JP2003275295A - 軟骨移植片及びその製造方法 - Google Patents

軟骨移植片及びその製造方法

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JP2003275295A JP2002378497A JP2002378497A JP2003275295A JP 2003275295 A JP2003275295 A JP 2003275295A JP 2002378497 A JP2002378497 A JP 2002378497A JP 2002378497 A JP2002378497 A JP 2002378497A JP 2003275295 A JP2003275295 A JP 2003275295A
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T Rei Wen-Fu
レイ ウェン−フ、ティ．
Tan Ja-Ren
ジャ−レン、タン
Chen Chen-Tsu
チェン−ツ、チェン
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 免疫原性が低い軟骨移植片を効率的に製造可
能な方法を提供する。 【解決手段】 ３次元の基質中に軟骨細胞又は間充織幹
細胞を組み込み増殖させて軟骨移植組織を形成する。基
質はランダムにリフォールディングされたタイプＩコラ
ーゲンのα−ヘリカルモノマーを含有している。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は軟骨移植片に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】軟骨組織は自己修復能力をほとんど有し
ない。軟骨組織の欠陥は、繊維軟骨によって自然に治癒
するが、それには制限がある。それらの生化学的特性、
機械特性及び生理学特性は、正常な軟骨よりも劣ってい
る。従って、傷ついた軟骨組織は退化し易くなる。
【０００３】軟骨再生の治療には、炭素材料のプラグ、
骨膜、軟骨間質、肋軟骨下の穿孔、及び自己由来軟骨細
胞の移植が含まれる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、それらのうち
の大多数は、自然の修復を越えるほど軟骨力学的又は生
理学的に改善していない。改善された治療の選択肢の提
供に対する臨床上の需要即ち、分離された軟骨細胞又は
間充織幹細胞から体外で作製された軟骨移植片に対する
需要がある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記問題点を解決するた
めに、請求項１に記載の発明は、タイプＩコラーゲンの
ランダムにリフォールディングされたα−ヘリカルモノ
マーを含有している３次元の基質中に、軟骨細胞又は間
充織の幹細胞を組み込む工程と、基質中の軟骨細胞又は
間充織幹細胞を増殖する工程とからなる軟骨移植片の製
造方法を要旨とする。
【０００６】請求項２に記載の発明は、請求項１に記載
の方法において、前記基質はタイプＩＩコラーゲンのラ
ンダムにリフォールディングされたヘリカルモノマーを
含有していることを要旨とする。
【０００７】請求項３に記載の発明は、請求項２に記載
の方法において、前記タイプＩＩコラーゲンは部分的に
消化されることを要旨とする。請求項４に記載の発明
は、請求項１〜３に記載の方法において、前記タイプＩ
コラーゲンは部分的に消化されることを要旨とする。
【０００８】請求項５に記載の発明は、請求項２に記載
の方法において、前記軟骨細胞又は間充織幹細胞と、タ
イプＩコラーゲンと、タイプＩＩコラーゲンとは、２種
類又は３種類の異なる動物源から調製されていることを
