KR102110252B1 - 가압환경 세포의 배양 장치 및 배양 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 가압환경 세포의 배양 장치 및 배양 방법에 관한 것으로서, 특히, 스테이지 상에 배치된 가압환경 세포가 담긴 디쉬(dish) 및 상기 디쉬에서 배양되는 상기 가압환경 세포를 기 결정된 압력으로 가압하는 트랜스웰(transwell)을 포함하고, 상기 트랜스웰은, 중공이 형성된 챔버, 상기 챔버의 중공 중 상측에 구비되고 다공성 막으로 이루어진 멤브레인(membrane) 및 상기 멤브레인의 하단부 부착된 알기네이트 하이드로겔을 포함함으로써, 가압환경 세포의 탈분화를 방지하면서도 재분화를 동시에 달성하여 관절 연골과 같은 가압환경 세포 배양의 범용적인 플랫폼을 제공하는 이점을 제공한다.

Description

가압환경 세포의 배양 장치 및 배양 방법{CULTURING DEVICE FOR CELL UNDER COMPRESSED CIRCUMSTANCE AND CULTURING METHOD FOR THE SAME}
본 발명은 가압환경 세포의 배양 장치 및 배양 방법에 관한 것이다.
일반적으로 관절 연골은 인체 상에서 지속적으로 가압을 받는 환경에 적응하여 관절의 운동 시 충격을 흡수하도록 함과 동시에 관절의 마모를 방지하는 역할을 한다. 이런 의미에서 관절 연골을 이루는 세포는 '가압환경 세포'로 정의될 수 있다.
관절 연골은 그 치유(Repair)와 재생(Regeneration)은 극히 제한적이고, 관절 연골 손상과 관절염은 다빈도 근골격계 질환에 속한다. 근골격계 질환을 앓는 질환자를 치유하기 위한 방법으로, 미세천공술 등의 관절경 수술, 세포치료제, 인공관절 치환술 등의 치료가 시도되고 있지만 연골 재생을 위한 근복적 치료의 근거는 매우 빈약한 상태이다.
특히, 관절 연골을 치유하기 위하여 각광받았던 줄기세포 치료제의 경우 최근 부작용 조사 결과에 의하여 치료제 개발업체의 판매취소가 있는 한편, 줄기세포 치료제의 경우 세포 성장이 더딘 문제점이 있다.
또한, 신체의 동일 연골 세포를 떼어내어 치료 부위를 미세천공한 후 이식하는 미세천공술의 경우 그 이식 과정이 매우 어려운 문제점이 있다.
방향성 있는 세포의 성장 및 성장 속도의 증가를 위해 세포 패터닝 기술을 이용하여 세포를 어레이화 및 소형화하려는 노력이 진행 중이다. 세포 패터닝 방법은, 금속이나 플라스틱과 같은 2차원 표면을 포토리소그래피(photolithography) 또는 소프트 리소그래피(soft lithography)를 이용하여 마이크로패터닝하고, 패터닝된 표면 위에서 세포를 배양하여 세포의 성장 및 배양을 제어하는 마이크로컨택트 프린팅(microcontact printing) 방법이 널리 이용되고 있다.
그러나, 관절 연골과 같은 가압환경 세포의 경우, 신체 내에서 지속적인 가압 조건을 받는 세포인데, 상술한 2차원 표면에서 배양하게 되면 키우는 과정 동안 연골 세포 고유의 성질이 섬유질화되는 이른바 탈분화 현상이 발생할 우려가 있다.
본 발명의 목적은, 가압환경 세포의 탈분화 억제 및 재분화를 촉진시킬 수 있는 가압환경 세포의 배양 장치 및 배양 방법을 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은, 코중격 연골 세포를 무릎 연골 치유를 위한 이식 세포로 사용하는 것과 같이, 채취가 용이한 신체의 어느 일부의 연골 세포를 채취한 후 배양하되, 연골 세포 고유의 기능을 유지한 채로 신체의 다른 일부의 근골격계 질환의 치유를 가능하게 하는 효과를 가진다.
