JP4958777B2 - 物理的/物理化学的刺激により処理される非晶質細胞送達ビヒクル - Google Patents
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Description
本発明は、機能的組織工学の分野に関する。さらに詳細には、本発明はいくつかの態様において、損傷を受けた組織の交換または修復部位に用いるのに適した組織の再生に有用な、インビトロ培養法およびその産物に関する。
生体の損傷を受けた組織または病原部を回復させる、種々の方法がある。1つの方法は、損傷を受けた組織または病原部を、生体組織以外の物質(例えば、プラスチック、金属、および/またはセラミック)で置き換えて、この損傷を受けた組織または病原部を回復させるものである。別の方法は、損傷を受けた組織または病原部を、他の個体または他の動物に由来する器官、あるいは生体の別の部位に由来する器官(例えば、皮膚)と置き換えるものである。これらの方法は、非生体組織の物理的磨耗およびずれ、ならびに特定の目的のための生体組織の入手可能性または適合性を含めた、特定の欠点を有し得る。第3の方法は、インビトロで新たに生命維持に必要な組織を生成するものである。
機能的組織工学の主要な目標は、損傷を受けた組織を修復または交換する新組織(細胞構築物)の開発である。整形外科用途については、移植物が体重負荷、関節荷重、および伸張に耐えなければならないので、剛性および堅さは、損傷を受けた組織の交換のために重要である。本発明は、3つの主要な構成要素である分解性キャリア、半透膜、およびバイオリアクター(とりわけ、培養中の細胞に静水流体圧を適用するもの)を用いてこれらの問題を解決する、新しい系に関する。
本発明は、新しい組織(例えば、軟骨)を成長させる方法、およびそのための組成物、ならびに被験体における損傷を受けた組織を処置するために上記の新しい組織組成物を使用する方法を提供する。
他に規定しない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同様の意味を有する。
1つの態様において本発明は、インビトロで細胞を培養する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、インビトロ培養のために選択された細胞集団を、生分解性の非晶質キャリアと接触させる工程、この接触させた細胞集団を、細胞を収容するための細胞空間(この細胞空間は、100kDaよりも大きく1,000kDa未満の分子量カットオフを有する半透膜で少なくとも一部が囲まれている)に配置する工程、およびこの接触させた細胞集団に周期的に圧力をかける工程を包含する。この方法は、特にECMを産生する細胞に使用するために、既存のインビトロ培養法よりも優れたいくつかの利点を有する。これらの利点としては、ECM産生を増大させる能力、その生体力学的特性に関して天然の組織によりよく似た組織を産生する能力、高分子量ECM成分の選択的保持、および直接流体剪断応力からの細胞の保護が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のインビトロ培養法を実施するのに有用な装置は、米国特許第6,432,713号(その内容全体が、参考として本明細書中に援用される)に開示される。手短に言うと、米国特許第6,432,713号に開示されるように、本発明に従って細胞または組織を培養するための装置は、細胞または組織をその中に含む培養チャンバーを備え、かつ、培地を供給する、培養ユニット(培養回路ユニット)、該培養チャンバー内の細胞または組織に圧力を適用するための加圧手段(加圧装置)、および該培養ユニットに断続的または連続的に培地を供給するための培地供給手段(培地供給装置)を備えることを特徴とする。
特定の態様において本発明は、本発明のインビトロ培養法によって生成される組成物を提供する。これらの組成物は一般に、インビトロで増殖させた細胞集団を含み、この細胞集団は、生分解性の非晶質キャリアと接触し、そして少なくとも一部が半透膜で囲まれた細胞空間内に含まれる。本発明の組成物は、本発明の臨床的方法に(例えば、被験体における損傷を受けた組織を処置するために)用いられ得る。
