JP5828916B2

JP5828916B2 - 幹細胞のインビボ移動誘導方法

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Publication number: JP5828916B2
Application number: JP2013557637A
Authority: JP
Inventors: ヌリ・ジ; ソンパク・ミン; ヒキム・ヨン
Original assignee: テゴサイエンスインコーポレイテッド
Priority date: 2011-03-08
Filing date: 2012-01-26
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2032-01-26
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Description

本発明は、損傷した組織治療用移植組成物及び損傷した組織部位への治療用細胞のインビボ移動を誘導する方法に関する。

幹細胞（ｓｔｅｍｃｅｌｌ）は、生物組織を構成する生物を多様な細胞に分化できる細胞であって、胚芽、胎児及び成体の各組織から得られる分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）される前段階の未分化細胞を総称する。幹細胞は、分化刺激（環境）により特定細胞に分化が進行されて、細胞分裂が停止した分化された細胞とは異なって、細胞分裂により自分と同一な細胞を生産（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）することができて、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）する特性があり、異なる環境または異なる分化刺激により異なる細胞にも分化でき、分化に柔軟性（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を有していることが特徴である。

関節軟骨は、主に蛋白多糖と第２型膠原質とから構成された無血性組織であり、組織体積の約５％の軟骨細胞を含んでいる［非特許文献１］。関節軟骨の損傷時、欠損部位への軟骨細胞の移動がほとんど起こらず、損傷した関節軟骨は、自発的な治癒が起こらない短所がある［非特許文献２］。損傷した関節軟骨を治療するための代表的な生物学的方法として、自家軟骨細胞移植法と骨髄穿孔術などがある。自家軟骨細胞移植法は、自家軟骨細胞を培養して欠損部位に移植する方法であって、比較的よい結果を示すが、繰り返される手術と供与部の制限性が短所である。骨髄穿孔術は、軟骨欠損部の軟骨下骨を穿孔して、骨髄と共に欠損部位に流入された骨髄由来間葉系幹細胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ）を利用し、損傷した軟骨を治療する方法である。この方法は、比較的簡単で経済的であるが、結果が一定ではなく、流入される間葉系幹細胞の数が十分ではない場合、組織再生が円滑ではないという短所がある［非特許文献３−非特許文献７］。

間葉系幹細胞は、骨、軟骨、脂肪細胞に分化できて、軟骨細胞に比べ速く増殖するため、関節軟骨再生のために重要な細胞源であり、また、既存関節軟骨治療法の短所を克服するために間葉系幹細胞に注目している。損傷した関節軟骨が間葉系幹細胞により再生されるためには、十分な数の間葉系幹細胞が軟骨欠損部位に流入されて、集まった間葉系幹細胞が関節軟骨基質に付着し、増殖及び軟骨細胞に分化して軟骨基質を生成しなければならない。自然治癒過程において、間葉系幹細胞は、関節軟骨損傷部位に移動して、軟骨細胞への分化過程を経るようになる。間葉系幹細胞の軟骨分化のためには、集まった間葉系幹細胞の凝集と細胞−細胞及び細胞−軟骨基質間の相互作用が必須的である［非特許文献８］。

間葉系幹細胞の軟骨分化において、細胞周囲の微細環境は重要な役割をする。

間葉系幹細胞と、細胞と隣接した膠原質との相互作用が間葉幹細胞の軟骨分化を促進させる［非特許文献９、非特許文献１０］。

軟骨を含む多様な損傷した組織の治療のためには、組織損傷部内への骨髄由来間葉系幹細胞の十分な流入が非常に重要である［非特許文献１１−非特許文献１３］。血液または骨髄内循環していた間葉系幹細胞が組織損傷部に集まる現象をホーミング（ｈｏｍｉｎｇ）といい、間葉幹細胞のホーミングは、多段階にかけて細胞付着蛋白とケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）によりなされる［非特許文献１４−非特許文献１７］。ケモカインは、約８１０ｋＤａの小さいサイトカインである。現在まで、約５０余種のケモカインが知られており、多様な細胞の化学走性を誘導する機能をする［非特許文献１８−非特許文献２０］。ケモカインは、Ｇ−蛋白受容体の一種であるケモカイン受容体（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ）に付着して、細胞の化学走性を誘導する。現在、約１９種のケモカイン受容体が報告されて、間葉系幹細胞においてもケモカインを利用した皮膚などの組織再生が報告された［非特許文献２１−非特許文献２３］。

現在使用されている関節損傷に対する治療法（例えば、薬物治療法、手術、遺伝子治療法など）は、関節軟骨損傷部位において正常関節軟骨への回復をもたらしていない。その他にも、移植物の物理的特性を考慮して、自家または同種間骨−軟骨組織を移植するか、再生に必要な十分な数の軟骨細胞を補充するために、自家軟骨細胞移植術が行われており、他の治療法に比べよい治療効果を示すが、供与部または供与者の制限により実際施術に制限があり、患者にとっては、高い治療費用及び２回以上の手術、そして移植される細胞の機能が顕著に劣る短所がある。

最近は、このような短所を克服するために、生分解性合成高分子に細胞を塗布した複合体で構成された人工代替物が活発に研究され、臨床適用が試みられる段階であるが、この方法も既存の問題点を克服することはできていないのが実情である。このように、損傷した関節軟骨組織の再生のために、細胞と生体材料の接木技術などの多様な治療方法が開発されたが、細胞と生体材料複合誘導体は、臨床的に適用するに制限的であり、まだ十分ではない。

したがって、細胞を利用し、その性質を最大限維持しながら、既存の短所を克服できる治療方法の開発が切実な状況である。

本明細書全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。

本発明者らは、損傷した組織部位の治療のために、組織再生に必要な細胞を損傷した部位に効果的に誘導できる方法を開発するために鋭意研究した。

その結果、本発明者らは、ケモカインであるＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）−８及びＭＩＰ（ＭａｃｒｏｐｈａｇｅＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙＰｒｏｔｅｉｎ）−３αが、損傷した部位に間葉系幹細胞（好ましくは、骨髄由来の間葉系幹細胞）またはケラチン細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）の流入を高い効率で促進させて、前記ケモカインを含む生分解性支持体（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅｓｃａｆｆｏｌｄｓ）を損傷した部位に移植させて簡便で効果的に治療することができることを見出し、本発明を完成した。

したがって、本発明の目的は、損傷した組織治療用移植組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、損傷した組織部位への治療用細胞のインビボ移動を誘導する方法を提供することにある。

