CN104368043B - 一种胶原基质软骨修复膜、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种胶原基质软骨修复膜的制备方法，包括以下步骤：（1）以猪腿肌腱为原料，经剪切、酶解、离心、过滤、溶解，得到Ⅰ型胶原溶液；（2）用1M碳酸氢钠溶液对步骤（1）得到的Ⅰ型胶原溶液进行中和；（3）将步骤（2）中中和后的Ⅰ型胶原溶液倒入模具，于30~40℃干燥35~54h，在模具内形成Ⅰ型胶原基质膜；（4）将步骤（3）得到的Ⅰ型胶原基质膜浸泡于20~200ug/mL甲状旁腺激素相关肽溶液中，于30~40℃孵育0.5~2h，得到复合甲状旁腺激素相关肽的Ⅰ型胶原基质软骨修复膜。本发明还公开了一种胶原基质软骨修复膜及其应用。本发明的软骨修复膜对软骨损伤面有一定的粘附性，适宜软骨损伤修复。

Description

一种胶原基质软骨修复膜、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物材料制备领域，特别涉及一种含活性因子的胶原基质软骨修复膜的快速制备方法与应用。

背景技术

关节软骨能减少相邻两骨间的摩擦，缓冲运动时产生的震动，所以由体育运动造成的软骨损伤极为普遍。有数据表明，单美国的软骨相关手术每年就有超过40万例。由于软骨无血管、无神经，传统观点认为软骨损伤无法自发修复，如果不采取外加手段干预治疗，会导致进一步的软骨磨损，甚至引发骨关节炎，对其结构和功能造成不可逆的损害，严重影响患者的生活工作质量。目前临床治疗表层软骨损伤的保守治疗方法包括关节腔灌洗清创术，微骨折术等只能减轻关节疼痛和暂时缓解临床症状，并不能有效地促进软骨组织的修复再生，阻止病程的发展。因此，寻找新型的、可有效促进软骨生理性再生修复的方法具有极其重要的临床意义。

近年来，随着组织工程和再生医学技术的不断成熟，为提高软骨的修复质量带来崭新的机会。天然生物材料Ⅰ型胶原，由于其免疫原性低，生物相容性好，降解速率可控等优点，被广泛用于软骨组织工程支架的制备。如德国ArthroKinetics公司的CaReS产品是由鼠尾Ⅰ型胶原构成的3D支架，用于治疗3.5-14cm²大小的软骨缺损；中国发明专利(ZL200710068762.5)“一种软骨组织工程支架及其应用”中，用Ⅰ型胶原构建含有致密层与疏松层的双层海绵支架，用于骨软骨损伤修复。

此外，有研究者发现软骨修复过程中会出现软骨钙化的迹象。软骨钙化一般发生于生理性生长板软骨内骨化过程，在此过程中，软骨细胞肥大、软骨基质矿化、降解，骨基质增多，钙化层上移，双重潮线出现，最终导致关节面受力改变，软骨结构和功能受损甚至骨关节炎的发生。

甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)是甲状腺激素家族中的一员，作为钙化抑制因子参与生长板发育过程。甲状旁腺激素相关肽由173个氨基酸组成，其活性片段1-34与甲状旁腺激素(PTH)一致。美国礼来制药研发的药物特立帕肽(商品名Forteo)为人重组蛋白PTH(1-34)，用于有骨折高发风险的绝经后妇女骨质疏松症的治疗。

发明内容

本发明是提供一种胶原基质软骨修复膜的制备方法，预先制备的胶原基质膜可在使用时与活性因子PTHrP(1-34)(甲状旁腺激素相关肽)迅速复合，保证了甲状旁腺激素相关肽的生物活性，其可以解决现有技术中的软骨修复过程中会出现软骨钙化的缺点。

