CN101507835B - 一种纳米仿生创面覆盖物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种纳米仿生创面覆盖物及其制备方法,所述纳米仿生创面覆盖物包括纳米仿生支架和附着于其上的水溶胶,所述水溶胶内包覆有一种或几种细胞因子。本发明提供的所述纳米仿生创面覆盖物的制备方法包括制备电纺溶液和含有细胞因子的水溶胶溶液及交联剂溶液;用静电纺丝制得纳米仿生支架;用喷墨打印机将含有细胞因子的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架上等步骤,电纺和打印可以重复,以得到不同厚度的创面覆盖物。本发明采用了原位自体干细胞工程技术,采用干细胞趋化因子吸引自体干细胞定向迁移进入创面并按设计要求进行分化,即避免了使用活细胞带来的不便,又能达到使用与其同等或者更佳的修复效果,有广阔和应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳米仿生创面覆盖物及其制备方法,属于生物医学技术领域。
背景技术
在人体的生命活动中,常见因机械创伤、物理、化学及生物损伤等不同原因造成皮肤的缺损。仅达表皮或浅层真皮或小面积深层真皮的皮肤损伤可以通过包扎和敷用外科辅料类创面覆盖物,依靠原有皮肤自身再生能力痊愈。这些外科辅料类创面覆盖物产品的作用是暂时性的覆盖烧伤创面,防止感染及水分、体液流失,并可能有加速创面愈合的作用。而伤及大面积的深层真皮、或表皮真皮完全损失的皮肤损伤则无法依靠原有皮肤自身再生能力痊愈,必须进行皮肤移植。
自临床开创皮肤移植成功抢救,将皮肤大面积烧伤者的存活率成功由20%以下提升到了64%,皮肤移植从此成为临床救治皮肤损伤的常用手段之一,尤其是严重皮肤损伤的重要手段。目前临床皮肤移植主要是自体皮肤移植和人工皮肤移植两大类型。
目前临床多采用自体皮肤的移植治疗皮肤缺损,然而这种方法有以下缺陷:①常受到供皮来源的限制。由于临床培养周期通常在10天以上,对严重受损的病人而言,缓不济急,尤其是大面积皮肤受伤的病人,皮肤来源有限。因此在临床上将皮肤一分再分,出现了筛状、网点,点状、微粒植皮,直到不可分的细胞,同此也造成临床移植效果不好,出现水疱,不贴附等现象;②以伤治伤,需要二次手术,造成供皮区新的创伤缺陷;③费用昂贵,据估算,做全身皮肤移植费用需要多次手术,总费用在10~40万元/人左右。为了克服上述缺陷,近年来以组织工程技术为基础开发的人工创面覆盖物产品得到了临床应用。
现有技术中的创面覆盖物主要是外科敷料类和人工皮肤类两种。
外科辅料类产品有:甲壳素类、海藻类、硅凝胶、胶原、水凝胶、生物活性玻璃材料、纳米银等。现有的人工皮肤又分为两大类产品,一类是由非活性材料组成,不含活细胞成分;另一类是含细胞的组织工程产品,是真正的组织工程皮肤。前者一般是天然真皮网状纤维结构或者是仿真皮纤维结构,这种网状结构作为细胞生长的支架,甚至营养物质。后者的主要原理是使用人体皮肤纤维细胞或角质细胞种植在合适的生物支架材料上,以模拟人体皮肤结构及功能。
非活性材料人工皮肤一般是天然真皮网状纤维结构或者是仿真皮纤维结构。根据其材料来源,又可以分为两大类:天然材料和人工合成材料两类。
天然材料又可以根据材料来源再分为两类:异种来源和异体来源。异种来源的多半是用猪皮或牛皮,来源于动物,因此无法彻底消除免疫原性,此外还可能携带病毒、传播疾病。临床研究中还发现,异体皮植皮后,与自体植皮相比,血管化更为困难,新生血管较难长入,而随后排斥反应却比传统器官移植要强烈得多。异体来源的取自人的尸体皮,其缺点是缺乏活细胞成分,且来源有限,人工皮中所含的异体表皮细胞可引起免疫排斥反应,非目前通用的免疫抑制剂可以控制,无法彻底消除免疫原性,有传播病毒危险。即使用高效免疫抑制剂,也很难保证皮片不被排斥。人工合成材料的产品的缺点是:无皮肤细胞成分,且与天然皮肤结构差异较大,也缺乏合适孔径和合理分布的释控的生长因子,不能有效诱导皮肤干细胞长入,也不能诱导其合理分化。