要旨とする。
【０００９】請求項６に記載の発明は、請求項１又は２
に記載の方法において、前記軟骨細胞又は間充織幹細胞
と基質とは、回転及び振動される容器に配置されること
を要旨とする。
【００１０】請求項７に記載の発明は、請求項２に記載
の方法において、前記軟骨細胞又は間充織幹細胞とタイ
プＩコラーゲンとは、それぞれ異なる動物源から調製さ
れていることを要旨とする。
【００１１】請求項８に記載の発明は、タイプＩコラー
ゲンのランダムにリフォールディングされたα−ヘリカ
ルモノマーを含有している３次元の基質中に、軟骨細胞
を組み込む工程と、 基質中の軟骨細胞を増殖する工程
とからなる軟骨移植片の製造方法を要旨とする。
【００１２】請求項９に記載の発明は、請求項１に記載
の方法において、前記基質はタイプＩＩコラーゲンのラ
ンダムにリフォールディングされたヘリカルモノマーを
含有していることを要旨とする。
【００１３】請求項１０に記載の発明は、請求項８に記
載の方法において、前記タイプＩＩコラーゲンは部分的
に消化されることを要旨とする。請求項１１に記載の発
明は、請求項９又は１０に記載の方法において、前記タ
イプＩコラーゲンは部分的に消化されることを要旨とす
る。
【００１４】請求項１２に記載の発明は、軟骨細胞と、
３次元のマトリクスと、同マトリクスはタイプＩコラー
ゲンのランダムにリフォールディングされたヘリカルモ
ノマーを含有していることと、前記軟骨細胞は前記マト
リクスに組み込まれていることとからなる軟骨移植片を
要旨とする。
【００１５】請求項１３に記載の発明は、請求項１２に
記載の軟骨移植片において、前記マトリクスはタイプＩ
Ｉコラーゲンのランダムにリフォールディングされたヘ
リカルモノマーを含有していることを要旨とする。
【００１６】請求項１４に記載の発明は、請求項１３に
記載の軟骨移植片において、前記タイプＩＩコラーゲン
は部分的に消化されることを要旨とする。請求項１５に
記載の発明は、請求項１３又は１４に記載の軟骨移植片
において、前記タイプＩコラーゲンは部分的に消化され
ることを要旨とする。
【００１７】請求項１６に記載の発明は、前記軟骨細胞
と、タイプＩコラーゲンと、タイプＩＩコラーゲンと
は、２種類又は３種類の異なる動物源から調製されてい
ることを要旨とする。
【００１８】請求項１７に記載の発明は、請求項１６に
記載の軟骨移植片において、前記タイプＩコラーゲンは
部分的に消化されることを要旨とする。請求項１８に記
載の発明は、請求項１２又は１７に記載の方法におい
て、前記軟骨細胞とタイプＩコラーゲンとは、それぞれ
異なる動物源から調製されていることを要旨とする。
【００１９】本発明は一実施態様において、３次元の基
質中に軟骨細胞又は間充織幹細胞を組み込むことによ
り、軟骨移植片を製造する方法を有する。基質は、タイ
プＩコラーゲンのランダムにリフォールディングされた
α−ヘリカルモノマーを含有しており、随意に、タイプ
ＩＩコラーゲンのランダムにリフォールディングされた
α−ヘリカルモノマーをさらに含有することもある。細
胞基質作成物は培地に置かれる。間充織幹細胞は、媒体
中に補給された分化要素によって軟骨細胞への分化を誘
発することが可能である。基質の中で軟骨細胞が増殖
し、分化するとともに、軟骨移植片が製造される間に細
胞外マトリクスタンパク質、例えばプロテオグリカン、
タイプＩＩコラーゲンなどを使用する。
【００２０】軟骨細胞又は間充織幹細胞と、タイプＩコ
ラーゲンと、タイプＩＩコラーゲンとは、２種類又は３
種類の異なる動物源から作製し得る。例えば、ヒトから
分離された軟骨細胞は、ウシのタイプＩコラーゲン及び
タイプＩＩコラーゲンと組み合わせて使用し得る。軟骨
細胞又は間充織幹細胞と基質とは、回転され及び振動さ
