KR102234284B1 - M1 대식세포로의 선택적 분화방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 가압환경에서 M1 대식세포로의 선택적 분화방법에 관한 것으로 더 상세하게는 미분화된 대식세포를 가압환경 조건의 배양기에서 배양하는 단계를 포함하는, 미분화된 대식세포의 M1 대식세포로의 선택적 분화 방법을 제공한다.

Description

M1 대식세포로의 선택적 분화방법{Method for the selective differentiation to M1 macrophage}
본 발명은 M1 대식세포로의 선택적 분화방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 세포에 압력을 주어 M1 대식세포로 선택적으로 분화하는 방법에 관한 것이다.
암(cancer)은 한국인의 사망원인 1위로서, 뇌혈관질환 및 심장질환과 함께 3대 사인(死因)으로 보고되고 있고 이에 따라 항암제 시장이 의약품 시장에서 차지하는 비중은 글로벌 약효군별 의약품 시장조서 결과에서도 가장 높은 비중을 차지하고 있으며, 암을 치료하기 위한 수술, 화학요법, 방사선요법 등의 방법들이 이용되고 있다. 그러나 전통적인 항암치료방법들은 오히려 장기적으로 면역력 저하와 같은 수반되는 부작용으로 인하여 심각한 치료방법의 한계를 보이고 있다. 이러한 한계를 극복하기 위한 효과적인 항암제 개발이 절실히 요구되고 있으며, 상대적으로 부작용이 낮고 약효가 우수한 면역학적 치료방법이 그 대안으로 부상하고 있다.
한편, 대식세포(macrophage)는 골수세포에서 유래하는 대표적인 선천면역의 주요한 기능을 담당하는 면역세포로서, 초기에는 미성숙 상태의 단핵세포(monocyte)의 형태로 혈류를 통해 골수를 떠나게 된다. 단핵세포는 감염된 세포로부터 유래하는 부산물이나 병원체들을 인식하는 과정에서 그 활성이 증가되어 성숙된 형태의 대식세포로 분화하게 된다. 대식세포는 외부에서 침입한 병원균을 제거하고, 적응면역을 유도하여 조직의 항상성유지에 중요한 기능을 가지고 있으며 인체 내 염증반응의 초기과정에 매우 중요한 역할을 갖는데, 그 분화되는 방법에 따라 특이적으로 M1 대식세포(classically activated macrophages) 및 M2 대식세포(alternatively activated macrophages)의 두 가지 형태로 성숙하게 된다. 이 중 M1 대식세포는 외부 유기체나 박테리아, 바이러스 등을 인식하여 제거하고, 암세포를 효율적으로 죽이고 방어하는 기능을 가진 대식세포를 말한다. 따라서 면역학적암치료제 개발을 위해 대식세포를 M1 대식세포로 효과적으로 분화시킬 수 있는 세포 분화방법의 개발이 시급하다. 이와 관련하여 대한민국 공개특허 제10-1754798호는 사이토카인이 담지된 다공성 실리카 나노입자를 포함하는 M2 대식세포로의 분화유도용 조성물에 대해 개시하고 있다.
그러나 상기 선행기술의 경우, M2 대식세포로의 분화시키는 기술로 항암 및 항염증 작용에 중요한 선천면역세포인 M1 대식세포로 유도하는 분화기술은 아직 존재하지 않는다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 대식세포에 압력을 가하여 매우 효과적으로 선천면역세포로 분화가 가능한 M1 대식세포로의 선택적 분화방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 미분화된 대식세포를 가압환경 조건의 배양기에서 배양하는 단계를 포함하는, 미분화된 대식세포의 M1 대식세포로의 선택적 분화방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 미분화된 대식세포를 가압환경 조건의 배양기에서 배양하여 M1 대식세포로 분화시키는 단계; 및 분화된 M1 대식세포를 파골세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 파골세포의 생산방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 대식세포에 적정 압력을 제공함에 따라 항암 및 항염증 작용에 중요한 선천면역세포인 M1 대식세포로 효율적으로 분화할 수 있는 선택적 분화방법을 구현할 수 있다. 또한 상기 M1 대식세포를 부작용이 낮고 약효가 우수한 항암치료제로 사용가능하다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 대식세포에 압력을 제공하기 위한 가압환경의 세포 배양장치의 형태를 개략적으로 나타내고 있는 개요도이다.
도 2는 본 발명의 M1 대식세포로의 선택적 분화방법에 대한 개념을 개략적으로 설명하고 있는 개요도이다.
