ES2380674A1 - Celulas mesenquimales y membrana compuesta para el tratamiento de lesiones osteocondrales. - Google Patents
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Abstract
Células mesenquimales y membrana compuesta para el tratamiento de lesiones osteocondrales.La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende células madre mesenquimales alojadas en una membrana compuesta que presenta al menos dos capas con distinta estructura, siendo la capa inferior porosa y la capa superior compacta, preferiblemente de colágeno. Además, la presente invención se refiere al uso de dicha composición farmacéutica para el tratamiento de lesiones osteocondrales y al método para la obtención de dicha composición farmacéutica.
Description
Células mesenquimales y membrana compuesta para
el tratamiento de lesiones osteocondrales.
La presente invención pertenece al campo de la
Biomedicina, de la Biotecnología, de la Biología Celular y de la
Medicina Regenerativa. La presente invención se refiere a una
composición farmacéutica que comprende células madre mesenquimales
alojadas en una membrana compuesta y a su uso para el tratamiento de
lesiones osteocondrales.
\vskip1.000000\baselineskip
El cartílago es un tejido conectivo altamente
especializado, formado por células, principalmente condroblastos o
condrocitos, y fibras, mayoritariamente de colágeno; todo ello
embebido en una matriz extracelular (MEC) amorfa, viscosa, de
aspecto gel y con una alta complejidad bioquímica, estructural y
biomecánica (Buckwalter JA y col. Arthr Rheumatol, 1998. 41:
1331-1342; Johnson, LL. Clin Orthop Rel Res,
2001391: 306-317).
El cartílago articular (CA) proporciona a los
huesos sobre los que se dispone un superficie elástica y resistente,
a la vez que protege a la articulación repartiendo la presión
(compresión) de carga a la que es sometida. Al mismo tiempo, junto
con el líquido sinovial, proporciona un coeficiente de baja fricción
que permite el movimiento libre de la propia articulación (Aigner,
T. Arthritis Rheum, 2003. 48: 1166-1177). Las fibras
colagénicas que constituyen la MEC de este cartílago son
predominantemente de tipo II, acompañadas por proteoglicanos,
responsables, específicamente el agrecano, del alto grado de
hidratación de su matriz gracias a su capacidad para retener agua,
en torno a un 75%, debido a su naturaleza electrostática negativa.
En relación al componente celular, los condrocitos son células
predominantemente redondeadas, originadas a partir de células madre
mesenquimales (MSCs, del inglés "Mesenchymal Stem
Cells"), procedentes de la médula ósea (MO) localizada en
cavidades de la matriz (Lin y col., Tissue Eng. 2006. 12(7):
1971-84.), y representan un 5-10%
del volumen de la fase sólida del cartílago. Los condrocitos son
esenciales en el mantenimiento de la MEC, regulando tanto la
secreción de sus componentes como la degradación o la remodelación
de la misma (Hunziker, EB. Osteoarthritis Cartilage, 2002. 16:
564-572). Estructuralmente, el CA se divide en tres
zonas diferentes: la superficial (ZS), la media (ZM), y la profunda
(ZP). Estas regiones, con funciones específicas diferentes, se
identifican por la composición de la MEC, su biosíntesis, la
expresión génica y morfología de sus células, así como por las
distintas propiedades biomecánicas de las mismas (Schinagl, RM y
col. J Orthop Res 1997, 15: 499-506; Darling, EM y
col. J Orthop Res. 2004, 22: 1182-1187; Shieh, AC y
col. J Biomech. 2006. 39: 1595-02).
La gran mayoría de las lesiones condrales
descritas ocurren en la ZS del cartílago. Desde el punto de vista
clínico, el CA presenta una limitada capacidad de regeneración,
debido a: 1) su naturaleza avascular, por lo que está desprovisto de
una fuente disponible de células madre circulantes (células
condroprogenitoras; Martin JM y col., Biotechnol Prog, 2005, 21:
168-177) y de los factores humorales
correspondientes; 2) su naturaleza aneural, con la consiguiente
carencia de inervación; y 3) la alta complejidad de su MEC que, en
un eventual proceso de reparación, no recapitula su propio
desarrollo y morfogénesis.