含活细胞成分的是真正意义上的组织工程皮肤,如Apligraf(Organogenesis,Inc.)、Dermagraft(Advanced Tissue Science,Inc.)。组织工程方法是通过获得自体或异体的极少量皮肤组织,将其在体外(实验室中)经过灭菌、消化、分离、培养,在获得足够的细胞数量时将其重组制备表皮皮肤组织或全层皮肤组织(包括表皮层及真皮层),用于患者皮肤创伤的修复,这种全层皮肤组织在种植后不易变形,易于愈合,将有着重要的临床价值和社会经济效益。
但由于为了解决临床现货供应的需要,所含的活细胞成分大都需要在预先在体外培养,导致细胞来源都多是异体的,这样,就无法完全消除免疫原性,影响皮肤移植的效果和成功率。同时,由于在目前人体细胞培养过程中,现多用动物血清培养,由于使用了异种动物的血清,就无法完全避免病毒传播的危险。而且目前的体外培养过程周期较长,难以及时满足临床需要。皮肤移植临床研究中还发现由于组织工程化人工皮没有血管系统供给营养,血管化较慢,表面上皮容易坏死脱落。由于移植的表皮膜薄脆,不能牢固地黏附于基底膜,缺乏正常的机能稳定性,因而移植后不可避免地导致许多功能和外观上的减弱,如易感染、瘢痕收缩、水泡形成等,这些都说明人工皮肤的韧性及机械性能同天然皮肤仍有较大的差距。
总结以上已有技术创面覆盖物的不足:
外科辅料类皮肤产品只是暂时性的覆盖创面,其共同缺点在于:
①效果一般,无法达到真皮层完全修复的效果,不含活细胞,不能再生皮肤,只能靠原来的皮肤修复;
②不适用于严重损伤,通常只对于伤及表皮和浅层真皮或小面积深层真皮受损有效,对慢性伤口效果非常有限;对于三度烧伤和大面积深二度烧伤及程度相同的皮肤损伤无效,不能代替人工皮肤。
③这类敷料都有其各自的适用范围和不同的缺点。其中海藻类、硅凝胶、胶原、水凝胶、生物活性玻璃材料等闭合敷料不适于感染创面。纳米银有低毒,而胶原耐用性、生物相容性及制备的高成本是问题。水凝胶最大的缺点就是相对较低的机械强度。海藻类敷料单独应用时粘附性较差。天然甲壳素/壳聚糖类则因为在中性、碱性溶液中溶解性不好,应用受到限制。
非活性材料的人工皮肤有以下缺点:
①由于缺乏活细胞成分,不能再生皮肤,只能靠原来的皮肤修复,也就不能充分发挥皮肤细胞再生增殖能力和其在皮肤修复中的作用,以至于达到的修复效果有限。这是这类材料共同缺点,也是其最大的缺点。
②多数人工材料结构与天然皮肤结构差异较大,缺乏合适孔径和合理分布的释控的生长因子,不能有效诱导皮肤干细胞长入,也不能诱导其合理分化。创面修复的效果有限。
③皮肤移植临床研究中还发现,人工材料的力学性能差,移植后缺乏合适的孔径及不利于周围血管的长入,不如自体移植的皮肤具有弹性和柔软度。
④目前不含活细胞成分的天然材料多来源于动物或异体的真皮,其主要成分为胶原,因此无法彻底消除免疫原性,异种/异体人工皮中所含的异种/异体表皮细胞可引起免疫排斥反应,非目前通用的免疫抑制剂可以控制,无法彻底消除免疫原性,即使用高效免疫抑制剂,也很难保证皮片不被排斥。
⑤异种/异体真皮的使用导致无法完全避免携带病毒、传播疾病的危险。
⑥临床研究中还发现,异体皮植皮后,与自体植皮相比,血管化更为困难,新生血管较难长入,而随后排斥反应却比传统器官移植要强烈得多。
⑦天然材料成本高,改性复杂,来源受限。异体皮肤来源尤其有限。
组织工程皮肤则有以下缺点:
①目前的体外培养过程周期较长,难以及时满足临床需要。
②皮肤移植中也发现由于组织工程化人工皮没有血管系统供给营养,血管化较慢,表面上皮容易坏死脱落。
③由于移植的表皮膜薄脆,不能牢固地黏附于基底膜,缺乏正常的机能稳定性,因而移植后不可避免地导致许多功能和外观上的减弱,如瘢痕收缩、水泡形成等,这些都说明人工皮肤的韧性及机械性能同天然皮肤仍有较大的差距。
④大多人工皮肤使用异体表皮细胞,可引起免疫排斥反应,非目前通用的免疫抑制剂可以控制,皮片最终坏死脱落,目前尚不能用于大面积深度烧伤创面。
⑤异体和异种来源的人工皮肤不仅无法彻底消除免疫原性,此外还可能携带病毒、传播疾病。由于为了解决临床现货供应的需要,组织工程皮肤所含的活细胞成分多需要在预先在体外培养,导致目前市场上商业化的人工皮肤细胞来源是异体的,这也导致了免疫原性。由于目前在人体细胞培养过程中,多用动物血清培养,因此无法避免病毒传播的危险。