れる容器に配置し得る。同容器は軟骨形成を許容する微
環境を提供する。
【００２１】本発明は上記された方法によって製造され
た軟骨移植片にも関する。軟骨移植片は、３次元のマト
リクス即ち、軟骨移植片の細胞外の部品に組み込まれた
軟骨細胞を含有している。マトリクスは上記の基質と組
成が異なる。例えばマトリクスは、分解に起因してタイ
プＩコラーゲンのランダムにリフォールディングされた
ヘリカルモノマーをより少ない量で含有し、組み込まれ
た軟骨細胞によって合成されたタイプＩＩコラーゲンを
含有している。組み込まれた軟骨細胞には、マトリクス
内部のものとマトリクス表面に付着しているものとの両
方が含まれる。
【００２２】本発明は免疫原性が低い軟骨移植片を効率
的に製造可能な方法を提供する。本発明のいくつかの実
施形態の詳細は、以下の詳細な説明に記載されている。
本発明の他の特徴、目的及び利点は発明の詳細な説明及
び請求項から明白となる。
【００２３】
【発明の実施の形態】本発明は軟骨移植片の製造方法に
関する。より詳細には、軟骨細胞又は間充織幹細胞は、
３次元の基質に組み込まれている。同基質は、タイプＩ
コラーゲンのランダムにリフォールディングされたヘリ
カルモノマーを含有している。そのような細胞コラーゲ
ン作成物は培地に置かれたときには、軟骨移植片を形成
すべく成長する。
【００２４】基質はタイプＩコラーゲンのみを含有する
ことも、或いはタイプＩコラーゲン及びタイプＩＩコラ
ーゲンの両方を含有することもある。タイプＩコラーゲ
ンは、本発明の軟骨移植片を構造的に支持する。タイプ
Ｉコラーゲンは骨、皮膚及び腱の主要成分であり、成熟
した瘢痕（即ち傷跡）中に主要成分として含まれるコラ
ーゲンである。それは、腱組織から抽出し、精製するこ
とができる（米国特許第５，８７６，４４４号、レイ
（Ｌａｉ）、１９９９年）。タイプＩＩコラーゲンは軟
骨中に主要に含まれる種類のコラーゲンである。タイプ
ＩＩコラーゲンは、軟骨細胞或いは間充織幹細胞の増殖
及び分化の能力の維持を促進する。下記のように、軟骨
組織から抽出及び精製できる。
【００２５】本発明の方法においては、タイプＩコラー
ゲン及びタイプＩＩコラーゲンのα−ヘリカルモノマー
は、基質内でランダムにリフォールディングされてい
る。そのような基質に組み込まれて増殖された軟骨細胞
又は間充織幹細胞から製造された軟骨移植片は予想外に
低い免疫原性を示す。タイプＩ又はタイプＩＩコラーゲ
ンのランダムにリフォールディングされたα−ヘリカル
モノマーは、以下のように作製される。（１）酸性溶液
に溶解し、プロテアーゼで部分的に分解することによっ
て、タイプＩ又はタイプＩＩコラーゲンの３重らせんを
巻き戻す。（２）タイプＩ又はタイプＩＩコラーゲンの
巻き戻されたヘリカルモノマーをランダムにリフォール
ディングする。米国特許第５，８７６，４４４号を参照
のこと。タイプＩ及びタイプＩＩコラーゲンの両方の種
類を含有する基質を作製する場合、タイプＩ対タイプＩ
の重量比は好適には、１：１〜１：２（例えば、１：
１．１，１：１．５，１：１．７）の範囲内にある。タ
イプＩ及びタイプＩＩコラーゲンの巻き戻されたα−ヘ
リカルモノマーが混合された場合には、タイプＩコラー
ゲンモノマーはタイプＩＩコラーゲンモノマーと巻き合
ってハイブリッドオリゴマーを形成することが可能であ
る。
【００２６】軟骨細胞及び間充織幹細胞はそれぞれ関節
軟骨と骨髄とから分離し得る。細胞はサブコンフルエン
スに培養され、次に上記の基質中に組み込まれる。細胞
数及び使用すべき基質の量は、当業者によって経験的
に、或いは下記の実施例に従って決定し得る。そのよう
にして得られた細胞基質作成物は培地に置かれ、成長可
能となる。間充織幹細胞が軟骨移植片をの形成に使用さ
れる場合、培地は間充織幹細胞の軟骨細胞への分化を誘