本発明はまた、被験体における損傷を受けた軟骨組織を処置する方法も提供する。この方法としては、患者における損傷を受けた関節軟骨表面を処置する方法が挙げられる。概括的に言えば、この方法は、損傷を受けた軟骨組織の部位または損傷を受けた関節軟骨表面への本発明の細胞/マトリックス組成物の有効量を導入する工程を含み、この導入された細胞/マトリックス材料は、生命維持に必要であり、損傷を受けた組織に置き換わって生移植片として留まることにより、損傷を受けた組織を処置する。骨格構造がある組成物とは異なり、本発明の細胞/マトリックス組成物は、それ自体に固有の3次元形状がないので、充填されるべき組織欠損によって規定される形状に容易に合わせられる押し出し成形可能な生成物として、組織空間内に導入され得る。
(細胞または組織を培養するための装置)
本発明のインビトロ培養法に用いるのに適した静水圧/灌流培養系(バイオリアクター)を図1に示し、これは米国特許第6,432,713号(その内容全体が、参考として本明細書中に援用される)に記載される。生分解性の非晶質キャリア中における細胞の培養のための半透膜の袋の使用を示す概略図を図2に示す。細胞および生分解性の非晶質キャリアを含む半透膜の袋を培養チャンバー内に配置し、1〜6週間以上の培養期間の間、水平に保ち、かつ、37℃に維持する。
(インビトロでの静水圧適用後の半透膜の袋内の生分解性ポリマーを用いた分子マーカーの物質移動の評価)
静置培養条件ならびに種々の大きさおよび周期の流体圧で、非晶質の細胞キャリア中の分子マーカーの半透膜を介する物質移動を評価するために実験を行った。軟骨ECMは高い分子量を有し、半透膜の袋内に留まる。分解された細胞キャリア残屑(小分子)および代謝廃棄物は、媒体相中に浸出する。静置条件下では、栄養分はフィックの法則に従って袋に浸透し得る。さらに、バイオリアクターを用いて、静水流体圧、媒体流量を規定し、かつ酸素/二酸化炭素濃度を制御して、物質移動を操作する。物質移動のモデルとして分子量マーカーを用いて、一連の実験条件下での物質移動を評価する(表1):0.3%の中性化I型コラーゲン(Vitrogen,Cohesion)、PEG(Coseal,Baxter)、および補充されたヒアルロナン(Smith&Nephew)は、規定された分子量カットオフ(MWCO)サイズの半透膜の袋内に存在する可能性のある細胞キャリアとして評価される。分子量マーカーである少なくとも70kDa、250kDa、および500kDaの蛍光FITC−またはローダミン−デキストラン(Sigma)をキャリアに添加する。硫酸化GAG(S−GAG)は極めて負に帯電しているので、FITC−デキストラン(酸性pI)マーカーを用いて荷電分子を模倣する。マーカー/キャリアを半透性の袋(内径1mm、外径1.2mm、長さ10mm)の中に注入する。この袋をヒートシールし、そして静置条件下で(すなわち、周囲圧力で)、または静水圧をかけて、インキュベートする。これらの袋を、1時間、3時間、12時間、24時間、48時間、および74時間で収集する。次いで、サンプル(マーカー/キャリア材料)をこれらの袋から単離する。サンプルの蛍光強度および容量を測定する。あるいは、膜をポリ−L−リジンでコーティングして、膜の正電荷を増加させる。これにより、負に帯電した軟骨ECMの捕捉効率を変化させ得る。
(半透膜の袋の中の物質移動および非晶質の細胞キャリアの分解に対する静水流体圧の影響)
生分解性の非晶質ポリマー(ヒドロゲルまたはゾル/ゲル可逆性ポリマー)を、組織培養系を用いた規定の細胞培養条件で試験する。半透膜の袋を用いて、細胞構築物および軟骨細胞によって産生された大きな分子量の細胞外マトリックス産物を保持する。袋の性能を、0〜0.5Hzで0〜5MPaの範囲の静水流体圧(HFP)下で、100〜500kDaの分子量カットオフサイズに従って分析する。試験キャリアを袋に注入し、分解速度論に関して評価する。100〜500kDaの範囲の蛍光分子トレーサー(例えば、デキストラン−FITC)をマーカーとして使用する。蛍光強度を、蛍光励起および検出のために適切に選択された波長を用いて、蛍光測定器で測定する。予備研究によれば、デキストラン−FITCは500kDaでは天然の軟骨に浸透しないことが観察された(図3)。従って、500kDa未満の分子マーカーが、本実験で使用するのに適している。
(髄核細胞および軟骨細胞による半透性の袋の中での細胞増殖およびECM産生に対する静水流体圧の影響)