总之,目前的组织工程皮肤生产成本昂贵、生产周期长,保存、运输困难,不利于大规模产业化生产及临床推广。
生物打印技术是近年来出现的新技术。生物打印能按预定计划精确定位,这和打印技术的特点是一致的。生物打印与一般打印的不同仅在于其墨水和接受打印的纸张不一样。生物打印的纸片是在体内可降解的生物纸片;生物打印的“生物墨水”是特制的细胞溶液或有生物活性的细胞因子溶液。生物打印技术是将这种特制溶液喷射到可生物降解的生物纸片上。打印后再将纸片按一定顺序的堆叠。由于使用了打印技术,可以将细胞或/和细胞因子(“生物墨水”)精确的结合到预定部位;而按特定的堆叠方式的生物纸片则会形成三维结构。理论上如果所用的生物墨水是细胞溶液,则形成三维的组织结构和器官,最后生物纸片降解,细胞保留下来,形成立体结构,例如,活的三维组织、血管和器官。但是生物打印技术仍处于基础研究的阶段,还没有出现直接利用细胞通过生物打印技术制备的人工器官,也没有见到相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服已有技术的不足,提供一种成本较低、生产周期很短、保存、运输容易、不带病毒、无免疫排斥或免疫排斥作用极低的、应用范围广泛的纳米仿生创面覆盖物,具体地说,本发明以细胞因子作为墨水,利用生物打印技术成功制备得到人工皮肤。
本发明的另一个目的是提供上述纳米仿生创面覆盖物的制备方法,所述方法简单易行、可适应大规模生产、成本低,同时拓宽了生物打印技术应用范围的。
本发明通过以下技术方案实现上述目的:
一种纳米仿生创面覆盖物,所述创面覆盖物为膜状结构,包括纳米仿生支架和附着于其上的水溶胶,所述水溶胶内包覆有一种或几种细胞因子。
本发明的纳米仿生创面覆盖物的厚度、形状和大小根据具体的应用场合来决定,如不同受伤程度的创面,不同的人体部位,应用于动物体的创面等多种情形。
所述纳米仿生支架是采用支架材料通过静电纺丝技术制备得到,所述支架材料包括:聚乳酸、聚己内酯、聚乙交酯、聚氨酯、聚乙二醇、聚对苯二甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚羟基丁酸己酸酯、聚磷酸酯、聚氨基甲酸酣、聚L-乳酸、聚酯酰胺、聚乙烯醇、聚丙交酯、聚氧乙烷、聚对二恶酮、丙交酯、乙交酯、丁内酯、戊内酯、己内酯、环氧乙烷、环氧丙烷、聚氨酯类、聚碳酸酯、胶原蛋白、明胶、壳聚糖、改性壳聚糖、淀粉、纤维素、改性纤维素、明胶、纤维蛋白、丝蛋白、弹力蛋白拟态的肽聚合物、海藻酸、硫酸软骨素,肝素,琼脂,葡聚糖、褐藻酸。将上述材料溶于一定的溶剂,形成电纺液,就可以通过静电纺丝技术得到纳米仿生支架。这些溶剂可以为甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、六氟异丙醇、三氟乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、氯仿、二噁烷、三氟乙烷、三氟乙酸、水或它们任意比例的混合物。上述的高分子材料和溶剂用于静电纺丝的相关技术,例如材料与溶剂的重量比例等参照现有技术。
用上面提到的一种或两种以上混合材料通过静电纺丝技术,可以按照具体需要做出合适孔径和直径的纳米材料。此项工艺在本发明制备方法一节有详细叙述,操作简单,所得到的纤维是纳米级的,比传统的方法得到的无纺布直径小几个数量级,其直径分布是几个纳米到几个微米,并可通过工艺参数调整得到不同直径,做到和人体真皮网状结缔组织高度相似,形成的网状结构的孔径大小和其分布也可调整,以利于不同类型的细胞迁入,如50±20微米的孔径有利于血管内皮细胞长入,而神经纤维则需要30~100微米的孔径。本发明采用上述材料的电纺丝(纳米仿生支架)根据创面修复过程自动安全降解,避免了结缔组织的异常增生,出现瘢痕、水泡等现象;避免了新生上皮坏死脱落现象的出现,保持了人的正常外貌,达到和人体自身皮肤的韧性及机械性完全相同的效果。
所述的纳米仿生支架在生物打印中同时起到生物“纸片”的作用。
