JP2001514551A

JP2001514551A - 組織移植体

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Publication number: JP2001514551A
Application number: JP53934098A
Authority: JP
Inventors: アランリーデイビッド; ローレンスベイダーダニエル; デボラスティーブンズミラ
Original assignee: University College London
Current assignee: University College London
Priority date: 1997-03-07
Filing date: 1998-03-06
Publication date: 2001-09-11
Also published as: EP1019109A1; US6306169B1; AU6506698A; WO1998040111A1; GB9704749D0; US20010016772A1

Abstract

(57)【要約】少なくとも二つのマトリックス成分を含んで成る生物機械的移植体であって、その第１のマトリックス成分が張力及び剪断力に耐える能力を持つ多孔性マクロ構造を有するコラーゲンから成るものであり、その第２のマトリックス成分が第１の成分の多孔性マクロ構造を実質的に充填しそして膨張圧を及ぼす水和したアルギン酸塩ゲルであり、付加的に軟骨細胞、繊維軟骨細胞、繊維芽細胞もしくは骨芽細胞又はこれらの前駆体を含む細胞集団を含むものである生物機械的移植体が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】組織移植体本発明は半月や関節軟骨などの損傷した荷重のかかった軟骨組織に使用するための組織移植体に関する。関節軟骨、半月、靱帯、腱及び椎骨間板などの多くの非石灰化骨格結合組織は機械的機能を有し、そのようなものとして、生理学的活動の間、力学的機械的荷重を受ける。例えば、正常な生理学的活動の間の関節の力は相当なものであり、普通２０００Ｎ又は体重の３倍を越え、そして年に約１００万回も反復して発生する。こうして、関節軟骨は５ＭＰａを越える接触応力を普通に受けることになる。軟骨組織は大量の細胞外マトリックス内に埋め込まれた細胞から構成されている。これらの組織の機能的挙動は、溶解した無機塩を含む細胞間水の「流動相」及びコラーゲン−プロテオグリカン有機固体基質を含む「固相」から成る二相としてそれを考えるとき、最もよく理解される。この二つの相は合わせると、透過性の固相を通して流体が流動することが可能となる。健康な組織の機械的諸性質に責任があるのは、細胞外マトリックスの種々の成分の物理化学的相互作用である。例えば、軟骨組織では、コラーゲン繊維ネットワーク内で発生する引っ張り応力による静水圧（Ｐ_elastic）によりバランスを取られるプロテオグリカンゲルの浸透膨潤圧（Ｐ_swelling）間の物理化学的平衡が存在する。このバランスは荷重のかかっていない関節軟骨でさえも存在する。それは静水圧の適用（Ｐ_appl _ied ）による圧縮の際に組織に荷重が与えられると変更され、ネットの圧力差（ Δｐ）及び圧縮された組織から流体の流出が生ずる。適切な方程式は Δｐ＝Ｐ_applied＋（Ｐ_e1astic−Ｐ_swelling）によって与えられる。この流体の流出は組織内のプロテオグリカン濃度の増加及び関節軟骨の二つの固体成分における相対応力量の変化を生ずる。もし圧縮荷重が一定に留まるならば、流体の流出の速度は時間と共に減少し終にはゼロに帰し新たな平衡状態に達する。この時間依存性のクリープ挙動は全ての粘弾性柔組織の特徴である。この細胞は、この組織容積の１０％未満を占めるけれども、マトリックスレベルの合成及び維持にとって必要であり、従って、この組織の構造的完全性及び機能にとって決定的に重要である。細胞が、それぞれ軟骨における軟骨細胞、半月における繊維軟骨細胞、又は鍵や靱帯における腱細胞及び繊維芽細胞のいずれであるとしても、適用された荷重に応じてそれらの代謝活性を変えることができることが知られている。適用される歪み（strain）のレベル及びその力学的頻度の両方がこの応答を決定する場合に重要であることが知られている。これらのプロセスはこれらの組織における細胞の活性を決定する際の主要な因子であると考えられている。細胞が機械的荷重を検出しそしてそれに応答するメカニズムは機械伝達経路と呼ばれ、そして複雑であり殆ど理解されていない。機械伝達事象は、細胞の変形、静水圧及び流動のポテンシャル、それに続く最終的にエフェクター細胞応答の変更に導く、細胞内カルシウムの流動、ｃＡＭＰ生産及び細胞骨格の変更などの細胞内シグナル発信事象を含む細胞外構成要素に分解することができる。しかしながら、このようなメカニズムの理解は、細胞レベルを含め、多くの異なるレベルでのプロセスを研究する必要性により複雑になってきた。柔組織の障害は病院臨床における極めて普通のことである。実際、柔組織の置換は全ての医学的装置に対する世界市場の推定３５％にも達する（マテリアルズ・テクノロジー・フォーサイト・イン・バイオマテリアルズ、インスティチュート・オブ・マテリアルズ、ロンドン（１９９５））。関節軟骨及び膝半月の場合には、外傷性の損傷は若い活発な人々では普通である。自然治癒は血管分布が限られているためしばしば貧弱である。処置しないときは、損傷は、障害を受けた組織及び関連構造における変形性関節症などの進行性の変性的変化に至るのが普通である。人工関節の使用を含む現代の解決法は、しかしこれらの移植体は１２〜１５年と比較的寿命が短く、その後の置換はさらに短い期間しか続かない。これは寿命が短い移植体を受けた患者にとっての特殊な問題である。柔組織の修復のために提案された多くの選択枝がある。これらは一般に、合成物質、生物物質またはこの両者の組合せを含む。前者の解決法は免疫学的に許容され得る構造であって荷重を支える構造に必要な機械的完全性を有するものを提供するという長所を持つ。しかしながら、その身体におけるそれらの不安定性のため、長期間の使用には比較的困難を招くことになる。生物学的解決法は、伝統的に、その組織の起源に依存して、自己移植体、同種移植体又は異種移植体を含む。これらの選択枝はいずれも理想的とは程遠く、例えば自己移植体は供与部位の病的状態を生じそして同種移植体及び異種移植体は移植体の拒否を生ずる。他の普通の解決法としては、合成構造物及び生物学的移植体の両方を組み込んだ増殖装置が挙げられる。これらの装置は、合成物質から天然の組織への応力の伝達の成功により誘導される組織の内部成長及び再生に依存する。この応力の伝達プロセスは、組織が再生するにつれ移植後の時間と共に変化する必要があるであろう。臨床報告は、例えば、増殖装置の合成成分の不適当な初期動作のため、一般に納得するものではない。関節軟骨損傷の治療に普通に用いられる方法としては、繊維軟骨修復組織を形成する修復細胞を放出させるための関節表面の穿孔又は剥離を含むプライディー法が挙げられる。他の方法としては、穿孔と併せて炭素繊維棒又はマットの使用及び同種移植体及び異種移植体の使用が挙げられる。