도 3은 가압장치의 알기네이트 하이드로겔의 농도에 따른 세포사멸을 관찰한 사진이다.
도 4는 대식세포에 압력을 제공하는 시간에 따라 세포 증식을 관찰한 사진이다.
도 5는 대식세포에 압력을 제공하여 세포 증식 억제 여부를 관찰한 사진이다.
도 6은 대식세포에 압력을 제공하여 표현형 및 거대세포를 관찰한 사진이다.
도 7은 대식세포에 압력을 제공하여 표현형 및 거대세포를 관찰한 사진이다.
도 8은 대식세포를 저산소증(hypoxia) 환경에서 가압하고 세포의 표현형 및 크기변화를 관찰한 사진이다.
도 9는 대식세포에 압력을 제공하고 겔 제거 후 세포의 표현형 및 크기변화를 관찰한 사진이다.
도 10은 대식세포에 압력을 제공하고 겔 제거 후 세포의 표현형 및 크기변화를 관찰한 사진이다.
도 11은 대식세포를 가압한 후 세포의 면적을 관찰한 사진이다.
도 12는 대식세포를 가압한 후 세포의 두께 및 면적을 분석한 그래프이다.
도 13은 대식세포를 가압하여 M1으로 분화를 유도한 후 세포의 크기 및 표현형을 관찰한 사진이다.
도 14는 대식세포를 가압하여 M1으로 분화를 유도한 후 관련 단백질의 발현을 분석한 FACS 결과를 나타내는 2차원 히스토그램이다.
도 15는 대식세포를 가압하여 M1으로 분화를 유도한 후 관련 단백질의 발현을 측정한 PCR 분석 그래프이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "M1 대식세포(M1 macrophage)"는 전형적인 기능을 갖는 종류의 대식세포(classically activated macrophage)로 기존에 일반적으로 알려진 대식세포의 기능적 특징 즉, 외부 유기체나 박테리아, 바이러스 등을 인식하여 제거하고, 암세포를 효율적으로 죽이고 방어하는 기능을 가진 대식세포이다
본 문서에서 사용되는 용어 "파골세포(osteoclast)"는 지름이 20~100 μm인 거대세포로 50개 가량의 핵을 포함하고 있으며 골흡수와 밀접한 관계가 있는 세포이다. 골다공증을 유발하는 세포로 현재 기술로는 배양이 되지 않으며, 세포주(cell line)로도 판매되고 있지 않아 관련분야에 대한 연구에 중대한 영향을 미치고 있다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 미분화된 대식세포를 가압환경 조건의 배양기에서 배양하는 단계를 포함하는, 미분화된 대식세포의 M1 대식세포로의 선택적 분화방법이 제공된다.
상기 분화방법에 있어서, 상기 가압환경은 배양기 상부로부터 배양용기 내로 수직방향으로 하강하여 세포상면을 기계적으로 눌러주는 트랜스웰에 의해 유도되거나 배양기 챔버 내에 가압 공기 주입함으로써 조성될 수 있고 상기 트랜스웰은 중공이 형성된 챔버, 상기 챔버의 중공 중 상측에 구비되고 다공성 막으로 이루어진 멤브레인 및 상기 멤브레인의 하단부에 부착된 하이드로 겔을 포함할 수 있다.
선택적으로, 상기 트랜스웰 대신 하면에 상기 하이드로 겔이 부착된 높낮이가 조절되는 가압판에 의해 세포상면에 압력을 가하는 것도 가능하다.
상기 분화방법에 있어서, 상기 가압 공기는 1.5 내지 5 기압의 압력을 가질 수 있고 상기 하이드로겔은 음전하를 나타내는 천연 또는 합성 고분자의 수화에 의해 이루어진 하이드로겔일 수 있으며 상기 음전하를 나타내는 천연 또는 합성 고분자는 카라기난, 알기네이트, 잔탄검, 겔란 검, 폴리아클릴산, 헤파린, 또는 카르복시메틸셀룰로오스일 수 있다.
상기 분화방법에 있어서, 상기 미분화 대식세포는 단핵구 유래 미분화 대식세포 또는 골수 유래 미분화 대식세포일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 미분화된 대식세포를 가압환경 조건의 배양기에서 배양하여 M1 대식세포로 분화시키는 단계; 및 분화된 M1 대식세포를 파골세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 파골세포의 생산방법이 제공된다.
