JP2009226221A - 軟骨移植片及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 3次元の基質中に軟骨細胞又は間充織幹細胞を組み込み増殖させて軟骨移植組織を形成する。基質はランダムにリフォールディングされたタイプIコラーゲンのα−ヘリカルモノマーを含有している。
【選択図】 なし
Description
上記の方法において、前記タイプIIコラーゲンは部分的に消化されていてもよい。
基質がタイプIIコラーゲンのランダムにリフォールディングされたヘリカルモノマーを含有している方法において、前記軟骨細胞又は間充織幹細胞と、タイプIコラーゲンと、タイプIIコラーゲンとは、2種類又は3種類の異なる動物源から調製されていてもよい。
基質がタイプIIコラーゲンのランダムにリフォールディングされたヘリカルモノマーを含有している方法において、前記軟骨細胞又は間充織幹細胞とタイプIコラーゲンとは、それぞれ異なる動物源から調製されていてもよい。
。
前記タイプIIコラーゲンは部分的に消化されていてもよく、前記タイプIコラーゲン
は部分的に消化されることがある。
第3の実施形態において、前記タイプIIコラーゲンは部分的に消化されるものであってもよい。
前記軟骨細胞と、タイプIコラーゲンと、タイプIIコラーゲンとは、2種類又は3種類の異なる動物源から調製されていてもよい。
第3の実施形態において、前記軟骨細胞とタイプIコラーゲンとは、それぞれ異なる動物源から調製されていてもよい。
(1) タイプIコラーゲンの抽出及び精製
タイプIコラーゲンは、ニュージーランドシロウサギの腱又はラット尾の腱から抽出及び精製された。(米国特許第5,876,444号、レイ(Lai)、1999年)血漿タンパクを除去するために腱を剥離、薄切り及び、冷却蒸留水を数回取替えながら洗浄し、次に、50mM、pH 7.4のトリス塩酸中の0.5M NaClを使用して4℃で一晩継続して攪拌しながら抽出した。上清を静かに移動し、残りは塩類を除去するために冷却蒸留水を数回取り替えて洗浄し、次に0.5M HOAc(pH 2.5)中にて4℃で一晩培養し、水溶性抽出物を得た。抽出物を塩性水溶液(0.9M NaCl)で沈澱した。沈殿物を30分間13,000rpmで遠心分離機にかけ、コラーゲン含有溶液を形成するために0.05M HOAcに溶解した。沈澱させるために別の塩溶液(0.02M Na2HPO4)を24〜48時間の間にわたってコラーゲン含有溶液に2度加えた。沈殿物を遠心分離機にかけ、次に別のコラーゲン含有溶液を得るために50mM HOAcに溶解した。溶液を5mM HOAcに対して透析し、凍結乾燥した。
タイプIIコラーゲンは、変更したミラー法(雑誌 酵素学大系(Methods Enzymol.)第82巻第33〜64ページ)によって作製された。ウサギ軟骨を薄切りし、0.05M トリスバッファ(pH 7.4)中の、0.5M NaCl及び20mM EDTAで洗浄した。4M グアニジン−HClで糖タンパクを除去し、抽出物を1mg/mlのペプシンとともに0.5M 酢酸に溶解した。0.9M NaClを加え、完全に酸と塩を除去すべく70%のアルコールで数回洗浄し、1M NaCl及び0.05M トリスバッファ(pH 7.4)に溶解することによってコラーゲンを沈澱させた。沈降反応のためにNaClを3.5Mまで加え、上清は回収した。その後NaClを4.5Mまで加えることによりタイプIIコラーゲンを沈澱させた。ペレットを70%のアルコールで数回洗浄し、2〜4mg/mlの最終濃度まで10mM 酢酸中に再び溶解した。
軟骨細胞を、ニュージーランドシロウサギの新生児の関節軟骨から分離した(レイ(Lai)、医学博士論文、ハーバード大学医学部、1993年)。細胞のスライスを、ヒアルロニダーゼ1mg/ml及びコラゲナーゼ1mg/mlを含有する、ハンクのバランス塩溶液(HBSS)中で一晩インキュベートした。遠心分離後に、組織ペレットを10%
PBS、50μg/ml硫酸ゲンタマイシン、100ユニット/ml ペニシリンGナトリウム、100μg/ml 硫酸ストレプトマイシン及び0.25μg/ml ファンギゾンをもって、DMEM中に再懸濁された。10cmペトリ皿につき5×105個の組織を播種し、37℃で5%炭酸ガスインキュベータにおいて培養した。媒体を3〜4日毎に取り替え、組織をサブコンフルエントまで成長させた。
タイプI及びタイプIIコラーゲンの両方をガンマ線で殺菌し、5mM HOAcにそれぞれ溶解した。コラーゲンは、テロペプチドを除去するためにペプシンで部分的に消化させた。例えば米国特許第5,876,444号を参照されたい。タイプIコラーゲン含有溶液及びタイプIIコラーゲン含有溶液を緩慢に混合した。必要な場合には混合を促進するために溶液を30〜40℃に加熱した。タイプIIコラーゲン対タイプIコラーゲン
の重量比は1:1〜1:2である。
