaccag SEQ ID NO: 5 and R-ggtcgccaaacagattcatcca SEQ ID NO: 6, ColIIa; F-ctggtgcctccggtaaccct SEQ ID NO: 7 and R-cttgcctttcaccagcgg SEQ ID NO: 8.
  • Cartilage tumor cells collected from the patients were cultured three-dimensionally using hyaluronic acid gel.
  • the culture was performed for two weeks in a conventional cell culture environment. After incubation, the cell-substrate mass formed was fixed with formalin and paraffin blocks were prepared. The block was made into sections to check the cartilage matrix formed by staining with Alcian blue.
  • type 2 collagen was confirmed by histological immunostaining using a type 2 collagen specific antibody (anti-collagen II Ab; ab3092, Abcam, USA). Staining using VECTASTAIN ® Elite ABC kit was performed according to the manufacturer's instructions, the antibody 1: 100 dilution was used.
  • Example 3 Confirmation of harmlessness of human cartilage substrate prepared by residual cancer cells and sterility test
  • the cartilage matrix powder was added to the cell culture solution and cultured for 3 weeks to confirm whether the remaining cells were present. Residual nucleotide bands were identified using PCR techniques.
  • the cartilage substrate powder was added to the culture medium, and cultured for 2 weeks to check for bacterial contamination.
  • Mycoplasma test was performed using the EZ-PCR Mycoplasma Test Kit (Biological Industries Israel Veit Haemek LTD.) According to the protocol provided by the manufacturer.
  • the cartilage differentiation markers Sox9 and aggrecan were most effectively expressed when TGF- ⁇ 1 was cultured at a concentration of 10 ng / ml under normal culture conditions. Therefore, the cartilage matrix of the present invention was added to the same conditions to culture the adipose derived and bone marrow derived adult stem cells.
  • cartilage production can be qualitatively analyzed by alcian blue, alizarin red staining and immunostaining with COL II antibody.
  • MTT analysis showed that the rate of proliferation of cartilage differentiated stem cells increased by 15% or more, indicating that the cartilage substrate prepared from the cartilage tumor cells of the present invention is not only differentiated but also growth-friendly.
  • Example 5 Confirmation of graft ability through cartilage seating and regeneration
  • cartilage differentiated stem cells differentiated using the cartilage substrate of the present invention confirmed the ability to sit on cartilage tissue, self-renewal ability (self renewality) and tumorigenesis to confirm the actual transplantability.
  • Cartilage seating and self-renewal were performed through sizing, immunostaining and tissue microscopy of the resulting cartilage.
  • Solid scaffolds can be used to facilitate transplantation in clinical applications. Scaffolds were prepared by using solvent-casting particulate-leaching with PLGA (polylactic-co-glycolic acid) as a biodegradable synthetic polymer. Specifically, 5 g of PLGA was dissolved in 50 ml of methylchloroform, and then solidified by adding 45 g of salt to have 90% porosity. Thereafter, the mixture was dried in air at room temperature for 2 days, and the scaffold was soaked in water for 3 days to remove salt, cut into a size of 5 ⁇ 5 ⁇ 2 mm, and lyophilized to completely remove methylchloroform. The water was changed once a day to remove salt and soaked in 70% alcohol for one day after sterilization. The sterile scaffolds were soaked in PBS for 1 day in a solution containing the cells and / or cartilage substrate (eg, cell culture) to remove the remaining alcohol and load the cells and / or cartilage substrate.
  • PLGA polylactic-co-

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Abstract

본 발명은 양성 연골종양세포를 이용하여 제조한 연골기질 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로 양성 연골종양세포를 배양한 후 종양세포를 분리하고, 연골기질을 추출하여 연골기질을 제조하는 방법, 상기 방법으로 제조된 연골기질, 상기 연골기질을 유효성분으로 포함하는 연골재생용 조성물, 주사제 및 이식체에 관한 것이다. 본 발명의 양성 연골종양세포로부터 제조된 연골기질 또는 상기 연골기질을 연골분화 배지에 첨가하여 배양함으로써 제조된 연골세포는 주사제 또는 이식체 등의 형태로 다양하게 제형화되어 손상된 연골의 재생에 효과적으로 사용될 수 있을 것이다. 본 발명의 연골기질은 인간 환자로부터 채취한 양성 연골종양세포를 이용하여 제조한 인간형 연골기질이므로 기존의 연구에 사용되는 동물의 연골기질을 이용하였을 때 수반될 수 있는 이식거부반응 및 인수공통 감염원에 의한 감염 등의 위험성을 배제하여 임상 적용 가능한 연골재생용 조성물을 제공할 수 있다.

Description

양성 연골종양세포를 이용하여 제조한 연골기질 및 이의 제조방법
본 발명은 양성 연골종양세포를 이용하여 제조한 연골기질 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로 양성 연골종양세포를 배양한 후 종양세포를 분리하고, 연골기질을 추출하여 연골기질을 제조하는 방법, 상기 방법으로 제조된 연골기질, 상기 연골기질을 유효성분으로 포함하는 연골재생용 조성물, 주사제 및 이식체에 관한 것이다.
연골은 혈관, 신경, 림프관이 없기 때문에 손상을 받은 후 세포를 보충할 수 있는 길이 매우 제한적이다. 연골 결손부위로 공급될 수 있는 세포에는 인근 연골로부터 이동(migration)하는 연골세포, 골수와 활막 및 지방조직에 존재하는 줄기세포 등이 있다. 이중 주위 연골로부터 이동한 연골세포는 이동 속도와 거리가 매우 제한적이기 때문에 연골재생에 충분하지 않다. 한편, 골수의 줄기세포는 전층 연골결손의 경우 연골의 재생에 참여할 수 있는 반면에, 부분층 결손인 경우에는 연골의 재생에 관여하기 어렵다. 한편, 활막과 지방조직에 있는 줄기세포의 존재가 보고되고 있으나, 아직 이들이 연골의 자발적 재생에 참여하는지에 대해서는 충분한 근거가 제시되지 않고 있다. 이러한 특징 때문에 물리적 손상을 받은 연골은 다시 정상적인 기능과 구조를 가진 연골조직으로 재생되는데 있어 많은 한계점을 지니고 있다.