일반적으로 관절연골(articular cartilage)은 인체에서 가압(pressurization)에 노출되는 환경에 적응하여 관절 운동 시 충격을 흡수하고 관절의 마모를 방지하는 역할을 하므로 ＇가압환경 세포＇로 정의될 수 있는데 이러한 세포의 성장 속도 증가를 위해 2차원 표면에서 배양하게 되면 성장 과정 동안 연골 세포 고유의 성질이 섬유질화되는 탈분화 현상이 발생할 우려가 존재하였다. 이에 본 발명자들은 스테이지(stage) 상에 배치된 가압환경 세포가 담긴 디쉬(dish) 및 상기 디쉬에서 배양되는 상기 가압환경 세포를 일정 압력으로 가압하는 트랜스웰(transwell)을 포함하고, 상기 트랜스웰은, 중공이 형성된 챔버 및 다공성(porous) 막으로 구성된 멤브레인(membrane) 및 상기 멤브레인의 하단부에 부착된 알기네이트 하이드로겔(alginate hydrogel)을 포함하여 가압환경 세포의 탈분화 억제 및 재분화를 촉진시킬 수 있는 가압환경의 배양장치 및 배양방법(특허 출원번호 제2018-0061111호)을 개발하였다.
이에 더하여 본 발명자들은 심각한 치료방법의 한계를 나타내고 있는 전통적인 항암치료방법들의 문제점을 극복하기 위해 상기 가압환경의 배양장치를 이용한 효과적인 항암제 개발을 위해 예의노력한 결과 대표적인 선천 면역세포인 골수세포에서 유래 대식세포(macrophage)를 적정 압력으로 특정 기간 동안 가압하여 면역학적 암치료제 개발에 효과적인 M1 대식세포로 분화시킬 수 있는 선택적 분화방법(selective differentiation)을 개발하여 본 발명을 완성하였다(도 1).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 공시재료
본 발명자들은 미분화 대식세포(RAW 264.7, TIB-71, ATCC)를 구입하였고, 배지(RPMI 1640 medium, Gibco)를 이용하여 37℃ 조건에서 초도배양하였다. 상기 RAW 264.7 세포는 미분화 대식세포로서 세포배양 접시 표면에 붙으면서 바로 M0 대식세포로 분화되는 특성을 가지는 세포이다.
대식세포에 압력을 제공하기 위한 가압환경의 세포 배양장치로는 특허출원 제2018-0061111호에 기재된 가압장치를 사용하였다(도 1). 본 발명의 일 실시예에 따른 가압환경 세포의 배양 장치는, 도 1에 도시된 바와 같이, 스테이지(5) 상에 배치된 가압환경 세포가 담긴 디쉬(dish, 20) 및 디쉬(20)에서 배양되는 가압환경 세포를 기 결정된 압력으로 가압하는 트랜스웰(transwell, 10)을 포함한다. 여기서, 트랜스웰(10)은, 중공이 형성된 챔버(11)와, 챔버(11)의 중공 중 상측에 구비되고 다공성 막으로 이루어진 멤브레인(membrane, 12) 및 멤브레인(12)의 하단부에 부착된 하이드로 겔(hydrogel, 13)을 포함할 수 있다. 멤브레인(12)은, 챔버(11)의 중공 중 상측에 구비된 미세다공성 막으로서, 완충액, 세포성 물질 또는 배양 배지 등의 물질이 투과하지만 세포는 투과할 수 없는 지지체일 수 있다. 멤브레인(12)의 포어 크기는 당업자가 적절히 채택할 수 있고, 예를 들어 10 ㎛ 이하일 수 있고, 바람직하게는 0.4 ㎛ 내지 8.0 ㎛의 범주 내에서 채택될 수 있다. 또한, 멤브레인(12)은, 폴리카르보네이트, 폴리에스테르 및 콜라겐-코팅된 폴리테트라플루오로에틸렌일 수 있다. 한편, 트랜스웰(10)은, 실질적으로 가압환경 세포를 가압하는 구성으로서, 가압환경 세포의 배양 완료 후 이식되는 신체 부위에 따라 상술한 기 결정된 압력은 상이하게 설정될 수 있다. 이 경우, 가압환경 세포에 따라 상이하게 설정되는 기 결정된 압력을 조절하기 위하여 하이드로겔(13)의 상하 높이(두께와 같은 의미임)와 농도를 조절함으로써 달성할 수 있다. 하이드로겔(13)은 고농도일수록 강도가 높아져 높은 압력을 형성할 수 있다. 나아가, 하이드로겔(13)은, 가압환경 세포의 배양을 위해 투입되는 수분 또는 배양액을 함유한 상태에서 가압환경 세포를 상술한 기 결정된 압력으로 가압하기 위한 무게를 가질 수 있다. 즉, 하이드로겔(13)의 중량은, 상술한 상하 높이(두께) 및 농도 뿐만 아니라 그 부피의 값에 따라 결정되는 무게이고, 이때 하이드로겔(13) 내부에 함유된 수분 또는 배양액의 무게를 동시에 고려할 수 있다.