所述水溶胶可以是以下聚合物制成的水溶胶:多糖类聚合物,如淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸或壳聚糖;多肽类聚合物,如胶原、聚L-赖氨酸或聚L-谷胺酸;合成的亲水高分子聚合物,如聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺或聚N-聚代丙烯酰胺。上述聚合物制备的水溶胶通过改变温度、酸碱度、经紫外线照射或者加入交联剂(固化液)等方法,可由液态转变为固态。
所述细胞因子是对细胞的归巢或趋化或细胞分化起作用的因子。这些因子可选自细胞定向迁移因子(SDF-1)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、白介素IL-3、血管生成素结合因子(ECM)、转化生长因子-α(TGF-α)、血小板衍生的生长因子(PDGF)或细胞定向迁移因子、胰岛素生长因子、骨形态发生蛋白、骨形态发生蛋白-2、血管内皮生长因子、结缔组织生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、骨桥蛋白、生长激素类(如:促生长素)等细胞吸引及粘附因子。本发明也可用于其它对干细胞归巢/趋化和分化起作用的其它因子。据已有的文献报道和证实,EGF具有在体促进骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的作用,在体内还可介导上皮生长,促进血管形成,加快皮肤创面愈合速度和提高愈合质量的作用;FGF对表皮细胞增殖、分化和皮肤附件发生有诱导作用;白介素IL-3可刺激皮肤上皮细胞增殖;ECM支持内皮或成纤维细胞的粘附和移动;TGF-α可促进成纤维细胞和上皮的生长,刺激体内的血管生成因子;血小板衍生的生长因子(PDGF)可促进皮肤成纤维细胞增殖;一定剂量的生长激素可促进皮肤胶原蛋白特别是I型胶原蛋白的合成,使皮肤明显增厚。SDF-1是目前明确的对干细胞趋化归巢起最重要作用的分子,可趋使干细胞定向迁移,应激、损伤、缺氧及G-CSF等均可诱导损伤局部干细胞定向迁移因子SDF-1大量表达,从而捕获干细胞定向迁移于损伤局部,进而增殖分化为各种功能细胞。CXCR4是SDF-1的唯一受体,且在CD34+干细胞表面都有广泛表达。SDF-1因子不仅能通过SDF-1-CXCR4结合来捕获迁移中干细胞,同时能通过CXCR4介导的细胞反应(如上调黏附分子的表达)来激活干细胞穿越内皮细胞层的迁移运动。目前现有技术已经证实CD34+干细胞可依据SDF-1的浓度梯度迁移,并且SDF-1在诱导干细胞趋化和转移动员的同时,也具有刺激活性,增加干细胞的增殖分化的作用。SDF-1-CXCR4是目前明确的对造血干细胞趋化定向迁移起最重要作用的分子。
本发明同时提供了上述纳米仿生创面覆盖物的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备电纺溶液、含有细胞因子的水溶胶溶液和交联剂溶液;
(2)用所述交联剂溶液接收静电纺丝制得纳米仿生支架;
(3)用喷墨打印机将含有细胞因子的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架上,水溶胶固化后即得。
上述步骤(1)中所述制备含有细胞因子的水溶胶溶液也可以步骤(2)和步骤(3)之间进行。
在本发明中,步骤(2)和(3)可重复一次或者更多次,以得到不同厚度的创面覆盖物。
所述电纺溶液是将前述支架材料溶于一定的溶剂,形成电纺液;支架材料包括聚乳酸、聚己内酯、聚乙交酯、聚氨酯、聚乙二醇、聚对苯二甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚羟基丁酸己酸酯、聚磷酸酯、聚氨基甲酸酣、聚L-乳酸、聚酯酰胺、聚乙烯醇、聚丙交酯、聚氧乙烷、聚对二恶酮、丙交酯、乙交酯、丁内酯、戊内酯、己内酯、环氧乙烷、环氧丙烷、聚氨酯类、聚碳酸酯、胶原蛋白、明胶、壳聚糖、改性壳聚糖、淀粉、纤维素、改性纤维素、明胶、纤维蛋白、丝蛋白、弹力蛋白拟态的肽聚合物、海藻酸、硫酸软骨素,肝素,琼脂,葡聚糖、褐藻酸的一种或两种以上混合溶液;