Dependiendo de la profundidad del daño, existen
3 tipos de lesiones que afectan al CA: microtrauma, fractura condral
y fractura osteocondral. En cualquiera de dichas situaciones puede
encuadrarse la osteoartritis (OA), la forma más común de artritis,
una enfermedad muy dolorosa, de una altísima prevalencia en la
sociedad (24 millones de adultos en EEUU), que no necesariamente es
una consecuencia de la edad, y que afecta directamente al CA por
alteración de su integridad, limitando la movilidad de la
articulación (Nakamura, N y col. J Arthr Rel Surg, 2009. 25:
531-55). La etiología de la OA es desconocida y se
manifiesta en cambios morfológicos, bioquímicos y moleculares de las
células y de la MEC del cartílago hialino (Christensen, R y col.
Osteoarthritis Cartilage, 2005. 13: 20-27).
Actualmente, la solución clínica de las lesiones
condrales supone un reto para los clínicos y científicos. La
reparación es el proceso rápido para resolver una lesión, pero el
tejido reparativo no es idéntico al tejido original, pudiendo
existir incluso una falta de integración con el mismo. La
regeneración, en cambio, es un proceso relativamente lento que
recapitula el desarrollo y la morfogénesis del tejido a tratar,
restaurando completamente la estructura y función del mismo,
incluyendo una adecuada integración con el tejido original. A pesar
de que los tratamientos de los últimos años son prometedores,
todavía no se ha encontrado ningún procedimiento que pueda producir
una reparación ni regeneración satisfactoria del cartílago hialino y
el hueso subcondral.
Teniendo en cuenta la capacidad de la célula
cartilaginosa para nutrirse por difusión de la MEC y por imbibición
sinovial, recientemente, desde los trabajos pioneros de Heatley, FW
y col. (J Bone Joint Surg Br. 1980. 62: 397-402) se
han desarrollado procedimientos quirúrgicos para tratar de reparar
los defectos osteocondrales, o para al menos proporcionar un alivio
sintomático. El objetivo es prevenir la extensión de las lesiones e
inducir la regeneración del cartílago, o al menos retrasar la
progresión a OA o la necesidad de reemplazamiento articular.
Estas técnicas se dividen en 4 categorías:
- a)
- tratamiento sintomático,
- b)
- estimulación de células derivadas de la MO,
- c)
- condrogénesis con células o tejidos trasplantados, y
- d)
- trasplantes de cilindros osteocondrales.
\vskip1.000000\baselineskip
La microfractura (b), que provoca la afloración
de MO por perforación del hueso subcondral (Buckwalter JA y col.
Arthr Rheumatol, 1998. 41: 1331-1342); o la
mosaicoplastia (d), ya sea heteróloga o autóloga, que transfiere
cilindros de cartílago hialino procedente de tejido sano, bien de
zonas de menos carga próximas a la lesión, o de otra articulación
(Hunziker y col. Tiss Eng. 2006, 12: 3341-3364),
acaban provocando la formación de fibrocartílago como tejido
cicatricial, el cual se muestra inviable para devolver las
características propias del CA a largo plazo, representando además,
con el paso de los años del paciente, lugares de fácil fractura y
nuevas lesiones (Buckwalter y col. Clin Orthop Rel Res, 2004. 423:
7-16), al margen de problemas para obtener
suficiente superficie de cartílago a trasplantar y de dañar un área
para reparar otra. En el caso de c), técnica muy extendida en la
clínica, se está trabajando con en el trasplante de condrocitos
autólogos, ya sea en ausencia de transportador (ACI, del inglés
"Autologous Chondrocytes Implantation"), o vehiculizados
en una membrana (MACI, del inglés "Matrix Autologous
Chondrocytes Implantation"), casi siempre de colágeno. En
este sentido, algunos trabajos se están centrando en la obtención de
cultivos celulares de condrocitos y su implantación in situ,
aunque este procedimiento está planteando problemas de falta de
prendimiento del implante a la lesión a medio plazo. En ningún caso,
y hasta el momento, se indica que el ACI/MACI sean superiores a
otras alternativas terapéuticas en el tratamiento de las lesiones
condrales de rodilla; más bien al contrario, por tratarse de un
procedimiento altamente invasivo y relativamente costoso, ya que
necesita de dos intervenciones quirúrgicas.
