KR102571831B1 - 헤파린 유사 고분자 하이드로겔을 이용한 대식세포의 분극화 평가 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 헤파린 유사 고분자 하이드로겔을 이용하여 세포를 분극화시키는 방법 및 상기 분극화된 세포의 거동을 분석하는 방법에 대한 것으로, 특히, 대식세포를 살아있는 단일세포 상태로 분극화를 평가할 수 있다.

Description

헤파린 유사 고분자 하이드로겔을 이용한 대식세포의 분극화 평가 방법{METHOD FOR MACROPHAGE POLARIZATION USING HEPARIN-MIMICKING POLYMER-BASED HYDROGEL}
본 발명은 헤파린 유사 고분자 하이드로겔을 이용하여 세포를 분극화시키는 방법 및 상기 분극화된 세포의 거동을 분석하는 방법에 관한 것이다.
대식세포는 미성숙 단핵구의 형태에서 골수로부터 유래된 대표적인 선척면역의 주요 기능의 원인이 되며 병원균을 제거하여 조직 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 하는 면역 세포이다. 다양한 용해성 시그널이 대식세포 분극화를 유도할 수 있다. 대식세포는 일반적으로 인터페론-감마와 같은 염증성 사이토카인 및 지질다당류 (LPS)와 같은 미생물 자극에 의해 염증전 또는 M1 경로를 통해 활성화된다. 그에 반해서, 대식세포는 또한 항염증제에 의해 또는 인터루킨-4 (IL-4) 또는 IL-10에 의한 M2 분극화를 통해 대안적으로 활성화될 수 있다. 면역 자극의 존재 하에서, 대식세포는 M1으로 분극하여 병원균을 죽이는 반응성 종 및 염증성 사이토카인을 방출한다 미세환경의 변화는 대식세포 표현형을 달라지게 하여 M1-M2 전이 및 치유의 해결을 촉진하거나 지연시킬 수 있다.
세포 부착은 세포 및 이의 미세환경 사이의 커뮤니케이션에 필수적이다. 이러한 상호작용은 형태형성, 증식, 이동 및 분화를 비롯한 세포의 거동의 여러 양상을 조절한다. 세포외 매트릭스 (extracellular matrix: ECM)는 ECM 및 인테그린 사이의 상호작용, 세포골격, 및 중심 부착 (focal adhesion; FA)을 통해 세포가 기질로 부착하는 능력을 조절하여, 세포내 수축성의 차후 변화를 이끌어낸다. FA는 세포골격의 조립 및 분해를 조절하고 세포 형태의 중요한 조절자인 Rho/Rho-관련 단백질 키나아제 (ROCK) 시그널링의 활성을 조절한다. 분해성 시그널링 분자 이외에 물리적 시그널도 대식세포 분극화를 조절한다. M1 분극화된 대식세포는 M0 비-분극화 대식세포와 다른 형태를 보인다; 대식세포의 분극화는 사이토카인을 통해 M1으로 자극되었을 때 원형 형태와 같은 다른 정도의 신장을 보였다. 그러나, 대식세포 분극화를 수반하는 기계적 변화는 아직까지 완전히 이해되지 않았다. 그러므로, 미세환경의 변화에 의해 유도되는 대식세포 분극화 및 뒤이은 세포 부착이 일어나는 메커니즘의 이해가 중요하다. 대식세포의 분극화 평가는 세포에서 RNA를 추출하거나, 유세포 분석기 및 면역형광염색을 통해 분극화를 평가하였다. 그러나, 대식세포의 qPCR, 유세포 분석기법 및 면역형광염색 기법으로는 세포가 죽는다는 점에서 세포 살아있는 대식세포의 분극화를 평가하기 힘들고, 단일세포 분석이 어려운 문제가 있다.
대한민국 공개특허 제10-2005-0117629호
이에, 본 발명의 발명자들은 헤파린-유사 성분을 포함하는 하이드로겔을 이용하여 인 비트로 하이드로겔-기반 세포 배양 플랫폼을 제조하고, 세포 부착 제어에 의한 이의 M1 분극화 촉진 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다..