본 발명의 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재들로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 가압환경 세포의 배양 장치는, 스테이지 상에 배치된 가압환경 세포가 담긴 디쉬(dish) 및 상기 디쉬에서 배양되는 상기 가압환경 세포를 기 결정된 압력으로 가압하는 트랜스웰(transwell)을 포함하고, 상기 트랜스웰은, 중공이 형성된 챔버, 상기 챔버의 중공 중 상측에 구비되고 다공성 막으로 이루어진 멤브레인(membrane) 및 상기 멤브레인의 하단부에 부착된 알기네이트 하이드로겔을 포함한다.
여기서, 상기 트랜스웰은, 상기 챔버의 하부에서 하측으로 연장 형성되고, 상기 디쉬 내부의 바닥면에 지지되는 적어도 2 이상의 받침 레그를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 트랜스웰은, 상기 챔버의 하부에서 하측으로 연장 형성되고, 상기 디쉬 내부의 바닥면에 지지되는 링 형상의 받침대를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 알기네이트 하이드로겔은, 상기 가압환경 세포의 배양을 위해 투입되는 수분 또는 배양액을 함유하는 다공성 구조를 가질 수 있다.
또한, 상기 알기네이트 하이드로겔은, 상기 가압환경 세포의 배양을 위해 투입되는 수분 또는 배양액을 함유한 상태에서 상기 가압환경 세포를 상기 기 결정된 압력으로 가압하기 위한 무게를 가질 수 있다.
또한, 상기 기 결정된 압력은, 상기 가압환경 세포의 탈분화 억제 및 재분화가 동시에 가능한 압력으로 설정될 수 있다.
또한, 상기 기 결정된 압력은, 상기 받침 레그 또는 상기 받침대의 상하 높이 또는 상기 알기네이트 하이드로겔의 농도에 의하여 조절 가능할 수 있다.
또한, 상기 가압환경 세포는, 신체의 관절 부위에 배치되어 지속적인 소정 압력 이상을 전달받는 연골 세포 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
또한, 상기 가압환경 세포는, 코중격 연골 세포를 포함할 수 있다.
또한, 상기 스테이지 상에 배치되고, 상기 트랜스웰을 상하로 이동시키되 상기 기 결정된 압력으로 상기 가압환경 세포를 가압하도록 이동시키는 가압부를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 가압부는, 상기 스테이지 상에 수직되게 배치된 승강대를 따라 상하 승강되게 구비될 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 가압환경 세포의 배양 방법은, 피시술자의 신체 중 어느 일부에서 이식할 가압환경 세포를 채취하는 채취 과정, 상기 채취 과정에서 채취된 상기 가압환경 세포를 수분 또는 배양액이 담긴 디쉬(dish)의 바닥면에 배양시키는 배양 과정, 상기 가압환경 세포의 상기 배양 과정 도중 하부에 상기 수분 또는 배양액을 함유 가능한 알기네이트 하이드로겔을 포함하는 트랜스웰(transwell)을 이용하여 상기 가압환경 세포를 기 결정된 압력으로 가압하는 가압 과정을 포함한다.
여기서, 상기 가압 과정에서의 상기 기 결정된 압력은, 상기 가압 과정 후 최종 배양된 상기 가압환경 배양 세포가 상기 채취 과정에서 채취된 상기 피시술자의 신체 중 어느 일부와 다른 부위에 이식 가능하도록 설정될 수 있다.
또한, 상기 가압 과정은, 상기 배양 과정 중 최대 5회의 패시지(passage) 전에 실시될 수 있다.
본 발명에 따른 가압환경 세포의 배양 장치 및 배양 방법의 일 실시예에 따르면 다음과 같은 다양한 효과를 달성할 수 있다.
첫째, 가압환경 세포의 탈분화를 억제하도록 배양할 수 있는 효과를 가진다.
둘째, 탈분화가 진행된 가압환경 세포를 재분화시켜 연골 세포의 기능을 손쉽게 복원할 수 있는 효과를 가진다.