Por tanto, en la actualidad no existen criterios
claros acerca de cuál de estas alternativas es la más adecuada para
el tratamiento de las lesiones del CA. Con todo ello, y en
consecuencia, la ingeniería tisular tiene actualmente el reto de
resolver el problema clínico de la regeneración del CA, estimulando
el crecimiento de suficiente cartílago nuevo en el lugar de la
lesión e impidiendo la pérdida posterior del mismo (Hollander AP y
col. Tiss Eng. 2006, 12: 1787-1798).
Las células son los efectores únicos e
insustituibles de la esqueletogénesis. Su número y biología sufren
cambios significativos con la edad y la enfermedad, que pueden ser
corregidos mediante acción directa, induciendo su proliferación,
migración y diferenciación in situ, o indirectamente,
realizando esos procesos ex vivo, aprovechando los
conocimientos que nos proporcionan las células troncales y la
terapia celular. Las especiales características de los tejidos
esqueléticos, donde la MEC, como hemos dicho, alcanza especial
relevancia, hace que la vehiculización de células y moléculas a su
través permita la condroosteoconducción y condroosteoinducción de la
forma deseada. El desarrollo de los materiales
condroosteoconductores, realzado por los avances que permiten la
conquista de magnitudes nanométricas, presenta un panorama de
cambios significativos en la clínica ortopédica. En estos momentos,
se está extendiendo la estrategia experimental que trata de buscar
MSCs susceptibles de diferenciarse hacia condroblastos, las cuales
pueden aislarse a partir de tejidos adultos, tales como MO, músculo
esquelético, grasa y sinovia. Las MSCs representan un atractivo para
la medicina regenerativa del cartílago, porque se pueden obtener con
una mínima morbilidad, aislar y expandir fácilmente en cultivo y son
multipotentes, incluyendo la vía condrogénica (Yoshimura y col. Cell
Tiss Res. 2007, 327: 449-462).
A pesar de estos datos, actualmente no existe
todavía un criterio único a la hora de proponer la terapia celular
más adecuada, con una clarificación de los procedimientos,
parámetros y condiciones a fin de seleccionar la fuente celular
ideal.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona un producto
eficaz para la terapia celular de las lesiones del cartílago
articular (CA) que se prepara in vitro y se basa en células
madre mesenquimales (MSCs) adultas autólogas y un biomaterial con
una organización fibrilar novedosa en forma de membrana
compuesta.
Gracias a este producto, en la lesión
condroosteoarticular se forma un tejido de regeneración igual al
cartílago adyacente en los tres estratos cartilaginosos e igual al
hueso subcondral, tanto en la organización y la disposición de las
células como en la cantidad y la calidad de la matriz cartilaginosa
u ósea circundante. El tejido regenerado se integra de manera
permanente en el tejido receptor y, además, es funcional desde el
punto de vista de su respuesta a las fuerzas de carga.
Los autores de la presente invención han
demostrado que este producto permite la formación de cartílago de
manera natural y, por tanto, que el nuevo tejido se forma de
novo y queda integrado en el tejido a tratar, permitiendo una
regeneración estable, duradera y funcional. Es decir, este producto
permite una regeneración intratisular más que una reparación de la
lesión.
Los autores de la presente invención presentan
evidencia experimental que demuestra la eficacia de una terapia
regenerativa que se basa en el implante de MSCs capaces de
diferenciarse a condrocitos, vehiculizadas en una matriz compuesta.