溶剂为甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、六氟异丙醇、三氟乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、氯仿、二噁烷、三氟乙烷、三氟乙酸或水的任意一种或者它们任意比例的混合物。上述的高分子材料和溶剂用于静电纺丝的相关技术,例如材料与溶剂的重量比例等参照现有技术。
所述电纺溶液优选粘均分子量为10000的聚-DL-乳酸和分子量为400的聚乙二醇的二氯甲烷溶液;所述聚-DL-乳酸和聚乙二醇所占的重量百分比分别为80%和20%,溶剂所占质量百分比为85%。
步骤(1)所述含有细胞因子的水溶胶溶液是含有干细胞定向迁移因子和干细胞分化因子的水溶胶缓冲液;所述干细胞定向迁移因子和干细胞分化因子所占质量百分比总数不高于10%。
步骤(1)所述水溶胶缓冲溶液为藻酸盐或藻酸盐与其它物质的混合溶液,交联剂溶液为氯化钙溶液;或所述水溶胶缓冲溶液为纤维蛋白原溶液,交联剂溶液为凝血酶溶液;或所述水溶胶缓冲溶液为透明质酸碳酸氢钠溶液,交联剂溶液为酰肼或碳化二亚胺;或所述水溶胶缓冲溶液为胶原-聚阴离子溶液,交联剂为碳化二亚胺。
步骤(2)所述静电纺丝的优选参数为:注射泵推进速度为0.3~0.8ml/h,纺丝针头为10、12、14、16、18或20号针头,施加电压为15~25KV,接收喷丝的细胞培养皿中装有交联剂溶液,生物打印的纸片为电纺制得的纳米仿生支架。
所述喷墨打印机优选改装的惠普550C喷墨打印机,改装方法参考美国专利US 7051654。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明采用干细胞技术及纳米仿生技术的结合,利用特定的干细胞迁移分化因子、结合纳米仿生支架材料,在创伤原位吸引干细胞迁移及分化为皮肤细胞,进行修复再生,解决了当前创人工皮肤所面临的发展屏障。
理想的人工皮肤替代物应具有以下特性:与正常皮肤组织相似的结构,对伤口有一定的贴附性,可防止细菌入侵及生长,可用于修复皮肤组织缺损,无毒性、不产生免疫排斥反应,并有良好的生物相容性等。结合这些特性说明本发明的优点和有益效果:
(1)本发明采用了原位自体干细胞工程技术,采用干细胞趋化因子吸引自体干细胞定向迁移进入创面并按设计要求进行分化,即避免了使用活细胞带来的不便,又能达到使用与其同等或者更佳的修复效果;
(2)本发明利用生物打印技术,将生长因子等生物物质按设计要求与纳米支架精确结合,形成诱导干细胞迁移、聚集、分化的微环境,吸引干细胞进入创面;
(3)本发明的纳米仿生创面覆盖物本身不含活细胞成分,不使用外源细胞和蛋白,免除了因此而带来免疫排斥、病毒传播、疾病传染的诸多风险;
(4)本发明所使用的材料是目前已经证实对人体无毒无害的安全生物材料,是人工材料,即不会带来免疫排斥、病毒传播、疾病传染的诸多风险,也不会带来其它毒害作用。
(5)本发明的创面覆盖物材料根据创面修复过程自动安全降解,在降解过程的同时创面得到了完全修复,这使得创面皮肤再生过程与正常的皮肤分化过程一致,新生的纤维与原来的皮肤纤维排列一致,这就避免结缔组织的异常增生,出现瘢痕、水泡等现象;皮肤的附属器官,如血管等,也在同时进行再生,这就避免了新生上皮坏死脱落现象的出现,使新生皮肤牢固地黏附于基底膜,达到正常的机能稳定性。因此保持了人的正常外貌。达到和天然皮肤的韧性及机械性完全相同的效果;
(6)本发明的创面覆盖物由于不含活细胞成分,材料来源充分,成本较低,避免了天然材料来源不足,成本高,改性复杂的缺点,贮存运输简单;
(7)本发明的创面覆盖物的制备方法工艺步骤简化,生产时间短,能有效避免加工过程中产品受到污染,产品质量易于控制,产品标准容易实现,产品可实现低成本、高效率的产业化生产。
(8)本发明的创面覆盖物具有良好的力学强度的柔韧性,能够有效保护皮肤,在皮肤完全修复之前,可以防止细菌入侵和生长,避免感染等现象发生。