本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。

本発明の一態様によると、本発明は、ＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）−８、ＭＩＰ（ＭａｃｒｏｐｈａｇｅＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙＰｒｏｔｅｉｎ）−３α、これらの誘導体及びこれらの組合せから構成された群から選択される１つ以上の化学走性因子を含む生分解性支持体（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅｓｃａｆｆｏｌｄｓ）を有効成分として含む、損傷した組織治療用移植組成物（ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を提供する。

その結果、本発明者らは、ケモカインであるＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）−８及びＭＩＰ（ＭａｃｒｏｐｈａｇｅＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙＰｒｏｔｅｉｎ）−３αが、損傷した部位に間葉系幹細胞（好ましくは、骨髄由来の間葉系幹細胞）またはケラチン細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）の流入を高い効率で促進させて、前記ケモカインを含む生分解性支持体（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅｓｃａｆｆｏｌｄｓ）を損傷した部位に移植させて簡便で効果的に治療することができることを見出した。

本発明者らは、ヒトの骨髄由来の間葉系幹細胞で発現し、軟骨または皮膚損傷インビトロ条件下で発現が増加するケモカイン受容体を選別して、そのリガンドを含む生分解性支持体を損傷した骨組織、関節または皮膚組織に移植することにより、間葉系幹細胞のホーミングを誘導して関節または皮膚損傷を効果的に治療することができることを確認した。

本発明の特徴及び利点を要約すると、以下のとおりである：
（ａ）本発明は、損傷した組織治療用移植組成物及び損傷した組織部位への治療用細胞のインビボ移動を誘導する方法を提供する。
（ｂ）本発明によると、本発明の化学走性因子（例えば、ＩＬ−８またはＭＩＰ−３α）と反応させた生分解性支持体を損傷した位置（例えば、骨組織、関節軟骨または皮膚）に移植して、組織再生のための細胞のホーミングを誘導／促進することにより、損傷した組織を治療することができる。
（ｃ）したがって、本発明の組成物は、それ自体として、従来技術と比較し、より簡便で効率的に損傷した骨組織、関節軟骨または皮膚組織の治療に適用できるだけではなく、他家細胞を利用した細胞治療において、希少性の高い治療用細胞資源を効率的に活用できるようにすることにより、有用な治療補助剤として利用できる。

図１は、親炎症性サイトカインにより刺激されたヒト骨髄由来の間葉系幹細胞において、ケモカイン受容体の変化された遺伝子発現を示す結果である。Ａ：ＲＴ−ＰＣＲ；Ｂ：逆ドットブロット（ｒｅｖｅｒｓｅｄｏｔ−ｂｌｏｔ）。対照群、正常間葉系幹細胞群；ＩＬ−４ｈ，ＩＬ−１βで４時間刺激された群；ＩＬ−２４ｈ，ＩＬ−１βで２４時間刺激された群；ＩＬ−４８ｈ，ＩＬ−１βで４８時間刺激された群；ＴＮＦ−４ｈ，ＴＮＦ−αで４時間刺激された群；ＴＮＦ−２４ｈ，ＴＮＦ−αで２４時間刺激された群；及びＴＮＦ−４８ｈ，ＴＮＦ−αで４８時間刺激された群。図２は、細胞増殖及び移動においてケモカインの効果を示す結果である。図２ａは、細胞増殖を示す結果である。図２は、細胞増殖及び移動においてケモカインの効果を示す結果である。図２ｂは、傷治癒効果を示す結果である。図２は、細胞増殖及び移動においてケモカインの効果を示す結果である。図２ｃは、移動能（ｍｉｇｒａｔｏｒｙｃａｐａｃｉｔｙ）を示す結果である。図３は、細胞分化上にケモカインの効果を示す結果である。図３ａの上側パネルは、マッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色結果であり、下側パネルは、軟骨標識遺伝子の発現を調べた結果である。図３は、細胞分化上にケモカインの効果を示す結果である。図３ｂは、フォンコッサ（Ｖｏｎｋｏｓｓａ）染色結果である。略語：Ｎ．Ｃ．，陰性対照群；Ｐ．Ｃ．，陽性対照群。図４ａ−ｄは、ｂＭＳＣｓ及びケラチン細胞のインビトロ化学走性をそれぞれ示す結果である。図４ａ−ｄは、ｂＭＳＣｓ及びケラチン細胞のインビトロ化学走性をそれぞれ示す結果である。図４ａ−ｄは、ｂＭＳＣｓ及びケラチン細胞のインビトロ化学走性をそれぞれ示す結果である。図４ａ−ｄは、ｂＭＳＣｓ及びケラチン細胞のインビトロ化学走性をそれぞれ示す結果である。図５は、ｂＭＳＣｓのインビボ化学走性を示す結果である。上側パネルは、動物実験結果を示し（Ｗ：週）、下側パネルは、ケモカインを含有したＰＬＧＡ支持体移植模式図を示す。図６ａは、ｂＭＳＣｓのインビボ化学走性観察後の肉眼観察を示す結果である。図６ｂは、ｂＭＳＣｓのインビボ化学走性観察後の病理学的所見を示す結果である。

本明細書の用語‘化学走性（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ）’は、化学的刺激により誘導される移動性細胞の陽性（即ち、刺激に向いた方向）または陰性（即ち、刺激から遠ざかる方向）移動を意味し、細胞膜が相応する化学走性因子（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ；ケモカイン）により活性化されて、これは、相応する細胞表面受容体（ケモカイン受容体）により媒介される。

本明細書の用語‘化学走性因子’は、組織から拡散されて化学走性を活性化させる細胞外マトリックス分子及び分泌されたタンパク質を意味し、例えば、ＴＧＦ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）ファミリー、ＢＭＰ（ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ）ファミリー、ＣＤＭＰ（ｃａｒｔｉｌａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）ファミリー、ＣＴＧＦ（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓ）、ＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）ファミリー、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）ファミリー、細胞外マトリックス分子（例えば、オステオポンチン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、ヘパリン、トロムボスポンジン、コラーゲン、ビトロネクチンなど）及びケモカインを含む。

本発明の好ましい具現例によると、本発明の化学走性因子は、ケモカインを含む。

ケモカインは、血液幹細胞の造血機能及び白血球の化学走性のような多様な過程において重要な生理学的機能をするタンパク質（５−２０ｋＤａ）である。

全てのケモカインのアミノ酸配列は、類似しており、４つのシステインの連続した配列により特徴化される。ケモカインファミリーは、４つのサブファミリーで区分される：（ａ）ＣＣＬ；（ｂ）ＣＸＣＬ；（ｃ）ＣＸ３ＣＬ；及び（ｄ）ＸＣＬ（Ｍｕｒｐｈｙ，ｅｔａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｕｎｉｏｎｏｆｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ＸＸＩＩ，Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅｏｆｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＰｈａｒｍａｃｏｌＲｅｖ，５２：１４５−１７６（２０００））。