発するために分化要素（例えばＩＬ−１やデクサメタゾ
ーン）を含有している必要がある。回転及び振動される
容器で作成物を増殖させることが可能である。予測を超
えて、作成物は静止フラスコよりも回転及び振動される
容器内ではるかに速く成長する。軟骨移植片は数週間で
形成される。輸送、成型、並びに患者に移植される前に
軟骨移植片は、密封した無菌の組織培養メディア箱内に
て室温で数日間貯蔵可能である。患者のもとへの輸送直
後に軟骨移植片が使用されない場合には、それはさらに
数日間上記の状態で貯蔵され得る。
【００２７】本発明は、上記された方法によって作製ら
れた軟骨移植片にも関する。例えば可動結合部及び椎間
円板内などの軟骨欠陥を修復するために使用された場合
にはそのような移植片は、軟骨移植片を作製するために
使用される、軟骨細胞或いは間充織幹細胞であるタイプ
Ｉコラーゲンと、タイプＩＩコラーゲンとが異なる動物
源から調製された場合であっても、低い免疫原性を示
す。例えば、ウサギ関節軟骨から分離された軟骨細胞
は、ラット尾から調製されたタイプＩコラーゲン及び、
ウサギ軟骨から調製されたタイプＩＩコラーゲンと混合
することができる。予測を超えて、そのような移植片は
ウサギ膝関節の軟骨欠陥を修復するために使用できる。
【００２８】下記の特定の実施例は、単に例示として解
釈されるべきものであり、いかようにも残りの明細書の
開示を限定するものではない。それ以上の詳細を提供す
ることなく、当業者ならば本明細書の記載に基づき本発
明を十分に利用可能である。
【００２９】軟骨移植片の作製 （１） タイプＩコラーゲンの抽出及び精製 タイプＩコラーゲンは、ニュージーランドシロウサギの
腱又はラット尾の腱から抽出及び精製された。（米国特
許第５，８７６，４４４号、レイ（Ｌａｉ）、１９９９
年）血漿タンパクを除去するために腱を剥離、薄切り及
び、冷却蒸留水を数回取替えながら洗浄し、次に、５０
ｍＭ、ｐＨ ７．４のトリス塩酸中の０．５Ｍ ＮａＣ
ｌを使用して４℃で一晩継続して攪拌しながら抽出し
た。上清を静かに移動し、残りは塩類を除去するために
冷却蒸留水を数回取り替えて洗浄し、次に０．５Ｍ Ｈ
ＯＡｃ（ｐＨ ２．５）中にて４℃で一晩培養し、水溶
性抽出物を得た。抽出物を塩性水溶液（０．９Ｍ Ｎａ
Ｃｌ）で沈澱した。沈殿物を３０分間１３，０００ｒｐ
ｍで遠心分離機にかけ、コラーゲン含有溶液を形成する
ために０．０５Ｍ ＨＯＡｃに溶解した。沈澱させるた
めに別の塩溶液（０．０２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４）を２４
〜４８時間の間にわたってコラーゲン含有溶液に２度加
えた。沈殿物を遠心分離機にかけ、次に別のコラーゲン
含有溶液を得るために５０ｍＭ ＨＯＡｃに溶解した。
溶液を５ｍＭ ＨＯＡｃに対して透析し、凍結乾燥し
た。
【００３０】（２） タイプＩＩコラーゲンの抽出及び
精製 タイプＩＩコラーゲンは、変更したミラー法（雑誌 酵
素学大系（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．）第８２
巻第３３〜６４ページ）によって作製された。ウサギ軟
骨を薄切りし、０．０５Ｍ トリスバッファ（ｐＨ
７．４）中の、０．５Ｍ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ ＥＤ
ＴＡで洗浄した。４Ｍ グアニジン−ＨＣｌで糖タンパ
クを除去し、抽出物を１ｍｇ／ｍｌのペプシンとともに
０．５Ｍ酢酸に溶解した。０．９Ｍ ＮａＣｌを加え、
完全に酸と塩を除去すべく７０％のアルコールで数回洗
浄し、１Ｍ ＮａＣｌ及び０．０５Ｍ トリスバッファ
（ｐＨ ７．４）に溶解することによってコラーゲンを