셋째, 가압환경 세포의 배양 속도를 향상시킬 수 있는 효과를 가진다.
넷째, 가압환경 세포의 이식 부위 특성에 맞도록 방향성 있는 세포 배양이 가능한 효과를 가진다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 가압환경 세포의 배양 장치를 나타낸 개략도이고,
도 2는 도 1의 구성 중 디쉬에 트랜스웰을 통한 가압환경 세포의 가압 모습을 나타낸 개략도이며,
도 3은 도 2를 구체화한 개략도이고,
도 4는 DMEM 배양액에서 냉장 보관된 트랜스웰을 나타낸 사진이며,
도 5는 본 발명에 따른 가압환경 세포의 배양 방법의 적용 모습을 나타낸 과정도이고,
도 6은 도 5의 블록도이며,
도 7은 가압 유무에 따른 가압환경 세포의 형태 변화를 대조군(Control)과 비교하기 위한 현미경 사진이고,
도 8은 다양한 연골세포 유전자별 탈분화 억제율을 그래프로 나타낸 실험 데이터이다.
이하, 본 발명의 일부 실시예들을 예시적인 도면을 통해 상세하게 설명한다. 각 도면의 구성요소들에 참조부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명의 실시예를 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 실시예에 대한 이해를 방해한다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.
본 발명의 실시예의 구성 요소를 설명하는 데 있어서, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가진 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 가압환경 세포의 배양 장치를 나타낸 개략도이고, 도 2는 도 1의 구성 중 디쉬에 트랜스웰을 통한 가압환경 세포의 가압 모습을 나타낸 개략도이며, 도 3은 도 2를 구체화한 개략도이고, 도 4는 DMEM 배양액에서 냉장 보관된 트랜스웰을 나타낸 사진이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 가압환경 세포의 배양 장치는, 도 1 내지 도 3에 참조된 바와 같이, 스테이지(5) 상에 배치된 가압환경 세포가 담긴 디쉬(dish) (20) 및 디쉬(20)에서 배양되는 가압환경 세포를 기 결정된 압력으로 가압하는 트랜스웰(transwell)(10) 을 포함한다.
여기서, 트랜스웰(10)은, 도 2 및 도 3에 참조된 바와 같이, 중공이 형성된 챔버(11)와, 챔버(11)의 중공 중 상측에 구비되고 다공성 막으로 이루어진 멤브레인(12)(membrane) 및 멤브레인(12)의 하단부에 부착된 알기네이트 하이드로겔(alginate hydrogel)(13)을 포함할 수 있다.
멤브레인(12)은, 챔버(11)의 중공 중 상측에 구비된 미세다공성 막으로서, 완충액, 세포성 물질 또는 배양 배지 등의 물질이 투과하지만 세포는 투과할 수 없는 지지체일 수 있다. 멤브레인(12)의 포어 크기는 당업자가 적절히 채택할 수 있고, 예를 들어 10㎛ 이하 일 수 있고, 바람직하게는 0.4㎛ 내지 8.0㎛의 범주 내에서 채택될 수 있다. 또한, 멤브레인(12)은, 폴리카르보네이트, 폴리에스테르 및 콜라겐-코팅된 폴리테트라플루오로에틸렌일 수 있다.
한편, 트랜스웰(10)은, 실질적으로 가압환경 세포를 가압하는 구성으로서, 가압환경 세포의 배양 완료 후 이식되는 신체 부위에 따라 상술한 기 결정된 압력은 상이하게 설정될 수 있다. 이 경우, 가압환경 세포에 따라 상이하게 설정되는 기 결정된 압력을 조절하기 위하여 알기네이트 하이드로겔(13)의 상하 높이(두께와 같은 의미임)와 농도를 조절함으로써 달성할 수 있다. 알기네이트 하이드로겔(13)은 고농도일수록 강도가 높아져 높은 압력을 형성할 수 있다.