Los resultados positivos obtenidos avanzan en la aplicación clínica
de una terapia celular basada en MSCs para el tratamiento de las
lesiones del CA.
\newpage
En el ámbito de la Cirugía Ortopédica y la
Traumatología, la presente invención proporciona un producto y una
metodología para la regeneración del cartílago hialino articular por
medio de la condrogénesis y la osteogénesis terapéutica, destinada,
entre otros, a pacientes afectos de lesiones osteocondrales que, en
mayor o menor superficie, pueden desencadenar osteoartritis
localizadas y áreas de osteocondritis.
La solución que ofrece la presente invención
supone una mejora sobre los productos y métodos que se conocen hasta
la fecha.
Por tanto, un primer aspecto de la presente
invención se refiere a una composición (en adelante llamada
composición de la invención) que comprende células madre
mesenquimales y una membrana compuesta. Preferiblemente, el origen
de las células madre mesenquimales es la médula ósea.
Las células madre mesenquimales (MSCs) son
células multipotentes, es decir, capaces de dar lugar a distintos
tipos celulares y que tienen capacidad de autorrenovación, de origen
mesodérmico. Las MSCs pueden dar lugar, tanto in vitro como
in vivo, a adipocitos, condrocitos, oscteoblastos, miocitos,
e incluso a neuronas, hepatocitos y células pancreáticas. La médula
ósea es un tejido flexible que se encuentra en el interior de
algunos huesos, entre los que se incluyen los huesos largos, la
cintura escapular y la pelvis. Su función principal es la
hematopoyesis, por lo que contiene células madre hematopoyéticas,
aunque también contiene células estromales, cuya función no es
directamente la hematopoyesis, entre las que se encuentran las
MSCs.
El término "compuesta", tal y como se
utiliza en la presente descripción, se refiere a que la membrana
presenta al menos dos capas con distinta estructura. Preferiblemente
dicha membrana presenta dos capas y es por tanto una membrana
bifásica.
En una realización más preferida del primer
aspecto de la invención, las células madre mesenquimales son
positivas para CD13, CD29, CD44, CD71, CD90, CD105, CD271 y Stro1; y
negativas para CD34 y CD45.
Los marcadores CD hacen referencia a moléculas
que se encuentran en la superficie celular, y que pueden detectarse
con anticuerpos específicos. Su nombre viene del inglés
"cluster of differentiation" y se usan comúnmente para
la identificación del tipo celular, el estadio de diferenciación o
la actividad celular. Stro1 se refiere a un anticuerpo que se ha
descrito como capaz de reconocer MSCs de la médula ósea.
En una realización preferida del primer aspecto
de la invención, por cada mm^{2} de membrana hay entre 250.000 y
2.000.000 MSCs. Preferiblemente, por cada mm^{2} de membrana hay
entre 400.000 y 1.000.000 MSCs. Más preferiblemente, por mm^{2} de
membrana hay entre 450.000 y 600.000 MSCs.
En una realización preferida del primer aspecto
de la invención, la membrana compuesta comprende al menos una capa
compacta con poros cuyo diámetro es menor de 35 \mum y al menos
una capa porosa que comprende poros cuyo diámetro es de entre 35 y
300 \mum. Preferiblemente, la membrana compuesta comprende
colágeno. Más preferiblemente, el colágeno es de tipo I y III.
En la capa compacta, la densidad de fibras de
colágeno es tan alta que apenas quedan huecos entre ellas que puedan
albergar MSCs. Se trata de una capa con una resistencia
mecánicamente similar a la del cartílago. En la capa porosa de la
membrana hay menos fibras de colágeno y éstas se disponen de forma
que dejan entre ellas grandes espacios capaces de albergar las
MSCs.
En una realización preferida del primer aspecto
de la invención, los poros de la capa porosa tienen entre 4 y 14
millones de \mum^{3} de volumen medio.