これらの方法は長期間の安定性に限界のある柔らかい繊維軟骨組織の形成に導く。損傷した半月の治療のための選択枝としては、半月の損傷部分を除去するための外科手術（半月が良く理解されていなかった２０年前には、損傷した半月は完全に除去された）、半月の裂けた部分を接着して元に戻すためのプラスチック半月の移植又はフィブリン接着剤の使用が現在挙げられる。しかしながら、プラスチック半月移植体では、ヒドロゲルの使用がしばしば不適当であり、そしてその移植体の上にかかる剪断力／応力に関する問題がある。フィブリン接着剤の使用も、その半月がなお弱点を含みそして非均質性の異方性構造であるため、満足すべきものではない。多くの外科手術、合成及び移植的解決法が比較的欠点を有するため、関節軟骨、半月及び靱帯などの結合組織に関連する多くの臨床問題を解決するための細胞 −接種修復システムの開発に対する関心が増大した。これらのシステムは組織− 工学修復システムとも呼ばれてきた。典型的には、自己細胞又は異種遺伝子型細胞を、その障害から離れた部位から採取した組織生検から単離する。細胞培養でその細胞を増殖させ、そして欠陥のある又は損傷を受けた部位に移植されると生物学的修復を誘導する適当な再吸収可能な３Ｄ足場物質の中に接種する。荷重を支える軟骨組織の修復のための細胞−工学システムのイン・ビトロ及びイン・ビボでの評価を記述する幾つかの報告がある。このようなシステムの例は、ブリットバーグら（New England Journal of Medicine 331, 889-95(1994)）、ＷＯ８９／００４１３号、ＷＯ９０／０９７６９号、ＷＯ９１／１６８６７号、ＷＯ９０／１２６０３号、ＷＯ９５／３１１５７号、及びペイジら（Plastic and Reconstructive Surgery 97(1)，168-180(1996)）により記述された。ブリットバーグらは、培養で増殖させた自己の軟骨細胞を欠損部位に移植する方法を記述する。この方法は足場物質を含まず、従って供与部位の損傷と関連してその欠損部位の内部の細胞を保持させるための骨膜の移植が必要となる。この移植された細胞はマトリックスをはぎ取られ、従って移植に対する機械的完全性を持たない。また、この方法は肋軟骨下の骨を含まない損傷に対してだけ適当である。ストーン（ＷＯ８９／００４１３号、ＷＯ９０／０９７６９号、ＷＯ９１／１６８６７号）は、椎骨間板、半月又は他の同様な組織に対する人工装具を記述する。各人工装具は、乾燥した、多孔性の、生体適合性及び生体再吸収性繊維のボリュームマトリックスを含むと言われる。これらは、繊維への架橋結合のための結合部位を提供しうるグリコサミノグリカン分子が全体に散らばっているものとして記述される。このような装置の形は、それが置換しようと設計される生物構造の外部表面輪郭を複製するように製造するか又はより大きな形に製造しそしてサイズまで刈り込んでいくことができる。長期間イン・ビボで稼働するために、これらの人工装具は、再生組織構造のための足場を提供するために機能的繊維軟骨細胞の注入を必要とする。しかしながら、この人工装具は接種された細胞ではなく、従って移植前における足場の中への接種された細胞の使用には左右されない。さらに、機械的相互作用の性質は特定されなかった。生体物質の選択は、今日まで、大部分は経験的に生体適合性及び細胞形態及び細胞機能の維持に基づいてきた。さらに、装置の構造的設計は一般に無視されてきた。種々の形態のコラーゲン、ポリ−Ｌ−乳酸及びアルギン酸などの物質が用いられてきた。移植後の分析の殆どは修復組織の組織学的及び生化学的分析に関するものであり、その機械的完全性を評価する報告は僅か二、三に留まった。この装置の移植前の機械的完全性は殆ど無視されてきた。例えば、バカンティ（Ｗ０９０／１２６０３号）及びキムら（Plastic and Reconstructive Surgery 94( 2)，233-237(1994)）は軟骨欠損中に移送するため生体再吸収可能なポリマー足場の上に軟骨細胞を接種する方法を記述する。この構築物は規定された形及びサイズを持つが、その機械的性質は関節軟骨のそれに近付いていない。関節軟骨の圧縮係数は約５〜１０ＭＰａである。初期の細胞密度及び軟骨細胞表現型の維持を保証するという問題も検討されていない。足場への被覆の適用が提案されたが、細胞の接着を誘導するためにだけである。この方法は顕著な機械的完全性が達成される前の、足場内の空隙を充填させるのに十分な軟骨マトリックスの合成に頼っている。ペイジら（Plastic and Reconstructive Surgery 97(1)，168-180(1996)）はアルギン酸単独内に埋め込まれた細胞の使用を提案する。しかしながら、これらの装置は、その装置の機械的機能に関する問題を提起している軟骨よりも堅さが約１００倍も低い。ＷＯ９５／３１１５７号は関節軟骨及び関連する肋軟骨下の骨におけるなどの柔らかい組織内の空隙の癒合のための解剖学的に特異的な生体再吸収可能な装置に関係する。この装置は巨大分子と呼ばれる繊維状の内部三次元構造であって、ミクロ構造を形成するポリマーゲルで部分的又は全体的に充填されている空隙を持っものであると記述されている。このゲルは選択された軟骨細胞のためのそしてその装置の軟骨部分内への化学的メディエーターと共同して組織の再生を高める担体物質を提供する。このゲル相はイン・ビボで７２時間後に再吸収されるように設計される。従って、この人工装具は細胞を送達しそして繊維状足場の上に細胞の短期移送を可能とする接種されたミクロ構造にのみ依存する。その設計はミクロ構造による空隙の全体充填には左右されない。移植後のどの時点においても、マクロ構造とミクロ構造の物理化学的相互作用に関する考察又は言及あるいはその結果生ずる人工装具の機械的完全性についての考察又は言及はなされていない。上記の方法のいずれも、修復されるべき組織が持つそれと類似の機械的機能を持つ構築物を作成していない。さらに、上記の方法のいずれも、望みの細胞の機械伝達−誘導応答を生ずる装置内の細胞への機械的荷重の伝達に取り組んでいない。しかし、ここに、損傷を受けた荷重を支える結合組織の修復のための移植体の機械的側面と生物学的側面の両面を考察する取り組みにより、移植のための優れた装置を提供することができることを発見した。本発明の第１の側面によれば、少なくとも二つのマトリックス成分であって、その第１のマトリックス成分が引張力又は剪断力に耐える能力を持つ多孔性のマクロ構造を有するものであり、その第２のマトリックス成分が第１の成分の多孔性マクロ構造を実質的に充填しそして膨張力を及ぼす水和したゲルであるものが提供される。この移植体は、分化した表現型を持つ又はそのような細胞に分化する潜在的能力を持つ未分化表現型を持つ動物細胞の一集団をさらに含む。本発明による生物機械的移植体は、それらが二つの成分それぞれの圧縮性の和よりも大きな圧縮荷重の下で機械的性質を持つ複合体構築物を提供する点で有利である。このようにして、この複合体構築物は移植の直後に損傷を受けた組織の生物機械的機能の回復に寄与することができる。この移植体は、圧縮が荷重の支配的なタイプである荷重状態及び未荷重状態の両方で、機械的機能を持つものなどの主要なマトリックス成分の間の平衡を作るのに十分な機械的相互作用が存在する組織に対する全体又は部分的置換に使用することができる。