하이드로겔(13)은 세포가 잘 부착하지 않으면서도 세포독성이 없는 소재라면 어떤 것이라도 사용이 가능하다. 예컨대, 하이드로겔(13)은 음전하를 나타내는 천연 또는 합성 고분자의 수화에 의해 이루어진 하이드로겔일 수 있고, 상기 천연 또는 합성 고분자는 카라기난, 알기네이트, 잔탄검, 겔란 검, 폴리아클릴산, 헤파린, 또는 카르복시메틸셀룰로오스일 수 있다. 본 발명자들은 하이드로겔(13)의 일 실시예로 알기네이트 하이드로겔을 사용하였다(도 2).
실시예 2: 알기네이트 최적 농도 선정
본 발명자들은 미분화 상태의 대식세포에 압력을 제공하기 위한 가압장치의 알기네이트 하이드로겔의 최적 농도를 선정하였다.
구체적으로 멸균수에 알기네이트(sodium alginate, sigma) 2, 4, 6 및 8%를 각각 첨가하여 24시간동안 교반기에서 녹인 후, 500㎕를 트랜스 웰로 눌러 고르게 분포시킨 다음 염화칼슘용액(Calcium chloride, sigma)을 이용하여 알기네이트 하이드로겔을 겔화 시켰다. 이어서, 상기 배양된 미분화 대식세포(RAW 264.7, TIB-71, ATCC) 1X105 개를 6-웰 플레이트(6-well plate)에 부착시킨 후 상기 제조한 알기네이트 하이드로겔을 이용하여 배지(RPMI 1640 medium, Gibco)에서 37℃ 조건으로 24시간 배양하였다.
그 결과, 2% 이상의 겔 농도에서는 세포사멸이 관찰되어 최적 농도를 2%로 선정하였다(도 3).
실시예 3: 최적 가압 간격 선정
본 발명자들은 대식세포에 제공하는 압력의 최적 간격을 선정하기 위해 2% 알기네이트 하이드로겔을 이용하여 24시간 동안 압력을 매 1, 3, 6, 12 및 24 시간 간격으로 세포를 가압한 것을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일한 조건으로 배양하였다.
그 결과, 24시간 동안 세포를 가압하는 것이 가장 최적임을 확인하였다(도 4).
실시예 4: 세포 증식 억제
본 발명자들은 미분화 대식세포를 가압하여 세포 증식 억제 여부를 관찰하였다. 구체적으로 2% 알기네이트 하이드로겔을 이용하여 24시간 동안 세포를 가압하여 실시예 2와 동일한 조건으로 배양하면서 라이브 광학 현미경으로 실시간 관찰하였다.
그 결과, 대조군과 비교하여 가압 실험군의 세포 증식이 억제되는 것으로 나타났다. 상기 결과는 세포 가압으로 세포 증식이 억제되고 분화는 촉진됨을 시사하는 것이다(도 5).
실시예 5: 표현형 및 크기변화
본 발명자들은 미분화 대식세포를 가압하여 표현형 및 크기변화를 관찰하였다. 구체적으로 2% 알기네이트 하이드로겔을 이용하여 8일 동안 세포를 가압하여 실시예 2와 동일한 조건으로 배양하면서 위상차 현미경으로 6시간, 1, 3, 6 및 8일 간격으로 관찰하였다.
그 결과, 가압 후 6일 경과 시점에서 핵이 3개 이상의 거대세포(giant cell)를 관찰하였고 8일 경과 시점에서는 대조군은 세포 증식만이 관찰되었으나 가압 실험군에서는 핵이 5개인 거대세포를 관찰하였다(도 6 및 7).
실시예 6: 저산소 환경(hypoxia)에서 관찰
본 발명자들은 가압환경이 혹시 저산소 상태를 야기하여 세포의 표현형 및 증식에 변화를 주는 것인지 여부를 조사하였다. 이를 위해, 미분화 대식세포를 저산소 환경(hypoxia)에서 배양함으로써 세포의 표현형 및 크기변화를 관찰하였다. 구체적으로 배양된 미분화 대식세포(RAW 264.7, TIB-71, ATCC) 1X105 개를 6-웰 플레이트(6-well plate)에 부착시킨 후 배지(RPMI 1640 medium, Gibco)에서 37℃, 산소농도 1% 조건으로 48시간 동안 배양하였다.