El colágeno es una proteína característica del
tejido conectivo, donde es secretado a la matriz extracelular (MEC)
por las células que lo forman. El colágeno se agrega y forma fibras
de unos 300 nm de largo y 1,5 nm de diámetro. Hasta la fecha se han
descrito 29 tipos de colágeno, aunque los tipos I, II, II y IV son
los más abundantes. El tipo I es el más abundante y se encuentra en
los huesos, la piel, los tendones y las paredes arteriales. Forma
fibrillas que se agrupan en fibras y otorga resistencia al tejido.
El tipo III es el componente principal de las fibras reticuladas y
es más abundante en el tejido conjuntivo laxo, en las paredes de los
vasos sanguíneos, en el intestino y el útero. Se asocia a las
fibrillas de colágeno I y funciona como sostén en tejidos
expandibles.
En otra realización preferida del primer aspecto
de la invención, entre el 70% y el 90% de las células se sitúan en
la capa porosa de la membrana.
En otra realización preferida del primer aspecto
de la invención, la membrana está recubierta con una composición que
favorece la adhesión de las células. Esta composición puede incluir
cualquier molécula que favorece la adhesión celular, como son
algunas proteínas de la matriz extracelular o algunos polímeros como
la poli-lisina o la
poli-ornitina.
En otra realización preferida del primer aspecto
de la invención, la membrana está recubierta con una molécula de la
matriz extracelular. Preferiblemente, la molécula de la matriz
extracelular es fibronectina, laminina o colágeno. Más
preferiblemente, es fibronectina.
La fibronectina es una glicoproteína típica de
la MEC implicada en procesos como la adhesión, la migración, el
crecimiento y la diferenciación celular.
En una realización preferida del primer aspecto
de la invención, la membrana imita la forma de una lesión
osteocondral y presenta unas dimensiones iguales o mayores a las de
la lesión, de forma que la membrana, en posición superpuesta a la
lesión, sobresale respecto de dicha lesión en una magnitud menor de
2 mm.
La composición farmacéutica de la invención
puede diseñarse como un implante cuyas dimensiones se adaptan a
medida de la lesión en cuestión. Generalmente, el cartílago
articular es un tejido fino, con una profundidad de alrededor de 1,5
cm en humanos y de menos 3 mm en conejos. Las dimensiones de la
membrana se adaptan, por tanto, a la superficie de la lesión, y
pueden ser tales que cada lado sea 1 mm más grande que la superficie
de la lesión. Por ejemplo, para una lesión de 3 mm de largo, 4 mm de
ancho y 3 mm de profundidad, se podría preparar una membrana de 4 mm
de largo y 5 mm de ancho. Una vez lista la membrana, recubierta o
no, se introducirían las MSCs en su interior.
Para la colocación de la membrana con las MSCs
en la lesión, basta con introducir dicha membrana en el hueco que
deja la lesión, comprimiendo ligeramente la membrana para que entre
dentro de dicha lesión. El tamaño ligeramente mayor de la membrana
permite que se mantenga en la posición deseada y no se mueva ni se
salga cuando se utilice la articulación. De esta forma se evita la
sutura de la membrana a la lesión, lo cual agiliza el proceso del
implante y lo hace más sencillo, aunque en casos de lesiones de gran
tamaño puede ser necesario utilizar sutura para la colocación de la
membrana con las MSCs en la lesión.
En otra realización preferida del primer aspecto
de la invención, la composición farmacéutica además comprende un
excipiente farmacéuticamente aceptable.
Un excipiente es un componente de una
composición farmacéutica que no es un compuesto activo sino un
diluyente, un vehículo o un relleno, entre otros, que se considera
farmacéuticamente aceptable cuando es seguro, no es tóxico y no
presenta efectos adversos.
En otra realización preferida del primer aspecto
de la invención, la composición farmacéutica además comprende otro
principio activo.