本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用できるケモカインは、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３α）、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ８（ＩＬ−８）、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ２３、ＣＸ３ＣＬ１、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３及びＣＸＣＬ７を含み、より好ましくは、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＣＬ２、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１３及びＣＣＬ２５を含み、さらに好ましくは、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２及びＣＸＣＬ１２を含み、最も好ましくは、ＣＣＬ２０及びＣＸＣＬ８を含む。

前記ＣＣＬ２０及びＣＸＣＬ８のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び配列番号２に記載されている。

本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用されるケモカインの濃度は、生分解性支持体（１ｇ）当り１０〜１，０００ｎｇ／ｍｌであり、より好ましくは、生分解性支持体（１ｇ）当り２０〜８００ｎｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは、生分解性支持体（１ｇ）当り３５〜７００ｎｇ／ｍｌであって、最も好ましくは、生分解性支持体（１ｇ）当り５０〜５００ｎｇ／ｍｌである。

本明細書の用語‘生分解性支持体（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅｓｃａｆｆｏｌｄｓ）’は、前記化学走性因子を含有した生分解性ポリマーからなる３次元構造体を意味し、移植を通じてターゲット位置（例えば、損傷した関節軟骨または皮膚組織）に損傷組織の再生に必要な細胞の移動を誘導する支持体として機能する。好ましくは、本発明の生分解性支持体は、生体的合成物質であって、一般に多孔性微細支持体を形成し、移動する細胞のための物理的支持体を提供して、移植された位置に治療または再生用細胞の流入のために提供される。

本発明の生分解性支持体は、化学走性を有して、これにより、損傷した組織に必要な細胞（好ましくは、幹細胞またはケラチン細胞）のホーミングを促進させる。流入された細胞は、損傷したターゲット部位で再生効能を発揮する。

本発明によると、本発明の生分解性支持体の移植は、移動された細胞数を著しく増加させて（参考：図２ｂ及び図４ｄ）、移動距離及び移動速度（図２ｃ）も明らかに増加させた。また、前記移植は、細胞移動のみを増加させただけで、細胞分化上に何の影響も与えなかった（図３）。これは、本発明の生分解性支持体が、損傷した組織再生のために必要な細胞の流入だけを促進させるということを意味する。

本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用できる生分解性支持体は、生体内で分解できる条件下で如何なる大きさ、形態または組成物にも利用できる。

本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用できる生分解性支持体は、ＰＬＧＡ（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃａｃｉｄ））、ＰＬＡ（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃａｃｉｄ）、ＰＧＡ（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃａｃｉｄ）、ＰＣＬ（ｐｏｌｙ−ε−ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、ＰＡＡ（ｐｏｌｙ（ａｍｉｎｏａｃｉｄ））、ポリアンハイドライド、ポリオルトエステル、これらの誘導体、共重合体、及びこれらの混合物；コラーゲンゲル、ポリビニルアルコールスポンジ、ポリサッカライド（例えば、アルギネート）、ポリフォスファゼン、ポリアクリレート及びポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロック共重合体から構成された群から選択されて、より好ましくは、ＰＬＧＡ、ＰＬＡ、ＰＧＡ、ＰＣＬ、ＰＡＡ、ポリアンハイドライド、ポリオルトエステル及びこれらの誘導体、共重合体及びこれらの混合物から構成された群から選択されて、最も好ましくは、ＰＬＧＡである。

本発明の好ましい具現例によると、本発明の組成物で治療される損傷組織は、骨組織、関節組織または皮膚組織である。

関節軟骨損傷（ｊｏｉｎｔｏｒｃａｒｔｉｌａｇｅｉｎｊｕｒｙ）は、損傷部位への軟骨細胞の移動がほとんど起こらず、自発的な治癒ができない。関節軟骨損傷の治療法としては、自家軟骨細胞移植法及び骨髄穿孔術などがあるが、下記のような短所がある：（ａ）繰り返される手術；（ｂ）供与部の制限性；及び（ｃ）十分な間葉系幹細胞の流入の困難。

最近は、従来の関節軟骨損傷治療法の短所を克服するために、間葉系幹細胞を軟骨損傷治療源として注目している。

間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＭＳＣｓ）は、骨、軟骨、筋肉、靭帯、腱及び脂肪のような間葉系組織（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｉｓｓｕｅｓ）に分化及び再生できる非造血基質細胞（ｎｏｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ）であって、多様な組織に存在する。例えば、ＭＳＣｓは、骨髄に少ない数（例えば、１０，０００個の単核細胞当り約１個）で存在すると知られている。また、たとえ不滅化はできないとしても、ＭＳＣｓは、成長及び多系統分化能を維持しながら数十倍に培養されて増殖する能力を有する。また、たとえＭＳＣが損傷した組織に移動するように見えるとしても、これらの移動（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）及び組織ホーミングは正確に理解できない過程である。例えば、ケモカイン及びその受容体のうち、ＣＸＣＲ４は、造血母幹細胞及び癌細胞転移に重要であると知られているが（ＺｏｕＹＲ，ｅｔａｌ．，ＦｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒＣＸＣＲ４ｉｎｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓａｎｄｉｎｃｅｒｅｂｅｌｌａｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｎａｔｕｒｅ，３９３：５９５−５９９（１９９８））、ＭＳＣインビトロ移動及びＭＳＣインビボホーミングでＣＸＣＲ４発現の必要性は評価されない。また、幾つかの報告から、損傷した組織に運搬されたＭＳＣｓが回復を誘導できるということが知られているが、制限されたＭＳＣｓだけが復旧された組織に分化されるということが証明された。このような不一致は、下記のような理由で説明できる：（ａ）復旧された組織からＭＳＣｓの分離の技術的困難；（ｂ）治癒段階で含まれた細胞へのＭＳＣ分化程度の同定；（ｃ）ＭＳＣ活性メカニズムで、分化ではなくＭＳＣの再生誘導可能性。

上述のように、臨床的にＭＳＣｓを適用するための数多い研究があったが、ＭＳＣｓが損傷部位に回帰（ｒｅｃｒｕｉｔ）して生存することによりインビボ治療効能を発揮するための効果的な方法の開発は、まだ不十分な状態である。