또한 일단 손상되 연골의 경계부위는 기계적 압력에 취약하여 쉽게 부서지고 마모되어 결손부위는 더 커지게 된다. 아울러 연골의 부스러기(debris)는 염증을 일으키는 원인을 제공함으로써 더욱 연골을 손상시키고, 그 결과 골관절염이 빠르게 진행될 수 있다. 따라서, 손상된 연골을 조기에 재생시켜주는 것이 매우 중요한데, 현재 연골 결손의 재생을 위한 방법이 다양하게 제시되고 있으나, 아직 정상적 초자 연골(hyaline cartilage)의 재생에는 미치지 못하고 있다.
1994년 M. Brittberg에 의해 자가 연골세포 이식술이 소개된 이래, 세포를 이용한 연골의 재생치료법이 급속히 발전하고 있다. 세포이식에 의한 연골의 재생치료 방법은 결손된 부위에 세포를 공급하거나 인공적으로 배양된 관절연골을 이식하는 방법 등이 있다.
이와 같은 종래 줄기세포를 이용한 치료제 개발을 위한 연구는 세포의 분화와 증식에 초점이 맞추어져 실제로 관절에 적용시 적절한 매개물질 또는 기질을 포함하고 있지 않아 임상적으로 이식하기에는 적절하지 못하였다. 즉, 손상연골과의 부착이 용이하지 않아 관절을 크게 개방하여 수술을 시행해야 하며, 관절의 침범부위가 넓은 경우에는 사용할 수 없다는 단점이 있다. 또한 관절에 부착한다 하더라도 이식된 세포가 실제로 성장하면서 환자의 관절에 생착되는 것을 보장할 수 없었고, 특히 가장 흔한 연골손상 질환인 퇴행성 관절염에는 효과를 나타내지 못한다는 단점이 있다.
이에 시험관 내에서 연골기질을 획득하고자 하는 시도가 있었으나, 인간의 연골세포를 배양하여 또는 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 조건 하에서 생산되는 연골기질의 생산이 가능하기는 하지만, 그 양이 매우 제한적이며 이를 위하여 인체로부터 연골세포 또는 줄기세포를 추출해야 하는 번거로움이 있다. 따라서, 동물의 연골 등으로부터 기질을 채취하는 방법이 수행되고 있으나, 이와 같이 동물로부터 채취되는 연골기질은 연구용으로는 사용가능하지만 이식거부반응 및 인수공통 감염원에 의한 감염 등의 위험성이 있으므로 실제 임상는 적용될 수 없다.
본 발명자들은 분화된 세포의 생착 및 효율적인 체내 전달을 위한 매개물질인 연골기질, 특히 임상에도 적용가능한 인간형 연골기질을 획득하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 환자로부터 채취한 양성 연골종양세포를 배양한 배양액으로부터 다량의 연골기질을 분리할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 상기 연골종양세포 배양액으로부터 연골종양세포를 분리 제거하여 순수한 연골기질을 추출하고 무균처리하여 잔존 암세포 및 균 오염 걱정이 없는 인체에 무해한 연골기질을 순수하게 다량으로 분리할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 하나의 목적은 (a) 양성 연골종양세포를 배양하는 단계, (b) 상기 배양액으로부터 종양세포를 분리하여 제거하는 단계, 및 (c) 종양세포를 제거한 여액으로부터 연골기질을 추출하는 단계를 포함하는 양성 연골종양세포로부터 연골기질의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 양성 연골종양세포로부터 제조된 연골기질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 양성 연골종양세포로부터 제조된 연골기질을 이용하여 세포를 연골세포로 분화시키는 단계를 포함하는 연골세포의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 양성 연골종양세포로부터 제조된 연골기질; 상기 연골기질을 이용하여 제조된 연골세포; 또는 상기 연골기질 및 연골세포 또는 연골세포로 분화가능한 세포의 조합을 유효성분으로 포함하는 연골재생용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 연골재생용 조성물을 유효성분으로 포함하는 연골재생용 주사제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 양성 연골종양세포로부터 제조된 연골기질; 상기 연골기질을 이용하여 제조된 연골세포; 또는 상기 연골기질 및 연골세포 또는 연골세포로 분화가능한 세포의 조합을 스캐폴드에 로딩시킨 연골재생용 이식체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 양성 연골종양세포로부터 제조된 연골기질; 상기 연골기질을 이용하여 제조된 연골세포; 상기 연골기질 및 연골세포 또는 연골세포로 분화가능한 세포의 조합; 또는 상기 연골재생용 이식체를 이용하여 연골을 재생시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 연골재생용 주사제를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계 또는 상기 연골재생용 이식체를 이를 필요로 하는 개체에 이식하는 단계를 포함하는 연골질환(chondropathy a.k.a. diseases of the cartilage)의 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 양성 연골종양세포로부터 제조된 연골기질 또는 상기 연골기질을 연골분화 배지에 첨가하여 배양함으로써 제조된 연골세포는 주사제 또는 이식체 등의 형태로 다양하게 제형화되어 손상된 연골의 재생에 효과적으로 사용될 수 있을 것이다. 본 발명의 연골기질은 인간 환자로부터 채취한 양성 연골종양세포를 이용하여 제조한 인간형 연골기질이므로 기존의 연구에 사용되는 동물의 연골기질을 이용하였을 때 수반될 수 있는 이식거부반응 및 인수공통 감염원에 의한 감염 등의 위험성을 배제하여 임상 적용 가능한 연골재생용 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시양태에 따른 연골기질의 생산방법 및 이의 다양한 응용분야를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시양태에 따른 시험관 내 배양한 연골종양세포의 제2형 콜라겐(type II collagen) 및 어그리칸(aggrecan)의 과발현을 나타내는 도이다. 대조군으로는 일반 배양조건 및 연골세포 분화조건에서 배양한 중간엽 줄기세포를 사용하였다.
도 3은 본 발명의 일 실시양태에 따른 다양한 세포의 연골기질 발현정도를 나타낸 도이다. 섬유아세포, 내연골종 및 골육종 세포에 대해 분석하였으며, 내연골종 세포에서 특이적으로 제2형 콜라겐 및 어그리칸이 발현됨을 확인하였으며, SOX9 또한 높은 수준으로 발현하는 것이 관찰되었다.
