CN1443576A - 软骨植入物的制造方法 - Google Patents

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Abstract

一种制造软骨植入物的方法，包括将软骨细胞与间叶干细胞植入三维结构的基材并使所述细胞在其中生长，此基材含有任意重绕的I型胶原蛋白的α－螺旋单体。

Description

软骨植入物的制造方法
                      技术领域
本发明涉及一种软骨植入物的制造方法，其包括在三维结构的基材中植入并培养软骨细胞。
                      背景技术
软骨组织的自行修复能力相当有限，一旦软骨组织受到损伤，仅能凭借纤维软骨进行十分有限的自然修复，而纤维软骨的生化性质、机械性质与生理性质均不及正常软骨，因此受损的软骨组织易于发生退行性改变。
目前针对软骨再生的疗法包括：碳填充物、骨膜、软骨膜、软骨下骨钻孔术以及自体软骨细胞移植术。然而大多数疗法无法获得较自然修复更好的软骨的力学性质或生理性质。临床上对疗效更佳的治疗选择的需要，导致了利用分离的软骨细胞或间叶干细胞开发活体外制造软骨植入物的方法。
                      发明内容
本发明涉及一种软骨植入物。
本发明的一个方面的特征是通过在一种三维基材中植入软骨细胞或间叶干细胞以制造一种软骨植入物的方法。此基材含有任意重绕的I型胶原蛋白的α-螺旋单体(randomly rewound α-helicalmonomersof type I collagen)，并且可选择性地进一步含有任意重绕的II型胶原蛋白的α-螺旋单体。将此细胞基材构建体置于培养基中。间叶干细胞可通过在培养基中加入分化因子，以诱导其分化为软骨细胞。当软骨细胞于基材中增殖与分化时，其将分泌细胞外基质蛋白，例如：蛋白多糖与II型胶原蛋白，直到形成软骨植入物。
软骨细胞或间叶干细胞、I型胶原蛋白与II型胶原蛋白可由二至三种不同的动物来源制备。例如人类的软骨细胞可与牛的I型胶原蛋白与II型胶原蛋白联合使用。软骨细胞或间叶干细胞与基材可放置于一旋转震荡培养瓶内以提供适合软骨形成的微环境。
本发明还包括根据前述方法所制得的软骨植入物。此软骨植入物含有包覆于三维结构基质(即软骨植入物的细胞外成分)中的软骨细胞。此基质的组成成分不同于前述之基材，例如：因为降解的缘故，基质含有较少量的任意重绕的I型胶原蛋白α-螺旋单体，并且含有其所包覆的软骨细胞所合成的II型胶原蛋白。基质包覆的软骨细胞包括基质内部与附着于基质表面的软骨细胞。
本发明提供了可用于有效地制造低免疫原性的软骨植入物的方法。本发明一些实施方案的细节将在下述说明书中进行阐明。本发明的其他特征、目的与优势可由本说明书与权利要求书而得知。
                  具体实施方式的描述
本发明的特征为制造软骨植入物的方法。具体而言，是将软骨细胞或间叶干细胞包覆于含有任意重绕的I型胶原蛋白的α-螺旋单体的三维结构基材中，此细胞-胶原蛋白构建体可在培养基中生长成软骨植入物。
基材可以仅包含I型胶原蛋白，或同时包含I型胶原蛋白与II型胶原蛋白。I型胶原蛋白为本发明的软骨植入物提供结构上的支撑。I型胶原蛋白是骨胳、皮肤以及肌腱的基本组成成分，也是成熟瘢痕(cicatrix)，即疤痕(scar)，中的主要胶原蛋白类型。I型胶原蛋白可从肌腱组织中提取并纯化(Lai，美国专利No.5,876,444，1999年)。II型胶原蛋白则是软骨的主要胶原蛋白类型，II型胶原蛋白可以帮助保持软骨细胞或间叶干细胞的增殖与分化能力，II型胶原蛋白可以按如下所述由软骨组织中提取并纯化。