예를 들면, 배양 완료된 가압환경 세포가 이식되는 부위가 신체 중 비교적 많은 신체 하중을 지탱하는 무릎 연골 세포에 이식될 경우에는, 상기 기 결정된 압력은 신체 하중을 덜 받는 신체 부위에 이식되는 경우보다 크게 설정될 수 있고, 알기네이트 하이드로겔(13)의 상하 높이를 더 크게 조절하고 고농도로 변경함으로써 요구 압력을 충족시킬 수 있다.
나아가, 알기네이트 하이드로겔(13)은, 가압환경 세포의 배양을 위해 투입되는 수분 또는 배양액을 함유한 상태에서 가압환경 세포를 상술한 기 결정된 압력으로 가압하기 위한 무게를 가질 수 있다. 즉, 알기네이트 하이드로겔(13)의 중량은, 상술한 상하 높이(두께) 및 농도 뿐만 아니라 그 부피의 값에 따라 결정되는 무게이고, 이때 알기네이트 하이드로겔(13) 내부에 함유된 수분 또는 배양액의 무게를 동시에 고려해야 할 것이다.
여기서의 기 결정된 압력은, 가압환경 세포의 탈분화 억제 및 재분화가 동시에 가능한 압력으로 설정될 수 있다. 여기서, '탈분화'라 함은, 연골 세포의 성질을 벗어나 섬유질 세포의 특질로 변경되는 것으로 정의할 수 있다.
가압환경 세포의 특성 상 신체 부위에 존재하는 경우에는 3차원 환경에서 지속적인 가압을 받게 되나, 배양 과정 중 디쉬(20)의 바닥면과 같은 2차원 환경으로 바뀜으로써 상술한 탈분화가 진행될 수 있다. 탈분화된 연골 세포는 배양 후 이식되더라도 고유 연골 세포의 기능을 수행하기 어려운 난점이 있는 바, 본 발명에 따른 가압환경 세포의 배양 장치에서는, 연골 세포를 배양하되, 채취 전의 신체에 존재하는 가압 상태를 트랜스웰(10)을 통해 구축함으로써 탈분화를 억제할 수 있는 이점을 가진다. 또한, 탈분화가 진행된 연골 세포의 배양 과정에서 트랜스웰(10)을 이용하여 기 결정된 압력으로 가압하는 경우 탈분화를 억제함과 동시에 재분화를 시킬 수 있는 이점이 있다.
그러므로, 기 결정된 압력은, 가압환경 세포의 탈분화 억제 및 재분화가 동시에 가능한 압력으로 설정될 수 있다.
한편, 트랜스웰(10)은, 도 1 및 도 3에 참조된 바와 같이, 챔버(11)의 하부에서 하측으로 연장 형성되고, 디쉬(20) 내부의 바닥면에 지지되는 적어도 2이상의 받침 레그(15')를 더 포함할 수 있다.
받침 레그(15')는, 후술하는 바와 같이, 가압환경 세포를 알기네이트 하이드로겔(13)을 이용하여 가압할 때 챔버(11)가 가압환경 세포가 배양 중인 디쉬(20)의 바닥면에 접하는 면적을 최소화시키는 역할을 할 수 있다. 아울러, 받침 레그(15')는, 그 상하 높이(두께)를 조절함으로써 챔버(11)의 중공에 부착된 알기네이트 하이드로겔(13)의 중력 방향에 대한 하중값을 제어하여 가압환경 세포에 대한 압력값인 상기 기 결정된 압력을 조절하는 역할을 할 수 있다.
그러나, 상기와 같은 기능을 위해서 받침 레그(15')가 도 1 및 도 3과 같은 바(bar) 형상의 레그(15')로 구비되어야 하는 것은 아니다. 즉, 도 2에 참조된 바와 같이, 트랜스웰(10)은, 챔버(11)의 하부에서 하측으로 연장 형성되고, 디쉬(20) 내부의 바닥면에 지지되는 링 형상의 받침대(15)로 구비될 수 있다.
받침대(15)는, 챔버(11)의 하부면 테두리를 따라 하방으로 연장되게 형성되되, 전체적으로 링 형상으로 형성될 수 있다. 링 형상으로 형성된 받침대(15) 또한 상기 기 결정된 압력은 그 상하 높이에 의하여 조절 가능할 수 있다.