도 4는 본 발명의 일 실시양태에 따른 다양한 세포에 있어서 줄기세포의 연골분화에 관여하는 부갑상선 호르몬 관련 단백질(parathyroid-hormone-related protein; PTHrP) 발현정도를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시양태에 따른 히알루론산 겔에서 3차원 배양한 연골종양세포의 연골기질 발현을 나타낸 도이다. 배양 후 형성된 세포-기질 덩어리를 포르말린으로 고정한 후 파리핀 블록으로 제조하여 절편을 만들고 알시안 블루로 염색하였다.
도 6은 본 발명의 일 실시양태에 따른 히알루론산 겔에서 3차원 배양한 연골종양세포의 연골기질 발현을 나타낸 도이다. 배양 후 형성된 세포-기질 덩어리를 동결 절편으로 만든 후 항-콜라겐 항체(anti-collagen Ab)을 이용하여 면역화학염색을 실시하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 양성 연골종양세포를 배양하는 단계, (b) 상기 배양액으로부터 종양세포를 분리하여 제거하는 단계, 및 (c) 종양세포를 제거한 여액으로부터 연골기질을 추출하는 단계를 포함하는 연골기질의 제조방법을 제공한다.
"연골"은 인간 및 동물의 체내 여러 부분에서 발견되는 유연한 결합조직으로, 뼈, 흉곽, 귀, 코, 기관지 및 추간판 사이의 접합부를 포함한다. 뼈와 달리 딱딱하고 경직되지 않으나, 근육보다는 뻣뻣하고 덜 유연하다. 연골은 콜라겐 섬유(collagen fiber), 단백당(proteoglycan)이 풍부한 기반물질(ground substance) 및 탄력소 섬유(elastin fiber)로 구성된 다량의 세포외기질(extracellular matrix)을 생산하는 연골모세포(chondroblast)라 불리는 특화된 세포로 구성된다. 연골은 상기 세 가지 주요 요소들의 상대적인 함유량에 따라 탄성연골(elastic cartilage), 유리연골(hyaline cartilage) 및 섬유연골(fibrocartilage)의 세 가지 타입으로 분류된다. 기질 내에 포획된 연골모세포를 연골세포(chondrocyte)라 하며, 이는 소강이라 불리는 공간에 위치한다. 하나의 공간은 8개의 연골세포까지 수용할 수 있다. 연골은 다른 결합조직과는 달리 혈관을 포함하지 않으며, 연골세포는 관절연골의 압박 또는 탄성연골의 굽힘에 의해 생성되는 펌핑작용에 의한 확산에 의해 제공된다. 따라서, 다른 결합조직에 비해 연골은 성장 및 회복이 매우 느리다.
"양성 종양(benign tumor)"은 정상세포에 비해서는 성장이 빠르지만, 발육속도가 비교적 완만하여 성장에 한계가 있고, 주위와의 경계가 명확하며, 다른 조직으로 전이하지 않으며, 침윤이나 전이를 일으키지 않는 종양을 의미한다. 따라서, 양성 종양이 존재한다 하더라도 1차적으로 숙주의 생명을 위협하지는 않는다.
"양성 연골종양세포"는 연골에서 발생하는 종양을 구성하는 세포로, 악성과는 달리 생명에는 위협이 없으나 빠르게 성장하여 연골조직을 파괴하는 종양세포를 의미한다. 발생 위치에 따라 연골에서 발생하는 것은 연골종(chondroma)이라고 하며 골의 중심부에 위치한 것은 내연골종(enchondroma)이라 한다. 연골을 형성하는 중배엽세포로부터 유래된 양성 종양으로 연골 또는 골 물질 내에 남아있거나, 연골표면상으로 전개될 수 있으며, 이는 외연골종(ecchondroma) 또는 골연골종(osteochondroma)이라 한다. 또한, 활액막(관절막)에서 형성되는 양성 연골종양을 활액막 연골종증(synovial chondromatosis)이라 한다.
본 발명의 일 실시예에서는 환자로부터 채취한 양성 연골종양세포를 시험관 내 배양하여 상기 연골종양세포가 시험관 내 배양 조건에서 중간엽 줄기세포, 상기 줄기세포로부터 분화시킨 연골세포 및 다른 세포주에서보다 연골기질을 과량으로 발현할 수 있음을 확인하였다(도 2 내지 4).
본 발명의 연골종양세포는 인간 연골종양세포일 수 있다. 동물로부터 채취된 양성 연골종양세포로부터도 연골기질을 다량으로 제조할 수 있으나, 인간에 이식될 경우 이식거부반응 및 인수공통 감염원에 의한 감염 등의 위험으로 실질적인 임상적용에 사용되기 어려우므로, 인간 환자로부터 채취한 연골종양세포를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 용어 "배양액"은 양성 연골종양세포의 시험관 내 성장 및 생존을 지지할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 세포를 일정기간 배양한 배지와 세포를 포함하는 물질을 의미하며, 배양기간동안 세포로부터 분비된 기질 등과 세포 배양에 소모되고 남은 영양성분 등도 모두 포함한다. 상기 배지는 연골종양세포의 배양에 적절한 당 업계에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 바람직하게는 비필수아미노산, 완충제, 피루브산염, 항생제(antibiotics) 및 FBS(소태아혈청)를 포함하는 배지일 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 완충제는 HEPES, 피루브산염은 피루브산 나트륨, 항생제는 페니실린-스트렙토마이신일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법으로 양성 연골종양세포로부터 제조되는 연골기질은 제2형 콜라겐, 어그리칸(aggrecan), 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan), 또는 부갑상선 호르몬 관련 단백질(parathyroid-hormone-related protein; PTHrP)을 포함할 수 있다. 상기 연골기질 성분 중 제2형 콜라겐, 어그리칸 및 글리코사미노글리칸은 연골의 세포외기질(extracellular matrix; ECM)을 구성하는 주된 성분들이다. 상기 연골의 세포외기질은 연골세포로부터 분비되는 물질인 동시에 연골성장을 촉진시키는 중요한 요소이다. 한편, 상기 부갑상선 호르몬 관련 단백질은 연골세포의 과다한 형성을 억제함으로써 골화를 억제하고 균형적인 연골생성을 유도한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 실험실 환경에서 배양한 연골종양세포가 제2형 콜라겐, 어그리칸, 글리코사미노글리칸 및/또는 부갑상선 호르몬 관련 단백질을 다량으로 분비 또는 발현함을 확인하였다(도 2 내지 5)
또한 상기 연골종양세포는 스캐폴드(scaffold)를 이용하여 3차원 배양하여 연골기질의 생산을 촉진시킬 수 있다.