沈澱させた。沈降反応のためにＮａＣｌを３．５Ｍまで
加え、上清は回収した。その後ＮａＣｌを４．５Ｍまで
加えることによりタイプＩＩコラーゲンを沈澱させた。
ペレットを７０％のアルコールで数回洗浄し、２〜４ｍ
ｇ／ｍｌの最終濃度まで１０ｍＭ 酢酸中に再び溶解し
た。
【００３１】（３） 軟骨細胞の単離及び培養 軟骨細胞を、ニュージーランドシロウサギの新生児の関
節軟骨から分離した（レイ（Ｌａｉ）、医学博士論文、
ハーバード大学医学部、１９９３年）。細胞のスライス
を、ヒアルロニダーゼ１ｍｇ／ｍｌ及びコラゲナーゼ１
ｍｇ／ｍｌを含有する、ハンクのバランス塩溶液（ＨＢ
ＳＳ）中で一晩インキュベートした。遠心分離後に、組
織ペレットを１０％ ＰＢＳ、５０μｇ／ｍｌ硫酸ゲン
タマイシン、１００ユニット／ｍｌ ペニシリンＧナト
リウム、１００μｇ／ｍｌ 硫酸ストレプトマイシン及
び０．２５μｇ／ｍｌ ファンギゾンをもって、ＤＭＥ
Ｍ中に再懸濁された。１０ｃｍペトリ皿につき５×１０
５個の組織を播種し、３７℃で５％炭酸ガスインキュベ
ータにおいて培養した。媒体を３〜４日毎に取り替え、
組織をサブコンフルエントまで成長させた。
【００３２】（４） 軟骨移植片の作製 タイプＩ及びタイプＩＩコラーゲンの両方をガンマ線で
殺菌し、５ｍＭ ＨＯＡｃにそれぞれ溶解した。コラー
ゲンは、テロペプチドを除去するためにペプシンで部分
的に消化させた。例えば米国特許第５，８７６，４４４
号を参照されたい。タイプＩコラーゲン含有溶液及びタ
イプＩＩコラーゲン含有溶液を緩慢に混合した。必要な
場合には混合を促進するために溶液を３０〜４０℃に加
熱した。タイプＩＩコラーゲン対タイプＩコラーゲンの
重量比は１：１〜１：２である。
【００３３】（１〜１０）×１０６個の軟骨細胞１．０
ｍｌを、２〜４ｍｇ／ｍｌのタイプＩ及びタイプＩＩコ
ラーゲンを含有している別の溶液１．０ｍｌに混合し
た。２４のウサギ基質（即ちウサギのタイプＩコラーゲ
ン及びウサギのタイプＩＩコラーゲンを含有している基
質）、及び２４のラット基質（即ちラットのタイプＩコ
ラーゲン及びウサギのタイプＩＩコラーゲンを含有して
いる基質）のそれぞれに軟骨細胞を播種した。混合物が
重合するまで６ウェル又は２４ウェルの皿に置いた。軟
骨細胞−コラーゲン作成物をさらに、特定の栄養素と薬
物とを含有しているＤＭＥＭ中で培養した。上記の特定
の栄養素は、１０〜２０％ウシ胎児血清、ＨＡＭ Ｆ−
１２Ｋ、０．３〜０．５ｍＭ プロリン、及び５０〜７
０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸を含有する。上記の薬物は５
％ＣＯ２下、３７℃において、５０μｇ／ｍｌ硫酸ゲン
タマイシン、１００ユニット／ｍｌペニシリンＧナトリ
ウム、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、及び
０．２５μｇ／ｍｌファンギゾンを含有する。
【００３４】軟骨細胞−コラーゲン作成物を、３〜５日
間フラスコ内でまず静地培養した。次にそれらの半分、
即ち軟骨細胞−ウサギ基質作成物１２個と、軟骨細胞−
ラット基質作成物１２個とを容器に移し、ある程度の振
動をもって８〜１６ｒｐｍで緩慢に回転させた。作成物
の残り半分は静止しているフラスコに残した。媒体を２
〜４日毎に取り替え、軟骨細胞−コラーゲン作成物は２
〜４週間で徐々に軟骨移植片になった。
【００３５】４つの軟骨細胞−コラーゲン作成物即ち、
静止フラスコ中の軟骨細胞−ウサギ基質作成物と、静止
フラスコ中の軟骨細胞−ラット基質作成物と、回転振動
容器中の軟骨細胞−ウサギ基質作成物と、回転振動容器
中の軟骨細胞−ラット基質作成物とを、１，２，３，４
週間で除去した。作成物を肉眼で検査し、１０％ホルマ