알기네이트 하이드로겔(13)은, 가압환경 세포의 배양을 위해 디쉬(20)로 투입되는 수분 또는 배양액을 일부 함유하는 다공성 구조를 가질 수 있다. 이와 같은 알기네이트 하이드로겔(13)은, 수분 또는 배양액을 일부 함유하도록 구비됨으로써 배양되는 세포의 건사 및 괴사를 방지할 수 있다. 동일한 가압 기능을 수행하는 것으로서 알기네이트 하이드로겔(13)과 같이 수분 또는 배양액을 전혀 함유하지 않는 가압체의 경우에는 세포의 건사 및 괴사를 초래할 우려가 있기 때문이다.
실제로 본 발명의 출원인은, 도 4에 참조된 바와 같은 가압환경 세포의 가압을 위한 플랫폼을 제작할 수 있었다. 도 4에 참조된 플랫폼은, 일반적으로 사용되는 트랜스웰(Six well 크기 기반) 바닥면에 알기네이트 하이드로겔 2%를 코팅하여 제작하되, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배양액에서 냉장보관되어 분홍색을 나타내고 있다.
한편, 디쉬(20)에 담겨져 배양되는 가압환경 세포는, 신체의 관절 부위에 배치되어 지속적인 소정 압력 이상을 전달받는 연골 세포 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 여기서, 가압환경 세포는, 신체의 관절 부위에 존재하는 모든 연골 세포를 포함하는 개념이고, 최종적으로 이식되는 신체 부위에서 지속적으로 가압되는 환경이라면 채취되는 연골의 종류를 구분하지 않고 가압환경 세포의 범주에 해당될 수 있다.
예를 들면, 연골 세포 중 코중격 연골 세포는, 코 뼈의 주위에 구비되어 코의 형상을 유지하면서도 외부로부터의 충격을 감쇄하기 위한 기능을 수행하는 연골 세포로서, 무릎 연골과 같이 지속적인 가압을 받는 환경은 아니나, 본 발명에 따른 가압환경 세포의 배양 장치에 의하여 배양된 후 이식되는 신체 부위가 상술한 가압 환경일 경우에는 '가압환경 세포'로 정의될 수 있다.
본 발명에 따른 가압환경 세포의 배양 장치의 일 실시예는, 도 1에 참조된 바와 같이, 스테이지(5) 상에 배치되고, 트랜스웰(10)을 상하로 이동시키되 상기 기 결정된 압력으로 가압환경 세포를 가압하도록 이동시키는 가압부(30)를 더 포함할 수 있다.
이와 같은 가압부(30)는, 스테이지(5) 상에 수직되게 배치된 승강대(31)를 따라 상하 승강되게 구비될 수 있다. 승강대(31)는 가압부(30)의 승강을 안내하는 역할을 할 수 있다.
가압부(30)는, 전기적으로 구동되는 구동 모터에 의하여 승강대(31)를 따라 상하로 승강되는 무빙 구성으로 구비될 수 있다. 이와 같은 가압부(30)는, 필요에 따라서는 트랜스웰(10) 자체를 가압함으로써 상술한 기 결정된 압력을 조절하는 역할을 할 수 있다. 그러나, 가압환경 세포의 배양 후의 이식 부위에 따른 유효 가압 압력은 상기 트랜스웰(10)의 알기네이트 하이드로겔(13)의 중량에 의한 것만으로 충분할 경우에는 가압부(30)는 단순히 트랜스웰(10)을 상하로 승강시키는 기능만을 수행할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 가압환경 세포의 배양 장치의 일 실시예는, 도면에 도시되지 않았으나, 가압환경 세포가 배양되는 디쉬(20)와 알기네이트 하이드로겔(13)의 바닥면은 배양되는 가압환경 세포가 소정의 방향성을 가지면서 배양되도록 기 결정된 방향 및 기 결정된 깊이로 패터닝된 패터닝부를 가질 수 있다.