修復のための適当な組織は、軟骨、顎関節半月、膝半月及び椎骨間板などの組織を含むが、これらに限定されない。第１のマトリックス成分は、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブタレート、ポリアンヒドリド及び上記のもののコポリマーなどの生物分解性の又は生物再吸収可能なポリマーから適当に構成される。しかしながら、非再吸収性ポリマー成分又は可溶性バイオグラスなどの非ポリマー性再吸収可能な成分の特定の使用は排除されない。第１のマトリックス成分はコラーゲンから構成されることが好ましい。第１のマトリックス成分を構成するポリマーの機械的性質、抗原性及び分解速度は、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、組織トランスグルタミナーゼ及び酸性アルデヒドなどの架橋剤の使用又は熱処理により修飾することができる。第１のマトリックス成分を形成するポリマーはポリマーの表面的性質に変更を加えることにより修飾することができる。これは、ヒドロキシアパタイト、フィブロネクチン、コラーゲン、ヴィトロネクチン、ヒアルロナン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン又はＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）トリペプチド細胞接着配列などの細胞の接着及び分化に影響を与えることが知られている成分で被覆することにより達成することができる。被覆は第１マトリックス成分の特定の領域に限定することもできる。また、接着は、０．１〜５０μｍ、適当なものは１〜２５μｍ、好ましくは３〜１０μｍの範囲内で溝又は微小な多孔性などの特定の表面超構造的特徴により影響を受けることができる。第１マトリックス成分を形成するポリマー成分は相互に連結しているチャンネルから成る多孔性のマクロ構造を持っている。孔の平均サイズは１０〜１０００ μｍ、適当なものは３０〜２５０μｍ、好ましくは５０〜１５０μｍの範囲にあり、総多孔率は５０〜９８％、適当なものは６０〜９５％、好ましくは７０〜９０％である。従って、このマクロ構造は、織布又は不織布、スポンジ又は泡、又は相互に連結しているひも、繊維又は接触しているプレートにより結合した一連のプレート又はシートの形状であることができる。第１のマトリックス成分のマクロ構造は、多孔性、孔サイズ及び／又はポリマー繊維／プレート／シートの優勢な配向に関して不均質であることができる。関節軟骨を置換するための生物機械的移植体では、第１マトリックス成分の大きさは、関節軟骨の厚さに対応して、厚さが約０．０５〜６ｍｍ、適当なものは０．０７５〜４ｍｍ、好ましくは０．１〜３ｍｍである。この構築物の他の大きさは修復されるべき欠損の大きさに対応させるのが適当である。マクロ構造は表面に平行な配向を優勢に持つ表面ゾーンを有するのが便利である。このゾーンは軟骨の天然の表面ゾーンに対応させ、それにより構築物の全体の厚さの約１０〜２０％、すなわち、０．００５〜１．２ｍｍ、適当なものは０．００７５〜０．８ｍｍ、好ましくは０．１〜０．６ｍｍの範囲にあることが好ましい。この表面ゾーンはまた、５０〜９８％、適当なものは６０〜９５％、好ましくは６５〜８０％の範囲内という比較的低い多孔率を持ち、１０〜１０００μｍ、適当なものは３０〜２５０μｍ、好ましくは５０〜１００μｍの平均孔サイズを持つことが好ましい。構築物の深さの残りの中の優勢なマクロ構造の構成は表面に適当に垂直となっており、５０〜９８％、適当なものは６０〜９５％、好ましくは７５〜９０％の間の多孔率及び１０〜１０００μｍ、適当には３０〜２５０μｍ、好ましくは５０〜１５０μｍの範囲の平均孔サイズを持つものであることができる。最も下部のゾーンは、０．０５〜１ｍｍの厚さであるが、下層にある肋軟骨下の骨との相互作用を高めるためにヒドロキシアパタイトなどの生物活性物質で被覆することができる。膝半月の置換のための好ましい態様では、第１マトリックス成分の全体の大きさは置換されるべき半月断片の大きさに対応させるのが好ましい。第１マトリックス成分のポリマー性マクロ構造の優勢な配向は、その構築物の天然の半月の表面ゾーンに対応する構築物の最外側の１００〜３００μｍにある構築物の表面に平行であることができる。この領域内の多孔率は５０〜９８％、適当なものは６０〜９５％、好ましくは６５〜８０％の間にあり、その孔サイズは１０〜１０００μｍ、適当なものは３０〜２５０μｍ、好ましくは５０〜１００μｍの範囲であることができる。第１マトリックス成分のポリマー性マクロ構造の中央のコアは放射状に優勢に配向し、その優勢な配向に９０°で配向する少量の連結構造を持つことができる。この領域の多孔率は５０〜９８％、適当なものは６０〜９５％、好ましくは７５〜９０％の間にあり、１０〜５００μｍ、適当なものは３０〜２５０μｍ、好ましくは５０〜１５０μｍの範囲の孔サイズを持つことができる。第２マトリックス成分を形成する水和したゲルは、アルギン酸塩、アガロース、カラギーナン、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、ポリエチレンオキシド又はコラーゲンの水和したゲルなどの水和したポリマーゲルであることができる。多くの状況では、水和したゲルはアルギン酸塩であることができる。水和したゲルは生物分解性又は生物再吸収可能であることが好ましい。第２マトリックス成分は圧縮荷重に耐えることができることが適当である。アルギン酸塩は褐色海藻由来の多糖類であって、Ｄ−マンヌロン酸及びＬ−グルロン酸単糖類サブユニットから構成される。アルギン酸のナトリウム塩は粘稠な溶液を形成するが、アルギン酸塩はカルシウムなどの２価のカチオンの存在下に、Ｌ−グルロン酸残基上に存在する負に荷電したカルボキシル基を介して架橋結合をすることにより、水和したゲルを形成することができる。架橋していない溶液の粘度及び架橋したゲルの機械的強度はアルギン酸の平均鎖長を変えることにより又はその多糖類内のＤ−マンヌロン酸残基とＬ−グルロン酸残基の比率を変えることにより影響を与えることができる。これらの因子はアルギン酸塩の再吸収の速度にも影響しうる。第２マトリックス成分を形成する水和したゲルの濃度は移植体の第１マトリックス成分により形成されるマクロ構造内では不均質であることができる。これは移植体の深さ全体にわたって機能的に類別された機械的性質を与えることができる。第２マトリックス成分を形成する水和したゲルは、架橋後にゲル内に固定化される因子又はゲルの水和した画分内に含まれ自由に拡散できる因子の添加により修飾することができる。これらの因子としては、コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、成長因子、サイトカイン、細胞接着因子、化学走性因子、血管形成誘導因子及びヒドロキシアパタイト、組織トランスグルタミナーゼ及びマトリックス分解酵素などの現存する組織へのこの構築物の接着に影響を与えうる因子が挙げられる。これらの因子が固定化される程度は因子のサイズや荷電そして濃度に依存し、そしてアルギン酸塩ゲルの孔サイズに依存する。