ウサギ髄核(NP)由来細胞および廃棄されたヒト椎間板(hIVD)組織を用いて、細胞実験を行う。2〜4週齢の屠殺されたばかりのウサギを、地元の食肉処理場(USDA認可)から購入する。NPおよび線維輪(AF)を腰部IVDから採取する。NP由来細胞およびAF由来細胞を別々に酵素的に単離する。単離したNP細胞およびAF細胞を通常の培養皿に播種して、細胞数を増加させる。全ての組織について表現型を維持するために、継代数を最小限にする。
(事前に選択した大きさの静水圧での半透膜内の非晶質キャリア中の軟骨形成活性の評価および静水圧についてのアルゴリズムの決定)
本実施例は、事前に選択した大きさの静水圧での半透膜内の非晶質キャリア中の軟骨形成活性(細胞の生存、増殖、表現型)を調べ、静水圧についてのアルゴリズムを決定する。新たに合成されたECM(主に、軟骨細胞に特異的なプロテオグリカン、またはアグリカン)の分子量は、2〜3×103kDaである。II型コラーゲン線維の長さは500nmである。ECMは、半透膜の袋内に保持される。軟骨細胞は、新たに合成されたECM内に包埋され、そして袋(実施例2の規定されたカットオフサイズ)の中に効率的に保持されるキャリア材料が選択される。物理的刺激(静水流体圧およびその静置条件でのアルゴリズム;媒体流速)を操作することにより、細胞の活性(細胞の生存および増殖ならびに形質発現)を変化させる。最適な物理的刺激下では、軟骨細胞は、インビトロで新たに再生プロセスを開始する。本実施例は、前述の生物学的マーカーを用いて最適培養条件を規定する。
(半透膜の袋の中で培養され、物理的刺激を用いて操作される、注射可能な軟骨細胞/マトリックスの開発)
中心的な方法論は、非晶質細胞キャリア、すなわち0.3%コラーゲンゲル(Cohesion)、PEG系止血剤(COSEAL(商標),Baxter)、および1.2%アルギン酸カルシウムゲル(Inotech)を用いて試験した。ウシ関節軟骨細胞をキャリアと懸濁し、半透膜の袋(PVDF、内径1mm、外径1.2mm、MWCOサイズ:500kDa)の中に導入した。この袋の中の細胞/ゲルキャリアは、静圧(周囲圧力)で(0.7MPaにて0.1Hzで4時間の周期的な静水流体圧の後に20時間休止するか、または0.7MPaにて4時間の一定の静水圧の後に20時間休止して)1週間インキュベートした。培養中のウシ関節軟骨細胞は、S−GAGを産生し、コラーゲンゲルおよびアルギン酸ゲル中にマトリックスを蓄積した(図4)。
(半透膜の袋の電荷変更)
実施例3の予備的結果から、天然の関節軟骨への分子トレーサーの浸潤が制限されることが示された。浸潤は、蛍光マーカーのpIおよび長期的な組織形態学に依存した。これらのデータは、細胞外マトリックス(ECM)の蓄積を制御することが可能であることを示す。軟骨細胞が高度に硫酸化されたECMを首尾良く産生する場合、このECMは袋内に蓄積する。電荷変更は、選択的な分子透過性を制御するのに用いられ得る。例えば、膜をポリ−L−リジンでコーティングして、正に帯電した表面を作製する。
(半透膜の袋の中で培養され、物理的刺激を用いて操作された、注射可能な自己軟骨細胞/マトリックスを用いる外科処置)
この外科的アプローチは、注射可能な細胞/マトリックスを用い、全組織置換の代わりに自己回復プロセスおよびインビトロ細胞処理に依存する。この修復技術は、組織自体の表面再生能力(resurfacing ability)を用いて、損傷の部位に軟骨の表層を作製する。一旦、表層が移動細胞で形成されると、軟骨細胞(軟骨細胞自体のマトリックスを含む)を新しい表面の下に注射し、欠損を充填した。この外科的アプローチにより、より侵襲性の高い外科的方法の代わりに関節鏡検査を用いることが可能になる。実施例1〜7の方法を用いて開発された最適な培養方法に基づいて、物理的刺激によって処理された注射可能な細胞/マトリックスは、新たな軟骨の再生を促進する。インビトロで細胞/マトリックス構築物を形成するために、効率的なECM蓄積のために半透膜の袋を使用し、非晶質細胞キャリアを選択し、そして物理的刺激のアルゴリズムを規定することによる、一連のインビトロ培養方法論が開発されている(図6)。この手順は、以下の3つの工程を包含する:
1)軟骨細胞を単離し、損傷を受けた欠損を浄化し、この欠損をフィブリン接着剤で充填する。
2)単離細胞を増殖させ、実施例1のバイオリアクターを用いた培養において最適な物理的刺激にて半透膜の袋内で非晶質ゲルとともにインキュベートする。
3)新しい被覆である軟骨の表層または表在性の移行帯と軟骨下骨との間に細胞/マトリックスを注入する。