本发明之方法中，I型胶原蛋白与II型胶原蛋白的α-螺旋单体在基材中任意重绕。由此基材中所包覆并生长的软骨细胞或间叶干细胞所形成的软骨植入物具有出乎意外的低免疫原性。任意重绕的I型胶原蛋白或II型胶原蛋白的α-螺旋单体可按如下所述的方法制备：(1)将I型或II型胶原蛋白溶解于酸性溶液以解开其三股螺旋结构，并且利用蛋白酶部分消化；以及(2)使解开的I型或II型胶原蛋白的α-螺旋单体任意重新缠绕，参见美国专利No.5,876,444号。当制备含有I型或II型胶原蛋白之基材时，II型与I型的比值优选地介于重量比1∶1～1∶2(例如1∶1.2，1∶1.5与1∶1.7)的范围间。当解开的I型或II型胶原蛋白的α-螺旋单体混合时，I型胶原蛋白单体可与II型胶原蛋白单体一起缠绕形成杂合寡聚物(hybridoligomers)。
软骨细胞或间叶干细胞可分别从关节软骨与骨髓中分离出来，细胞培养至接近汇合(subconfluence)，然后种植于前述之基材中。使用的细胞数量与基材量可根据本领域技术人员的经验或依照下述实施例来确定。将此细胞基材构建体置于培养基中使其生长，若使用间叶干细胞来制造软骨植入物，则培养基内应加入分化因子(例如：IL-1与地塞米松)以诱导间叶干细胞分化成软骨细胞。此构建体系可培养于一旋转震荡的培养瓶内。出乎意外的是，此构建体置于旋转震荡的培养瓶中较置于静态培养瓶中生长迅速得多。软骨植入物的形成需要数周。软骨植入物可放置于一密封、无菌的含有组织培养基的箱子内，于室温中保存数天，再运送、塑型以及植入患者身上。当软骨植入物运送至患者处但不会立即使用时，可继续于前述环境下储存数天。
本发明的特征还包含根据前述方法所制得的软骨植入物。即使此软骨植入物是利用不同动物来源的软骨细胞或间叶干细胞、I型胶原蛋白与II型胶原蛋白所制备的，此软骨植入物用于修复软骨缺损时(例如：动关节(diarthrotic joints)以及椎间盘)，仍具有低免疫原性，例如：由兔子关节软骨所分离出的软骨细胞，可与由大鼠尾巴所分离出的I型胶原蛋白以及兔子软骨的II型胶原蛋白互相混合以产生软骨植入物。出乎意外地，此植入物可用来修复兔子膝关节的软骨缺损。
以下实施例仅供说明，而非以任何方式限制本发明所公开之范畴，相信不需进一步阐述，本领域技术人员均能依据本文之描述充分实施本发明，本文中所引用的著作均以全文引入作为参考。软骨植入物的制备
(1)I型胶原蛋白的提取与纯化
I型胶原蛋白提取与纯化自新西兰白兔的肌腱或大鼠尾巴的肌腱(Lai，美国专利No.5,876,444，1999年)，将肌腱解剖、切片，以及用冷的蒸馏水清洗数次以去除血浆蛋白，之后用0.5M NaCl于50mMTris-HCl、pH7.4提取，于4℃持续搅拌隔夜，抽出上清液，利用冷的蒸馏水清洗剩余物数次以去除盐分，之后于0.5M HOAc、pH2.5中于4℃培养隔夜以获得水相提取物，加入盐溶液(0.9M NaCl)使提取物沉淀，将沉淀物以13,000 rpm离心30分钟后，以0.05M HOAc溶解以获得含有胶原蛋白的溶液。于24小时至48小时期间内分别在含有胶原蛋白的溶液中加入两次另一种盐溶液(0.02M Na2HPO4)以得到沉淀，将沉淀物离心后以50mM HOAc溶解，如此可得到另一种含有胶原蛋白的溶液，将其以5mM HOAc透析并且冷冻干燥。
(2)II型胶原蛋白之提取与纯化
II型胶原蛋白的制备依据改良的Miller方法(Methods Enzymol.82：33-64)。将兔子软骨切片并用0.5M NaCl与20mM EDTA于0.05M的Tris缓冲液(pH7.4)清洗，用4M盐酸胍移除糖蛋白后，用0.5M醋酸与1mg/ml胃蛋白酶溶解提取物。加入0.9M NaCl以沉淀胶原蛋白，用70％酒精清洗数次以充分去除酸与盐分，之后溶于1M NaCl与0.05M Tris缓冲液(pH7.4)。增加NaCl到3.5M以获得沉淀，将上清液移去，加入4.5M NaCl以沉淀II型胶原蛋白，将沉淀物用70％酒精清洗数次后，再次溶解于10mM之醋酸到最终浓度为2～4mg/ml。