組織切片を第1の抗体(抗タイプIIコラーゲン及び抗コンドロイチン硫酸塩)又は制御血清ブランクで培養した。タイプIIコラーゲンは細胞外マトリクスの軟骨に特有の成分である。コンドロイチン硫酸塩は軟骨プロテオグリカンの主成分である。抗原−第1抗体錯体は、第2抗体−ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合体でさらに培養された。タイプIIコラーゲン及びコンドロイチン硫酸塩の濃度は、第3の抗原−抗体錯体の量を3−3’ジアミノベンジジン(DAB)で検出することによって決定した。
表1 軟骨細胞−コラーゲン作成物の軟骨形成
(1) 軟骨欠陥及び移植
36個のオスのニュージーランドシロウサギがこの実験で使用された。各ウサギは約2.5kgの体重を有し、平均年齢は4か月であった。ケタミン(100mg/ml、0.65ml/体重kg)及びキシラジン(20mg/ml、0.30ml/体重kg)の混合物の筋肉注射によってウサギに麻酔をした。膝前部周辺の皮膚を削り、ヨウ素で洗浄した。膝関節に到達するために内側傍膝蓋アプローチを使用した。膝蓋骨を摘出し、関節軟骨の4mmの環状全層欠陥を4mmドリルで形成した。孔は中間の大腿部内側顆状突起に設けられた。深さ4mmかつ、骨髄穴の海綿質骨へ延伸する円錐形の欠陥を形成した。交絡因子の影響を回避するために、半数のウサギは右膝継手に欠陥を形成し、残りの半数は左膝継手に欠陥を形成した。
陥の中心部から得られた。試験片をヘマトキシリン/エオシンで染色し、微視的に検査した。
正常な関節軟骨は大腿顆の関節をなす端部を覆って、黄色を帯びた半透明白色の外観を有する。移植をしていない外科的欠陥は凹面に観察され、4週で白色光沢を有する組織で充填された。欠陥の端縁は明確であった。12週で欠陥表面は、繊維によって不規則な形状になっていた。
(外科対照群)
1か月後に軟骨の緩慢な退化、繊維攣縮及び細分化が傷及び隣接した領域で観察された。欠陥はわずかな軟骨芽細胞の成長とともに繊維芽細胞によって修復された。2か月後に軟骨の通常から重篤な退化、繊維性攣縮、及び細分化が傷内部及び隣接した領域で観察された。欠陥は繊維及び部分的軟骨芽細胞内の成長によって修復された。3か月後に欠陥の軟骨下骨が曝され、繊維組織によって被覆された。
予測を超えて、1か月後に欠陥は軟骨芽細胞でほぼ充填された。軟骨細胞の組織形態は円形から多角形類似まで多様であった。軟骨芽細胞は肋軟骨下の層に入り込んだ。わずかな炎症が両グループ中の移植箇所底部で観察された。
本明細書に示された特徴はすべて、任意の組合せとして組み合わせてもよい。本明細書に示された各特徴は、同一、等価、又は類似目的の役割を果たす代替の特徴で置換されてもよい。したがって、特に明示されない場合には、示された各特徴は一般的な一連の等価又は同様の特徴を例示のみするものである。
Claims (14)
- 部分的に消化されているが還元反応を受けていないタイプIコラーゲンから、ランダムにリフォールディングされたα−ヘリカルモノマーであって架橋されている前記α−ヘリカルモノマーを含有する3次元の基質中に、軟骨細胞又は間充織の幹細胞を組み込む工程と、
基質中の軟骨細胞又は間充織幹細胞を増殖する工程とからなる軟骨移植片の製造方法。 - 前記基質はタイプIIコラーゲンのランダムにリフォールディングされたヘリカルモノマーを含有している請求項1に記載の方法。
- 前記タイプIIコラーゲンは部分的に消化される請求項2に記載の方法。
- 前記軟骨細胞又は間充織幹細胞と、タイプIコラーゲンと、タイプIIコラーゲンとは、2種類又は3種類の異なる動物源から調製されている請求項2に記載の方法。
- 前記軟骨細胞又は間充織幹細胞と基質とは、回転及び振動される容器に配置される請求項1又は2に記載の方法。
- 前記軟骨細胞又は間充織幹細胞とタイプIコラーゲンとは、それぞれ異なる動物源から調製されている請求項2に記載の方法。
- 部分的に消化されているが還元反応を受けていないタイプIコラーゲンからランダムにリフォールディングされたα−ヘリカルモノマーであって架橋されている前記α−ヘリカルモノマーを含有する3次元の基質中に、軟骨細胞を組み込む工程と、
基質中の軟骨細胞を増殖する工程とからなる軟骨移植片の製造方法。 - 前記基質はタイプIIコラーゲンのランダムにリフォールディングされたα−ヘリカルモノマーを含有している請求項7に記載の方法。
- 前記タイプIIコラーゲンは部分的に消化される請求項7に記載の方法。
- 軟骨細胞と、
3次元のマトリクスと、同マトリクスは、部分的に消化されているが還元反応を受けていないタイプIコラーゲンからランダムにリフォールディングされたα−ヘリカルモノマーであって架橋されている前記α−ヘリカルモノマーを含有していることと、
前記軟骨細胞は前記マトリクスに組み込まれていることとからなる軟骨移植片。 - 前記マトリクスはタイプIIコラーゲンのランダムにリフォールディングされたα−ヘリカルモノマーを含有している請求項10に記載の軟骨移植片。
- 前記タイプIIコラーゲンは部分的に消化される請求項11に記載の軟骨移植片。
- 前記軟骨細胞と、タイプIコラーゲンと、タイプIIコラーゲンとは、2種類又は3種類の異なる動物源から調製されている請求項11の軟骨移植片。
- 前記軟骨細胞とタイプIコラーゲンとは、それぞれ異なる動物源から調製されている請求項10に記載の方法。
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