이에 따라, 본 발명은 헤파린 유사 고분자 하이드로겔을 이용하여 세포를 분극화시키는 방법 및 상기 분극화된 세포의 거동을 분석하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 위해, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 구조를 갖는 헤파린 유사 고분자를 포함하는, 세포의 부착 및 분극화를 위한 헤파린 유사 고분자 하이드로겔을 제공한다:
[화학식 1]
위 식에서, x 및 y는 각각 1-10,000의 정수임.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 헤파린 유사 고분자 하이드로겔 상에 세포를 배양하는 것을 포함하는, 세포의 분극화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 아크릴아마이드/비스아크릴아마이드 및 소듐 4-비닐벤젠술포네이트를 혼합한 후 젤화시켜 제조한 것인, 헤파린 유사 고분자 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 형광 비드를 포함한 폴리아크릴아미드 하이드로겔을 사용하여 본 발명에 따른 방법에 의해 분극화된 세포의 거동을 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명은 헤파린 유사 고분자 (PSS) 하이드로젤을 기반의 대식세포 분극화 배양 기술과 형광 비드를 통한 단일 대식세포-기질 부착 힘 및 대식세포 내부 장력을 측정할 수 있는 Traction force microscopy와 Intracellular force microscopy 기술에 관한 것으로, 기존 방법과 다르게 비교적 분석이 용이하고, 단일세포 분석이 가능하며, 살아있는 상태로 정밀하게 부착력 및 내부 장력을 측정하여 대식세포의 분극화를 평가하는 플렛폼 기술을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 기술은 대식세포의 분극화뿐만 아니라 암세포의 전이능, 줄기세포의 분화능 및 다양한 세포거동을 분석하는데도 적용될 수 있어 활용가능성이 높다.
도 1은 다른 기질에서 배양된 대식세포를 나타낸 것이다: (a) 실험 공정을 나타낸 개략도. (b) Gene expression of M1 분극화 마커의 세포 발현. 데이터는 표준 ± 표준편차로 나타냈다, *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. (c) 대식세포 및 M1 마커 F4/80 (green) 및 iNOS2 (red)의 면역형광 염색 결과. Scale bar = 20 μm. iNOS2, inducible nitric oxide synthetase; LPS, lipopolysaccharide; PSS, poly(sodium-4-styrenesulfonate); CTL, control; BMDMs, bone marrow-derived macrophages.
도 2는 빈쿨린의 형태, 강도 및 공간 분포를 나타낸 것이다: (a) F-액틴 (green) 및 빈쿨린 (red)의 면역형광 염색 이미지. (b) 중심에서부터 경계까지의 빈쿨린 강도 맵 및 거리 맵. Scale bar = 50 μm (c) 세포의 면적, 길이 및 신장. (d) 빈쿨린의 강도 분석 결과. (e) 세포 경계에서 중심까지의 거리를 보이는 개략도. (f) 빈쿨린의 분포. Scale bar = 50 μm, error bars = 95% confidence interval, * p<0.05, *** p<0.001. 에러 바에서 겹침이 없는 것은 95% 신뢰수준을 갖는 유의차를 의미한다. PSS, poly(sodium-4-styrenesulfonate); CTL, control; LPS, lipopolysaccharide.
도 3은 대조로서 M0 비-분극화 대식세포 LPS 및 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스에 의해 M1 분극화된 마크로파지를 나타내는 CTL, LPS, 및 PSS에서 배양한 대식세포의 견인 스트레스 및 세포내 장력을 나타낸 것이다: (a) 대식세포의 스트레스 벡터 및 등고선 이미지를 나타내는 DIC. 대식세포의 (b) 평균 세포 스트레스 및 (c) 세포내 장력. Scale bar = 10 μm, error bars = 95% confidence interval, * p<0.05, *** p<0.001, 에러 바에서 겹침이 없는 것은 95% 신뢰수준을 갖는 유의차를 의미한다. LPS, lipopolysaccharide; PSS, poly(sodium-4-styrenesulfonate); CTL, control; ECM, extracellular matrix; DIC, differential interference contrast.