(3)分离与培养软骨细胞
由新生的新西兰白兔之关节软骨分离出软骨细胞(Lai，DoctoralThesis of Medical Sciences，Faculty of Medicine，Harvard University，1993)，将组织切片隔夜培养于含有1mg/ml透明质酸酶与1mg/ml胶原蛋白酶的Hank’s平衡盐溶液(HBSS)中。离心后，用含有10％胎牛血清(FBS)、50μg/ml硫酸庆大霉素、100单位/ml的青霉素G钠、100μg/ml硫酸链霉素and 0.25μg/ml二性霉素B的DMEM重新溶解细胞沉淀物。每10厘米培养皿接种5×105个细胞，置于37℃、5％二氧化碳浓度之培养箱，每隔3到4天换一次培养基，并让细胞生长至接近汇合。
(4)制备软骨植入物
I型与II型胶原蛋白均用伽玛射线灭菌并分别溶于5mM HOAc，胶原蛋白系用胃蛋白酶部分消化以移去端肽(参见例如：美国专利No.5,876,444)。将含有I型胶原蛋白之溶液与含有II型胶原蛋白之溶液温和混合均匀，视需要将溶液加热至30～40℃以助混合，II型与I型胶原蛋白的重量比为1∶1～1∶2之间。
取(1-10)×106个软骨细胞1毫升与另外含有2～4mg/ml I型与II型胶原蛋白的溶液1毫升互相混合。软骨细胞分别接种于24个兔子基材(即，基材内含有兔子的I型胶原蛋白与兔子的II型胶原蛋白)与24个大鼠基材(即，基材内含有大鼠的I型胶原蛋白与兔子的II型胶原蛋白)，将混合物置于6孔或24孔的培养盘直到形成聚合物。将软骨细胞-胶原蛋白之构建体继续培养于含有特定养份与药物的DMEM中，特定养分包括：10～20％的胎牛血清、HAM’s F-12K、0.3～0.5mM脯氨酸、50～70mg/L维生素C，特定药物包括：50μg/ml硫酸庆大霉素、100单位/毫升的青霉素G钠、100μg/ml硫酸链霉素以及0.25μg/ml二性霉素B，培养于37℃、5％二氧化碳浓度之培养箱。
首先将软骨细胞-胶原蛋白构建体于静置状态下在培养瓶中培养3～5天后，将其中一半，即12个软骨细胞-兔子基材构建体与12个软骨细胞-大鼠基材构建体，移至培养瓶中以8-16rpm旋转并加一定程度的震荡，另一半则继续留在静置的培养瓶中。每2～4天更换一次培养基，软骨细胞-胶原蛋白构建体在2至4个星期后逐渐形成软骨植入物。
将4个软骨细胞-胶原蛋白构建体，即1个在静置培养瓶中的软骨细胞-兔子基材构建体、1个在静置培养瓶中的软骨细胞-大鼠基材构建体、1个在旋转震荡培养瓶中的软骨细胞-兔子基材构建体，以及1个在旋转震荡培养瓶中的软骨细胞-大鼠基材构建体，于1，2，3，4周移出。将这些构建体大致检查后用10％福尔马林固定，包埋于石腊中并以厚度为5-10微米(Sacura Sledge microtome)切片。组织切片利用苏木精/伊红染色，并观察成软骨性分化(chondrogenicdifferentiation)。
(5)免疫组织化学分析
组织切片与第一抗体(抗II型胶原蛋白及抗硫酸软骨素)或与对照组的空白血清共同孵育。II型胶原蛋白为细胞外基质的软骨特异性成分，硫酸软骨素则为软骨蛋白多糖的主要成分。此抗原-第一抗体复合物进一步与辣根过氧化物酶缀合的第二抗体共同孵育，II型胶原蛋白与硫酸软骨素的含量则通过测定与3，3’二氨基联苯胺(DAB)形成第三抗原-抗体复合物后显色以判定。
表1概括描述了组织化学结果。表1软骨细胞-胶原蛋白构建体的软骨生成