상기 3차원 배양에 사용될 수 있는 "스캐폴드"는 일정한 골격을 갖는 고체지지체를 의미하는 것으로 본 발명의 양성 연골종양세포가 스캐폴드의 내외에 부착하여 배양될 수 있는 환경을 제공한다. 바람직하게 상기 스캐폴드는 히알루론산 겔(hyaluronic acid gel), 알지네이트(alginate), 아가로즈(agarose), 피브린(fibrin), 콜라겐(collagan) 등의 천연지지체 또는 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락트산(polylactic acid; PLA), 폴리(락트산-글리콜산)(poly-(lactic-co-glycolide acid); PGA) 등의 생분해성 고분자 합성지지체일 수 있으나, 본 발명의 세포가 부착되어 3차원 배양될 수 있는 환경을 제공할 수 있는 것이면 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명의 연골기질 제조방법은 잔존 종양세포로 인한 오염 가능성을 배제하여 인체 무해한 연골기질을 수득하기 위하여 생성된 연골기질로부터 종양세포를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 연골기질로부터 종양세포를 분리하는 단계는 배양물을 증류수와 혼합하여 원심분리하여 가라앉은 세포층을 제거함으로써 수행될 수 있다.
또한 본 발명의 연골기질 제조방법은 순수한 연골기질을 제공하기 위하여 종양세포를 제거한 여액으로부터 연골기질을 추출하는 단계를 포함한다. 상기 연골기질을 추출하는 단계는 양성 연골종양세포 배양액으로부터 종양세포를 제거한 여액에 90% 에탄올을 처리하고 원심분리하여 침전된 연골기질을 분리함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 방법으로 제조된 연골기질의 장기보관 및 보관의 편의성을 위해 상기 분리된 연골기질을 동결건조시키는 단계를 추가로 수행할 수 있다.
또한 본 발명의 제조방법은 상기 동결건조시킨 연골기질을 70% 에탄올로 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법으로 제조된 연골기질은 세균 오염을 배제하기 위하여 상기 세척된 연골기질을 무균처리 후 분말화하여 -80℃에서 보관할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 연골기질을 제공한다.
구체적으로, 전술한 바와 같이 양성 연골종양세포를 배양하는 단계, 상기 배양액으로부터 종양세포를 분리하여 제거하는 단계 및 종양세포를 제거한 여액으로부터 연골기질을 추출하는 단계를 통해 제조될 수 있다. 장기보관, 보관의 편의성 및 세균 오염 배제를 위하여 수득한 연골기질을 동결건조시키는 단계, 이를 70% 에탄올로 세척하는 단계 및 무균처리하여 분말화하는 단계를 추가로 수행하여 제조될 수 있으며, 제조된 연골기질은 바람직하게 -80℃에서 보관할 수 있다.
본 발명의 방법으로 제조된 연골기질은 성장이 빠른 연골종양세포를 이용하기 때문에 간편한 방법으로 다량으로 확보할 수 있으며, 이는 연구용으로 뿐만 아니라 이하에서 후술할 연골재생용 주사제, 코팅제 및 이식체 등으로 유용하게 사용될 수 있다(도 1). 또한 본 발명의 일 실시예에서는 환자로부터 채취한 양성 연골종양세포로부터 인간형 연골기질을 생산함으로써 이식거부반응 및 인수공통 감염원에 의한 감염 위험이 없는 연골기질을 획득하고 잔존 암세포 검사를 통해 종양형성 가능성을 확인함으로 인체에 무해함을 확인하여 연골재생 치료 등에 이용 가능하다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 연골기질을 이용하여 세포를 연골세포로 분화시키는 단계를 포함하는 연골세포의 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 연골세포로 분화시키는 단계는 공지된 연골세포 분화조건인 TGF-β1을 포함하는 배지에 본 발명의 방법으로 양성 연골종양세포로부터 제조된 연골기질을 첨가하여 배양함으로 수행될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 방법으로 제조된 연골기질은 연골의 세포외기질을 구성하는 주요 성분인 제2형 콜라겐, 어그리칸 및 글리코사미노글리칸 등을 풍부하게 함유한다. 아주대학교 민병현 박사 등에 의해 보고된 바에 따르면, 세포외기질을 이용하여 지지체를 제작하고, 상기 지지체에 미분화 줄기세포를 접종하여 연골세포로 분화시킨 경우, 정상연골과 유사한 수준으로 단백당 및 글리코사미노글리칸의 함량이 증가하였으며, 제2형 콜라겐의 발현도 증가하였음을 보고하였다. 나아가, 대표적인 합성 고분자인 PGA와 비교한 결과, PGA는 배양기간이 오래될수록 골형성이 촉진되는 반면, 연골세포에서 분비된 세포외기질을 포함하는 지지체를 사용한 경우 연골형성능이 오랫동안 유지될 수 있음을 확인하였다(J. Korean Med. Assoc., 2009, 52(11): 1077-1089). 즉, 본 발명에 따른 연골기질은 세포외기질의 주요성분을 포함하므로, 이를 통해 연골세포로의 분화를 촉진할 수 있을 뿐만 아니라, 시간이 지나도 골형성을 유발하지 않고 연골형성능을 유지할 수 있으므로, 공지의 연골세포 분화조건에 본 발명의 연골기질을 첨가하여 배양함으로써 연골세포 형성을 촉진할 수 있다. 또한 부갑상선 호르몬 관련 단백질을 포함하므로 연골세포의 과다한 형성을 억제함으로써 골화를 억제하고 균형적인 연골생성을 유도할 수 있다.
바람직하게 연골세포로 분화시키는 세포는 골수유래 줄기세포, 지방조직유래 줄기세포, 제대혈 줄기세포, 활막줄기세포, 근육줄기세포, 피부 섬유아세포(dermal fibroblast), 제대유래 줄기세포(umbilical cord-derived mesenchymal stromal cell) 등의 성체줄기세포, 배아줄기세포 및 자가연골세포일 수 있다. 상기 성체줄기세포, 배아줄기세포 및 자가연골세포를 얻는 방법은 제한없이 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 연골기질; 상기 연골기질을 이용하여 제조된 연골세포; 또는 상기 연골기질 및 연골세포 또는 연골세포로 분화가능한 세포의 조합을 유효성분으로 포함하는 연골재생용 조성물을 제공한다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 방법으로 제조된 연골기질은 연골세포로 분화가능한 세포의 연골세포로의 분화를 촉진할 수 있다. 따라서, 연골기질 자체로 연골손상자리에 주입되어도 해당 자리에서 연골세포 분화 및 연골성장을 촉진하는 분위기를 조성함으로써 연골재생을 유도할 수 있다. 또한 상기 연골기질은 체내에 투여되었을 때 면역반응을 일으키지 않는 장점이 있다.