本发明采用的技术方案是：

一种胶原基质软骨修复膜的制备方法，包括以下步骤：(1)以新鲜猪腿肌腱为原料，经剪切、酶解、离心、过滤、溶解，获得Ⅰ型胶原溶液；(2)用1M碳酸氢钠溶液对步骤(1)得到的5～20mg/mLⅠ型胶原溶液进行中和；(3)将步骤2得到的中和后的Ⅰ型胶原溶液倒入模具，于30～40℃干燥48h，在模具内形成Ⅰ型胶原基质膜；(4)手术前，将步骤3得到的Ⅰ型胶原基质膜浸泡于20～200ug/mL甲状旁腺激素相关肽溶液中，于30～40℃孵育0.5～2h，得到复合甲状旁腺激素相关肽的Ⅰ型胶原基质膜材料。

进一步，步骤(1)所述Ⅰ型胶原溶液的制备方法为：A)从二月龄健康白猪猪腿处剥取肌腱，去除筋膜和脂肪，剪碎浸泡于体积浓度75％的乙醇水溶液中，4℃过夜；B)将步骤A的肌腱碎片用蒸馏水冲洗5遍，加入0.5mol/L的乙酸水溶液中，调节pH至1，加入胃蛋白酶，4℃放置3天，获得胶原溶胶液；所述乙酸水溶液的体积用量以肌腱碎片质量计为18.9mL/g，所述胃蛋白酶质量用量以肌腱碎片质量计为94.7mg/g；C)将步骤B获得的胶原溶胶液于4℃、4000rpm水平离心25分钟，弃上层脂肪层，将沉淀a用0.5mol/L乙酸水溶液稀释3倍体积，在超净台中用4层纱布过滤，将滤液与0.9mol/L的NaCl水溶液以体积比1：10混合，间歇震荡，4℃过夜，再在4℃、4000rpm水平离心25分钟，弃上清液及悬浮物，获得沉淀b；D)将沉淀b按下述方式之一处理，制备水溶性Ⅰ型胶原：a)将沉淀b用0.5mol/L的乙酸水溶液在4℃溶解过夜，所述乙酸水溶液与沉淀b的体积比为4：1，获得所述水溶性Ⅰ型胶原；b)将沉淀b置于直径0.25μm的再生纤维素透析袋中，以三蒸水作为透析液，每天换水4～6次，透析3天，将透析袋中透析后的沉淀置于培养皿中-80℃过夜，再于冻干机中抽干2～3天，获得所述水溶性Ⅰ型胶原。

进一步，步骤(2)中，用1M碳酸氢钠溶液对步骤(1)得到的Ⅰ型胶原溶液进行中和，其中Ⅰ型胶原溶液的浓度为10mg/mL。

进一步，步骤(2)所述碳酸氢钠溶液与Ⅰ型胶原水溶液的体积比是1～4：1。

进一步，步骤(2)所述碳酸氢钠溶液与Ⅰ型胶原水溶液的体积比是2.3:1。

进一步，步骤(3)所述模具可以为表面平整光滑的各种形状、各种材质的模具，通常采用塑料材质的方形皿、圆形皿或孔板容器。

进一步，步骤(4)所述甲状旁腺激素相关肽溶液选用商品化的人重组蛋白甲状旁腺激素相关肽粉末配制。

进一步，步骤(4)所述甲状旁腺激素相关肽溶液由灭菌PBS缓冲液(pH＝7.4)配制成的水溶液。

进一步，步骤(4)所述甲状旁腺激素相关肽溶液的体积用量是Ⅰ型胶原基质膜体积的10～20倍。

本发明还公开了一种胶原基质软骨修复膜，其通过上述制备方法制备得到。

本发明还公开了胶原基质软骨修复膜在制备软骨损伤的修复治疗或联合其他全层软骨损伤或骨软骨损伤修复治疗的支架材料中的应用。

本发明所述的软骨修复膜，颜色半透明、表面光滑，对软骨损伤面有一定的粘附性，适宜软骨损伤修复。

本发明所述的软骨修复膜，制备工艺中不接触有毒物质，未使用变性剂、促凝剂和交联剂等添加剂。

本发明所述的软骨修复膜，制备工艺简单，手术操作前将预先制备的胶原基质膜在使用前与甲状旁腺激素相关肽溶液复合，避免预先复合甲状旁腺激素相关肽溶液的支架灭菌时造成的活性因子失活，最大程度保证了甲状旁腺激素相关肽溶液的生物活性。