この修飾の具体的例は、この複合体装置のコラーゲン全含量を増加させるための、アルギン酸塩ゲルの内部へのコラーゲンの組み込みである。これは半月修復のための装置の調製において特に重要である。上に論じたように、第１及び第２マトリックス成分は両方共再吸収可能であり、一定期間の間に加水分解、酵素分解、解重合及び拡散によりイン・ビボで再吸収され取り除かれて、移植体の細胞によって合成される天然のマトリックス成分により置き換えられる。このようにして、元の構築物は、細胞及び適当な機械的及び生化学的シグナルの存在により、細胞数、構造及びマトリックス代謝回転の面で安定な平衡に達することができる、機能的に完全な全く天然の修復組織により置き換えることができる。移植体の中の動物細胞は宿主に対して自己、同種異系又は異種であることができるが、この細胞は自己のものであることが好ましい。便宜的には、この細胞は、分化した表現型を持つ軟骨細胞、繊維軟骨細胞、繊維芽細胞、骨芽細胞、又はそれらの亜集団であることができる。また、このような細胞に分化する潜在能力を有する前記の細胞型の前駆体も使用することができる。これらの細胞は組織生検から又は骨髄から、当技術分野の熟練者に普通の方法を使用することにより単離することができる。単離時に十分な細胞数が入手可能でないときは、その細胞を構築物内に接種する前に組織培養で増殖させることができる。増殖相の間に、細胞は組織培養処理基板の上に単層として培養され、そして、例えば１〜２０％のウシ胎児血清またはヒトの自己血清を補強したダルベッコ修正イーグル培地などの組織培養培地中で維持される。また、細胞は、特異的接着因子の固定化により修飾された組織培養プラスチックの上でマイトジェンを補強した無血清培地中で培養することができる。別のもう一つの取り組み法では、分化した細胞をアルギン酸塩ビーズ内に特定の接種密度で接種しそして血清又はマイトジェン様成長因子を補強した組織培養培地中で培養する。クエン酸ナトリウム食塩水溶液処理、その後コラゲナーゼ消化を行ってこのビーズを溶解することによりこの細胞を単離することができる。これらの細胞は前記したものと同じ接種密度でアルギン酸ビーズ中に接種し培養することにより逐次継代することができる。これらの細胞は適当な回転式バイオリアクター内で培養することができる。本発明の生物機械的移植体は、少なくとも次の理由で先行技術の既知の装置に優る改良を示す。第１及び第２マトリックス成分の間の相互作用は二つの成分の個々の性質の和よりも大きな増強された機械的性質を提供することができる。このようにして、この移植体は天然の軟骨組織内の物理化学的相互作用を模倣する。第２マトリックス成分内に固定された細胞が存在することは、長期間にわたって、この構築物全体に均一な細胞密度を保証する。第１マトリックス成分全体の細胞密度は、達成される細胞密度の不均一性を許容するその多孔率を変えることにより変更することができる。増殖の接触阻害は典型的には単層として培養された細胞及びＷＯ９０／１２６０３に記述されたものなどの単一因子足場の上に接種された細胞に対して現れ、従って細胞数が制限されるため足場内の空隙を満たさない。一方、本発明は、全３−次元容積が満たされるまで増殖の接触阻害の発生を誘導しない３−次元状態に細胞を維持させる。このようにして、より大きな細胞密度が得られ又はより小さな初期接種密度を用いることができる。細胞の形態が、細胞によって形成される細胞の表現型及びタイプ、量及び細胞外マトリックスの構成に影響を与えることが知られている。本発明は細胞を丸い形か又は伸びた形で維持させ、それによって達成すべき細胞の表現型の制御を可能とする。半月は細胞の二つの亜集団を含む。すなわち、一方は表現型が伸びており繊維芽細胞的であるもの、他方は表現型が丸く軟骨細胞的なものである。表現型は適当な細胞培養条件を使用することにより相互に変換可能である。本発明は第１マトリックス成分の上に及び第２マトリックス成分の中に細胞を接種することによるこの二つの亜集団の回復を許容する。本発明の生物機械的移植体は、規定された方法で、この構築物に適用された機械的荷重のその中に接種された細胞への伝達をも許容する。この構築物の固有の機械的完全性はイン・ビトロか又はイン・ビボでの機械的荷重の適用を可能とする。第１マトリックス成分上に又は第２マトリックス成分内に細胞を接種することにより、異なる細胞株の領域及び機械伝達経路を誘導することができる。さらに、機械的歪みが、関節軟骨、半月、腱、靱帯、椎骨間板、骨及び皮膚などの多くの荷重を支える結合組織における細胞の挙動に影響を与えることが知られている。多くの場合に、この現象は組織の構造及び機能の維持に極めて重大であることができる。細胞が歪みを感知しそして応答するその正確なメカニズム、すなわち、機械伝達として知られるものは、明らかではないが、細胞の変形、流体圧力、流動ポテンシャル、流体流動の変更、栄養素濃度及び移送の変更、ｐＨの変更及び浸透性環境の変動が関与すると考えられている。本発明の好ましい態様は前記の機械伝達経路の多くを介して機械的荷重に対する応答としての細胞の挙動における変更を誘導しうる。機械的荷重は、特別に設計された技法を用いて移植前にこの構築物内の細胞に適用することができ、あるいは連続的受動的運動計画などの規定された訓練計画又は外部から適用される計画により移植後に構築物内の細胞に適用することができる。静的又は動的方法で適用される機械的荷重計画は、一軸圧縮又は張力又は静水圧を含む多様な形をとることができるが、これらは決して排他的なものではない。静的及び動的な歪み振幅のピークは０．５〜３０％、適当なものは１〜２５％、好ましくは５〜２０％の範囲でありうるが、動的振動数は０．００１〜１０Ｈｚ、適当なものは０．０１〜５Ｈｚ、好ましくは０．１〜３Ｈｚの範囲であるべきである。移植前の構築物内の細胞に伝達されうる機械歪みの適用には幾つかの長所もある。第一に、生合成応答という最適歪みウインドーを使用すれば、工学的組織修復装置の成功に影響を与えることが知られている、細胞増殖、プロテオグリカン合成及びコラーゲン合成などの代謝的パラメータを定量的に増加させることができる。第二に、異方性を与えそして潜在的に全体の機械的性質を改良する、歪みに応答して新たに合成されるマトリックス成分の定性的再構成及び／又は配向が誘導されうる。歪み場に沿った細胞の配向は配向されたマトリックスの長期間形成を誘導する。配向された細胞の増殖は、関節軟骨の特徴でありそして組織内での構造／機能相関関係において重要なカラムなどの細胞の構造を回復させもする。移植体内の細胞は移植前の歪みの履歴を適当に所有しており、従って移植後の機械的歪みに応答するように適応することができる。本発明の第２の側面によれば、損傷した結合組織を修復する方法であって、上に規定したような生物機械的移植体で損傷した組織を全部又は部分的に置換するという工程を含む方法が提供される。本発明のこの側面は、損傷した結合組織修復のための生物機械的移植体の調製において、少なくとも二つのマトリックス成分及び動物集団の使用を予定する。