본 발명의 연골재생용 조성물에는 본 발명의 방법으로 제조된 연골기질이 그 자체로도 포함될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이 외에 상기 연골기질을 이용하여 제조된 연골세포 또는 연골기질과 연골세포로 분화가능한 세포와의 조합 등 본 발명의 방법에 의해 제조된 연골기질이라면 상기 연골기질을 응용한 다양한 형태로 제조되는 것을 모두 포함한다.
본 발명의 용어 "재생"은 일반적으로 생물체에는 몸의 일부 또는 그 기능을 상실하였을 때, 그 부분의 조직이나 기관을 다시 만들어 원래 상태로 복구시키거나 그 기능을 회복하려는 작용을 일컫는다. 이러한 재생능력은 체계가 간단하고 계통적으로 진화의 정도가 낮은 것일수록 강하다.
본 발명의 연골재생용 조성물에 사용될 수 있는 연골세포로 분화가능한 세포는 골수유래 줄기세포, 지방조직유래 줄기세포, 제대혈 줄기세포, 활막줄기세포, 근육줄기세포, 피부 섬유아세포(dermal fibroblast), 제대유래 줄기세포(umbilical cord-derived mesenchymal stromal cell), 배아줄기세포 또는 자가연골세포일 수 있으며, 연골세포로의 분화는 상기한 바와 같이 일반적인 연골분화조건인 TGF-β1을 포함하는 배지에 본 발명의 연골기질을 첨가하여 배양함으로 수행될 수 있다.
본 발명의 연골재생용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용되는"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 연골재생용 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명의 연골재생용 조성물은 질병부위로 이동을 유도할 수 있다면 어떠한 경로를 통해서든지 투여 가능하다. 경우에 따라서는 본 발명의 연골기질, 상기 연골기질을 이용하여 분화시킨 연골세포 또는 이들의 조합을 병변으로 향하게 하는 수단을 구비한 비히클에 로딩하는 방안을 고려할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 국소(협측, 설하, 피부 및 안내 투여 등), 비경구(피하, 피내, 근육 내, 점적, 정맥 내, 동맥 내, 관절 내 및 뇌척수액 내 등) 또는 경피성 투여를 포함한 여러 경로를 통해 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구로, 보다 바람직하게는 손상부위에 직접 투여한다. 일 양태로서 본 발명의 연골기질, 상기 연골기질을 이용하여 분화시킨 연골세포 또는 이들의 조합은 적합한 희석제에 100 내지 200 μg/ml의 농도로 현탁시켜 개체에 투여할 수 있는데, 상기 희석제는 기질 및/또는 세포를 보호 및 유지하고, 목적하는 조직에 주입시 사용에 용이하도록 하는 용도로 사용된다. 상기 희석제로는 생리식염수, 인산완충용액, HBSS 등의 완충용액, 혈장, 뇌척수액 또는 혈액성분 등일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 조직으로 이동할 수 있도록 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 연골재생용 조성물을 유효성분으로 포함하는 연골재생용 주사제을 제공한다.
본 발명의 연골재생용 조성물을 유효성분으로 포함하는 연골재생용 조성물의 바람직한 투여방식 및 제제 중 하나는 주사제이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액, Hank 용액 또는 멸균된 수용액 등의 수성용제, 올리브 오일 등의 식물유, 에틸올레인산 등의 고급 지방산 에스테르 및 에탄올, 벤질알콜, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 또는 글리세린 등의 비수성용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 점막 투과를 위해, 통과할 배리어에 적합한 당업계에 공지된 비침투성제가 사용될 수 있으며, 변질방지를 위한 안정화제로 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등과, 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알콜 등의 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 등의 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 양성 연골종양세포로부터 제조된 연골기질; 상기 연골기질을 이용하여 제조된 연골세포; 또는 상기 연골기질 및 연골세포 또는 연골세포로 분화가능한 세포의 조합을 포함하는 연골재생용 조성물을 스캐폴드에 로딩시킨 연골재생용 이식체를 제공한다.
본 발명의 용어 "이식(transplantation)"은 일반적으로 공여자의 세포, 조직 또는 장기 등을 수혜자의 손상 조직 또는 장기에 옮기는 과정을 의미한다. 공여자의 형태에 따라 자기 세포나 조직을 다른 곳에 이식하는 자가이식(autograft), 수혜자와 동일한 종인 공여자로부터의 세포, 조직, 장기 등을 이식하는(예컨대 인간에서 인간으로) 동종이식(allograft), 다른 종으로부터의 장기 등을 이식하는(예컨대 동물의 장기를 인간에게) 이종이식(xenograft)로 분류될 수 있다. 이식의 대상은 보다 넓게는 공여자의 세포, 조직 또는 장기 뿐 아니라 수혜자의 손상된 조직의 재생을 도울 수 있는 물질이면 제한없이 포함한다. 이식은 당업계에 공지된 방법으로 수행될 수 있으며, 본 발명의 실시예에 제한되지 않는다. 예를 들어 외과적 수술로 수행될 수 있고, 세포 등과 같은 물질은 환부에 직접 주사할 수 있다.
상기 스캐폴드는 이식하고자 하는 물질과 함께 이식되는 구조체로 상기 이식하고자 하는 물질을 머물러 있도록 지지하는 역할을 하는 구조체이다. 따라서, 생체적합성을 갖는 물질이어야 하고, 세포나 조직의 생착률이 높아야 한다. 바람직하게 상기 이식용 스캐폴드는 생분해성 물질일 수 있고, 보다 바람직하게는 히알루론산 겔(hyaluronic acid gel), 알지네이트(alginate), 아가로즈(agarose), 피브린(fibrin), 콜라겐(collagan) 등의 천연지지체 또는 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락트산(polylactic acid; PLA), 폴리(락트산-글리콜산)(poly-(lactic-co-glycolide acid); PGA) 등의 생분해성 고분자 합성지지체일 수 있다.