リンに固定し、パラフィンに組み込み、５〜１０ミクロ
ンに連続的に分割（サクラスレッジ（Ｓａｃｕｒａ Ｓ
ｌｅｄｇｅ）ミクロトーム）した。組織切片をヘマトキ
シリン／エオシン染色し、軟骨形成分化を評価した。
【００３６】（５） 免疫組織化学 組織切片を第１の抗体（抗タイプＩＩコラーゲン及び抗
コンドロイチン硫酸塩）又は制御血清ブランクで培養し
た。タイプＩＩコラーゲンは細胞外マトリクスの軟骨に
特有の成分である。コンドロイチン硫酸塩は軟骨プロテ
オグリカンの主成分である。抗原−第１抗体錯体は、第
２抗体−ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合体で
さらに培養された。タイプＩＩコラーゲン及びコンドロ
イチン硫酸塩の濃度は、第３の抗原−抗体錯体の量を３
−３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で検出することに
よって決定した。
【００３７】組織化学的結果は、表１に要約される。 表１ 軟骨細胞−コラーゲン作成物の軟骨形成
【表１】
【００３８】予測を超えて、回転及び振動させた容器中
の軟骨細胞−ラット基質作成物は１週間でのわずかな軟
骨形成及び、２週後の軟骨形成の異常発達を示した。回
転振動容器中の軟骨細胞−ウサギ基質作成物及び、静止
フラスコ中の軟骨細胞−ラット基質作成物は、２週間で
わずかな軟骨形成を開始し、３週後に軟骨形成の異常発
達を示した。静止フラスコ中の軟骨細胞−ウサギ基質作
成物は３週後まで軟骨形成を示さなかったが、わずかな
軟骨形成異常発達が４週目までに観察された。
【００３９】一般に、静止フラスコ中のものより回転振
動容器中で増殖した作成物で軟骨細胞周囲でのより多く
の欠陥部分形成が観察された。全てのグループ中の大部
分の軟骨細胞−コラーゲン作成物は４週間で軟骨状の外
観を示した。免疫組織化学的評価は、タイプＩＩコラー
ゲン及びコンドロイチン硫酸塩が全ての異常発達軟骨細
胞−コラーゲン作成物中に存在していることを示した。
【００４０】軟骨修復 （１） 軟骨欠陥及び移植 ３６個のオスのニュージーランドシロウサギがこの実験
で使用された。各ウサギは約２．５ｋｇの体重を有し、
平均年齢は４か月であった。ケタミン（１００ｍｇ／ｍ
ｌ、０．６５ｍｌ／体重ｋｇ）及びキシラジン（２０ｍ
ｇ／ｍｌ、０．３０ｍｌ／体重ｋｇ）の混合物の筋肉注
射によってウサギに麻酔をした。膝前部周辺の皮膚を削
り、ヨウ素で洗浄した。膝関節に到達するために内側傍
膝蓋アプローチを使用した。膝蓋骨を摘出し、関節軟骨
の４ｍｍの環状全層欠陥を４ｍｍドリルで形成した。孔
は中間の大腿部内側顆状突起に設けられた。深さ４ｍｍ
かつ、骨髄穴の海綿質骨へ延伸する円錐形の欠陥を形成
した。交絡因子の影響を回避するために、半数のウサギ
は右膝継手に欠陥を形成し、残りの半数は左膝継手に欠
陥を形成した。
【００４１】欠陥を上記の軟骨移植片で修復した。１２
個のウサギを軟骨細胞−ウサギマトリクス移植片（ＣＲ
ＢＴＣＭ）で治療した。他の１２個のウサギを軟骨細胞
−ラットマトリクス移植片（ＣＲＴＴＣＭ）で治療し
た。残りの１２個のウサギは、外科対照群として移植組
織で治療しなかった。外科手術をしていない膝関節は完
全な膝関節コントロールとして使用された。
【００４２】外科手術後１，２，３か月で軟骨修復部を
検査した。各回ごとに各グループ中の３個のウサギを使
用した。膝関節は端受けが除去され微視的に検査され
た。大腿骨の末端部をホルマリンで固着し、脱灰し、欠
陥部に垂直かつ矢状方向に切断した。これらの切断部は
欠陥の中心部から得られた。試験片をヘマトキシリン／
エオシンで染色し、微視的に検査した。
【００４３】（２） 微視的検査 正常な関節軟骨は大腿顆の関節をなす端部を覆って、黄