本発明の組成物は、関節組織（ｊｏｉｎｔｔｉｓｓｕｅ）以外の一般的な骨（骨組織）損傷部位にＭＳＣｓをホーミングして組織再生に寄与することにより、骨関連疾患を治療することができる。本発明の組成物が移植できる骨組織は、肋骨、頭蓋骨、腸骨、上腕骨、脊髄骨、骨盤骨、肩骨などの体内のあらゆる骨格部位を含むが、これらに限定されるものではない。

本発明の好ましい具現例によると、本発明の組成物が移植できる関節部位は、股関節、肩、膝、足首、手首、肘、足根骨、尺骨、脊髄骨、足首骨、腸骨及び顎関節を含むが、これらに限定されるものではない。

本発明の損傷した関節軟骨部位は、硝子軟骨（ｈｙａｌｉｎｅｃａｒｔｉｌａｇｅ；例えば、関節、鼻、喉頭または胸骨にある硝子軟骨）、弾性軟骨（（ｅｌａｓｔｉｃｃａｒｔｉｌａｇｅ；例えば、耳にある弾性軟骨）及び繊維軟骨（ｆｉｂｒｏｃａｒｔｉｌａｇｅ；例えば、椎間板）を含むが、これらに限定されるものではない。

本発明の組成物により治療できる骨疾患または関節軟骨疾患は、骨関節炎及び関節リウマチを含む関節炎、骨多孔症、骨軟骨症、骨軟骨炎、不完全骨形成症、骨髄炎、骨増殖体、軟骨形成不全症、軟骨炎、軟骨腫、軟骨肉腫、椎間板脱出症、クリッペル・ファイル症候群、変形性骨炎、嚢胞性線維性骨炎、及び事故、骨折、傷、関節損傷、自己免疫疾患、糖尿病及び癌による組織損傷に係わる関節軟骨疾患を含むが、これらに限定されるものではない。

本発明の組成物は、損傷した皮膚組織の再生及び治療にも有用に利用できる。本発明によると、本発明で選別された化学走性因子であるＩＬ−８及びＭＩＰ−３αは、損傷した皮膚組織にヒトケラチン細胞の流入を大きく増加させ、皮膚表皮、真皮及び皮下組織の再生を促進することができる。

本明細書において、用語‘ケラチン細胞（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）’は、当業界で‘皮膚細胞’、‘角質細胞’または‘ケラチン形成細胞’とも呼ばれ、表皮の基底層に存在して‘基底細胞（ｂａｓａｌｃｅｌｌ）’または‘基底ケラチン細胞（ｂａｓａｌｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）’とも呼ばれるため、これらを全部含む意味である。

皮膚の再生または傷治療は、免疫反応、再上皮化（ｒｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）、肉芽組織形成（ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）、繊維組織形成（ｆｉｂｒｏｐｌａｓｉａ）、傷組織の収縮（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ）など、多様な過程を通じてなされて、皮膚再生の一連の過程において、ケラチン細胞の移動、増殖、分化は重要な役割をする。ケラチン細胞は、皮膚の最外郭を構成する表皮（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）の９５％を占める細胞であって、一次的な機能は、病原菌（バクテリア、寄生虫、ウイルスなど）、熱、紫外線及び水分喪失のような外部的な被害から保護膜を形成することである。ケラチン細胞は、基底層で生成されて表面の顆粒層（ｇｒａｎｕｌａｒｌａｙｅｒ）に向いて上がってきて、ここで生成されたケラチンが既存の細胞構成及び皮膚組織を代替して、究極的に皮膚の再生を助ける。したがって、皮膚組織の損傷部位にケラチン細胞が効率的に移動するように誘導する本発明の組成物は、有効な皮膚疾患治療用組成物として応用できる。

本発明の組成物により治療できる皮膚疾患は、火傷、凍傷、創傷、ケロイド、組織の化学的破壊、擦過傷（ａｂｒａｓｉｏｎ）、骨壊疽、裂傷（ｌａｃｅｒａｔｉｏｎ）、引き抜き損傷（ａｖｕｌｓｉｏｎ）、貫通傷（ｐｅｎｅｔｒａｔｅｄｗｏｕｎｄ）、切傷、打撲傷（ｃｏｎｔｕｓｉｏｎｏｒｂｒｕｉｓｅ）、皮膚潰瘍、皮膚角化症、褥瘡、臥瘡及びニキビを含むが、これらに限定されるものではない。

本発明の好ましい具現例によると、本発明の組成物が移植できる皮膚組織は、表皮、真皮及び皮下組織を含むが、これらに限定されるものではない。

本発明の好ましい具現例によると、本発明で流入が誘導された細胞は、幹細胞またはケラチン細胞である。前記幹細胞は、自家（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）幹細胞または非自家（ｎｏｎ−ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）幹細胞を含み、好ましくは、自家幹細胞であり、より好ましくは、自家間葉系幹細胞または自家外胚葉幹細胞であって、最も好ましくは、骨髄由来の間葉系幹細胞または皮膚幹細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓｔｅｍｃｅｌｌ）である。

本発明の組成物は、（ａ）上述の生分解性支持体の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物としても提供できる。

本明細書において、用語‘薬剤学的有効量’は、上述の損傷組織の治療または再生活性を達成するのに十分な量を意味する。

本発明の組成物が薬剤学的組成物に製造される場合、本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体を含む。本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。

本発明の薬剤学的組成物は、損傷した部位に直接的に投与して、例えば、皮下注入、筋肉注入、経皮投与、関節腔内注射などで投与できる。

本発明の薬剤学的組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方できる。

本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、または多用量容器内に入れて製造できる。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。

本発明によると、本発明の組成物は、生きている哺乳動物に移植できて、より好ましくは、損傷した関節部位（例えば、関節軟骨）または皮膚組織に移植できる。

本発明の好ましい具現例によると、前記哺乳動物は、特に制限されず、好ましくは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、猿、豚、馬、牛、羊、犬及び猫を含み、より好ましくは、ヒト及びマウスを含む。

本発明の他の態様によると、（ａ）ＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）−８、ＭＩＰ（ＭａｃｒｏｐｈａｇｅＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙＰｒｏｔｅｉｎ）−３α、これらの誘導体及びこれらの組合せから構成された群から選択される１つ以上の化学走性因子を含む溶液に生分解性支持体（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅｓｃａｆｆｏｌｄｓ）を浸す段階と、（ｂ）前記生分解性支持体を、損傷した組織部位に移植させる段階と、を含む、損傷した組織部位に治療用細胞のインビボ移動を誘導する方法を提供する。