容器 胶原蛋白基材     培养时间
1周 2周 3周 4周
旋转震荡培养瓶 大鼠基材 少许的软骨生成(Slightchondrogenesis) 肥厚的软骨生成(Hypertrophicchondrogenesis) 肥厚的软骨生成 肥厚的软骨生成
旋转震荡培养瓶 兔子基材 无分化 少许的软骨生成 肥厚的软骨生成 肥厚的软骨生成
静置的培养瓶 大鼠基材 无分化 少许的软骨生成 肥厚的软骨生成 肥厚的软骨生成
静置的培养瓶 兔子基材 无分化 无分化 无分化 少许肥厚的软骨生成
出乎意外地，在旋转震荡培养瓶的软骨细胞-大鼠基材构建体在第一周呈现少许的软骨生成，而在两周后呈现肥厚的软骨生成。在旋转震荡培养瓶的软骨细胞-兔子基材构建体与在静置培养瓶的软骨细胞-大鼠基材构建体在两周内呈现少许的软骨生成，而在三周后呈现肥厚的软骨生成。至于在静置培养瓶的软骨细胞-兔子基材构建体则在三周后仍未呈现软骨生成的现象，不过在第四周则有少许肥厚的软骨生成。
一般而言，相对于静置培养，在旋转震荡培养瓶的构建体有较多的腔隙(lacunae)形成于软骨细胞的周围，所有类型的软骨细胞-胶原蛋白构建体多数均能在四星期内形成近似软骨的外观。免疫组织化学分析结果显示所有的肥厚的软骨细胞-胶原蛋白构建体均含有II型胶原蛋白与硫酸软骨素。软骨修复
(1)软骨缺损与植入术
本实验使用36只雄性新西兰白兔，每只体重约为2.5公斤，平均年龄为4个月大。对兔子肌肉注射一氯胺酮(100毫克/毫升，0.65毫升/公斤体重)与甲苯噻嗪(20毫克/毫升，0.30毫升/公斤体重)的混合物使其麻醉昏迷，先剔除接近膝盖部位的皮肤上的毛发，之后用碘酊清洗，利用髌骨内侧法(parapatellar medial method)以接近膝关节，将髌骨分离并使用4毫米钻孔机将关节软骨钻孔，形成一个4毫米的圆形深层缺损，于股骨内髁形成一孔洞，此圆锥形缺损深度为4毫米，并且延伸进入骨髓腔的海绵骨。为避免产生干扰效应(confounder effect)，一半的兔子在右膝关节产生缺损，另一半的兔子则在左膝关节产生缺损。
利用上述之软骨植入物修复缺损，其中12只兔子以软骨细胞-兔子基材(CRBTCM)处理，另外12只兔子以软骨细胞-大鼠基材(CRTTCM)处理，至于剩下的12只兔子，则作为手术对照组不以任何植入物处理，未实施手术的膝关节则视为完整的膝关节对照组。
在手术后1、2或3周观察软骨修复状态，每次牺牲每组三只兔子，膝盖关节系整块移除并且于显微镜下观察，股骨的末端用福尔马林固定、脱钙，并在垂直于缺损处的方向作矢状切面解剖，从缺损处的中央切取切片，之后将标本用苏木精/伊红染色并于显微镜下观察。
(2)显微镜观察
正常关节软骨呈现半透明的白色与浅黄色的外观，覆盖股骨髁的关节末端，未进行植入术的手术所形成的缺损成凹陷状，于第四周时由亮白色的组织填充，缺损的边界可以明显的区分出来，在第12周时，缺损的表面成为不规则形并呈现纤维化现象。
出乎意料地，CRBTCM与CRTTCM组中，手术处理的膝盖均未发现任何骨关节炎，例如：骨刺、软骨侵蚀、关节囊膜增生等的迹象。手术后4周缺损部位由白色不透明的组织填充，于12周后两组均呈现类似软骨的组织覆盖于手术部位，修补的组织外观呈半透明而且边缘与健康的组织形成一体。
(3)组织学
手术对照组：一个月后发现在伤处与临近区域的软骨呈现轻微退化、纤维化与片段化之现象，缺损处由成纤维细胞结合稀疏的内生成软骨细胞来修复。2个月后，在伤处与临近区域的软骨呈现中度至重度的软骨退化、纤维化与片段化之现象，缺损处由成纤维细胞结合部分内生的成软骨细胞来修复。三个月后将缺损的软骨下骨剥除，并且以纤维组织覆盖。