도 4는 세포 형태 및 세포 부착 단백질의 분석 결과를 나타낸 것이다: (a) 세포 부착-관련 유전자 어레이. (b,c) 대식세포의 세포 부착-관련 유전자 발현. (d) 대식세포의 M1 분극화 시그널링 경로의 PSS-매개 유도의 개략도 (created with BioRender.com). 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타냈다, *p < 0.05; **p < 0.005; ***p < 0.0005. LPS, lipopolysaccharide; PSS, poly(sodium-4-styrenesulfonate); CTL, control.
도 5는 헤파린 유사 고분자 (PSS) 하이드로젤의 합성 반응식 및 형광비드를 포함한 하이드로겔의 분극화 평가를 나타낸 개략도이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 의해 본 발명이 한정되지 않으며 본 발명은 후술할 청구 범위에 의해 정의될 뿐이다.
덧붙여, 본 발명에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 본 발명의 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 '포함'한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 구조를 갖는 헤파린 유사 고분자를 포함하는, 세포의 부착 및 분극화를 위한 헤파린 유사 고분자 하이드로겔 및 이의 제조방법에 관한 것이다:
[화학식 1]
위 식에서, x 및 y는 각각 1-10,000의 정수일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 위 식에서 x 및 y는 두 고분자 간의 몰비 (molar ratio)를 나타내며, 2.9:1 (y=2.9x)의 농도로 사용되었으며, 두 고분자의 질량농도는 각각 17.7%w/v일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 헤파린 유사 고분자는 하기와 같은 반응 과정에 의해 합성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
상기 헤파린 유사 고분자 하이드로겔은 아크릴아마이드/비스아크릴아마이드 및 소듐 4-비닐벤젠술포네이트를 혼합한 후 젤화시켜 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 아크릴아마이드/비스아크릴아마이드는 15 내지 20% (w/v)/0.5 내지 1%(v/v)의 비율, 예를 들어 17.7% (w/v)/0.8%(v/v)의 비율로 혼합될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 젤화는 테트라메틸에틸렌 디아민 및 암모늄 퍼설페이트를 첨가하여 중합시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 헤파린 유사 고분자 하이드로겔 상에 세포를 배양하는 것을 포함하는, 세포의 분극화 방법에 관한 것이다.
상기 세포는 대식세포, 암세포, 줄기세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으며, 예를 들어, 대식세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법은 대식세포의 세포 부착을 억제하여 세포의 확산을 억제하여 대식세포의 M1 분극화를 유도할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 형광 비드를 포함한 폴리아크릴아미드 하이드로겔을 사용하여 본 발명에 따른 방법에 의해 분극화된 세포의 거동을 분석하는 방법에 관한 것이다.
상기 분극화된 세포를 상기 형광 비드를 포함한 폴리아크릴아미드 하이드로겔 상에서 배양, 예를 들어, 계대배양한 후, TFM (traction force microscopy) 및 IFM (intracellular force microscopy) 기술을 사용하여 세포의 부착력과 세포내 장력을 측정할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 세포의 부착력과 세포내 장력을 측정하여 세포의 분극화를 평가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 등을 제시한다. 그러나 하기의 실시예 등은 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 등에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
제조예 1
골수-유래 대식세포(bone marrow-derived 대식세포; BMDMs)의 분화
6-12주령 암컷 C57BL/6J 마우스의 경골 및 대퇴골로부터 분리한 골수를 10% 우태아혈청 (FBS)이 보충된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)으로 세척하였다. 분리된 골수 샘플을 적혈구 용균 버퍼로 처리하고 원심분리한 후 마크로파지로 분화시키기 위해 10% (v/v) FBS 및 20% (v/v) L929 조정 배지가 보충된 DMEM에 접종하였다. 7일간 분화시킨 후, 세포를 추가 실험에 사용하였다.