第１のマトリックス成分は張力又は剪断力に耐える能力を持つ多孔性のマクロ構造を持ち、第２のマトリックス成分は第１の成分の多孔性マクロ構造を実質的に充填しそして圧縮荷重に耐える能力を有する水和したゲルであり、そしてその動物集団は分化した表現型を持つ細胞又はこのような細胞に分化する潜在能力を持つ未分化表現型のものである。この移植体は、荷重状態と未荷重状態において機械的機能を持つ成分などの主要なマトリックス成分の間での平衡を作り出すのに十分な機械的相互作用が成分間に存在する組織であって、圧縮が荷重の優勢なタイプである組織に最もよく適用することができる。修復のための適当な組織としては、軟骨、顎関節半月、膝半月及び椎骨間板などの組織が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の第３の側面によれば、損傷した結合組織の修復のための生物機械的移植体の調製における同時、別々又は逐次使用のための複合調製物としての、少なくとも二つのマトリックス成分を含んで成る生物機械的移植体であって、その第１のマトリックス成分は張力又は剪断力に耐える能力を持つ多孔性マクロ構造を持つものであり、第２のマトリックス成分は第１成分の多孔性マクロ構造を実質的に充填し、圧縮荷重に耐える能力を持つ水和したゲルであり、付加的に分化された表現型又はこのような細胞に分化する潜在能力を有する未分化表現型を持つ動物細胞の集団を含むものである移植体が提供される。本発明の第４の側面によれば、上に規定した生物機械的移植体の製造方法であって、下記の工程、すなわち（ａ）第１マトリックス成分中に水和したゲルの未架橋前駆体の溶液を注入する工程、（ｂ）そのままの状態でゲルを架橋して第２マトリックス成分を形成させる工程、（ｃ）そのマトリックスに細胞を組み込む工程、及び（ｄ）機械的荷重を加える工程、を含んで成る方法が提供される。水和したゲルがアルギン酸塩である場合には、０．５〜１０％（ｗ／ｖ）、適当なものは１〜８％（ｗ／ｖ）、好ましくは２〜６％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度のアルギン酸ナトリウムの溶液を水、食塩水溶液又は組織培養培地中に調製することができる。この溶液は第１マトリックス成分の多孔の中に、すべての孔が満たされるのを保証する方法で拡散、真空注入又は遠心分離により注入することができる。アルギン酸ナトリウム溶液は、浸透性の障壁で等張食塩水溶液から分離すると顕著に膨張する。典型的には、水の取り込みの最初の４時間の間に重量で５０％の増加が起こる。このように、第１マトリックス成分の内部に取り込まれたアルギン酸ナトリウムは食塩水に浸漬することができそして第１マトリックス成分によって抵抗される物理化学的膨張圧を生じ、それによって未荷重状態の第１マトリックス成分内に張力を発生する。これは膨張に抵抗し自分自身では顕著な膨張を示さない第１マトリックス成分の能力に依存する。この能力は第１マトリックス成分の構造的組成により決定される。次いで、この複合体構築物を２価カチオンの塩を含む溶液に浸漬して、そのままの状態でアルギン酸塩の架橋を誘導し水和したゲルを形成させることができる。最も好ましい架橋溶液としては、１０〜５００ｍＭ、適当なものは２５〜２５０ｍＭ、好ましくは５０〜１５０ｍＭの範囲の濃度の塩化カルシウムが挙げられる。この方法で、アルギン酸塩ゲルは第１マトリックス成分の多孔の内部に固定化することができる。この細胞は幾つかの方法でこの構築物の中に取り込むことができる。その方法としては、第１マトリックス成分に直接接着する方法、第１マトリックス成分内への注入の前に又は第１マトリックス成分に細胞を接着する前に第２マトリックス成分の溶液に細胞を添加する方法、及び第２マトリックス成分内に細胞を固定化し構築物内に異なる形態を持つ細胞の二つの亜集団を形成させる方法が挙げられる。第１マトリックス成分への細胞の直接接着は、適当に調製された第１マトリックス成分の１片に培地中の細胞懸濁液を添加することにより達成することができる。第１マトリックス成分の多孔の中へ細胞懸濁液を注入すると、細胞はその孔に引き寄せられ、その後その第１マトリックス成分のポリマー表面上に接着しそして広がることができる。この細胞は平らな又は伸びた形態をとることができる。適当な組織培養培地中でその後培養すると、その細胞の増殖と移動が起こり、第１マトリックス成分の全表面を覆う細胞の均一な被覆の形成に至ることができる。細胞が第１マトリックス成分に接着した後のどの段階でも第２マトリックス成分の注入及び架橋を行うことができる。第１マトリックス成分中への注入の前に第２マトリックス成分の溶液に細胞を添加するときは、注入が第２マトリックス成分と結合している第１マトリックス成分の多孔性構造内にその細胞を引き入れるとき、その細胞のマトリックスへの取り込みが達成される。この細胞は、第２マトリックス成分を架橋した後、水和したゲル内に固定化されるようにできる。それにより、この細胞は丸い形態を保持し、そして第１マトリックス成分に直接接着していない状態に留まる。第１マトリックス成分への細胞の一定の割合の接着及び第２マトリックス成分内の細胞の固定化は、構築物内に異なる形態を持った細胞の二つの亜集団を形成させることができる。また、関節軟骨の表面ゾーン及び深部ゾーンから単離された細胞などの細胞の増殖させた亜集団を、移植体の異なるゾーン内の片方又は両方のマトリックス成分中に接種することができる。この構築物は細胞接種後に直接移植することができ又は細胞を含む構築物は移植前に細胞による細胞外マトリックス成分の合成及び細胞の増殖を可能とするため組織培養中で維持することができる。規定された荷重計画は実施例に記述したように特別に設計された技法を用いて培養相の間に構築物内の細胞に適用することができる。第２及びそれ以後の側面の好ましい特徴及び特性は、必要な変更を加えて、第１の側面に対するものと同様である。本発明は併記する実施例及び図面を参照しながら実例を使用してここに記述する。これらは例示の目的で提供するものであり、いずれも本発明について制限するものと解すべきではない。下記の記述では、参照は図面の番号に対してなされる。図１は、カスティング後直ちに固定し、半月繊維軟骨細胞を接種したコラーゲンゲルから調製し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した切片の顕微鏡写真を示す。倍率は×２５０。図２は、ウシ軟骨細胞を接種し１４日培養したコラーゲンスポンジ構築物から調製し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した切片の顕微鏡写真を示す。倍率は×２５０。図３は、ウシ軟骨細胞を接種し７日間培養したアルギン酸塩構築物から調製し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した切片の顕微鏡写真を示す。倍率は×２５０。図４は、ウシ軟骨細胞を接種し３日間培養したアガロース構築物から調製し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した切片の顕微鏡写真を示す。倍率は×２５０。図５は、半月繊維軟骨細胞を接種し３日間培養したコラーゲンゲル／アルギン酸塩複合体構築物から調製し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した切片の顕微鏡写真を示す。