(9)本发明的应用范围较任何一种现有技术的产品都更为广泛,能用于修复三度烧伤和大面积深二度烧伤及程度相同的皮肤损伤,达到与自身皮肤移植相近的修复效果;再生皮肤的韧性和机械强度与自体皮肤接近,能够维持人的正常外貌;由于生产成本低,还适用于轻度损伤或烧伤,促进修复效果,有效降低病人痛苦;也可用于溃疡等引起的慢性伤口修复。
附图说明
图1为本发明创面覆盖物的结构示意图;
图2为实施例5中创面覆盖物移植到家兔皮肤创伤部位6小时后的结果示意图;
图3为实施例5中创面覆盖物移植到家兔皮肤创伤部位7小时后的结果示意图;
图4为实施例5中创面覆盖物移植到家兔皮肤创伤部位14天的结果示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例来进一步详细说明本发明。
实施例1
(1)制备电纺溶液、含有细胞因子的水溶胶溶液和交联剂溶液;
电纺溶液采用粘均分子量为10000的聚-DL-乳酸和分子量为400的聚乙二醇的二氯甲烷溶液;所述聚-DL-乳酸和聚乙二醇所占的重量百分比分别为80%和20%,溶剂所占质量百分比为85%。
交联剂溶液选用0.1M氯化钙溶液。
含有细胞因子的水溶胶溶液采用细胞因子藻酸盐溶液,所述细胞因子藻酸盐溶液中细胞因子SDF-1的质量百分比浓度为10ppm。
将配置好的0.1M氯化钙溶液放入直径150mm的细胞培养皿中,置于静电纺丝装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专利报道进行改装,例如可参照美国专利US 7051654公开的方法,固定在电纺丝装置箱内电纺针头正下方,用作细胞因子定位打印。将配好的细胞因子藻酸盐溶液装入喷墨打印墨盒中。本实施例采用的墨盒型号为HP51626A。
(2)用所述交联剂溶液接收静电纺丝制得纳米仿生支架;
将电纺溶液装入注射泵开始纺丝,设定注射泵推进速度为0.6ml/h,选用12号针头,施加电压为20KV,用装有氯化钙溶液的细胞培养皿接收喷丝。喷丝30分钟后,停止静电纺丝;
(3)用喷墨打印机将含有细胞因子的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架上,水溶胶固化后即得。
开启喷墨打印机,按照设定的位置,将细胞因子藻酸盐溶液打印在培养皿的电纺层上,藻酸盐溶液接触电纺层上的氯化钙溶液后迅速固化,形成藻酸盐水溶胶,将细胞因子包裹并固定。
重复打印20遍后,关闭打印机,重新静电纺丝30分钟,然后再关闭静电纺丝,打印20遍,形成厚度约0.5mm的纳米仿生创面覆盖物。
制得的纳米仿生创面覆盖物是纳米纤维水溶胶薄膜,将其从培养皿中取出,用蒸馏水漂洗5遍,经冻干后真空包装,经25kGy钴-60灭菌后负20摄氏度低温保存。
实施例2
实施步骤同实施例1。
电纺溶液采用粘均分子量为10000的聚-DL-乳酸和分子量为400的聚乙二醇的二氯甲烷溶液;所述聚-DL-乳酸和聚乙二醇所占的重量百分比分别为80%和20%,溶剂所占质量百分比为85%。
交联剂溶液选用100IU/ml凝血酶溶液;
含有细胞因子的水溶胶溶液采用细胞因子纤维蛋白原溶液,纤维蛋白原浓度为40mg/ml,所述纤维蛋白原溶液中表皮生长因子和SDF-1因子的质量百分比浓度为500ppm。
具体操作是将配置好的凝血酶溶液放入直径90mm的细胞培养皿中,置于静电纺丝装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专利报道进行改装,例如可参照美国专利US 7051654公开的方法,固定在电纺丝装置箱内电纺针头正下方,用作细胞因子定位打印。将配好的细胞因子纤维蛋白原溶液装入喷墨打印墨盒中,本实施例采用的墨盒型号为HP51626A。
将电纺溶液装入注射泵开始纺丝,设定注射泵推进速度为0.3ml/h,选用16号针头,施加电压为15KV,用装有凝血酶溶液的细胞培养皿接收喷丝。喷丝25分钟后,停止静电纺丝,开启喷墨打印机,按照设定的位置,将打印在培养皿的电纺层上,纤维蛋白原溶液接触电纺层上的凝血酶溶液后迅速固化,形成水溶胶,将细胞因子包裹并固定。重复打印15遍后,关闭打印机,重新静电纺丝30分钟,然后再关闭静电纺丝,打印15遍,形成厚度约0.4mm的纳米仿生创面覆盖物。