Un segundo aspecto de la presente invención se
refiere al uso de la composición farmacéutica de la invención para
la preparación de un medicamento. Preferiblemente, el medicamento es
para el tratamiento de una lesión de cartílago. Más preferiblemente,
es para la regeneración del cartílago. Preferiblemente, el
medicamento es para el tratamiento de una lesión de hueso. Más
preferiblemente, es para la regeneración del hueso. Más
preferiblemente, para el tratamiento de una lesión osteocondral. Aún
más preferiblemente, el medicamento es para el tratamiento de la
osteoartritis. Una lesión osteocondral es una lesión del cartílago y
del hueso subcondral. La osteoartritis es una enfermedad en la que
se produce el desgaste del cartílago, lo cual provoca el roce de los
huesos y su consiguiente desgaste e inflamación.
La composición farmacéutica de la presente
invención puede emplearse como un implante en la terapia
regenerativa de lesiones de cartílago. Esta composición farmacéutica
podría administrarse colocándose en la zona de lesión condral de
manera que la capa compacta de la membrana compuesta quede orientada
hacia el líquido sinovial, y la capa porosa, que contiene la mayor
parte de las MSCs, quede orientada hacia el tejido lesionado.
Como se muestra en el ejemplo 3 y en la figura 9
de la presente descripción, los inventores demuestran que la
composición farmacéutica de la presente invención implantada en una
lesión osteocondral, es capaz de regenerar el tejido lesionado,
tanto el cartílago como el hueso subcondral, quedando el nuevo
tejido perfectamente integrado con el tejido sano y presentando una
estructura histológica normal.
Un tercer aspecto de la presente invención se
refiere a un método para la obtención de la composición farmacéutica
de la invención que comprende:
- a.-
- obtener una muestra aislada de médula ósea de un sujeto,
- b.-
- cultivar las células madre mesenquimales de la médula ósea de (a),
- c.-
- introducir las células de cultivadas en (b) en una membrana compuesta mediante vacío.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de médula ósea (MO) se aíslan
mediante una punción y extracción de una pequeña cantidad de sangre
del hueso, lo que recibe el nombre de aspirado de MO, o de un
pequeño cilindro de hueso, lo que recibe el nombre de biopsia de MO.
Las aspiraciones suelen realizarse en el esternón o en la cresta
ilíaca posterior, mientras que las biopsias suelen realizarse en la
cresta ilíaca anterior o posterior.
El cultivo de las MSCs puede realizarse como se
describe en el ejemplo 1 de la presente descripción. La introducción
de las MSCs en la membrana puede realizarse como describe Solchaga
LA y col. Tissue Eng. 2006 12(7):
1851-1863.
En una lesión condral u osteocondral, la
membrana compuesta puede ser colocada con la capa compacta hacia el
líquido sinovial y la capa porosa hacia el tejido lesionado. De esta
forma, la capa más compacta y tupida, que apenas alberga MSCs,
impide que éstas salgan de la membrana pero permite que estén
comunicadas con dicho líquido sinovial, ya que la capa compacta no
bloquea el intercambio de sustancias. Las MSCs situadas en la capa
porosa quedan orientadas hacia la lesión y, al regenerar nuevo
tejido de cartílago y/o hueso, pueden incorporarse al tejido no
lesionado para que el nuevo tejido quede perfectamente
integrado.
En una realización preferida del tercer aspecto
de la invención, la membrana compuesta del paso (c) está recubierta
con una composición que favorece la adhesión celular.
En una realización preferida del tercer aspecto
de la invención, la membrana compuesta del paso (c) está recubierta
con una molécula de la matriz extracelular (MEC). Preferiblemente,
la molécula de la MEC es fibronectina o laminina. Más
preferiblemente, la molécula de la MEC es la fibronectina.
La MEC es el medio extracelular o intersticial
de un tejido. Su naturaleza es compleja y su composición es distinta
en cada tipo de tejido, aunque en animales está compuesta
mayoritariamente por glicoproteínas y glicosaminoglicanos. Sus
funciones principales son la resistencia mecánica y el soporte
nutritivo.