色を帯びた半透明白色の外観を有する。移植をしていな
い外科的欠陥は凹面に観察され、４週で白色光沢を有す
る組織で充填された。欠陥の端縁は明確であった。１２
週で欠陥表面は、繊維によって不規則な形状になってい
た。
【００４４】予測を超えて、ＣＲＢＴＣＭ及びＣＲＴＴ
ＣＭで手術された両方のグループにおいて、骨増殖体、
軟骨浸食、或いは滑膜増殖などの骨関節炎の徴候は観察
されなかった。欠陥は外科手術後４週間で白い不透明な
組織で充填された。１２週後に両方のグループにおい
て、外科手術箇所を被覆する軟骨状の組織が観察され
た。修復組織は半透明に観察され、端縁部は隣接してい
る健康な組織と一体化していた。
【００４５】（３） 組織学 （外科対照群）１か月後に軟骨の緩慢な退化、繊維攣縮
及び細分化が傷及び隣接した領域で観察された。欠陥は
わずかな軟骨芽細胞の成長とともに繊維芽細胞によって
修復された。２か月後に軟骨の通常から重篤な退化、繊
維性攣縮、及び細分化が傷内部及び隣接した領域で観察
された。欠陥は繊維及び部分的軟骨芽細胞内の成長によ
って修復された。３か月後に欠陥の軟骨下骨が曝され、
繊維組織によって被覆された。
【００４６】（ＣＲＢＴＣＭグループ及びＣＲＴＴＣＭ
グループ）予測を超えて、１か月後に欠陥は軟骨芽細胞
でほぼ充填された。軟骨細胞の組織形態は円形から多角
形類似まで多様であった。軟骨芽細胞は肋軟骨下の層に
入り込んだ。わずかな炎症が両グループ中の移植箇所底
部で観察された。
【００４７】２か月後には１か月後の同一グループのも
のと比較して、より多くの繊維軟骨が観察された。さら
に、より多くの繊維軟骨がＣＲＢＴＣＭグループよりＣ
ＲＴＴＣＭグループで観察された。さらに、ＣＲＴＴＣ
Ｍグループでは移植箇所で適度な炎症が観察されたが、
ＣＲＢＴＣＭグループではわずかな炎症のみが移植箇所
で観察された。
【００４８】３か月後、欠陥はＣＲＴＴＣＭ及びＣＲＢ
ＴＣＭの両グループで類似線維軟骨によって修復され
た。軟骨移植組織は周囲の隣接した正常な軟骨より薄か
った。欠陥の端縁にて、軟骨移植組織は隣接した健康な
組織と一体化した。いずれのグループでも炎症反応は観
察されなかった。
【００４９】他の実施形態 本明細書に示された特徴はすべて、任意の組合せとして
組み合わせてもよい。本明細書に示された各特徴は、同
一、等価、又は類似目的の役割を果たす代替の特徴で置
換されてもよい。したがって、特に明示されない場合に
は、示された各特徴は一般的な一連の等価又は同様の特
徴を例示のみするものである。
【００５０】上記の記載から当業者ならば容易に本発明
の本質的な特性を認識し、その精神及び範囲から逸脱す
ることなく、様々な使用法及び条件に適応させるべく本
発明の様々な変更及び修飾を加えることが可能である。
従って、他の実施形態もまた請求項の範囲内にある。
【発明の効果】本発明によると、免疫原性が低い軟骨移
植片及びその製造方法が提供される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウェン−フ、ティ． レイ 台湾 タイペイ ホーピング イー．ロー ド セクション ２ アレイ 118 アレ イ ６ 23 (72)発明者 ジャ−レン、タン 台湾 タイペイ シンディアン シティ リーミン ロード レーン 57 ナンバー 42 １フロア (72)発明者 チェン−ツ、チェン 台湾 タイペイ ウ シン ストリート ナンバー472 ２フロア

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 タイプＩコラーゲンのランダムにリフォ
    ールディングされたα−ヘリカルモノマーを含有してい
    る３次元の基質中に、軟骨細胞又は間充織の幹細胞を組
    み込む工程と、 基質中の軟骨細胞又は間充織幹細胞を増殖する工程とか