本发明所述的软骨修复膜，Ⅰ型胶原基质膜可以有效的缓释甲状旁腺激素相关肽，因而能够抑制软骨钙化，从而提高软骨损伤的修复质量。

附图说明

图1实施例3中新西兰大白兔软骨损伤造模照片及修复6周后的结果。图1A为新西兰大白兔造模为4mm×4mm的表层软骨缺损，图1B为软骨修复膜，图1C为修复6周空白对照组大体图片，图1D为修复6周软骨修复膜组大体图片。

图2实施例9中新西兰大白兔软骨损伤修复6周后的组织学结果。图2A为4倍镜下空白对照组SO染色图片，图2B为4倍镜下软骨修复膜组SO染色图片，图2C为40倍镜下软骨修复膜组SO染色图片。

具体实施方式：

下面结合具体实施方式，详细描述本发明。应理解，这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：

A)从二月龄健康白猪猪腿处剥取肌腱，去除筋膜和脂肪，剪碎120g，浸泡于500mL体积浓度75％的乙醇水溶液中，4℃过夜；B)将步骤A的肌腱碎片95g用蒸馏水冲洗5遍，加入0.5mol/L的乙酸水溶液1800mL中，用6M氢氧化钠水溶液调节pH至1，加入胃蛋白酶(Sigma-ALDRICH)9g，4℃放置3天，获得胶原溶胶液1800mL；C)将步骤B获得的胶原溶胶液于4℃、4000rpm水平离心25分钟，弃上层脂肪层，将沉淀a用0.5mol/L乙酸水溶液稀释3倍体积，在超净台中用4层纱布过滤，将滤液与0.9mol/L的NaCl水溶液以体积比1：10混合，间歇震荡，4℃过夜，再在4℃、4000rpm水平离心25分钟，弃上清液及悬浮物，获得沉淀b；D)将沉淀b按下述方式之一处理，制备水溶性Ⅰ型胶原：a)将沉淀b用0.5mol/L的乙酸水溶液在4℃溶解过夜，所述乙酸水溶液与沉淀b的体积比为4：1，获得所述水溶性Ⅰ型胶原；b)将沉淀b置于直径0.25μm的再生纤维素透析袋中，以三蒸水作为透析液，每天换水4～6次，透析3天，将透析袋中透析后的沉淀置于培养皿中-80℃过夜，再于冻干机中抽干2～3天，获得所述水溶性Ⅰ型胶原62g。

实施例2：

将实施例1方法提取的水溶性Ⅰ型胶原溶于去离子水中配制成浓度为10mg/mL胶原水溶液10mL，加入40mL浓度为1M的碳酸氢钠溶液进行中和。取出4.3mL中和后的Ⅰ型胶原溶液，倒入直径6cm的细胞培养皿(Corning)。将培养皿放置在温度为37℃的烘箱，干燥48h，在模具内形成Ⅰ型胶原膜。将干燥的Ⅰ型胶原膜取出，剪切成5mm×5mm大小。取10张剪切后的膜片，置于直径10cm的细胞培养皿(Corning)，加入5mL由PBS(pH＝7.4)配制的浓度为100ug/mL的甲状旁腺激素相关肽(Bachem)溶液，置于细胞培养箱中于37℃浸泡1h，得到复合甲状旁腺激素相关肽的Ⅰ型胶原膜材料，即含活性因子的胶原基质软骨修复膜，甲状旁腺激素相关肽溶液的体积用量是Ⅰ型胶原基质膜体积的15倍。