예를 들면, 무릎 연골 세포는 무릎 관절을 둘러싼 수많은 무릎 근육들과의 조화를 위하여 일정한 방향성을 가진 배양된 가압환경 세포가 적당하다. 그러나, 배양을 위하여 채취된 가압환경 세포가 코중격 연골 세포일 경우에는 일정한 방향성이 없으므로, 무릎 연골 세포에 적합한 방향성을 부여할 필요가 있다.
이 경우, 디쉬(20)와 알기네이트 하이드로겔(13)의 바닥면에 형성된 패터닝부는, 배양되는 가압환경 세포가 일정한 방향성을 갖도록 배양하는 역할을 한다.
따라서, 본 발명에 따른 가압환경 세포의 배양 장치의 일 실시예에 의하여 배양되는 가압환경 세포는, 채취된 표본 연골 세포의 종류에 불구하고, 상측에서는 트랜스웰(10)을 이용하여 기 결정된 압력으로 가압함과 동시에 상측 및 하측에서는 동시에 디쉬(20)와 알기네이트 하이드로겔(13)의 바닥면에 형성된 패텅닝부에 따른 방향성을 가지면서 배양될 수 있다.
이와 같은 본 발명에 따른 가압환경 세포의 배양 장치의 일 실시예를 통해 배양되는 가압환경 세포는, 탈분화가 억제됨과 동시에 재분화가 촉진된 상태로서 연골 조직의 특성을 잃지 않으면서도 신속하게 배양 가능한 이점을 가진다.
이하, 상기와 같이 구성되는 본 발명에 따른 가압환경 세포의 배양 장치를 이용한 배양 방법의 일 실시예를 첨부된 도면을 참조하여 설명한다.
도 5는 본 발명에 따른 가압환경 세포의 배양 방법의 적용 모습을 나타낸 과정도이고, 도 6은 도 5의 블록도이다.
본 발명에 따른 가압환경 세포의 배양 방법의 일 실시예는, 도 5 및 도 6에 참조된 바와 같이, 피시술자의 신체 중 어느 일부에서 이식할 가압환경 세포를 채취하는 채취 과정(S10), 채취 과정(S10)에서 채취된 가압환경 세포를 수분 또는 배양액이 담긴 디쉬(20)(dish)의 바닥면에 배양시키는 배양 과정(S20), 가압환경 세포의 배양 과정(S20) 도중 하부에 수분 또는 배양액을 함유 가능한 알기네이트 하이드로겔(13)을 포함하는 트랜스웰(10)을 이용하여 가압환경 세포를 기 결정된 압력으로 가압하는 가압 과정(S30)을 포함한다.
여기서, 가압 과정(S30)에서의 기 결정된 압력은, 가압 과정(S30) 후 최종 배양된 가압환경 배양 세포가 채취 과정(S10)에서 채취된 피시술자의 신체 중 어느 일부와 다른 부위에 이식 가능하도록 설정될 수 있다.
예를 들면, 채취되는 가압환경 세포는, 신체의 어느 일부 중 시술자가 가장 손쉽게 채취 가능하면서도 한 번에 많은 양의 연골 세포의 획득이 가능한 코중격 연골 세포일 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이, 코중격 연골 세포는, 일반적으로 신체에 존재하는 경우에도 지속적인 압력을 받는 실질적인 가압환경 세포는 아니지만, 이식이 이루어지는 신체의 부위가 지속적인 압력을 받는 경우에도 가압환경 세포로 정의될 수 있다.
따라서, 이식되는 피시술자의 신체 부위가 무릎 연골 부위일 경우, 상기 기 결정된 압력은, 무릎 연골 세포의 특성에 맞도록 설정될 수 있다.
아울러, 가압환경 세포의 배양 과정(S20)은 하나의 디쉬(20)에서 이루어지지 않고, 배양되는 세포의 양에 따라 다수의 디쉬(20)로 나누는 패시지(passage, 개대)가 이루어질 경우, 배양 과정(S20) 중 최대 5회의 패시지 전에 가압 과정(S30)이 실시될 수 있다.