그 결과, 저산소 환경에서는 대조군 및 실험군의 증식 및 표현형의 변화가 거의 없는 것으로 나타났다(도 8).
실시예 7: 겔 제거 후 관찰
본 발명자들은 미분화 대식세포를 일정기간 가압하고 겔 제거 이후 세포의 표현형 및 크기변화를 관찰하였다. 구체적으로 2% 알기네이트 하이드로겔을 이용하여 5일 동안 세포를 가압한 후 실시예 2와 동일한 조건으로 배양하였고 상기 알기네이트 하이드로겔을 제거하였다.
그 결과, 가압 후 겔을 제거해도 세포의 표현형이 유지되었고 거대세포를 관찰하였다(도 9 및 10). 이는 일정기간 가압조건을 유지할 경우 세포의 분화가 비가역적으로 일어남을 시사하는 것이다.
실시예 8: 세포 두께 및 면적 관찰
본 발명자들은 대식세포를 가압한 후 주사전자현미경과 위상차 현미경으로 세포의 두께 및 면적을 관찰하였다. 구체적으로 2% 알기네이트 하이드로겔을 이용하여 6시간 동안 세포를 가압하였고 실시예 2와 동일한 조건으로 배양하였다.
그 결과, 대조군과 비교하여 가압 실험군 세포의 두께는 감소하였으나 면적은 증가한 것으로 나타났다. 이는 알지네이트 하이드로젤이 세포에게 가압환경을 제공하고 있음을 시사하는 것이다.(도 11 및 12).
실시예 9: 분화된 대식세포 종류 확인
본 발명자들은 미분화 대식세포를 가압하여 분화를 유도한 후 세포의 크기 및 표현형을 관찰하였다. 구체적으로 2% 알기네이트 하이드로겔을 이용하여 48시간 동안 세포를 가압하여 실시예 2와 동일한 조건으로 배양한 것과 M1으로 유도할 수 있는 M1 cytokine(LPS, IFN-gamma, R&D systems)을 이용하여 배지(RPMI 1640 medium, Gibco)에서 37℃ 조건으로 48시간 배양한 것을 비교 관찰하였다.
그 결과, 가압 실험군의 경우 cytokine에 의해 M1으로 유도된 세포와 크기 및 표현형이 유사한 것으로 나타났다(도 13). 이는 본 발명의 가압환경에서의 미분화 대식세포의 배양은 M1 선택적인 분화를 촉진함을 시시하는 것이다.
실시예 10: M1 분화 관련 마커 분석
본 발명자들은 대식세포를 가압하여 M1 유사 세포로 분화를 유도한 후, 실제 상기 분화가 유도된 세포가 M1 대식세포인지 확인하기 위해, 단백질의 발현 양상을 유세포 분석(FACS) 및 RT-PCR 분석으로 확인하였다.
구체적으로, 미분화 대식세포를 가압환경에서 2일간 가압하거나 하지 않고 배양한 후 유세포 분석은 M1 마커로 iNOS 단백질에 특이적인 항체를 M2 마커로는 Arg1 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 수행하였고, RT-PCR은 저산소증 마커로HIF-1, M1 마커로 NOS2, M2 마커로 Arg1, 파골세포 마커로 NFATc1 및 TRAP mRNA를 각각 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용하였다. 상기 RT-PCR에 사용한 프라이머쌍의 정보는 하기 표 1에 기재된 바와 같다.