实施例3：

将实施例1方法提取的水溶性Ⅰ型胶原溶于去离子水中配制成浓度为5mg/mL胶原水溶液10mL，加入10mL浓度为1M的碳酸氢钠溶液进行中和。取出4.3mL中和后的Ⅰ型胶原溶液，倒入直径6cm的细胞培养皿(Corning)。将培养皿放置在温度为37℃的烘箱，干燥48h，在模具内形成Ⅰ型胶原膜。将干燥的Ⅰ型胶原膜取出，剪切成5mm×5mm大小。取10张剪切后的膜片，置于直径10cm的细胞培养皿(Corning)，加入5mL由PBS(pH＝7.4)配制的浓度为100ug/mL的甲状旁腺激素相关肽(Bachem)溶液，置于细胞培养箱中于37℃浸泡1h，得到复合甲状旁腺激素相关肽的Ⅰ型胶原膜材料，即含活性因子的胶原基质软骨修复膜。甲状旁腺激素相关肽溶液的体积用量是Ⅰ型胶原基质膜体积的10倍。

实施例4：

将实施例1方法提取的水溶性Ⅰ型胶原溶于去离子水中配制成浓度为20mg/mL胶原水溶液10mL，加入23mL浓度为1M的碳酸氢钠溶液进行中和。取出4.3mL中和后的Ⅰ型胶原溶液，倒入直径6cm的细胞培养皿(Corning)。将培养皿放置在温度为37℃的烘箱，干燥48h，在模具内形成Ⅰ型胶原膜。将干燥的Ⅰ型胶原膜取出，剪切成5mm×5mm大小。取10张剪切后的膜片，置于直径10cm的细胞培养皿(Corning)，加入5mL由PBS(pH＝7.4)配制的浓度为100ug/mL的甲状旁腺激素相关肽(Bachem)溶液，置于细胞培养箱中于37℃浸泡1h，得到复合甲状旁腺激素相关肽的Ⅰ型胶原膜材料，即含活性因子的胶原基质软骨修复膜。甲状旁腺激素相关肽溶液的体积用量是Ⅰ型胶原基质膜体积的20倍。

实施例5：

将实施例1方法提取的水溶性Ⅰ型胶原溶于去离子水中配制成浓度为10mg/mL胶原水溶液10mL，加入23mL浓度为1M的碳酸氢钠溶液进行中和。取出4.3mL中和后的Ⅰ型胶原溶液，倒入直径6cm的细胞培养皿(Corning)。将培养皿放置在温度为30℃的烘箱，干燥54h，在模具内形成Ⅰ型胶原膜。将干燥的Ⅰ型胶原膜取出，剪切成5mm×5mm大小。取10张剪切后的膜片，置于直径10cm的细胞培养皿(Corning)，加入5mL由PBS(pH＝7.4)配制的浓度为20ug/mL的甲状旁腺激素相关肽(Bachem)溶液，置于细胞培养箱中于30℃浸泡2h，得到复合甲状旁腺激素相关肽的Ⅰ型胶原膜材料，即含活性因子的胶原基质软骨修复膜。

实施例6：

将实施例1方法提取的水溶性Ⅰ型胶原溶于去离子水中配制成浓度为10mg/mL胶原水溶液10mL，加入23mL浓度为1M的碳酸氢钠溶液进行中和。取出4.3mL中和后的Ⅰ型胶原溶液，倒入直径6cm的细胞培养皿(Corning)。将培养皿放置在温度为40℃的烘箱，干燥35h，在模具内形成Ⅰ型胶原膜。将干燥的Ⅰ型胶原膜取出，剪切成5mm×5mm大小。取10张剪切后的膜片，置于直径10cm的细胞培养皿(Corning)，加入5mL由PBS(pH＝7.4)配制的浓度为200ug/mL的甲状旁腺激素相关肽(Bachem)溶液，置于细胞培养箱中于40℃浸泡0.5h，得到复合甲状旁腺激素相关肽的Ⅰ型胶原膜材料，即含活性因子的胶原基质软骨修复膜。