본 발명의 용어 "로딩(loading)"은 상기 이식용 스캐폴드에 치료효과가 있는 물질을 함유시키는 과정을 의미한다. 이러한 기능을 충족시키는 방법이면 제한없이 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 연골조직 재생에 효과가 있는 본 발명의 방법으로 양성 연골종양세포로부터 제조된 연골기질, 상기 연골기질을 이용하여 제조된 연골세포 또는 상기 연골기질 및 연골세포 또는 연골세포로 분화가능한 세포의 조합을 생분해성 스캐폴드에 흡수시켰다.
본 발명의 용어 "이식체"는 손상된 부위를 외부로부터 격리하거나 이식된 세포나 분비된 치료물질을 포함하고 상기 세포나 치료물질이 머물러 있도록 하는 지지체로서, 인체 또는 포유동물에 이식될 수 있는 물질을 의미한다. 이와 같은 이식체는 조직공학용 지지체로서 생분해성을 가지는 합성고분자와 천연재료 등 당업계에 다양하게 사용되는 물질을 제한없이 포함한다. 바람직하게는 히알루론산 겔(hyaluronic acid gel), 알지네이트(alginate), 아가로즈(agarose), 피브린(fibrin), 콜라겐(collagan) 등의 천연지지체 또는 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락트산(polylactic acid; PLA), 폴리(락트산-글리콜산)(poly-(lactic-co-glycolide acid); PGA) 등의 생분해성 고분자 합성지지체일 수 있다. 본 발명의 이식체는 생분해성 스캐폴드에 연골세포로의 분화를 촉진시킬 수 있는 본 발명의 연골기질, 상기 연골기질을 이용하여 시험관 내에서 연골세포로 분화시킨 세포, 또는 상기 연골기질과 상기 연골세포로 분화시킨 세포 또는 연골세포로 분화가능한 세포를 동시에 로딩시켜 제조된 것일 수 있다. 자가세포가 아닌 동종세포를 로딩시킨 이식체는 체내에 이식하였을 경우 발생할 수 있는 면역거부반응 도는 염증반응을 억제하기 위하여 면역거부반응 억제제 또는 항염증제를 함께 로딩하여 제조할 수 있다.
상기 본 발명의 이식체에 사용할 수 있는 연골세포로 분화가능한 세포 및 분화방법은 전술한 바와 같다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 연골기질; 상기 연골기질을 이용하여 제조된 연골세포; 상기 연골기질 및 연골세포 또는 연골세포로 분화가능한 세포의 조합; 또는 상기 연골재생용 이식체를 이용하여 연골을 재생시키는 방법을 제공한다.
구체적으로 연골기질을 제조하는 방법, 제조된 연골기질을 이용하여 연골세포를 제조하는 방법 및 이식체는 전술한 바와 동일하다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 연골재생용 주사제를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계 또는 상기 연골재생용 이식체를 이를 필요로 하는 개체에 이식하는 단계를 포함하는 연골질환(chondropathy a.k.a. diseases of the cartilage)의 치료방법을 제공한다.
연골은 다른 결합조직과는 달리 혈관을 포함하지 않는 것이 특징이다. 따라서, 연골질환을 치료하기 위한 약물 투여시에는 효율적인 전달을 위해 환부에 직접 투여하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명에 따른 연골재생용 주사제 및 연골재생용 이식체는 연골질환이 발병한 부위에 직접 투여 및 이식하는 것이 바람직하다.
본 발명의 용어 "치료"란 상기 연골재생용 주사제의 투여 또는 연골재생용 이식체의 이식에 의해 연골질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되게 하는 모든 행위를 의미한다.
상기 용어 "개체"란 연골질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
바람직하게, 상기 연골질환은 연골이 형성되지 않거나, 연골형성에 장애가 있거나, 연골이 마모 또는 손상되거나 결핍되어 발병하는 질병일 수 있다. 상기 연골질환의 비제한적인 예로는 연골연화증(chondromalacia), 다발성 연골염(polychondritis), 재발성 다발성 연골염(relapsing polychondritis), 연골형성장애증(chondrodysplasia), 연골무형성증(achondroplasia), 늑연골염(costochondritis) 및 골관절염(osteoarthritis) 등이 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 양성 연골종양세포의 배양, 배양액으로부터 종양세포의 분리 및 연골기질의 추출
환자로부터 분리된 양성 연골종양을 1 mm3 정도 크기로 잘게 자른 후, 멸균 여과시킨 1.5 mg/ml의 제2형 콜라겐분해효소(type II collagenase; Invitrogen/Gibco, Burlington, ON)를 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지를 이용하여 37℃에서 16시간 동안 배양한 후, 70 μm 필터를 사용하여 분리된 세포를 여과하였다. 이후, 세포를 하기 조성의 연골세포성장배지(chondrocyte growth medium)에서 배양하였다; 0.1 mM 비필수아미노산(nonessential amino acids), 10 mM HEPES, 1 mM 피루브산 나트륨(sodium pyruvate), 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신-글라이신(penicillin-streptomycin-glycine) 용액을 포함하는 고농도 글루코스 DMEM(high-glucose DMEM) 배지. 비교를 위하여 세포를 하기의 3가지 형태로 배양하였다. 첫째, 하이드로겔(hydrogel)에서 1.5×106 세포를 6-웰 플레이트에서, 둘째는 1500 rpm으로 3분간 원심분리하여 모은 세포를 팰렛 형태로 1.5×108 세포를 50 ml 코니칼 튜브에서, 셋째는 부유배양 형태로 1.5×106 세포를 초처부착(ultra-low-attach) 6-웰 플레이트에서 배양하였다. 상기 세 가지 형태로 연골세포성장배지에서 2주간 배양하여 연골기질이 충분히 합성되도록 하였다. 이후, 종양세포를 분리, 제거하여 연골기질만을 추출하기 위하여 상기 세 가지 형태로 배양된 세포 및 기질을 4℃ 증류수에 15분간 담그어 두어 세포막을 파괴하고, 이후 2000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층의 기질성분 만을 수득하였다. 알시안 블루(Alcian blud) 염색으로 합성된 기질층을 확인하였고, 원심분리 후 상등액을 취하여 가장 하층에 가라앉은 세포층을 제거하였다. 획득한 상등액에 90% 에탄올을 5분간 처리하여 침전시키고 200 rpm으로 3분간 원심분리하여 하층에 침전된 연골기질을 취하여 동결건조시켰다. 상기 동결건조물을 70% 에탄올로 2회 세척한 후 37℃ 건조오븐에서 8시간 건조처리한 후 -80℃에 분말형태로 보관하였다. 무균처리를 위하여 2.0 Mrad 세기의 γ-선으로 처리하였다.