本発明の方法で利用される化学走性因子及び生分解性支持体については既に詳述したため、過度なる重複を避けるためにその記載を省く。

本発明の他の態様によると、（ａ）ＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）−８、ＭＩＰ（ＭａｃｒｏｐｈａｇｅＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙＰｒｏｔｅｉｎ）−３α、これらの誘導体及びこれらの組合せから構成された群から選択される１つ以上の化学走性因子を含む溶液に生分解性支持体（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅｓｃａｆｆｏｌｄｓ）を浸す段階と、（ｂ）前記生分解性支持体を、損傷した組織部位に移植させる段階と、を含む、損傷した組織の治療方法を提供する。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。

対象及び方法
細胞培養
ヒトの骨髄由来の間葉系幹細胞は、自家腸骨移植術が必要な患者の同意下、ＩＲＢ審議を経て、後腸骨稜（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒｉｌｉａｃｃｒｅｓｔ）から骨髄を吸引して遠心分離し、骨髄内細胞を沈殿させてペレットを製造し、上済み液を除去した後、ＤＭＥＭ−ＬＧ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄｅａｇｌｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ−ｌｏｗｇｌｕｃｏｓｅ；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）培養液に１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清（ＦＢＳ，ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ；ＧＩＢＣＯＢＲＬ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ），１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリンＧ（ＧＩＢＣＯ）及び０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）が添加された基本培養液で洗浄した後、Ｔ−７５ｃｍ^２細胞培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に分株させて、４日間培養した。以後、フラスコ底に付着されていない細胞は除去し、底に付着された間葉系幹細胞は、３日間隔で培養液を入れ替えて、フラスコに約９０％程度満たされると、継代培養を行った。分離された骨髄由来の間葉系幹細胞は、２または３継代培養まで細胞を増殖させて、全ての実験は、２または３継代の細胞を使用した。

体外軟骨損傷条件の形成
体外軟骨損傷条件は、前炎症性サイトカインであるＩＬ−１β（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）またはＴＮＦ−α（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）で処理することにより組成した。間葉系幹細胞を１２時間牛胎児血清の含まれていないＤＭＥＭ−ＬＧ培養液で培養した後、１０ｎｇ／ｍｌの濃度でＩＬ−１βまたはＴＮＦ−αを培養液に添加して、４、２４、４８時間細胞を培養した後、実験に使用した。

逆転写ＰＣＲ法（ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）
正常間葉系幹細胞で発現するケモカイン受容体を選別するためにＲＮｅａｓｙｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用して間葉系幹細胞の総ＲＮＡを抽出して、逆転写ＰＣＲ法を通じてケモカイン受容体の遺伝子発現を分析した。分析したケモカイン受容体は、ＣＣＲ１−１０、ＣＸＣＲ１−７、ＣＸ３ＣＲ、ＸＣＲ１であって、総１９個である（表１−１及び１−２）。増幅されたケモカイン受容体のＤＮＡは、３１００ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｓｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用したＤＮＡ塩基配列分析技法を利用して、互いに重複する配列がないことを確認した。

逆ドットブロット−ハイブリダイゼーション（ＲｅｖｅｒｓｅＤｏｔ−ＢｌｏｔＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）
ＩＬ−１βまたはＴＮＦ−αにより発現が増加するケモカイン受容体を選別するために、逆転写ＰＣＲ法を利用して１９個のケモカイン受容体のＤＮＡを合成して試料ＤＮＡとして使用して、４、２４または４８時間ＩＬ−１βまたはＴＮＦ−αの刺激を受けた間葉系幹細胞のｃＤＮＡを、ＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔＲＴＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を利用して合成してプローブｃＤＮＡとして使用した。ケモカイン受容体のＤＮＡをナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）にドッティング（ｄｏｔｔｉｎｇ）して、紫外線（１２００×１００ μｊｕｌｅｓ）を照射して固定し、前炎症性サイトカインの刺激を受けた間葉系幹細胞のｃＤＮＡをＲｅｄｉｐｒｉｍｅＩＩｒａｎｄｏｍｐｒｉｍｅｌａｂｅｌｉｎｇｓｙｓｔｅｍ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＵＫＬｉｍｉｔｅｄ．ＡｍｅｒｓｈａｍＰｌａｃｅ，ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）とγ^３２Ｐ−ｄＣＴＰ（ＮＥＮＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＵＳＡ）を利用して標識した。膜に固定されたケモカイン受容体のＤＮＡと標識された間葉系幹細胞のｃＤＮＡは、４２℃で１５時間ハイブリダイズした。膜を洗浄した後、蛍光イメージ分析器（ＦＬＡ−７０００，Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，Ｊａｐａｎ）でシグナルを検出し、密度計測器（ＴＩＮＡｐｉｘｅｌａｎａｌｙｚｅｒｖｅｒｓｉｏｎ２．１０，ＲａｙｔｅｓｔＩｓｏｔｏｐｅｎｍｅｇｅｒａｔｅＧｍｂＨ，Ｓｔｒａｕｂｅｎｈａｒｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して定量化した。定量化された結果値は、ペアｔ−検定（ｐａｉｒｅｄｔ−ｔｅｓｔｓ）を利用して、統計学的有意性を検証した（Ｐ−値＜０．０５）。

細胞増殖に対する影響
細胞増殖に対する影響を確認するために、ＭＳＣに５０−５００ｎｇ／ｍｌのケモカインを処理して１日から４日間培養した。ケモカイン刺激後、各日付別にＭＴＴ法を利用して細胞増殖率を測定した。

細胞分化に対する影響
軟骨芽細胞への分化誘導のために、１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ−β３（Ｒ＆ＤｓｙｓｔｅｍＩｎｃ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）及び３０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（ＳｉｇｍａＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）が添加された基本培養液［１０％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ），１％抗生剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）溶液（ＧＩＢＣＯ）が含有されたＤＭＥＭ−ＬＧ（ＧＩＢＣＯ）］で１４日間軟骨分化を誘導し、ＴＧＦ−β３を処理しなかった間葉系幹細胞と比較し、軟骨分化状態を検査した。骨芽細胞への分化誘導のために骨芽細胞分化培養液［１０ｍＭ β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｉｇｍａ），１００μＭｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ），５０μｇ／ｍｌａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ−２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｉｇｍａ）が添加された基本培養液］で１４日間分化誘導後、基本培養液で培養した間葉系幹細胞と比較した。