保存方法同实施例1。
实施例3
实施步骤同实施例1。
电纺溶液采用粘均分子量为50000的聚己内脂和分子量为400的聚乙二醇的六氟异丙醇溶液;所述聚己内脂和聚乙二醇所占的重量百分比分别为90%和10%。所述六氟异丙醇溶液的重量百分比浓度为85%。
交联剂溶液选用100mg/ml水溶性碳化二亚胺溶液;
含有细胞因子的水溶胶溶液采用细胞因子的胶原与聚阴离子溶液,其中胶原浓度为1%,聚阴离子采用聚谷氨酸,浓度50mg/ml,所述细胞因子包括细胞定向迁移因子SDF-1、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、白介素IL-3和碱性成纤维细胞生长因子,质量百分比浓度为1%。
具体操作是将配置好的碳化二亚胺溶液放入直径150mm的细胞培养皿中,至于静电纺丝装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专利报道进行改装,例如可参照美国专利US 7051654公开的方法,固定在电纺丝装置箱内电纺针头正下方,用作细胞因子定位打印。将配好的细胞因子溶液装入喷墨打印墨盒中,本实施例采用的墨盒型号为HP51626A。
将电纺溶液装入注射泵开始纺丝,设定注射泵推进速度为0.6ml/h,选用12号针头,施加电压为20KV,用装有碳化二亚胺溶液的细胞培养皿接收喷丝。喷丝30分钟后,停止静电纺丝,开启喷墨打印机,按照设定的位置,将细胞因子的透明质酸碳酸氢钠溶液(细胞因子质量百分比浓度:0.1%)打印在培养皿的电纺层上,透明质酸溶液接触电纺层上的碳化二亚胺后迅速固化,形成透明质酸水溶胶,将细胞因子包裹并固定。
重复打印15遍后,关闭打印机,重新静电纺丝35分钟,然后再关闭静电纺丝,打印15遍,重新静电纺丝35分钟,然后再关闭静电纺丝,形成厚度约0.5mm的纳米仿生创面覆盖物。
保存方法同实施例1。
实施例4
(1)制备电纺溶液、含有细胞因子的水溶胶溶液和交联剂溶液;
电纺溶液采用粘均分子量为50000的聚己内脂和分子量为400的聚乙二醇的六氟异丙醇溶液;所述聚己内脂和聚乙二醇所占的重量百分比分别为90%和10%。所述六氟异丙醇溶液的重量百分比浓度为85%。
交联剂溶液选用1%碳化二亚胺溶液;
含有细胞因子的水溶胶溶液采用透明质酸的碳酸氢钠溶液,透明质酸浓度为15mg/ml,所述细胞因子为细胞定向迁移因子SDF-1、表皮生长因子,浓度0.1%。
将配置好的碳化二亚胺溶液放入直径150mm的细胞培养皿中,置于静电纺丝装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专利报道进行改装,例如可参照美国专利US 7051654公开的方法,固定在电纺丝装置箱内电纺针头正下方,用作细胞因子定位打印。将配好的细胞因子溶液装入喷墨打印墨盒中。本实施例采用的墨盒型号为HP51626A。
(2)用所述交联剂溶液接收静电纺丝制得纳米仿生支架;
将电纺溶液装入注射泵开始纺丝,设定注射泵推进速度为0.8ml/h,选用20号针头,施加电压为25KV,用装有碳化二亚胺溶液的细胞培养皿接收喷丝。喷丝30分钟后,停止静电纺丝;
(3)用喷墨打印机将含有细胞因子的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架上,水溶胶固化后即得。
开启喷墨打印机,按照设定的位置,将含细胞因子的透明质酸溶液打印在培养皿的电纺层上,含细胞因子的透明质酸溶液接触电纺层上的酰肼二亚胺溶液后迅速固化,形成水溶胶,将细胞因子包裹并固定,形成厚度约0.01mm的纳米仿生创面覆盖物。
保存方法同实施例1。
实施例5
本发明实施例1的纳米材料人工皮肤,见图1所示,图1中显示了在纳米仿生支架结构中,分布不同浓度、不同类型的细胞因子,其中1为细胞趋化因子,2为纳米纤维,3是细胞分化因子。