실시예 2: 양성 연골종양세포의 연골기질 과발현 확인
<2.1> 연골로 분화시킨 성체줄기세포와의 연골기질 발현정도 비교
실험실에서 배양한 연골종양세포의 제2형 콜라겐(type II collagen) 및 어그리칸(aggrecan)을 비롯한 다양한 기질의 발현을 측정하여 성체줄기세포 및 이를 TGF-β를 이용하여 연골세포로 분화시킨 세포와 비교하였다. 환자의 무릎에서 채취한 활액막간질세포(synovial stromal cell)에서 분리한 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)을 3×105 세포/6-웰 플레이트 농도로 도포한 후 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 16시간 동안 배양하였다. 이튿날 TGF-β를 10 ng/ml 농도로 첨가한 1% FBS DMEM 배지로 교환하였다. TGF-β를 첨가한 배지를 2일 간격으로 교환하면서 2주간 일반 세포배양기에서 배양하였다. 2주 후 연골기질 성분의 발현 정도를 확인하기 위하여 배양된 세포에서 mRNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다. 상기 RT-PCR을 위하여 하기의 서열을 갖는 프라이머들을 사용하였다: Aggrecan; F-ggaagccaatgagtgcc 서열번호 1 및 R-ggttggcatgcacgtagacg 서열번호 2, Sox9; F-gagcgaggaggacaagttcc 서열번호 3 및 R-ctcgctctcgttcagaagtc 서열번호 4, Runx2; F-gagtggacccttccagaccag 서열번호 5 및 R-ggtcgccaaacagattcatcca 서열번호 6, ColIIa; F-ctggtgcctccggtaaccct 서열번호 7 및 R-cttgccttcttcaccagcgg 서열번호 8.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 연골종양세포는 연골기질의 성분인 제2형 콜라겐(type II collagen) 및 어그리칸(aggrecan)을 과량 발현하는 것을 확인하였다. 반면, 성체줄기세포 및 이를 TGF-β를 이용하여 연골세포로 분화시킨 세포는 상기 연골기질 성분을 생산하지 못하는 것을 확인하였다.
<2.2> 다양한 세포주와의 연골기질 발현정도 비교
환자로부터 채취한 내연골종(enchondroma)의 기질 발현정도를 섬유아세포(fibroblast) 및 골육종(osteosarcoma)과 RT-PCR을 통하여 비교하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 일부 내연골종(연골종양세포)에서 연골기질의 주요 성분인 제2형 콜라겐이 다량으로 발현됨을 확인하였고 이후 실험을 위하여 이들 세포를 선별하여 배양하였다.
동일한 방법으로 다른 기질들의 발현정도를 측정하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 환자로부터 채취한 연골종양세포에서 연골모세포의 재생과 성장에 필수적인 요소인 부갑상선 호르몬 관련 단백질(parathyroid-hormone-related protein; PTHrP)이 과다 발현되는 것을 확인하였다.
<2.3> 연골종양세포의 3차원 배양에 따른 연골기질 생산
환자로부터 채취한 연골종양세포를 히알루론산 겔을 이용하여 3차원 배양하였다. 상기 배양은 통상적인 세포배양환경에서 2주간 수행되었다. 배양 후, 형성된 세포-기질 덩어리를 포르말린으로 고정하고 파라핀 블록을 제조하였다. 상기 블록을 절편으로 만들어 알시안 블루로 염색하여 형성된 연골기질을 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 그물모양의 연골기질이 형성된 것을 확인하였으며, 상기 기질은 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)을 풍부하게 함유하고 있었다.
또한 제2형 콜라겐 특이적 항체(anti-collagen II Ab; ab3092, Abcam, USA)를 이용한 조직면역화학염색법을 통해 제2형 콜라겐의 발현정도를 확인하였다. 염색은 VECTASTAIN® 엘리트 ABC 키트를 이용하여 제조업자의 지시대로 수행하였으며, 항체는 1:100으로 희석하여 사용하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 연골종양세포를 배양한 겔은 대조군과 비교하여 세포 주위 기질(matrix)에서 보다 많은 제2형 콜라겐이 분비됨을 확인하였다.
실시예 3: 잔존 암세포 및 무균 검사를 통한 제조된 연골기질의 인체 무해성 확인
상기 실시예 1에서 제조된 연골기질 분말 중의 종양세포가 잔존하는지 여부를 확인하기 위하여 상기 연골기질 분말을 세포배양액에 첨가하여 3주간 배양하여 잔존세포 여부를 확인하였다. PCR 기법을 이용하여 잔존 뉴클레오티드 밴드를 확인하였다.
또한 상기 연골기질 분말을 균배양 배지에 첨가하여 2주간 배양하여 균 오염 여부를 확인하였다. 더불어 미코플라스마 테스트(mycoplasma test)와 균의 세포막 성분인 LPS(lipopolysaccharide)의 잔존량을 확인하였다. 미코플라즈마 테스트(mycoplasma test)는 EZ-PCR 미코플라즈마 테스트 키트(Biological Industries Israel Veit Haemek LTD.)를 이용하여 제조업자에 의해 제공된 프로토콜에 따라 수행하였다.
LPS 잔존량은 톡신센서TM 겔 응고 내독소 에세이 키트(ToxinSensorTM Gel Clot Endotoxin Assay kit; GenScript, USA)를 이용하여 제공된 프로토콜에 따라 수행하였다. 그 결과, 본 발명의 방법으로 제조된 연골기질은 종양세포가 모두 제거되어 종양형성 가능성이 없으므로 인체에 무해함을 확인하였다.
실시예 4: 연골종양세포로부터 제조된 연골기질의 성체줄기세포 분화능 및 연골분화 줄기세포 성장 친화성
활액막 유래 줄기세포의 경우, 일반 배양조건에 TGF-β1을 10 ng/ml의 농도로 처리하여 배양하였을 때 연골분화 표지자인 Sox9 및 어그리칸 성분이 가장 효과적으로 발현되는 것으로 알려졌다. 따라서, 이와 동일한 조건에 본 발명의 연골기질을 첨가하여 지방유래 및 골수유래 성체줄기세포를 배양하였다.