실험적으로, 5회의 패시지 과정을 도과할 경우에는 가압환경 세포의 탈분화 과정이 시작되므로, 본 발명의 일 실시예에 따른 가압환경 세포의 배양 방법에서는, 최대 5회의 패시지 전에 가압 과정(S30)을 실시하도록 설정하였으나, 가장 바람직한 것은 배양 과정(S20) 초기부터 가압 과정(S30)을 실시하는 것이 좋다.
도 7은 가압 유무에 따른 가압환경 세포의 형태 변화를 대조군(Control)과 비교하기 위한 현미경 사진이고, 도 8은 다양한 연골세포 유전자별 탈분화 억제율을 그래프로 나타낸 실험 데이터이다.
본 발명의 출원인은, 상술한 가압환경 세포 배양 장치 및 배양 방법의 일 실시예를 이용하여 피시술자에게서 채취한 연골 세포 2.5x105 개를 상기 Six well 기반 디쉬(20)로 분주하여 6시간 동안 안정적으로 배양시키되, 4회 패시지되어 배양된 연골 세포를 2일 동안 가압하고, 트랜스웰(10)을 분리한 후 그 세포의 형태와 수를 확인하였다.
그 결과, 도 7에 참조된 바와 같이, 대조군의 연골 세포의 배양 개수는 5x105 개임에 반하여, 가압 조건(Pressing) 하에서 배양된 가압환경 세포는 4.4x105 개로써 세포의 증식 속도 차이를 보였으며, 그 구체적인 형태 변화의 차이는 도 7을 통해 확인 가능하다.
아울러, 본 발명의 출원인은, 가압환경 세포에 대한 가압에 따른 연골 세포의 영향을 형태 또는 개수의 측면에서의 비교 뿐만 아니라, 유전자 발현의 범위에서의 정확한 비교를 위하여, 도 8에 참조된 바와 같이, 실시간 RT-PCR을 진행하였다.
여기서, 가압환경 세포는, 연골 세포의 특성과 관련된 유전자로서, 그 발현 차이를 확인하기 위해, COL1a1, COL2a1, Aggrecan(AGC) 및 SOX9로 선정하여 측정하였다.
참조된 도 8을 통해 알 수 있는 바와 같이, 대조군(Control)에 비하여 가압 조건에서 배양된 가압환경 세포는 탈분화가 지속될수록 연골 세포 조직에서 발현되는 유전자인 COL2a1, Aggrecan(AGC) 및 SOX9의 발현이 높게 나타나는 한편, 탈분화된 증거로서 COL1a1의 발현은 낮게 나타남을 알 수 있다. 이러한 결과는, 압력을 가하는 가압 배양 조건에서는 탈분화가 억제됨을 보여주는 것이다.
상술한 바와 같은 본 발명에 따른 가압환경 세포의 배양 장치 및 배양 방법의 일 실시예에 따르면, 동종의 연골 세포이더라도 이식되는 부위에 따른 연골 세포의 특성을 유지하면서도 손쉽게 배양할 수 있는 범용적인 배용 플랫폼의 구축이 가능한 이점을 가진다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다.