Una realización del segundo aspecto de la
invención es el uso de una membrana compuesta con una capa compacta
y otra capa porosa, de colágeno I de 3 mm de ancho por 3 mm de largo
donde los poros de la capa porosa tienen un volumen de 6 millones de
\mum^{3} y donde se introducen 5,4 millones de MSCs obtenidas a
partir de un cultivo de MO de un aspirado de cresta ilíaca de un
individuo, para el tratamiento de una lesión osteocondral en
dicho
individuo.
individuo.
Una realización del segundo aspecto de la
invención es el uso de una membrana compuesta con una capa compacta
y otra porosa, de colágeno II de 4 mm de ancho por 6 mm de largo,
recubierta con laminina, donde se introducen por vacío 4,8 millones
de MSCs de MO, para la elaboración de un medicamento.
Una realización del segundo aspecto de la
invención es el uso de una membrana bifásica con una capa compacta y
otra porosa, que comprende colágeno I y II de 5 mm de ancho por 10
mm de largo, recubierta con un material fibroso biocompatible, por
ejemplo, pero sin limitarse a, fibronectina, donde los poros de la
capa porosa donde se introducen por vacío 30 millones de MSCs
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1. Muestra un cultivo in vitro de
células madre mesenquimales (MSCs) adultas en pase de cultivo 0 (p0)
mostrando su aspecto fibroblástico característico, tras 7 días de su
aislamiento a partir de un aspirado de médula ósea procedente de la
cresta ilíaca del conejo. Imagen obtenida por microscopía óptica de
inversión.
Figura 2. Muestra un cultivo in vitro
confluente de células madre mesenquimales (MSCs) adultas en pase de
cultivo 1 (p1), tras 12 días de su aislamiento a partir de un
aspirado de médula ósea procedente de la cresta ilíaca del conejo.
Imagen obtenida por microscopía óptica de inversión.
Figura 3. Muestra un cultivo in vitro de
células madre mesenquimales (MSCs) adultas en pase de cultivo 1
(p1), prediferenciadas hacia el linaje cartilaginoso en presencia de
un medio de cultivo condroinductor durante 12 días. Imagen obtenida
por microscopía óptica de inversión.
Figura 4. Muestra la membrana compuesta y las
células madre mesenquimales (MSCs) en ella. (a) Cara donde las
fibras colagénicas se distribuyen de forma más laxa, que se coloca
hacia la lesión. (b) Cara más compacta que se coloca hacia el
espacio sinovial. (c) Muestra el número y la distribución de las
MSCs sobre la cara laxa. (d) Muestra el número y la distribución de
las MSCs sobre la cara compacta. Imágenes obtenidas por microscopía
electrónica de barrido.
Figura 5. Muestra el cóndilo femoral de la
rodilla del conejo donde se ha practicado un defecto osteocondral
completo (3x3 mm) en la zona de máxima carga.
Figura 6. Representa el defecto osteocondral en
el cóndilo femoral de la rodilla del conejo en el momento de la
colocación del implante, tiempo 0 (t0). Las flechas indican la
membrana con las células. (a) Muestra el tamaño del implante. (b)
Muestra la introducción del implante en el interior de la
lesión.
\newpage
Figura 7. Muestra el resultado de la lesión
osteocondral sin tratar tras 1 y 6 meses, donde puede observarse que
el defecto permanece sin regenerar, al tratarse de una herida que no
regenera por sí misma. (a) Muestra una lesión en el cóndilo femoral
de la rodilla de conejo 1 mes después de la cirugía. (b) Muestra una
lesión en el cóndilo femoral de la rodilla de conejo 6 meses después
de la cirugía. (c) Muestra el resultado histológico de la zona de la
lesión 1 mes después de la cirugía. (d) Muestra el resultado
histológico de la zona de la lesión 6 meses después de la cirugía.
En (c) y (d) se observa únicamente formación de tejido fibroso y la
completa ausencia de cualquier vestigio de matriz cartilaginosa.