傷治癒及び実時間細胞移動速度の測定
傷形成のためにシリコン培養挿入（ｓｉｌｉｃｏｎｃｕｌｔｕｒｅｉｎｓｅｒｔ；ＩＢＩＤＩ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用してＭＳＣを培養した後、細胞に５００ｎｇ／ｍＬのケモカイン刺激を加えて、傷治癒程度を、移動した細胞数を数えて分析し、移動する細胞を実時間追跡して移動距離及び速度を測定した。

細胞化学走性の確認
インビトロ細胞化学走性は、８μｍ孔大きさのトランスウェルインサート（Ｆａｌｃｏｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して細胞を培養した後、マイクロポアを通過してケモカインに向いて移動した細胞をカウントして評価した。インビトロ細胞化学走性は、蛍光標識された１．５×１０^６個のＭＳＣが、尻尾血管に注入されてヌードマウス皮下に移植されたケモカイン（ＩＬ−８、ＭＩＰ−３ａ）を含有したＰＬＧＡ支持体（韓国科学技術研究院バイオ素材センターキムスヒョン博士からの提供）に向いて移動することを実時間撮影装備（Ｏｐｔｉｘ，ＡＲＴ，ＵＳＡ）で観察した。

実験結果
間葉系幹細胞で発現するケモカイン受容体
逆転写ＰＣＲ法を行うために製作したヒトのケモカイン受容体に対するプライマー配列は表１−１及び１−２に示したとおりである。表１−１及び１−２のプライマーにより増幅された遺伝子の塩基配列は、ＤＮＡ塩基配列分析法を通じて、他のケモカイン受容体の配列と重複しないことを確認した（結果は示していない）。ＲＴ−ＰＣＲを通じて、ヒトの骨髄由来の正常間葉系幹細胞から１９個のケモカイン受容体の発現を分析した（図１）。３人以上の供与者（ｄｏｎｏｒ）から得た間葉系幹細胞からケモカイン受容体の発現を分析した結果、ＣＣＲ２、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ５及びＣＸＣＲ７が３人以上の間葉系幹細胞から共通的に発現した。

関節軟骨損傷時、骨髄由来の間葉系幹細胞で発現が増加するケモカイン受容体
関節軟骨が損傷すると、前炎症性サイトカイン（ＩＬ−１βまたはＴＮＦ−α）が分泌されて、これに刺激された軟骨細胞などにより多様な化学走性因子の分泌が増加する［非特許文献２３］。したがって、関節軟骨損傷モデルにおいて、間葉系幹細胞で発現するケモカイン受容体のうち、どのような受容体が増加するか調べるために、逆ドットブロット−ハイブリダイゼーションを利用して、３人の供与者から得た間葉系幹細胞において４、２４及び４８時間目にＩＬ−１βまたはＴＮＦ−αの刺激により増加するケモカイン受容体を分析した。本研究では、代表供与者１人に対する結果だけを示しているが、反復実験を通じて、３人の供与者由来の間葉系幹細胞において、ケモカイン受容体の発現様相が全部類似していることを確認した（図２）。逆ドットブロット−ハイブリダイゼーションの結果を、各供与者の間葉系幹細胞に対する結果を密度計測器（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）（ＴＩＮＡＰｉｘｅｌＡｎａｌｙｚｅｒｖｅｒｓｉｏｎ２．１０（ＲａｙｔｅｓｔＩｓｏｔｏｐｅｎｍｅｇｅｒａｔｅＧｍｂＨ，Ｓｔｒａｕｂｅｎｈａｒｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して定量して、２倍以上（ｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ≧２）増加した受容体を刺激時間によってまとめた結果、各供与者の間葉系幹細胞において、３人の供与者の間葉系幹細胞で共通的に前炎症性サイトカインにより２倍以上増加するケモカイン受容体をまとめてみると、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３などが３人の供与者の間葉系幹細胞で共通的に発現が増加して、その他の受容体は、発現増加率が統計的に有意ではなかった。

上述の結果をまとめてみると、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＸＣＲ１などの受容体が正常間葉系幹細胞で有意に発現して、前炎症性サイトカインによりその発現が３人の供与者の間葉系幹細胞で優位に増加した（２倍以上）。

細胞移動に対する影響
選別された候補物質の細胞移動に対する影響を評価するために、傷治癒技法を行った。既存報告によると、ＳＤＦ１は、ＣＸＣＲ４とＣＸＣＲ７を通じて間葉系幹細胞の化学走性を誘導すると知られている［非特許文献１７］。したがって、本研究で選別された候補因子とＳＤＦ１とを比較してみた。まず、傷治癒効果が細胞増殖ではないことを確認するために、細胞増殖に対する影響を調べた結果、５０、１００、または５００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞毒性及び細胞増殖に対して何の影響を与えなかった（図２ａ）。４つの候補物質のうち、ＩＬ−８とＭＩＰ−３αが最も速い傷治癒結果を示し、多様な濃度のうち、５００ｎｇ／ｍｌの濃度で最もよい結果を確認した（図２ｂ）。次に、動く細胞を実時間で追跡して、細胞の移動距離及び速度を測定した。ＭＩＰ−３αが最も速い速度で最も長い距離を移動したことが確認された（図２ｃ）。

細胞分化に対する影響
１４日間の間葉系幹細胞の骨、軟骨分化誘導の間、候補因子による影響を調べた結果、分化に対して影響を与えなかったことが確認された（図３）。したがって、本研究で発掘されたケモカインは、損傷した関節軟骨再生のために必要な自家間葉系幹細胞の流入を促進すると考えられる。

化学走性評価
インビトロ及びインビボで選別された候補物質の間葉系幹細胞に対する化学走性を評価した。まず、トラスウェルインサートを利用したインビトロ実験で、ＴＮＦαに向いた細胞化学走性が観察された（図４ａ）。一方、選別された４つの候補物質のうち、ＩＬ−８とＭＩＰ−３αがインビトロで細胞化学走性を最も多く誘導して（図４ｂ）、この２つの物質を併用して使用した時、化学走性は、さらに大きく増加することを確認した（図４ｃ）。また、ＩＬ−８及びＭＩＰ−３αにより皮膚組織再生に必須的なケラチン細胞が流入できるかどうかをインビトロ実験で確認した結果、ＩＬ−８とＭＩＰ−３αがケラチン細胞の細胞化学走性を誘導した（図４ｄ）。この結果に基づいて、ＩＬ−８とＭＩＰ−３αにより誘導された細胞化学走性をインビボでも確認した。ＰＬＧＡ支持体をＰＢＳまたはＩＬ−８及びＭＩＰ−３αにそれぞれ２４時間浸した後、ヌードマウスなどの皮下に移植した後、尻尾血管を通じて注入された間葉系幹細胞の移動を、細胞に標識された蛍光を利用して確認した。約２週目に注入された間葉系幹細胞がＩＬ−８及びＭＩＰ−３αから確認されて、６週目まで細胞の移動が増加して観察された（図５）。