따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
5: 스테이지 10: 트랜스웰
11: 챔버 12: 멤브레인
13: 알기네이트 하이드로겔 15: 받침대
15': 받침 레그 20: 디쉬
30: 가압부 31: 승강대
S10: 채취 과정 S20: 배양 과정
S30: 가압 과정

Claims (13)

  1. 스테이지 상에 배치된 가압환경 세포가 담긴 디쉬(dish); 및
    상기 디쉬에서 배양되는 상기 가압환경 세포를 기 결정된 압력으로 가압하는 트랜스웰(transwell); 을 포함하고,
    상기 트랜스웰은,
    중공이 형성된 챔버;
    상기 챔버의 중공 중 상측에 구비되고 다공성 막으로 이루어진 멤브레인(membrane); 및
    상기 멤브레인의 하단부에 부착되어 상기 디쉬에 담긴 상기 가압환경 세포를 상기 기 결정된 압력으로 가압하는 알기네이트 하이드로겔; 을 포함하는 가압환경 세포의 배양 장치.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 트랜스웰은,
    상기 챔버의 하부에서 하측으로 연장 형성되고, 상기 디쉬 내부의 바닥면에 지지되는 적어도 2 이상의 받침 레그; 를 더 포함하는 가압환경 세포의 배양 장치.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 트랜스웰은,
    상기 챔버의 하부에서 하측으로 연장 형성되고, 상기 디쉬 내부의 바닥면에 지지되는 링 형상의 받침대; 를 더 포함하는 가압환경 세포의 배양 장치.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 알기네이트 하이드로겔은, 상기 가압환경 세포의 배양을 위해 투입되는 수분 또는 배양액을 함유하는 다공성 구조를 가지는 가압환경 세포의 배양 장치.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 알기네이트 하이드로겔은, 상기 가압환경 세포의 배양을 위해 투입되는 수분 또는 배양액을 함유한 상태에서 상기 가압환경 세포를 상기 기 결정된 압력으로 가압하기 위한 무게를 가지는 가압환경 세포의 배양 장치.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 기 결정된 압력은, 상기 가압환경 세포의 탈분화 억제 및 재분화가 동시에 가능한 압력으로 설정되는 가압환경 세포의 배양 장치.
  7. 청구항 3에 있어서,
    상기 기 결정된 압력은, 상기 받침 레그 또는 상기 받침대의 상하 높이 또는 상기 알기네이트 하이드로겔의 농도에 의하여 조절 가능한 가압환경 세포의 배양 장치.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 가압환경 세포는, 신체의 관절 부위에 배치되어 지속적인 소정 압력 이상을 전달받는 연골 세포 중 어느 하나를 포함하는 가압환경 세포의 배양 장치.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 가압환경 세포는, 코중격 연골 세포를 포함하는 가압환경 세포의 배양 장치.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 스테이지 상에 배치되고, 상기 트랜스웰을 상하로 이동시키되 상기 기 결정된 압력으로 상기 가압환경 세포를 가압하도록 이동시키는 가압부; 를 더 포함하는 가압환경 세포의 배양 장치.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 가압부는, 상기 스테이지 상에 수직되게 배치된 승강대를 따라 상하 승강되게 구비된 가압환경 세포의 배양 장치.
  12. 가압환경 세포를 준비하는 과정;
    상기 가압환경 세포를 수분 또는 배양액이 담긴 디쉬(dish)의 바닥면에 배양시키는 배양 과정;
    상기 가압환경 세포의 상기 배양 과정 도중 하부에 상기 수분 또는 배양액을 함유 가능한 알기네이트 하이드로겔을 포함하는 트랜스웰(transwell)을 이용하여 상기 알기네이트 하이드로겔이 직접 상기 가압환경 세포를 기 결정된 압력으로 가압하는 가압 과정; 을 포함하는 가압환경 세포의 배양 방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 가압 과정에서의 상기 기 결정된 압력은,
    상기 가압 과정 후 최종 배양된 가압환경 배양 세포가 피시술자의 신체 중 어느 일부와 다른 부위에 이식 가능하도록 설정되는 가압환경 세포의 배양 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001238663A (ja) * 2000-03-02 2001-09-04 Takagi Ind Co Ltd 細胞又は組織の培養方法及びその装置
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Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5919702A (en) * 1996-10-23 1999-07-06 Advanced Tissue Science, Inc. Production of cartilage tissue using cells isolated from Wharton's jelly
WO2006015304A2 (en) * 2004-07-30 2006-02-09 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Amorphous cell delivery vehicle treated with physical/physicochemical stimuli

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001238663A (ja) * 2000-03-02 2001-09-04 Takagi Ind Co Ltd 細胞又は組織の培養方法及びその装置
JP2008151012A (ja) 2006-12-15 2008-07-03 Takagi Ind Co Ltd 加圧装置、その加圧方法、ポンプ装置及び培養装置

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