헤파린-유사 고분자 (PSS) 기반 하이드로겔 매트릭스의 제조
인산염 완충 식염수에서 17.7% (w/v) 아크릴아미드, 0.8% (w/v) n,n'-메틸렌-비스아크릴아미드, 및 17.7% (w/v) 소듐 4-비닐벤젠술포네이트를 혼합하여 헤파린-유사 고분자를 제조하였다. 중합을 유도하기 위해, n'-테트라메틸에틸렌 디아민 및 암모늄 퍼설페이트를 용액에 첨가하였다. 헤파린-유사 고분자의 수용액을 유리에 부어 주조하였다. 헤파린-유사 고분자를 PBS에 붓고 PBS를 하루에 2번 교체하면서 1-2일간 두었다; 그런 다음 고분자를 12-웰 플레이트 크기에 맞도록 원형으로 잘라냈다. 그런 다음, 고분자를 70% 에틸 알코올과 함께 30분간 인큐베이션하여 살균한 후, 겔을 PBS 중에서 1-2일 동안 인큐베이션하여 남아있는 에틸 알코올을 제거하였다. 또한, 헤파린-유사 고분자를 12-웰 플레이트에 위치시키고 밤새 배지와 함께 인큐베이션하여 세포 배양을 위한 준비를 하였다.
실시예 1
qRT-PCR (Quantitative real-time polymerase chain reaction)
세포를 PBS로 세척하고, TRIzol (Invitrogen, Waltham, MA, USA)을 사용하여 RNA 샘플을 추출하였다. DNase I (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 처리한 후, 총 RNA 샘플을 ReverTraAce qPCR RT Master Mix (Toyobo, Osaka, Japan)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 표적 유전자 발현을 SYBR Green (Toyobo)을 사용하여 정량하였다. 반응은 QuantStudio5 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)을 사용하여 실시하였다. 사용한 프라이머 서열은 표 1에 나타냈다.
PCR 유전자 어레이
RNA를 TRIzol 시약을 사용하여 분리하고 DNase I을 처리하였다. cDNA 합성을 위해, RT2 First Strand Kit (330401; Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 역전사를 실시하였다. PCR array kit (Qiagen, PAMM-013Z)를 RT2 SYBR Green qPCR master mix (Qiagen, 330529)과 병용하여 ECM 및 부착 분자와 관련된 84개 유전자에 대해 RT-PCR을 실시하였다.
면역형광 염색
세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정한 후 PBS 중의 0.1% Triton X-100으로 투과화하고 3% 우혈청 알부민 (BSA)으로 차단하였다. 세포를 4℃에서 밤새 anti-inducible nitric oxide synthetase 2 (iNOS2) (Abcam, Cambridge, United Kingdom), 항-빈쿨린 (Abcam), 및 F4/80 (eBioscience, San Diego, CA, USA) 으로 염색하였다. 그런 다음 F-액틴 염색을 위해 세포를 실온에서 1시간 동안 anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Invitrogen), anti-rabbit Alexa Fluor 555 (Invitrogen), anti-rat Alexa Fluor 488 (Invitrogen), 및 phalloidin (Invitrogen)으로 염색하였다. 마지막으로, 세포를 실온에서 5분간 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Sigma-Aldrich)으로 염색하였다. 모든 항체는 1:200 비율로 3% BSA로 희석하였다. 염색된 세포를 공초점 현미경 (LSM 710; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 이미지화하였다.
traction force microscopy (TFM) 및 intracellular force microscopy (IFM)를 위한 폴리아크릴아미드 (PAA) 하이드로겔의 제조
10.6 kP의 영률을 갖는 PAA 하이드로겔을 종래 공개된 방법에 기반하여 제조하였다. 아크릴아미드/비스-아크릴아미드의 최종 농도는 각각 10.6 kPa에서 10%/0.1%이었다. 부착력 분석을 위해, 0.01% (w/v)의 최종 농도를 갖는 0.2 μm 지름의 빨간색 형광 (580/605) 폴리스티렌 비드 (Invitrogen)를 중합 전에 PAA 용액에 첨가하였다. 겔은 일반적으로 30-50 μm 두께였다. 겔에 세포가 부착할 수 있도록 인간 피브로넥틴 (FN; Corning, Corning, NY, USA) (100 μg/mL)을 이기능성 가교-링커인 N-sulfosuccinimidyl-6-[4'-azido-2'-nitrophenylamino] hexanoate (sulfo-SANPAH)로 PAA와 결합시켰다.