肉眼観察及び病理学的所見
支持体と共に移植された化学走性因子による炎症細胞の流入程度を調べて炎症反応を確認するために、６週目に移植された支持体を回収して、肉眼観察及びＨ＆Ｅ染色法を行った。肉眼観察結果、ＰＢＳ群に比べ、ＩＬ−８及びＭＩＰ−３α群の支持体は、移植された部位の周辺組織との融合がよくなっており、血管形成が多かった（図６ａ）。Ｈ＆Ｅ染色の結果、ＰＢＳ群は、移植された支持体の縁部位にのみ一部血管形成があって、その周辺にポア（ｐｏｒｅ）を通じてその細胞が浸透したが、ＩＬ−８またはＭＩＰ−３α群では、血管が支持体の中央部位まで多く形成されており、注入されたヒトの間葉系幹細胞が支持体中央部位まで浸透して細胞外基質を形成した。ＰＢＳ、ＩＬ−８、ＭＩＰ−３α群の３つとも大食細胞などを始めとした炎症性細胞が血管周辺で一部観察されたが、群間の差がなく、３つの群全部、炎症反応所見を確認することができなかった（図６ｂ）。

以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。

ＨｕｎｔｅｒＷ．Ｏｆｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｄｉｓｅａｓｅｏｆａｒｔｉｃｕｌａｔｉｎｇｃａｒｔｉｌａｇｅｓ．１７４３．ＰｈｉｌｏｓＴｒａｎｓＲＳｏｃＬｏｎｄ１９９５；４２ｂ：５１４−２１．ＢｕｃｋｗａｌｔｅｒＪＡ，ＭａｎｋｉｎＨＪ．Ａｒｔｉｃｕｌａｒｃａｒｔｉｌａｇｅｒｅｐａｉｒａｎｄｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ１９９８；４１：１３３１−４２．ＰｒｉｄｉｅＫ．Ａｍｅｔｈｏｄｏｆｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓｋｎｅｅｊｏｉｎｔｓ．ＪＢｏｎｅＪｏｉｎｔＳｕｒｇＢｒ１９５９；４１：６１８９．ＳｔｅａｄｍａｎＪＲ，ＲｏｄｋｅｙＷＧ，ＢｒｉｇｇｓＫＫ，ＲｏｄｒｉｇｏＪＪ．Ｔｈｅｍｉｃｒｏｆｒａｃｔｕｒｅｔｅｃｈｎｉｃｉｎｔｈｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆｃｏｍｐｌｅｔｅｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｓｉｎｔｈｅｋｎｅｅｊｏｉｎｔ．Ｏｒｔｈｏｐａｄｅ１９９９；２８：２６−３２ＢｒｉｔｔｂｅｒｇＭ，ＬｉｎｄａｈｌＡ，ＮｉｌｓｓｏｎＡ，ＯｈｌｓｓｏｎＣ，ＩｓａｋｓｓｏｎＯ，ＰｅｔｅｒｓｏｎＬ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｄｅｅｐｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｓｉｎｔｈｅｋｎｅｅｗｉｔｈａｕｔｏｌｏｇｏｕｓｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ１９９４；３３１：８８９−９５．ＰｅｌｔｔａｒｉＫ，ＬｏｒｅｎｚＨ，ＢｏｅｕｆＳ，ＴｅｍｐｌｉｎＭＦ，ＢｉｓｃｈｅｌＯ，ＧｏｅｔｚｋｅＫ，ｅｔａｌ．Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ３ｂｙｅｘｐａｎｄｅｄａｒｔｉｃｕｌａｒｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓａｓａｐｒｅｄｉｃｔｏｒｏｆｅｃｔｏｐｉｃｃａｒｔｉｌａｇｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔｙｉｎｖｉｖｏ．ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ２００８；５８：４６７−７４．ＫｅｓｓｌｅｒＭＷ，ＡｃｋｅｒｍａｎＧ，ＤｉｎｅｓＪＳ，ＧｒａｎｄｅＤ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓａｎｄｆｏｕｒｔｈｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｓｓｕｅｓｉｎｃａｒｔｉｌａｇｅｒｅｐａｉｒ．ＳｐｏｒｔｓＭｅｄＡｒｔｈｒｏｓｃ２００８；１６：２４６−５４．ＤｅＬｉｓｅＡＭ，ＦｉｓｃｈｅｒＬ，ＴｕａｎＲＳ．Ｃｅｌｌｕｌａｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓａｎｄｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＯｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓＣａｒｔｉｌａｇｅ２０００；８：３０９−３４．ＤｉｃｋｈｕｔＡ，ＧｏｔｔｗａｌｄＥ，ＳｔｅｃｋＥ，ＨｅｉｓｅｌＣ，ＲｉｃｈｔｅｒＷ．Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｇｅｌ−ｌｉｋｅｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏ．ＦｒｏｎｔＢｉｏｓｃｉ２００８；１３：４５１７−２８．ＳｔｅｃｋＥ，ＦｉｓｃｈｅｒＪ，ＬｏｒｅｎｚＨ，ＧｏｔｔｅｒｂａｒｍＴ，ＪｕｎｇＭ，ＲｉｃｈｔｅｒＷ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎａｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔ：ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｏｆｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙｔｏｂｏｎｅ−ｃｌｏｓｅｎｅｏｃａｒｔｉｌａｇｅ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＤｅｖ２００９；１８：９６９−７８．ＺｈａｏＬＲ，ＤｕａｎＷＭ，ＲｅｙｅｓＭ，ＫｅｅｎｅＣＤ，ＶｅｒｆａｉｌｌｉｅＣＭ，ＬｏｗＷＣ．Ｈｕｍａｎｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｓｔｅｍｃｅｌｌｓｅｘｈｉｂｉｔｎｅｕｒａｌｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓａｎｄａｍｅｌｉｏｒａｔｅｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌｄｅｆｉｃｉｔｓａｆｔｅｒｇｒａｆｔｉｎｇｉｎｔｏｔｈｅｉｓｃｈｅｍｉｃｂｒａｉｎｏｆｒａｔｓ．ＥｘｐＮｅｕｒｏｌ２００２；１７４：１１−２０．ＪｉｎＨＫ，ＣａｒｔｅｒＪＥ，ＨｕｎｔｌｅｙＧＷ，ＳｃｈｕｃｈｍａｎＥＨ．Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｔｏａｃｉｄｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅｄｅｆｉｃｉｅｎｔｍｉｃｅｄｅｌａｙｓｔｈｅｏｎｓｅｔｏｆｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓａｎｄｅｘｔｅｎｄｓｔｈｅｉｒｌｉｆｅｓｐａｎ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ２００２；１０９：１１８３−９１．ＴｕｒｇｅｍａｎＧ，ＰｉｔｔｍａｎＤＤ，ＭｕｌｌｅｒＲ，ＫｕｒｋａｌｌｉＢＧ，ＺｈｏｕＳ，ＰｅｌｌｅｄＧ，ｅｔａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｈｕｍａｎｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ：ａｎｏｖｅｌｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｓｋｅｌｅｔａｌｃｅｌｌｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ．ＪＧｅｎｅＭｅｄ２００１；３：２４０−５１．ＬａｐｉｄｏｔＴ，ＤａｒＡ，ＫｏｌｌｅｔＯ．Ｈｏｗｄｏｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｉｎｄｔｈｅｉｒｗａｙｈｏｍｅ？Ｂｌｏｏｄ２００５；１０６：１９０１−１０．ＦｒｅｎｅｔｔｅＰＳ，ＳｕｂｂａｒａｏＳ，ＭａｚｏＩＢ，ｖｏｎＡｎｄｒｉａｎＵＨ，ＷａｇｎｅｒＤＤ．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｓｅｌｅｃｔｉｎｓａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ−１ｐｒｏｍｏｔｅｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｈｏｍｉｎｇｔｏｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１９９８；９５：１４４２３−８．ＰａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕＴ，ＰｒｉｅｓｔｌｅｙＧＶ，ＮａｋａｍｏｔｏＢ，ＺａｆｉｒｏｐｏｕｌｏｓＶ，ＳｃｏｔｔＬＭ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐａｔｈｗａｙｓｉｎｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｈｏｍｉｎｇ：ｄｏｍｉｎａｎｔｒｏｌｅｏｆａ（４）ｂ（１）ｏｖｅｒｂ（２）−ｉｎｔｅｇｒｉｎｓａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｎｓ．Ｂｌｏｏｄ２００１；９８：２４０３−１１．ＬａｐｉｄｏｔＴ，ＫｏｌｌｅｔＯ．ＴｈｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｓｏｆｔｈｅｃｈｅｍｏｋｉｎｅＳＤＦ−１ａｎｄｉｔｓｒｅｃｅｐｔｏｒＣＸＣＲ４ｉｎｈｕｍａｎｓｔｅｍｃｅｌｌｈｏｍｉｎｇａｎｄｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｉｍｍｕｎｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔＮＯＤ／ＳＣＩＤａｎｄＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｂ２ｍ（ｎｕｌｌ）ｍｉｃｅ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ２００２；１６：１９９２−２００３．ＢａｇｇｉｏｌｉｎｉＭ．Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓｉｎｐａｔｈｏｌｏｇｙａｎｄｍｅｄｉｃｉｎｅ．ＪＩｎｔｅｒｎＭｅｄ２００１；２５０：９１−１０４．ＬｕｓｔｅｒＡＤ．Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃｃｙｔｏｋｉｎｅｓｔｈａｔｍｅｄｉａｔｅｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ１９９８；３３８：４３６−４５．ＲｏｌｌｉｎｓＢＪ．Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ．Ｂｌｏｏｄ１９９７；９０：９０９−２８．ＲｉｃｈａｒｄＨ．Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ＣｙｔｏｋｉｎｅａｎｄＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｖｉｅｗｓ２００１；１２；３１３−３５．ＰｏｎｔｅＡＬ，ＭａｒａｉｓＥ，ＧａｌｌａｙＮ，ＬａｎｇｏｎｎＡ，ＤｅｌｏｒｍｅＢ，ＨＯ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｉｎｖｉｔｒｏｍｉｇｒａｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔｙｏｆｈｕｍａｎｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｃｈｅｍｏｋｉｎｅａｎｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２００７；２５：１７３７−４５．ＳａｓａｋｉＭ，ＡｂｅＲ，ＦｕｊｉｔａＹ，ＡｎｄｏＳ，ＩｎｏｋｕｍａＤ，ＳｈｉｍｉｚｕＨ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｒｅｒｅｃｒｕｉｔｅｄｉｎｔｏｗｏｕｎｄｅｄｓｋｉｎａｎｄｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｔｏｗｏｕｎｄｒｅｐａｉｒｂｙｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｔｏｍｕｌｔｉｐｌｅｓｋｉｎｃｅｌｌｔｙｐｅ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ２００８；１５：２５８１−７．