实施例7：

将实施例1方法提取的水溶性Ⅰ型胶原溶于去离子水中配制成浓度为10mg/mL胶原水溶液10mL，加入23mL浓度为1M的碳酸氢钠溶液进行中和。取出4.3mL中和后的Ⅰ型胶原溶液，倒入直径6cm的细胞培养皿(Corning)。将培养皿放置在温度为40℃的烘箱，干燥35h，在模具内形成Ⅰ型胶原膜。将干燥的Ⅰ型胶原膜取出，剪切成5mm×5mm大小。取10张剪切后的膜片，置于直径10cm的细胞培养皿(Corning)，加入5mL由PBS(pH＝7.4)配制的浓度为50ug/mL的甲状旁腺激素相关肽(Bachem)溶液，置于细胞培养箱中于40℃浸泡0.5h，得到复合甲状旁腺激素相关肽的Ⅰ型胶原膜材料，即含活性因子的胶原基质软骨修复膜。

实施例8：

将实施例1方法提取的水溶性Ⅰ型胶原溶于去离子水中配制成浓度为10mg/mL胶原水溶液10mL，加入23mL浓度为1M的碳酸氢钠溶液进行中和。取出4.3mL中和后的Ⅰ型胶原溶液，倒入直径6cm的细胞培养皿(Corning)。将培养皿放置在温度为40℃的烘箱，干燥35h，在模具内形成Ⅰ型胶原膜。将干燥的Ⅰ型胶原膜取出，剪切成5mm×5mm大小。取10张剪切后的膜片，置于直径10cm的细胞培养皿(Corning)，加入5mL由PBS(pH＝7.4)配制的浓度为100ug/mL的甲状旁腺激素相关肽(Bachem)溶液，置于细胞培养箱中于40℃浸泡0.5h，得到复合甲状旁腺激素相关肽的Ⅰ型胶原膜材料，即含活性因子的胶原基质软骨修复膜。

实施例9：

(1)软骨损伤造模：取体重2.5～3kg成年雄性新西兰大白兔，术前10％水合氯醛(剂量4mL/kg)耳缘静脉注射和腹腔注射各半总量的方式给药麻醉。膝关节周围5cm范围剪毛，将兔仰卧在手术手术台上，四肢固定，碘伏消毒，铺无菌洞巾。取膝关节内侧切口，切开皮肤、皮下筋膜，经髌骨内侧缘切开兔膝关节，向外侧牵开髌腱和股四头肌肌腱，显露膝关节，在膝关节股骨滑车处，用手术刀片制造一个4mm×4mm的方形表层软骨缺损区，不穿透软骨下骨。

(2)应用软骨修复膜：将实施例2中的膜片修剪后覆盖在(1)中所造软骨损伤处，自然干燥5分钟后，将脱位的髌骨从膜上方小心归位，避免接触膜片使其移动。严密缝合膝关节囊和肌肉筋膜组织，缝合皮肤切口。切口碘伏消毒，肌肉注射青霉素钠40万单位后，放回兔笼。术后抗生素护理，肌注青霉素40万单位，每天一次，连续3天。标准动物饲料喂养。

(3)修复效果评估：术后6周，使用耳缘静脉空气针将兔处死。取材包括股骨下端在内的关节面。大体观察发现软骨损伤处有大量白色新生软骨形成，与周围组织连接平滑，无炎症反应。组织学切片结果显示软骨修复膜能够诱导软骨微环境中的原位细胞迁移粘附至损伤部位，并促进软骨损伤的修复再生。新生软骨SO染色深，细胞呈椭圆形，基本为透明软骨组织，表现出较好的修复效果。如图2所示,图2中新西兰大白兔软骨损伤修复6周后的组织学结果。SO染色结果表明使用软骨修复膜的实验组表层软骨损伤有明显的修复，软骨面更为光滑平整，能检测到软骨微环境原位细胞参与新生软骨的形成。而空白对照组软骨表面切痕明显，凹凸不平，未见明显修复痕迹。A为4倍镜下空白对照组SO染色图片，B为4倍镜下软骨修复膜组SO染色图片，C为40倍镜下软骨修复膜组SO染色图片。