TFM 및 IFM 공정
TFM 및 IFM을 이전에 공개된 방법을 사용하여 실시하였다. TFM을 위해, 10% (v/v) FBS가 보충된 DMEM을 사용하여 세포가 기재에 부착하도록 세포를 FN-결합 PAA 하이드로겔 상에 밤새 접종하였다. 생세포 및 형광 비드의 이미지는 레이저 공초점 현미경 (Carl Zeiss, LSM 710)을 사용하여 각각 형광 및 differential interference contrast (DIC) 모드로 촬영하였다. 기재의 이동은 null-force (세포 없음) 및 forced image (세포 있음)를 비교하여 MATLAB (MathWorks, Torrance, CA, USA)으로 코딩되고 이미지 픽셀 사이즈 (0.10 mm/px)에 기반한 입자 영상 유속계 방법을 사용하여 측정하였다. 윈도우 크기는 x- 및 y-방향으로 32 Х 32 픽셀로서, 16 픽셀 (또는 1.6 mm)의 공간 해상도를 나타냈다. 세포에 의해 가해지는 측면 스트레스는 종래 공개된 바와 같이 기재 변형 및 탄성 기재에 대한 평형 방정식에 기반하여 결정하였다. 이러한 편미분 방정식은 상업적 소프트웨어 Abaqus (Dassault Systemes, Velizy-Villacoublay, USA)를 사용한 유한 요소법으로 계산하였다. 세포 스트레스 및 세포력은 FEM 분석으로부터 수득된 변형력 텐서를 사용하여 결정하였다.
세포내 장력 (Intracellular tension)의 맵을 묘사하기 위해 MATLAB (MathWorks)로 코딩된 IFM을 사용하였다. 견인 스트레스 필드의 고유치 분석으로부터 수득된 수축성 모먼트의 주된 형태를 사용하여 주요 축 방향을 결정하였다. 세포내 장력을 주요 축을 따라 2개의 다른 도메인으로 세포를 분리하여 계산하였다. 장력은 단위 길이 당 힘으로 규정하였다.
이미지 분석 - 형태 및 강도
면적, 길이 및 신장을 포함하는 세포 형태를 MATLAB (MathWorks)로 코딩된 이미지 프로세싱 프로그램을 사용하여 정량하였다. 면적, 중심 (CT), 최대 축 길이 (LN), 신장 (EL), 및 환상성 (CR)을 포함하는 세포 형태를 F-액틴 및 DAPI의 형광 이미지로부터 정량하였다. 첫째로, 강도 히스토그램에 기반한 가장 낮은 픽셀 수치를 미가공 이미지로부터 차감해서 백그라운드 노이즈를 제거하였다. 둘째로, 개별 세포 및 핵 경계를 region of interest (ROI) 및 Otsu's algorithm을 사용하여 F-액틴 및 DAPI 이미지로부터 결정하였다. 0.10 μm의 픽셀 크기를 갖는 2진화 이미지로부터 형태를 확인하였다. 면적은 픽셀의 총 수를 픽셀 (0.01 μm2)의 단위 면적으로 나눈 0차순 이미지 모먼트로 규정하였다. CT는 1차순 모먼트로부터 계산하였다. 최대 축 길이는 영역과 같은 면적을 갖는 타원의 최대 반-축 길이의 두배이다. 이들은 2차순 정규화 중심 모먼트로 구성된 공변 매트릭스의 고유치 분석으로부터 유래하였다. EL은 최대 및 최소 반-축 길이 사이의 비율로 규정하였다. CR은 완전한 원 2√πR의 둘레 및 연구 대상의 둘레 사이의 비율의 제곱인 무차원 인덱스이다. 이는 연구 대상이 원형에 얼마나 가까운지를 측정하는 것이다. CR은 0 내지 1의 범위로, 1은 원을 나타내고 0은 무한 둘레 (또는 무한 거칠기/ 뾰족함)를 갖는 연구 대상을 나타낸다. CR은 연구 대상의 거칠기 또는 뽀족함을 나타내는 형태 인자의 역제곱이다.