倍率は×５００。図６は、軟骨細胞を接種し１日培養したコラーゲンスポンジ／アルギン酸塩複合体構築物から調製し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した切片の顕微鏡写真を示す。倍率は×２５０。図７は、軟骨細胞を接種し７日間培養したコラーゲンスポンジ／アガロース複合体構築物から調製し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した切片の顕微鏡写真を示す。倍率は×２５０。図８ａは、アガロース構築物中に接種されそして種々の振動数の１５％の総圧縮歪みを４８時間かけられた軟骨細胞によるグリコサミノグリカン合成を表すグラフを示す。数値は歪みを与えなかった対照レベル（１００％）に正規化された。図８ｂは、アガロース構築物中に接種されそして種々の振動数の１５％の総圧縮歪みを４８時間かけられた軟骨細胞による〔³Ｈ〕−チミジンの取り込みを表すグラフを示す。数値は歪みを与えなかった対照レベル（１００％）に正規化された。図９は、軟骨の表面ゾーン及び深部ゾーンから単離されそしてアガロース構築物中に接種されそして種々の振動数の１５％の総圧縮歪みを４８時間かけられた軟骨細胞による〔³Ｈ〕−チミジンの取り込みを表すグラフを示す。数値は歪みを与えなかった対照レベル（１００％）に正規化された。実施例（１）細胞の単離及び培養での増殖軟骨細胞は骨原性肉腫のための切断後に得たウシ軟骨か又はヒト軟骨から単離した。半月細胞は骨原性肉腫のための切断後に得たヒト膝半月から単離した。この軟骨又は半月組織を僅か２ｍｍ³のサイコロ状に切断し、続いて２０％ＦＣＳを含むダルベッコ修正イーグル培地、２％ヘペスバッファー、１％グルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（以下、ＤＭＥＭと呼ぶ）中３７℃で１時間、１％（ｗ／ｖ）プロナーゼ（ＢＤＨリミティッド、プール、英国）で消化し、ＤＭＥＭ＋２０％ＦＣＳ中、３７℃で２時間、コラゲナーゼタイプ１Ａ（シグマ）で消化した。この酵素濃度（ｉ．ｕ．／ｍｌ）はコラゲナーゼの新たなバッチ毎に最適化する。破砕物はナイロン篩（ファルコン７０μｍポアサイズ）を通す濾過により培地中の細胞から除去し、そして細胞を１０００×ｇで５分間遠心分離により分離した。この細胞ペレットをＤＭＥＭ＋２０％ＦＣＳで２回洗浄し、適当量の培地に再懸濁した。細胞密度及び生存率はトリパンブルー排除テストにより測定した。必要なときは、細胞集団を反復継代により所望の数まで増殖させる。細胞は組織培養フラスコ中、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中、３７℃／５％ＣＯ₂で、２日毎に培地を交換して、単層として培養する。全面を覆った時に、０．２％トリプシン／ＥＤＴＡで細胞を剥がしそしてさらに培養するため３個のフラスコに分割する。実施例（２）コラーゲンゲル中への繊維軟骨細胞の接種ヒト繊維軟骨細胞を接種したコラーゲンゲルは、１２ｍｌの２倍強度のダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ、ギブコ、ペイスリー、ＵＫ）、３ｍｌの細胞懸濁液（ＤＭＥＭ中、１×１０⁶細胞／ｍｌ）、３ｍｌのウシ胎児血清（ＦＣＳ、ギブコ、ペイスリー、ＵＫ）、３ｍｌの０．１ＭのＮａＯＨ、及び９ｍｌのコラーゲン溶液（０．５Ｍ酢酸中、３ｍｇ／ｍｌコラーゲンタイプＩ、ＩＣＮ、ペイスリー、ＵＫ）を混合することにより調製した。全ての成分を混合の間４℃に維持した。この溶液の一部（１．５ｍｌ）をウエルに添加し、３７℃／５％ＣＯ₂ で３０分間ゲル化させた。このゲルをＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋１５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸塩中、３７℃／５％ＣＯ₂で維持し、２日毎に培地交換を行った。細胞に誘導されたゲルの収縮が最初の３日間の間に起こった。組織学的検査により、図１に示すように、組織化されていない繊維状コラーゲンマトリックス内に均等に分布した典型的な繊維芽状の形態を持った細胞の存在が明らかになった。実施例（３）コラーゲンスポンジ上への軟骨細胞の接種ウシ軟骨細胞を吸収によりコラーゲンスポンジの上に接種した。厚さ３ｍｍ、Ａ）の円筒に切断した。１．５×１０⁷細胞／ｍｌを含む培地（１００μｌ）をこの乾燥マトリックスの表面に滴下により添加するか又はこのスポンジを細胞を含む培地に浸漬した。細胞を含むこのスポンジをＤＭＥＭ＋２０％ＦＣＳ中で２４日まで培養し、２日毎に培地交換を行った。ヘマトキシリンとエオシンの染色を用いる組織学的検査により、スポンジマトリックス内に軟骨細胞の塊の存在が明らかになった。図２に示すように、大多数の細胞は丸い形態を示したがある割合で平らな形状又は繊維芽状の形のものが存在した。その密度は均一ではなく、スポンジの周辺で細胞は最大の割合を示した。細胞の周りのマトリックスに豊富なプロテオグリカン合成の証拠に注目された。実施例（４）アルギン酸塩中に軟骨細胞の接種イーグル緩衝化塩溶液（ＥＢＳＳ）中の４％（ｗ／ｖ）アルギン酸塩（ケルコ・インターナショナル・リミティッド、ウォーターフィールド、タドワース、サリー、ＵＫ）の等量を２０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中の１．６×１０⁷細胞／ｍｌと混合し、穏和に攪拌した。アルギン酸塩懸濁液の架橋はＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中の１００ｍＭのＣａＣｌ₂溶液に対して透析することにより行った。架橋したゲル構築物をＤＭＥＭ＋２０％ＦＣＳ＋１５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸塩中で２４日まで培養し、２日毎に培地交換を行った。培養６日後にアルギン酸塩ゲル内の軟骨細胞のある割合は増殖し、図３に示すように小さな塊を形成した。この細胞はその元の丸い形態を保持し、そして軟骨のマトリックスの「光輪」を合成した。実施例（５）アガロース中への軟骨細胞の接種２×１０⁷細胞／ｍｌを含む細胞懸濁液の調製の間に、蒸留水中のアガロース（タイプVII、シグマ、プール、英国）の６％懸濁液をオートクレーブにより溶解し、続いて３７℃に冷却した。等量のアガロースに軟骨細胞懸濁液を添加し、最終濃度を３％アガロース中１×１０⁷細胞／ｍｌとした。このアガロース懸濁液を組織培養皿中に平板とし、４℃で２０分間ゲル化した。５ｍｍ直径×５ｍｍ高さの円筒構築物を形成し、ＤＭＥＭ＋２０％ＦＣＳ＋１５０μｇアスコルビン酸塩の中で２４日まで培養した。ヘマトキシリンとサフラニン−Ｏの染色を用いる組織学的検査により、図４に示すように、丸い形態を持った細胞の均等な分布の存在が明らかになった。３日後に、軟骨のマトリックスの顕著な「光輪」が細胞の周りに存在した、そして６日後には増殖による細胞の塊が注目された。実施例（６）拡散法による二成分構築物の調製繊維軟骨細胞を接種したコラーゲンゲルを実施例２に記述したように調製し、そして２４時間培養した。このゲルをＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ：ＥＢＳＳ（１：１）中の２％（ｗ／ｖ）アルギン酸塩の懸濁液中に置いた。このアルギン酸塩をＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中の１００ｍＭＣａＣｌ₂溶液に対して透析することにより架橋した。この構築物をＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋１５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸塩中で２４日まで培養し、２日毎に培地交換を行った。組織学的検査により、図５に示すようにこの複合体の全体にわたって繊維芽状の形態を持つ均等に分布した細胞の存在が明らかになった。アルギン酸塩含量は構築物の周辺でより大きな濃度を持ち不均一であった。前培養をし又はしていないコラーゲンスポンジに、ＤＭＥＭ＋２０％ＦＣＳ：ＥＢＳＳ（１：１）中の１．５×１０⁷軟骨細胞／ｍｌを含む２．０％（ｗ／ｖ）のアルギン酸塩又はＤＭＥＭ＋２０％ＦＣＳ：ＥＢＳＳ（１：１）中の４×１０⁶細胞／ｍｌを含む２％（ｗ／ｖ）アガロースタイプVIIをスポンジの表面に滴下により添加してしみ込ませた。この構築物をＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中の１００ｍＭのＣａＣｌ₂溶液に漬けることにより、このアルギン酸塩を架橋した。アガロースを含む構築物は４℃で３０分間インキュベートすることによりゲル化した。これらの構築物をＤＭＥＭ＋２０％ＦＣＳ＋１５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸塩中で２４日まで培養し、２日毎に培地交換を行った。アガロースと関連した細胞は図６に示すように、コラーゲンスポンジの多孔性ミクロ構造内に均等に分布していることが見出されそして丸い形態を示した。その細胞の周りには軟骨マトリックスの生産の証拠が存在した。実施例（７）真空注入による二成分構築物の調製細胞の前培養をしまたはしていない６ｍｍ直径のコラーゲンゲル又はスポンジ、１．５×１０⁷細胞／ｍｌを含むＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ：ＥＢＳＳ（１：１）中の２％（ｗ／ｖ）アルギン酸塩１００μｌでそのコラーゲンゲル又はスポンジの上部を層状に覆った。そのコラーゲンゲル又はスポンジの中にアルギン酸塩と細胞が取り込まれるように穏和に減圧した。アルギン酸塩の架橋は、この構築物をＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中の１００ｍＭのＣａＣｌ₂溶液に漬けることにより行った。細胞の均等な分布がコラーゲンスポンジの多孔性ミクロ構造の全体にわたって見られた。アルギン酸塩と関連した細胞も均等に分布しており、そして図７に示すように、これらの細胞は丸い形態を有していた。実施例（８）低速遠心分離による二成分構築物の調製細胞の前培養をし又はしないコラーゲンゲル又はスポンジを組織培養プレートのウエルの中に置いた。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中の４×１０⁶細胞／ｍｌを含むイーグル緩衝化塩溶液（ＥＢＳＳ）中の２％アルギン酸塩をこのコラーゲンゲル又はスポンジの上部に穏和に層状に加えた。この組織培養プレートを１００× ｇで５分間遠心分離し、アルギン酸塩及び細胞懸濁液をコラーゲンゲル又はスポンジの中に取り込ませた。アルギン酸塩の架橋は、この構築物をＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中の１００ｍＭのＣａＣｌ₂溶液に漬けることにより行った。実施例（９）二成分構築物及びそれらの成分の機械的テストこのコラーゲンゲル及び複合体の機械的特性を評価した。テスト対象である均一な孔サイズの物質それぞれを二つの大きな板の間に載せ、そしてユニバーサル・テスティング・マシーン（インストロン・モデル１１２２）を用い、１ｍｍ／分のクロスヘッド速度で圧縮した際の崩壊をテストした。物質の硬さの評価である、タンジェント係数は下記の方程式を用いて線形領域から計算した。上の方程式中、Ｆ＝圧縮力、ｔ＝物質の元の厚さ、ｄｔ＝厚さの変化、Ａ＝試料の断面積である。別のパラメータである、平衡係数は予め決められた２０％歪みで行われた荷重解除実験から計算される。コラーゲンスポンジ中に真空により注入された２％ケルトンＨＶアルギン酸塩からなる複合体構築物は、コラーゲン又はアルギン酸塩単独のいずれよりも有意に大きなタンジェント係数を持っていた。このことは表１に示すように成分間の物理化学的相互作用があることを示す。表１一成分及び二成分コラーゲン及びアルギン酸塩構築物の機械的評価実施例（１０）水和したゲル中の細胞の機械的刺激文献に記述された特別に設計された細胞加圧装置（cell straining apparatus ）（ダルテック・リミティッド、ストゥールブリッジ、ＵＫ）を用い、実施例６に記述したようなアガロース中に接種された軟骨細胞に圧縮歪みを加えた(リー，ディー．エイ．，及びベイダー，ディー．エル．、Journal of Orthopaedic R esearch 15（2）181-188(1997))。この構築物を３種の動的振動数（０．３Ｈｚ、１Ｈｚ、３Ｈｚ）で１５％の圧縮歪み振幅に付した。さらに、静止圧縮歪みも加えた。対照には歪みを与えなかった。この圧縮歪みを４８時間加え、そして歪みに対応するＧＡＧの合成、細胞の増殖及び総タンパク合成を評価した。図８ａに示すように、ＧＡＧの合成は１Ｈｚで刺激されたが、細胞の増殖は図８ｂに示すように、動的歪み計画の全てにより刺激された。実施例（１１）水和したゲル中の軟骨細胞亜集団の機械的刺激軟骨細胞をウシ軟骨の表面ゾーン及び深部ゾーンから別々に単離し、そして３％アガロース構築物内に接種した。この構築物を３種の動的振動数（０．３Ｈｚ、１Ｈｚ、３Ｈｚ）で１５％の圧縮歪み振幅に付した。さらに、静止圧縮歪みを加えた。対照には歪みを与えなかった。圧縮歪みは４８時間加え、そして歪みに応ずる細胞の増殖を評価した。細胞の増殖は図９に示すように、表面ゾーン細胞では動的歪み計画の全てにより刺激された。これと対照的に、深部ゾーン細胞は図９に示すように静止歪み計画及び動的歪み計画の両方で影響を受けなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者デイビッドアランリー英国、エイチエイ７４エルピーミドルセックス、スタンモア、ブロックリーヒル、ロイヤルナショナルオルトペディクスホスピタルトラスト、インスティチュートオブオルトペディクス (72)発明者ダニエルローレンスベイダー英国、イー１４エヌエスロンドン、マイルエンドロード、クイーンメリーアンドウエストフィールドカレッジ (72)発明者ミラデボラスティーブンズ英国、エイチエイ７４エルピーミドルセックス、スタンモア、ブロックリーヒル、ロイヤルナショナルオルトペディクスホスピタルトラスト、インスティチュートオブオルトペディクス