本发明所述的软骨修复膜，以Ⅰ型胶原蛋白为原料，现有的研究表明胶原蛋白及其降解产物(氨基酸)拥有良好的生物相容性，无免疫原性和细胞毒性。

本发明所述的软骨修复膜，除了可以直接应用于软骨损伤的修复治疗，也可联合其他全层软骨损伤或骨软骨损伤修复支架材料，对不同深度的软骨损伤进行治疗，具有广阔的应用前景，预先制备的胶原基质膜可在使用时与活性因子甲状旁腺激素相关肽迅速复合，保证了甲状旁腺激素相关肽的生物活性,该复合物用于软骨缺损治疗时，能够提高软骨修复质量，抑制软骨钙化的发生，从而有效促进软骨损伤的修复再生。

应理解，这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明的配方作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种胶原基质软骨修复膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以猪腿肌腱为原料，经剪切、酶解、离心、过滤、溶解，得到Ⅰ型胶原溶液；

(2)用1M碳酸氢钠溶液对步骤(1)得到的Ⅰ型胶原溶液进行中和；

(3)将步骤(2)中中和后的Ⅰ型胶原溶液倒入模具，于30～40℃干燥35～54h，在模具内形成Ⅰ型胶原基质膜；

(4)手术前，将步骤(3)得到的Ⅰ型胶原基质膜浸泡于20～200ug/mL甲状旁腺激素相关肽溶液中，于30～40℃孵育0.5～2h，得到复合甲状旁腺激素相关肽的Ⅰ型胶原基质软骨修复膜；

其中，步骤(2)中Ⅰ型胶原溶液的浓度为5～20mg/mL；步骤(4)中甲状旁腺激素相关肽溶液的体积用量是Ⅰ型胶原基质膜体积的10～20倍。

2.根据权利要求1所述的胶原基质软骨修复膜的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中干燥的温度为37℃，且干燥的时间为48h。

3.根据权利要求1至2任意一项所述胶原基质软骨修复膜的制备方法，其特征在于，步骤(1)中剪切为将猪腿肌腱去除筋膜和脂肪，剪切成肌腱碎片，并浸泡于75％的乙醇中。

4.根据权利要求3所述的胶原基质软骨修复膜的制备方法，其特征在于，步骤(1)中酶解为将浸泡于乙醇溶液中的肌腱碎片用蒸馏水冲洗五次，然后加入0.5mol/L的乙酸溶液，并用6M氢氧化钠溶液调节pH至1，加入胃蛋白酶，4℃放置3天，获得胶原溶胶液。

5.根据权利要求4所述的胶原基质软骨修复膜的制备方法，其特征在于，步骤(1)中离心和过滤为将胶原溶胶液于4℃、4000rpm水平离心25分钟，弃上层脂肪层，将沉淀用0.5mol/L乙酸水溶液稀释3倍体积，在超净台中用4层纱布过滤，将滤液与0.9mol/L的NaCl水溶液以体积比1：10混合，间歇震荡，4℃过夜，再在4℃、4000rpm水平离心25分钟，弃上清液及悬浮物，获得沉淀。

6.根据权利要求5所述的胶原基质软骨修复膜的制备方法，其特征在于，步骤(1)溶解为将离心和过滤步骤中得到的沉淀用0.5mol/L的乙酸水溶液在4℃溶解过夜，所述乙酸水溶液与沉淀的体积比为4：1，获得Ⅰ型胶原溶液。

7.一种胶原基质软骨修复膜，其特征在于，通过如1至6任意一项所述的胶原基质软骨修复膜的制备方法制备得到。

8.一种如权利要求7所述的胶原基质软骨修复膜在制备软骨损伤的修复治疗或联合其他全层软骨损伤或骨软骨损伤修复治疗的支架材料中的应用。