Claims

化学走性因子を含む生分解性支持体（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅｓｃａｆｆｏｌｄｓ）を有効成分として含み、
前記化学走性因子が、ＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）−８とＭＩＰ（ＭａｃｒｏｐｈａｇｅＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙＰｒｏｔｅｉｎ）−３αとの組合せ、またはＭＩＰ−３αを含む、損傷した組織治療用移植組成物（ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）。
前記生分解性支持体は、ＰＬＧＡ（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃａｃｉｄ））、ＰＬＡ（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃａｃｉｄ）、ＰＧＡ（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃａｃｉｄ）、ＰＣＬ（ｐｏｌｙ−ε−ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、ＰＡＡ（ｐｏｌｙ（ａｍｉｎｏａｃｉｄ））、ポリアンハイドライド、ポリオルトエステル、コラーゲンゲル、ハイドロゲル、ポリビニルアルコールスポンジ、ゼラチン、ポリサッカライド、ポリフォスファゼン、ポリアクリレート、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロック共重合体及びこれらの混合物から構成された群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
前記損傷した組織は、骨組織、関節組織または皮膚組織であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
前記関節組織は、股関節、肩、膝、足首、手首、肘、足根骨、尺骨、脊髄骨、足首骨、腸骨または顎関節であることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
前記皮膚組織は、表皮、真皮または皮下組織であることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
前記組成物は、損傷した組織部位に幹細胞またはケラチン細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）の細胞移動能を増大させることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
前記幹細胞は、自家（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）幹細胞であることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
前記幹細胞は、間葉系幹細胞または外胚葉幹細胞であることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
前記組成物は、哺乳動物に適用できることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。