CRBTCM与CRTTCM组：在一个月后，缺损处意外地大多以成软骨细胞填充，软骨细胞的形态从圆形到多角形不等，成软骨细胞穿透到软骨下骨层。两组均发现在植入处底部有轻微的炎症反应。
两个月后，相对于第一个月有更多纤维软骨产生，并且，在CRTTCM组比CRBTCM组发现有更多的纤维软骨。此外，在CRTTCM组发现于植入处有中度炎症反应，然而在CRBTCM组的植入处只有轻微的炎症反应。
在3个月后，于CRTTCM组与CRBTCM组的缺损处均被类似的纤维状软骨修复，并且软骨植入物与周围的正常软骨组织相比较薄。在缺损的边缘，软骨植入物与周围的健康组织形成一体，两组均未发现有炎症反应。
                    其它实施方案
本说明书中描述的所有特征可以任何方式相互组合。本说明书中的每一种特征可以由达到相同的、相等的或相似的目的之另一种特征取代。因此，除非另有说明，每一个描述的特征仅仅是这一类相当的或相似的系列特征的一个实施例。
根据上文详述，本领域人员能够轻易了解本发明的基本特征，并且在不脱离本发明的主旨和范畴前提下对本发明做出各种变动和修改使其适用于各种用途和条件。所以，其它实施方案也属于下述权利要求范围之内。

Claims (24)

1.一种软骨植入物的制造方法，其包括：
将软骨细胞或间叶干细胞植入含有任意重绕的I型胶原蛋白的α-螺旋单体的三维结构基材中；及
于所述基材中生长软骨细胞或间叶干细胞；
由此制得软骨植入物。
2.权利要求1的方法，其中的基材进一步含有任意重绕的II型胶原蛋白的α-螺旋单体。
3.权利要求2的方法，其中的II型胶原蛋白被部分消化。
4.权利要求3的方法，其中的I型胶原蛋白被部分消化。
5.权利要求2的方法，其中的I型胶原蛋白被部分消化。
6.权利要求2的方法，其中软骨细胞或间叶干细胞、I型胶原蛋白与II型胶原蛋白是从二种或三种不同的动物来源而制备的。
7.权利要求2的方法，其中软骨细胞或间叶干细胞与基材被置于一旋转震荡培养瓶内。
8.权利要求1的方法，其中的I型胶原蛋白被部分消化。
9.权利要求1的方法，其中的软骨细胞或间叶干细胞与I型胶原蛋白是从不同的动物来源而制备的。
10.权利要求1的方法，其中的软骨细胞或间叶干细胞与基材被置于一旋转震荡培养瓶内。
11.一种软骨植入物的制造方法，其包括：
将软骨细胞植入含有任意重绕的I型胶原蛋白的α-螺旋单体的三维结构基材中；及
于所述基材中生长软骨细胞；
由此制得软骨植入物。
12.权利要求11的方法，其中的基材可进一步含有任意重绕的II型胶原蛋白的α-螺旋单体。
13.权利要求12的方法，其中II型胶原蛋白被部分消化。
14.权利要求13的方法，其中I型胶原蛋白被部分消化。
15.权利要求12的方法，其中I型胶原蛋白被部分消化。
16.一种软骨植入物，其包括：
软骨细胞；及
三维基质，所述基材含有任意重绕的II型胶原蛋白的α-螺旋单体；
其中的软骨细胞被植入所述基质内。
17.权利要求16的软骨植入物，其中的基质可进一步含有任意重绕的II型胶原蛋白的α-螺旋单体。
18.权利要求17的软骨植入物，其中的II型胶原蛋白被部分消化。
19.权利要求18的软骨植入物，其中的I型胶原蛋白被部分消化。
20.权利要求17的软骨植入物，其中的I型胶原蛋白被部分消化。
21.权利要求17的软骨植入物，其中的软骨细胞、I型胶原蛋白与II型胶原蛋白是从两种到三种不同的动物来源而制备的。
22.权利要求16的软骨植入物，其中的I型胶原蛋白被部分消化。
23.权利要求22的软骨植入物，其中的软骨细胞与I型胶原蛋白是从不同的动物来源而制备的。
24.权利要求16的软骨植入物，其中的软骨细胞与I型胶原蛋白是从不同的动物来源而制备的。
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