RT-PCR로부터 SOX9, Aggrecan 및 COL II의 발현이 3일 이상 빠르게 진행되며, 발현 정도도 30%이상 증가하는 반면, COL X의 발현은 30% 감소되는 것을 확인하였다. 또한, 알시안 블루, 알리자린 레드 염색 및 COL II 항체로 면역염색하여 연골 생성을 정성적으로 분석할 수 있었다. 나아가 MTT 분석은 연골분화 줄기세포의 증식 속도가 15% 이상 증가하였음을 나타내었으며, 이는 본 발명의 연골종양세포로부터 제조한 연골기질이 줄기세포의 분화 뿐만 아니라 성장에 친화적임을 나타낸다.
실시예 5: 연골안착 및 재생력 확인을 통한 이식능 확인
최종적으로 본 발명의 연골기질을 사용하여 분화시킨 연골분화 줄기세포의 연골조직에 대한 안착능력, 자기재생능(self renewality) 및 종양형성 가능성을 확인하여 실질적인 이식가능성을 확인하였다.
연골 안착 및 자기재생능은 생성된 연골의 크기 측정, 면역염색 및 조직 현미경 검사를 통해 수행되었다. 한편, 연속 계대 배양 및 동물모델에 이식을 통하여 종괴를 형성하지 않음을 확인하였다. 즉, 본 발명의 연골기질에 의해 분화된 세포는 시험관 내 배양시 및 이식 후에도 종양형성능력을 가지지 않으며, 실질적으로 연골조직에 이식시 산업적으로 이용가능할 수 있는 가능성을 제시하였다.
실시예 6: 이식체의 제작
임상 적용시 이식을 용이하게 하기 위하여 고체 지지체인 스캐폴드를 이용할 수 있다. 스캐폴드는 생분해성 합성 고분자인 PLGA(polylactic-co-glycolic acid)를 재료로 하여 염침출법(solvent-casting particulate-leaching)을 이용하여 제작하였다. 구체적으로 PLGA 5g을 50ml의 메틸클로로포름에 녹인 후, 90% 공극률을 갖도록 45 g의 소금을 첨가하여 고형화하였다. 이후 2일 동안 상온에서 공기 중에 건조시키고 스캐폴드를 3일간 물에 담궈 소금을 제거하고, 5×5×2 mm의 크기로 잘라 동결건조하여 메틸클로로포름을 완전히 제거하였다. 소금제거를 위해 물은 하루 한번씩 교체하였고, 동결건조가 끝난 후 멸균을 위해 70% 알콜에 하루 동안 담가두었다. 멸균이 끝난 스캐폴드는 PBS에 담구어 남은 알콜을 제거하고 세포 및/또는 연골기질을 로딩하기 위하여 세포 및/또는 연골기질을 포함하는 용액(예컨대 세포배양액)에 하루 동안 담가두었다.

Claims (18)

  1. (a) 양성 연골종양세포를 배양하는 단계, (b) 상기 배양액으로부터 종양세포를 분리하여 제거하는 단계, 및 (c) 종양세포를 제거한 여액으로부터 연골기질을 추출하는 단계를 포함하는 양성 연골종양세포로부터 연골기질의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 연골종양세포는 인간 연골종양세포인 것인 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 연골기질은 제2형 콜라겐(type II collagen), 어그리칸(aggrecan), 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan), 또는 부갑상선 호르몬 관련 단백질(parathyroid-hormone-related protein; PTHrP)을 포함하는 것인 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 연골종양세포는 스캐폴드를 이용하여 3차원 배양하는 것인 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 스캐폴드는 히알루론산 겔(hyaluronic acid gel), 알지네이트(alginate), 아가로즈(agarose), 피브린(fibrin), 콜라겐(collagan), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락트산(polylactic acid; PLA), 폴리(락트산-글리콜산)(poly-(lactic-co-glycolide acid); PGA)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 배양물을 증류수와 혼합하여 원심분리하여 가라앉은 세포층을 제거함으로써 수행되는 것인 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 90% 에탄올을 처리하고 원심분리하여 침전된 연골기질을 분리함으로써 수행되는 것인 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    (d) 상기 추출된 연골기질을 동결건조시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    (e) 상기 동결건조시킨 연골기질을 70% 에탄올로 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것인 제조방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 연골기질.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 연골기질을 이용하여 세포를 연골세포로 분화시키는 단계를 포함하는 연골세포의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 세포는 골수유래 줄기세포, 지방조직유래 줄기세포, 제대혈 줄기세포, 활막줄기세포, 근육줄기세포, 피부 섬유아세포(dermal fibroblast), 제대유래 줄기세포(umbilical cord-derived mesenchymal stromal cell), 배아줄기세포 및 자가연골세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제조방법.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 연골기질; 제11항 또는 제12항에 기재된 방법으로 제조된 연골세포; 또는 상기 연골기질 및 연골세포 또는 연골세포로 분화가능한 세포의 조합을 유효성분으로 포함하는 연골재생용 조성물.
  14. 제13항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 연골재생용 주사제.
  15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 연골기질; 제11항 또는 제12항에 기재된 방법으로 제조된 연골세포; 또는 상기 연골기질 및 연골세포 또는 연골로 분화가능한 세포를 스캐폴드에 로딩시킨 연골재생용 이식체.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 연골기질; 제11항 또는 제12항에 기재된 방법으로 제조된 연골세포; 상기 연골기질 및 연골세포 또는 연골로 분화가능한 세포의 조합을 이용하여 연골을 재생시키는 방법.
  17. 제14항에 기재된 연골재생용 주사제 또는 제15항에 기재된 연골재생용 이식체를 이를 필요로 하는 개체에 이식하는 단계를 포함하는 연골질환(chondropathy a.k.a. diseases of the cartilage)의 치료방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 연골질환은 연골연화증(chondromalacia), 다발성 연골염(polychondritis), 재발성 다발성 연골염(relapsing polychondritis), 연골형성장애증(chondrodysplasia), 연골무형성증(achondroplasia), 늑연골염(costochondritis) 및 골관절염(osteoarthritis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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