RT-PCR에 사용된 프라이머 정보
유전자 핵산서열 (5'→3') Tm 서열번호
HIF-1 포워드: CTT GAC AAG CTA GCC GGA GG 59.5 1
리버스: TCG ACG TTC AGA ACT CAT CCT 56.2 2
NOS2 포워드: TGC CAG GGT CAC AAC TTT ACA 56.2 3
리버스: CTC TCC ACT GCC CCA GTT TT 57.4 4
Arg1 포워드: ACG GCA GTG GCT TTA ACC TT 55.4 5
리버스: AGG TAG TCA GTC CCT GGC TT 57.4 6
NFATc1 포워드: TTC GAG TTC GAT CAG AGC GG 57.4 7
리버스: CGA GCC AGG TAT CTT CGG TC 59.5 8
TRAP 포워드: AGC AGC TCC CTA GAA GAT GGA 58.2 9
리버스: GTA GGC AGT GAC CCC GTA TG 59.5 10
GAPDH 포워드: GGC AAA TTC AAC GGC ACA GT 59.9 11
리버스: TAG GGC CTC TCT TGC TCA GT 59.9 12
또한 실시예 10과 동일한 방법으로 세포를 배양하여 상기 마커와 프라이머 쌍을 이용하여 FACS와 RT-PCR 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 15에서 나타난 바와 같이, M1으로 유도된 세포와 유사한 단백질 발현량 증가를 나타내었고(도 14), RT-PCR 분석 결과 M2와 관련된 유전자는 발현이 거의 되지 않았고, M1과 관련된 유전자인 NOS2의 발현은 증가됨을 확인할 수 있었다. 흥미로운 점은 파골세포(osteoclast) 관련 유전자인 NFATc1 및 TRAP의 발현량이 증가한 것으로 나타난 것인데, 이는 M1 대식세포가 궁극적으로 파골세포로 분화할 수 있는 잠재성이 존재한다는 점을 고려하면 충분히 설명할 수 있는 현상이다(도 15).
결론적으로, 본 발명의 M1 대식세포로의 선택적 분화방법은 미분화 대식세포를 항암 및 항미생물 면역반응에 중요한 역할을 수행하는 선천 면역세포인 M1 대식세포로 선택적이고 효율적으로 분화시킬 수 있기 때문에, 부작용이 낮고 약효가 우수한 항암 면역치료제 개발에 활용하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따라 선택적으로 분화된 M1 대식세포는 적절한 조건 하에서 파골세포로 분화가 가능하기 때문에, 아직까지 확립된 세포주가 존재하지 아니하여 초도배양 상태로만 활용할 수 있었던 파골세포를 대량으로 생산하여 골다공증 치료제 개발 등 관련 연구에 매우 효율적으로 사용하는 것이 가능하다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Method for the selective differentiation to M1 macrophage <130> PD18-3419 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for HIF-1 <400> 1 cttgacaagc tagccggagg 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for HIF-1 <400> 2 tcgacgttca gaactcatcc t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for NOS2 <400> 3 tgccagggtc acaactttac a 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for NOS2 <400> 4 ctctccactg ccccagtttt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Arg1 <400> 5 acggcagtgg ctttaacctt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Arg1 <400> 6 aggtagtcag tccctggctt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for NFATc1 <400> 7 ttcgagttcg atcagagcgg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for NFATc1 <400> 8 cgagccaggt atcttcggtc 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for TRAP <400> 9 agcagctccc tagaagatgg a 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for TRAP <400> 10 gtaggcagtg accccgtatg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for GAPDH <400> 11 ggcaaattca acggcacagt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for GAPDH <400> 12 tagggcctct cttgctcagt 20

Claims (9)

  1. 배양기 상부로부터 배양용기 내로 수직방향으로 하강하여 배양 중인 미분화 대식세포의 상면을 하면에 하이드로겔이 부착된 가압판 또는 트랜스웰을 이용하여 기계적으로 눌러줌으로써 유도되는 가압환경 조건의 배양기에서 상기 미분화 대식세포를 배양하는 단계를 포함하는, 미분화된 대식세포의 M1 대식세포로의 선택적 분화 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 트랜스웰은 중공이 형성된 챔버, 상기 챔버의 중공 중 상측에 구비되고 다공성 막으로 이루어진 멤브레인 및 상기 멤브레인의 하단부에 부착된 하이드로 겔을 포함하는, 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 음전하를 나타내는 천연 또는 합성 고분자의 수화에 의해 이루어진 하이드로겔인, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 음전하를 나타내는 천연 또는 합성 고분자는 카라기난, 알기네이트, 잔탄검, 겔란 검, 폴리아클릴산, 헤파린, 또는 카르복시메틸셀룰로오스인, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 미분화 대식세포는 단핵구 유래 미분화 대식세포 또는 골수 유래 미분화 대식세포인, 방법.
  9. 배양기 상부로부터 배양용기 내로 수직방향으로 하강하여 배양 중인 미분화 대식세포의 상면을 하면에 하이드로겔이 부착된 가압판 또는 트랜스웰을 이용하여 기계적으로 눌러줌으로써 유도되는 가압환경 조건의 배양기에서 상기 미분화 대식세포를 배양하여 M1 대식세포로 분화시키는 단계; 및
    분화된 M1 대식세포를 파골세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 파골세포의 생산방법.
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