    らなる軟骨移植片の製造方法。
  2. 【請求項２】 前記基質はタイプＩＩコラーゲンのラン
    ダムにリフォールディングされたヘリカルモノマーを含
    有している請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記タイプＩＩコラーゲンは部分的に消
    化される請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記タイプＩコラーゲンは部分的に消化
    される請求項１〜３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記軟骨細胞又は間充織幹細胞と、タイ
    プＩコラーゲンと、タイプＩＩコラーゲンとは、２種類
    又は３種類の異なる動物源から調製されている請求項２
    に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記軟骨細胞又は間充織幹細胞と基質と
    は、回転及び振動される容器に配置される請求項１又は
    ２に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記軟骨細胞又は間充織幹細胞とタイプ
    Ｉコラーゲンとは、それぞれ異なる動物源から調製され
    ている請求項２に記載の方法。
  8. 【請求項８】 タイプＩコラーゲンのランダムにリフォ
    ールディングされたα−ヘリカルモノマーを含有してい
    る３次元の基質中に、軟骨細胞を組み込む工程と、 基質中の軟骨細胞を増殖する工程とからなる軟骨移植片
    の製造方法。
  9. 【請求項９】 前記基質はタイプＩＩコラーゲンのラン
    ダムにリフォールディングされたヘリカルモノマーを含
    有している請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記タイプＩＩコラーゲンは部分的に
    消化される請求項８に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記タイプＩコラーゲンは部分的に消
    化される請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 軟骨細胞と、 ３次元のマトリクスと、同マトリクスはタイプＩコラー
    ゲンのランダムにリフォールディングされたヘリカルモ
    ノマーを含有していることと、 前記軟骨細胞は前記マトリクスに組み込まれていること
    とからなる軟骨移植片。
  13. 【請求項１３】 前記マトリクスはタイプＩＩコラーゲ
    ンのランダムにリフォールディングされたヘリカルモノ
    マーを含有している請求項１２に記載の軟骨移植片。
  14. 【請求項１４】 前記タイプＩＩコラーゲンは部分的に
    消化される請求項１３に記載の軟骨移植片。
  15. 【請求項１５】 前記タイプＩコラーゲンは部分的に消
    化される請求項１３又は１４に記載の軟骨移植片。
  16. 【請求項１６】 前記軟骨細胞と、タイプＩコラーゲン
    と、タイプＩＩコラーゲンとは、２種類又は３種類の異
    なる動物源から調製されている請求項１の軟骨移植片。
  17. 【請求項１７】 前記タイプＩコラーゲンは部分的に消
    化される請求項１６に記載の軟骨移植片。
  18. 【請求項１８】 前記軟骨細胞とタイプＩコラーゲンと
    は、それぞれ異なる動物源から調製されている請求項１
    ２又は１７に記載の方法。
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