以腹部人为造成全层皮肤缺损(3×3cm2)的成年家兔作为实验动物模型。创伤后2小时,将实施例1制备的纳米材料人工皮肤(3×3cm2)移植到创伤部位。移植进行6小时后,可见干细胞开始定向迁移进入人工皮肤;移植物与正常皮肤组织融合良好,且与创面贴合紧密,见图2,受到趋化因子作用,干细胞迁入、贴附,同时形态发生变化,图2中4表示干细胞迁入分化为皮肤细胞;5表示干细胞正迁入;6表示干细胞。移植7天后镜下可见有毛细血管从周围正常组织向移植物内长入,且长入移植物基质内的新生毛细管数量逐渐增多。移植的人工皮肤与其周围正常皮肤颜色十分接近,表皮层清晰可见层次分明的基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层,并可见表层有角质化细胞层剥离脱落,同时可见真皮层细胞数量及细胞外基质显著增加,并且纳米支架已开始被吸收并被这些增殖的细胞及其所分泌的细胞外基质所取代,参见图3,由图3可见干细胞分化为皮肤细胞的同时,人工皮肤的纤维开始分解并吸收,同时血管和神经开始形成,图中7表示分化为上皮细胞,8表示降解的纳米纤维,9表示尚未完全分化的细胞,10表示诱导的神经,11表示诱导的血管。术后14天,经过本发明创面覆盖物治疗的皮肤,创面覆盖物完全降解后,所达到的皮肤修复效果见图4,由图4大体可见创面已基本愈合,修复区皮肤颜色正常,并且无残留的瘫痕,图中12表示腺体,13表示血管,14表示神经。
Claims (5)
1.一种纳米仿生创面覆盖物的制备方法,其特征在于所述纳米仿生创面覆盖物,包括纳米仿生支架和附着于其上的水溶胶,所述水溶胶内包覆有一种或几种细胞因子;其制备方法包括以下步骤:
(1)制备电纺溶液、含有细胞因子的水溶胶溶液和交联剂溶液;
(2)用所述交联剂溶液接收静电纺丝制得纳米仿生支架;
(3)用喷墨打印机将含有细胞因子的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架上,水溶胶溶液固化后即得;
其中,步骤(1)所述水溶胶是选自以下聚合物制成的水溶胶:淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸、壳聚糖、胶原、聚L-赖氨酸、聚L-谷胺酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸或聚丙烯酰胺;
步骤(1)所述的电纺溶液采用选自以下的支架材料:聚乳酸、聚己内酯、聚乙交酯、聚氨酯、聚乙二醇、聚对苯二甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚羟基丁酸己酸酯、聚磷酸酯、聚酯酰胺、聚乙烯醇、聚氧乙烷、聚对二恶酮、聚碳酸酯、胶原蛋白、明胶、壳聚糖、改性壳聚糖、淀粉、纤维素、改性纤维素、纤维蛋白、丝蛋白、弹力蛋白拟态的肽聚合物、海藻酸、硫酸软骨素、肝素、琼脂、葡聚糖或褐藻酸的任意一种或两种以上材料的混合物。
2.如权利要求1所述纳米仿生创面覆盖物的制备方法,其特征在于步骤(1)中所述水溶胶溶液的制备在步骤(2)和步骤(3)之间进行。
3.如权利要求1或2所述纳米仿生创面覆盖物的制备方法,其特征在于步骤(2)和(3)重复若干次。
4.如权利要求1或2所述纳米仿生创面覆盖物的制备方法,其特征在于步骤(1)中所述电纺溶液所用的溶剂为甲酸、乙酸、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、六氟异丙醇、三氟乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、二噁烷、三氟乙烷、三氟乙酸、水或它们的任意混合物;
所述含有细胞因子的水溶胶溶液是含有干细胞定向迁移因子和干细胞分化因子的水溶胶缓冲液;所述干细胞定向迁移因子和干细胞分化因子所占质量百分比总数不高于10%。
5.如权利要求1或2所述纳米仿生创面覆盖物的制备方法,其特征在于步骤(2)中所述静电纺丝的参数为:注射泵推进速度为0.3~0.8ml/h,用10、12、14、16、18或20号针头,施加电压为15~25KV。
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