FA 분자 빈쿨린의 형태 및 강도는 MATLAB (MathWorks)에서 코딩된 이미지 프로세싱 프로그램을 사용하여 정량하였다. 면역형광을 위해 세포를 F-액틴, 빈쿨린, 및 DAPI으로 표지하였다. 2진화 이미지는 상기 언급한 바와 같이 ROI 및 Otsu's algorithm을 사용하여 F-액틴 및 DAPI 이미지로부터 형태 분석 과정 동안 수득하였다. 빈쿨린 강도는 이들 경계에서 측정하였다. 밝기 차이를 보상하기 위해, 각 셀에서 DAPI 강도의 평균에 기반하여 강도를 정규화하였다. 그런 다음 평균 빈쿨린 강도를 측정하였다.
통계분석
막대 그래프에서 통계를 표시하기 위해 평균 및 평균의 표준 오차를 사용하였다. 비 (bee) 그래프에서 그룹 사이의 쉬운 비교를 위해 평균 및 95% 유의도의 평균의 신뢰구간 (CI)을 사용하였다. 막대 및 비 그래프 둘 다에서 Student's t-test를 사용하여 두 그룹 사이의 유의성을 비교하였으며, one-way ANOVA 후 Fisher's least significant difference multi-comparison test를 실시하여 다중 그룹 중에서 유의성을 테스트하였다.
실시예 2
헤파린-유사 고분자-기반 하이드로겔 매트릭스는 대식세포의 M1 분극화를 유도한다
헤파린-유사 고분자-기반 하이드로겔 매트릭스에 배양된 대식세포가 대식세포의 M1 분극화에서 어떤 변화를 보이는지를 평가하기 위해, 성숙 BMDMs를 다른 3가지 조건 하에서 배양하였다: 24시간 동안 조직 배양 플레이트 (TCP), LPS를 함유한 TCP, 및 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스. 별개의 세포 형태가 3가지 다른 조건 하에서 관찰되었다. 세포를 TCP에서 배양했을 때, 가늘고 긴 형태를 보였다; 그러나, LPS가 포함된 TCP에서 배양한 세포는 둥글고 평평했다. 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스에서 대식세포를 배양했을 때에는 둥근 형태의 세포 형태가 관찰되었다 (도 1a). 배양 조건에 따른 세포 형태의 변화가 분극화에 어떤 영향을 미치는지 연구하기 위해, qPCR을 실시하여 Il1b, Il6, 및 iNos2와 같은 M1 분극화 마커의 상대적 유전자 발현을 분석하였다. LPS 및 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스에서 배양된 대식세포는 M1 분극화 마커 유전자의 높은 발현 수준을 보였다; 그러나, M1 분극화 마커는 TCP에서 배양된 세포에서는 적게 발현되었다 (도 1b). M1 분극화 대식세포 마커 F4/80 및 iNOS2 단백질 발현을 면역형광 염색을 통해 더 연구하였다 대식세포는 TCP, LPS를 포함한 TCP, 및 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스에서 배양된 세포에서 F4/80을 발현하였다. 게다가, LPS를 포함한 TCP 및 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스 그룹은 iNos2를 발현하였으며, 이는 iNos2의 이전 유전자 발현 결과와 일치한다; 그러나, iNos2는 TCP 그룹에서는 발현되지 않았다 (도 1c). 이러한 결과는 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스가 대식세포 신장을 저해하고, 및 대식세포 분극화가 LPS와 같은 전통적인 활성화제뿐만 아니라, 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스에 의해서도 유사한 정도로 유도됨을 나타내는 것이다.
헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스는 대식세포의 형태 및 부착을 조절한다
액틴에 직접적으로 결합하는, 빈쿨린을 비롯한 FA 단백질은 액틴 중합을 증가시키고 세포 형태를 유지하는데 중요하다. 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스가 대식세포 형태 및 부착의 조절에 관여하는지를 확인하기 위해, 세포골격 및 FA 단백질인 F-액틴 및 빈쿨린으로 면역형광 염색을 실시하였다 (도 2a). 여러 조건 하에서 대식세포 형태의 차이 및 변화를 정량하기 위해, 면적, LN, 및 EL을 F-액틴의 이미지 분석을 사용하여 분석하고 TCP, LPS를 포함한 TCP, 및 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스에서 배양한 세포를 비교하였다. LPS를 포함한 TCP 그룹에서, LN 및 EL은 TCP 그룹에 비해 상당히 감소하였으며 둥근 형태를 나타냈다. 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스에 배양한 대식세포는 LPS를 포함한 TCP에서 배양한 세포와 유사하게 면적, LN, 및 EL가 현저히 감소하였다 (도 2c). 세포 부착 거동을 확인하기 위해, 빈쿨린 발현 및 분포를 연구하였다. 평균 빈쿨린 강도를 측정하여 이들이 LPS를 포함한 TCP 및 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스에서 배양한 세포에서 상당히 감소하였음을 확인하였다 (도 2b, d). TCP, LPS를 포함한 TCP, 및 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스에서 배양한 세포에서 중심 (수치 = 0.0)에서부터 세포 경계 (수치 = 1.0)로의 빈쿨린의 공간 분포를 분석하였다 (도 2b,e). TCP에서 배양한 세포 그룹과 비교했을 때, LPS를 포함한 TCP 및 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스에서 배양한 세포 그룹은 유의차를 보였다. LPS를 포함한 TCP 및 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스에서 배양한 세포의 빈쿨린 분포는 유사한 분포를 보였으며 세포 중심 (0-0.2의 거리)에 집중되어 있었다; 그러나, TCP 그룹에서 빈쿨린은 세포의 주변 영역 (0.5-0.7의 거리)에 국한되어 있었다 (도 2f). 빈쿨린 분포 결과는 LPS 처리된 대식세포의 M1 분극화는 중심에서의 빈클린 집중을 야기하였으며 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스에 배양된 대식세포도 유사한 빈쿨린 분포를 보임을 시사하는 것이다. 게다가, 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스에 배양된 대식세포는 LPS를 포함한 TCP 그룹과 유사한 면적, LN, 및 EL을 포함하는 세포 형태를 보였다. 이러한 결과는 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스-기반 대식세포 배양 플랫폼이 중심 부착의 감소로 인해 대식세포의 확산을 감소시킴을 보였다.
헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스는 부착력 및 세포내 장력을 감소시킨다
빈쿨린은 세포의 가장자리에서 부착을 위해 구성되며 부착력 발생에 관련되어 있다. 그러므로, 세포 부착을 연구하기 위해 세포 부착력 및 세포내 장력을 TFM 및 IFM을 사용하여 평가하였다. 우선, 부착력 및 세포내 장력을 평가하기 위해, 하기 3개의 다른 조건에서 대식세포를 배양하였다: TCP, LPS를 포함한 TCP, 및 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스. 그런 다음, 비-분극화 및 M1 분극화 대식세포를 PAA 하이드로겔 함유 형광 비드로 옮긴 후 계대배양하였다. 배양시 세포가 부착하는 힘에 의해 형광비드의 위치 변화가 생기고, 이러한 형광비드의 위치 변화를 분석하여 세포의 부착력 및 세포 내부 장력 뿐만 아니라 힘의 방향까지 정밀하게 측정할 수 있다 (도 5). DIC 이미지 및 스트레스 벡터 화살 및 등고선은 도 3a에 나타냈다. 대식세포의 부착력 벡터 및 등고선 맵은 모든 그룹에서 세포 부착력이 세포 정점에서부터 내부로 작용함을 보였다. TCP에서 배양된 대식세포는 선두의 가장자리에서 강한 스트레스를 보인 반면, LPS를 포함한 TCP 및 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스에서 배양한 대식세포는 세포의 내부에서 더 적은 스트레스가 발생하였다 (도 3b). 이러한 패턴은 빈쿨린 분포에서 관찰된 것과 동일하다. 또한, LPS를 포함한 TCP 및 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스에서 배양한 대식세포는 TCP에서 배양한 대식세포보다 적은 세포내 장력이 발생하였다 (도 3c). 종합하면, LPS-유도 M1 분극화 대식세포는 TCP에서 배양된 M0 비-분극화 대식세포보다 적은 스트레스가 발생하며, 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스에서 배양된 분극화 대식세포는 LPS-유도M1 분극화 대식세포와 유사한 세포성 스트레스를 보였다. 이러한 결과는 대식세포의 M1 분극화가 세포성 스트레스 및 세포내 장력을 감소시킴을 나타내는 것이다. 유사하게, 대식세포를 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스에서 배양했을 때, 세포성 스트레스 및 세포내 장력은 감소하였으며, 이는 M1 분극화를 유도할 수 있다.
헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스는 인테그린, 빈쿨린, 및 Rho/ROCK의 하향조절에 의해 세포 부착을 감소시킨다
다른 배양 조건 하에서 다른 세포 형태, FA의 분포, 및 세포성 스트레스를 관찰하였다. 세포 부착-매개 M1 분극화 및 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스 사이의 관계를 추가 평가하기 위해, PCR 어레이를 사용하여 ECM 및 부착 분자-관련 유전자를 분석하였다. PCR 어레이 결과는 대식세포가 LPS 자극에 의해 M1 분극화되었을 때 디스인테그린 및 트롬보스폰딘 모티프를 갖는 메탈로프로테아제, 메탈로프로테아제, 인테그린, 콜라겐, 및 FN과 같은 세포 부착 및 ECM-관련 유전자의 발현이 감소함을 보였다. 또한, 대식세포를 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스에서 배양했을 때에도 유사하게 ECM 및 세포 부착-관련 유전자 발현이 감소하였다 (도 4a). ITGa5, ITGαV, ITGβ1, 및 ITGβ3을 포함하는 인테그린 패밀리 맴버는 FN에 친화성을 가지며 대식세포 분극화와 밀접하게 관련되어 있다. 대식세포의 M1 분극화에 대한 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스의 영향을 연구하기 위해, 인테그린 유전자 발현을 확인하였다. TCP에서 배양한 M0 대식세포는 Itgav, Itgb1, 및 Itgb3의 더 높은 유전자 발현을 보였으나, Itga5의 발현은 약간 낮았다. 그러나, LPS를 포함한 TCP 및 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스에서 배양한 M1 분극화 대식세포는 Itgav, Itgb1, 및 Itgb3의 발현이 감소함을 보였다 (도 4b). 인테그린-매개 세포 부착은 세포 형태 및 세포내 장력에서의 변화와 관련된 중심 부착 및 Rho/ROCK 시그널링을 조절한다. 이전 결과들과 일관되게, LPS를 포함한 TCP 및 헤파린-유사 고분자-기반 매트릭스에서 배양한 M1 분극화 대식세포에서 빈쿨린, Rhoa, 및 이의 다운스트림 Rock1/2의 발현이 감소됨을 관찰하였다 (도 4c). PCR 어레이 및 qPCR 결과는 LPS 및 하이드로겔이 M1 분극화 대식세포에서 인테그린 α5β1 및 αVβ3을 비롯한 세포 부착-관련 유전자를 하향조절함을 명확히 시사하였다. 또한, 빈쿨린, Rhoa, 및 Rock1/2와 같은 FA- 및 세포골격 조직-관련 유전자는 세포 형태 및 장력을 조절하는 것으로 확인되었으며 대식세포의 M1 분극화에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 예상된다 (도 4d).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

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  9. 하기 화학식 1로 표시되는 구조를 갖는 헤파린 유사 고분자를 포함하는 헤파린 유사 고분자 하이드로겔 상에 대식세포를 배양하여 대식세포를 분극화시키는 단계; 형광 비드를 포함한 폴리아크릴아미드 하이드로겔 상에 상기 분극화된 대식세포를 배양하는 단계; 및, TFM (traction force microscopy) 및 IFM (intracellular force microscopy) 기술을 사용하여 상기 대식세포의 부착력과 세포내 장력을 측정하는 단계를 포함하는, 세포의 거동을 분석하는 방법:
    [화학식 1]

    위 식에서, x 및 y는 각각 1-10,000의 정수임.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 대식세포의 부착력과 세포내 장력을 측정하여 세포의 분극화를 평가하는 것인, 세포의 거동을 분석하는 방법.
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KR20050117629A (ko) 2004-02-28 2005-12-15 학교법인고려중앙학원 클레이-폴리우레탄 나노 복합재 및 그 제조방법
US20130177980A1 (en) * 2011-12-06 2013-07-11 The Regents Of The University Of California Synthetic matrices for self-renewal and expansion of stem cells
KR20210001294A (ko) * 2019-06-27 2021-01-06 한국과학기술연구원 M1 대식세포로의 선택적 분화방법

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