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも二つのマトリックス成分を含んで成る生物機械的移植体であって、その第１マトリックス成分が張力又は剪断力に耐える能力を持つ多孔性のマクロ構造を有するものであり、その第２マトリックス成分が第１成分の多孔性マクロ構造を実質的に充填しそして膨張圧を及ぼす水和したゲルであり、さらに分化した生物機械的表現型を持つ動物細胞又はこのような細胞に分化する潜在能力を有する未分化表現型を持つ動物細胞の集団を含むものである移植体。２．その移植体が、荷重及び未荷重状態の両方において主要なマトリックス成分間の、平衡を作り上げるのに十分な機械的相互作用が存在する組織に対する全部又は一部の置換体である請求項１記載の生物機械的移植体。３．その組織が軟骨、顎関節半月、膝半月又は椎骨間板を含むものである、請求項２記載の生物機械的移植体。４．その第１マトリックス成分が生物分解可能な又は生物再吸収可能なポリマーから構成されるものである、請求項１〜請求項３いずれか１項に記載の生物機械的移植体。５．その生物分解可能な又は生物再吸収可能なポリマーがコラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリ−グリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブタレート、ポリアンヒドリド又はこれらのコポリマーを含むものである、請求項４記載の生物機械的移植体。６．その生物分解可能な又は生物再吸収可能なポリマーが架橋剤により修飾されているものである、請求項４又は請求項５記載の生物機械的移植体。７．その第１マトリックス成分がヒドロキシアパタイト、フィブロネクチン、コラーゲン、ヴィトロネクチン、ヒアルロナン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン又はＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の被覆をさらに含むものである、請求項４〜請求項６いずれか１項に記載の生物機械的移植体。８．その被覆が移植体の特定の位置に限定されるものである、請求項４〜請求項７いずれか１項に記載の生物機械的移植体。９．その第１マトリックス成分が０．１〜５０μｍ、適当なものとしては１〜２５μｍ、好ましくは３〜１０μｍの範囲の溝又は微小孔を持つものである、請求項４〜請求項８いずれか１項に記載の生物機械的移植体。１０．第１マトリックス成分を形成するポリマー成分が１０〜１０００μｍ、適当なものとしては３０〜２５０μｍ、好ましくは５０〜１５０μｍの平均孔サイズ及び５０〜９８％、適当なものとしては６０〜９５％、好ましくは７０〜９０％の総多孔率を持つものである、請求項４〜請求項９いずれか１項に記載の生物機械的移植体。１１．それが織布又は不織布繊維、スポンジ、泡、又は相互連結している紐、繊維又は隣接プレートにより結合されている一連のプレート又はシートの形状である、請求項１〜請求項１０いずれか１項に記載の生物機械的移植体。１２．第２マトリックス成分を形成する水和されたゲルが水和されたポリマー性ゲルである請求項１〜請求項１１いずれか１項に記載の生物機械的移植体。１３．その水和されたポリマー性ゲルが生物分解可能な又は生物再吸収可能なものである請求項１〜請求項１２いずれか１項に記載の生物機械的移植体。１４．その水和されたポリマー性ゲルがアルギン酸塩、アガロース、カラギーナン、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、ポリエチレンオキシド又はコラーゲンモノマーを含むものである、請求項１２又は請求項１３記載の生物機械的移植体。１５．その水和されたゲルが性質上不均質である、請求項１２〜請求項１４いずれか１項に記載の生物機械的移植体。１６．その水和されたゲルが架橋されているものである、請求項１２〜請求項１５いずれか１項に記載の生物機械的移植体。１７．その水和されたゲルがコラーゲン、ヒドロキシアパタイト、成長因子、サイトカイン、細胞接着因子、化学走性因子、血管形成誘導因子又は酵素をさらに含むものである、請求項１２〜請求項１６いずれか１項に記載の生物機械的移植体。１８．移植体中の動物細胞が宿主に関して自己の、同種異系の又は異種のものである、請求項１〜請求項１７いずれか１項に記載の生物機械的移植体。１９．その細胞が軟骨細胞、繊維軟骨細胞、繊維芽細胞もしくは骨芽細胞、又はそれらの亜集団を含むものである、請求項１８記載の生物機械的移植体。２０．その細胞が組織生検由来のものである、請求項１８又は請求項１９記載の生物機械的移植体。２１．損傷した結合組織を修復する方法であって、請求項１〜請求項２０いずれか１項に記載の生物機械的移植体で損傷した組織を全部又は一部置換する工程を含むものである方法。２２．損傷した結合組織の修復のための生物機械的移植体の調製における、少なくとも二つのマトリックス成分及び動物細胞集団の使用であって、その第１のマトリックス成分が張力又は剪断力に耐える能力を持つ多孔性のマクロ構造を有するものであり、その第２マトリックス成分が第１成分の多孔性マクロ構造を実質的に充填しそして圧縮性荷重に耐える能力を持つ水和したゲルであり、そしてその動物細胞集団が分化した生物機械的表現型を持つ細胞又はこのような細胞に分化する潜在能力を有する未分化表現型を持つものである使用。２３．修復されるべき組織が軟骨、顎関節半月、膝半月又は椎骨間板である、請求項２２記載の使用。２４．損傷した結合組織の修復のための生物機械的移植体の調製における同時、別々又は逐次使用のための複合調製物としての、少なくとも二つのマトリックス成分を含んで成る生物機械的移植体であって、その第１マトリックス成分が張力又は剪断力に耐える能力を持つ多孔性マクロ構造を有するものであり、その第２マトリックス成分が第１成分の多孔性マクロ構造を実質的に充填しそして圧縮性荷重に耐える能力を持つ水和したゲルである移植体であって、分化した生物機械的表現型を持つ動物細胞又はそのような細胞に分化する潜在能力を有する未分化表現型を持つ動物細胞の集団を付加的に含むものである生物機械的移植体。２５．請求項１〜請求項２０いずれか１項に記載の生物機械的移植体の製造方法であって、下記の工程、すなわち（ａ）水和したゲルの未架橋前駆体の溶液を第１マトリックス成分中に注入する工程、（ｂ）このゲルをそのまま架橋させて第２マトリックス成分を形成させる工程、（ｃ）そのマトリックスに細胞を組み込む工程、及び（ｄ）機械的荷重を加える工程、を含んで成る方法。２６．水和したゲルの未架橋前駆体が拡散、真空注入又は遠心分離により第１マトリックス成分内に注入されるものである、請求項２５記載の方法。２７．（ｉ）第１マトリックス成分への直接接着により、（ii）第１マトリックス成分内への注入の前に第２マトリックス成分の溶液に細胞を添加することにより、(iii)第１マトリックス成分への細胞の接着及び第２マトリックス成分内での細胞の固定化により、細胞がマトリックス内に組み込まれるものである、請求項２５又は請求項２６記載の方法。