以上に記載の明細書は、当業者が本発明を実施することができる程度に十分に記載されているとみなされる。本発明は、提示された実施例によって範囲を限定されるものではない。なぜなら実施例は、本発明の1つの態様の単一の例示であって、他の機能的に等価な実施形態が、本発明の範囲内にあることが意図されるからである。本明細書中に示しかつ記載したものに加えて、本発明の種々の改変が、前述の説明によって当業者には明らかとなり、かつ、添付の特許請求の範囲内にある。本発明の利点は、本発明の各実施形態に必ずしも含まれるわけではない。
Claims (24)
- インビトロで細胞を培養する方法であって、以下の工程:
インビトロ培養のために選択された細胞集団を、生分解性の非晶質キャリアと接触させる工程;
該接触させた細胞集団を、100kDaよりも大きく1,000kDa以下の分子量カットオフを有する半透膜で少なくとも一部が囲まれている、細胞を収容するための細胞空間に配置する工程;および
該接触させた細胞集団に周期的に圧力をかける工程
を包含する方法。 - 前記細胞が、軟骨細胞および必要に応じてその前駆細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、本質的に軟骨細胞からなる、請求項1に記載の方法。
- 前記生分解性の非晶質キャリアが、I型コラーゲンを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記生分解性の非晶質キャリアが、デキストラン、コンドロイチン硫酸、ポリエチレングリコール、ヒアルロナン、およびその任意の組み合わせから選択されるヒドロゲルを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞を収容するための細胞空間が、該細胞を収容するための少なくとも1つの閉鎖可能な開口部を含む半透膜チューブからなる、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞を収容するための細胞空間が、該細胞を収容するための閉鎖可能な開口部を含む半透膜の袋からなる、請求項1に記載の方法。
- 前記半透膜が、少なくとも200kDaの分子量カットオフを有する、請求項1に記載の方法。
- 前記半透膜が、少なくとも250kDaの分子量カットオフを有する、請求項1に記載の方法。
- 前記半透膜が、少なくとも500kDaの分子量カットオフを有する、請求項1に記載の方法。
- 前記半透膜が、1,000kDaの分子量カットオフを有する、請求項1に記載の方法。
- 前記半透膜が、正味の正電荷を有する半透膜である、請求項1に記載の方法。
- 前記正味の正電荷を有する半透膜が、ポリ−L−リジンでコーティングされた半透膜である、請求項12に記載の方法。
- 前記周期的に圧力をかける工程が、0.001〜1Hzで0.5〜3.5MPaの圧力をかける工程を包含する、請求項1に記載の方法。
- 生分解性の非晶質キャリアと接触させた、インビトロで増殖させた細胞集団を含む、組成物であって、該細胞およびキャリアが、該細胞を収容するための細胞空間に含まれ、該細胞空間が、100kDaよりも大きく1,000kDa以下の分子量カットオフを有する半透膜で少なくとも一部が囲まれており、該キャリアおよび該半透膜が該組成物の構成要素である、組成物。
- 前記細胞が、軟骨細胞および必要に応じてその前駆細胞を含む、請求項15に記載の組成物。
- 前記細胞が、本質的に軟骨細胞からなる、請求項15に記載の組成物。
- 前記生分解性の非晶質キャリアが、I型コラーゲンを含む、請求項15に記載の組成物。
- 前記生分解性の非晶質キャリアが、デキストランビーズを含む、請求項15に記載の組成物。
- 前記生分解性の非晶質キャリアが、デキストラン、コンドロイチン硫酸、ポリエチレングリコール、ヒアルロナン、およびその任意の組み合わせから選択されるヒドロゲルを含む、請求項15に記載の組成物。
- 前記半透膜が、少なくとも200kDaの分子量カットオフを有する、請求項15に記載の組成物。
- 前記半透膜が、少なくとも250kDaの分子量カットオフを有する、請求項15に記載の組成物。
- 前記半透膜が、少なくとも500kDaの分子量カットオフを有する、請求項15に記載の組成物。
- 前記半透膜が、1,000kDaの分子量カットオフを有する、請求項15に記載の組成物。
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