Figura 8. Muestra el resultado de la lesión
osteocondral tratada con MSCs autólogas prediferenciadas in
vitro hacia el linaje condrogénico tras 6 meses, donde puede
observarse que el defecto está recubierto por un tejido de color
blanquecino y que los bordes del tejido formado no están soldados
con el cartílago sano circundante. (a) Muestra una lesión
osteocondral en el cóndilo femoral de la rodilla del conejo 6 meses
después de la cirugía. (b) Muestra el resultado histológico donde se
observa la formación de un fibrocartílago con una pobre formación de
matriz cartilaginosa, a la vez que se confirma que los bordes de la
lesión no están soldados con el cartílago sano lateral (más oscuro,
en el lateral izquierdo).
Figura 9. Muestra el resultado de una lesión
osteocondral en el cóndilo femoral de la rodilla del conejo, tratada
con MSCs autólogas sin prediferenciar in vitro (pase de
cultivo p1), 6 meses después de la cirugía. (a) Se observa que la
lesión presenta un aspecto brillante, aparece completamente cubierta
de tejido integrado en los bordes del cartílago sano circundante.
(b) Detalle de la zona de la lesión. (c) Muestra los resultados
histológicos donde se observa la completa regeneración del tejido
osteocondral, con una matriz cartilaginosa hialina típica, de grosor
normal, así como una total remodelación del hueso subcondral
subyacente, que alcanza la altura natural hasta el contacto con el
frente cartilaginoso inferior.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de
manifiesto la efectividad del implante que comprende MSCs en una
membrana compuesta para la regeneración de las lesiones
osteocondrales.
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se realizaron utilizando 40
conejos de la variedad New Zealand, de unos 3 kg de peso, de acuerdo
a los procedimientos del Comité Ético de la Universidad de Málaga
sobre el trato de animales de experimentación.
La obtención de los tejidos, así como las
operaciones de trasplante, se llevaron a cabo bajo analgesia o
anestesia con buprenorfina 0,05 mg/kg, ketamina
25-35 mg/kg y xilacina 5-10 mg/kg,
administrada intramuscularmente.
Se lesionaron las dos rodillas, por lo que, en
el caso de los implantes una rodilla sirvió como control de la
otra.
La médula ósea (MO) se obtuvo por punción y
aspirado en la cresta ilíaca utilizando un catéter flexible y aguja
de 18G. Se obtuvo en torno a 4 ml de MO en presencia de 1 ml de
heparina. Las células obtenidas se lavaron 2 veces en medio de
cultivo no suplementado, se centrifugaron y se resuspendieron con
medio de cultivo completo (DMEM, de "Dulbecco's Modified Eagle
Medium", 10% FCS, de "Fetal Calf Serum", 1,5%
L-glutamina, 1% Penicilina/Estreptomicina y 0,5%
anfotericina B) y se cultivaron en frascos de 75 cm^{2} (Nunc
Int., EEUU) a 37ºC y 5% CO_{2}.
A los 4 días se realizó el primer cambio de
medio para eliminar las células no adheridas y, a partir de aquí,
los cambios de medio se realizaron cada 3 días hasta un total de 14
días a pase de cultivo 0 (p0). A continuación, las células se
tripsinizaron, contaron y sembraron a pase 1 (p1) de cultivo en
placas de cultivo de 60 cm^{2}, a una densidad de 10, 50 y 100
células/cm^{2}. En este momento, se guardaron varios viales
congelados para posterior estudio, utilizando DMSO al 5% en medio
completo y una densidad de 1x10^{6} células/ml.
Tras otros 7 y 14 días de cultivo, se recogieron
las células pocillos de cada densidad celular y se contaron en un
hemocitómetro, a fin de calcular la tasa de crecimiento. Se realizó
una citometría de flujo rutinaria para certificar el perfil
fenotípico de las células obtenidas, constatando que las MSCs de MO
aisladas son positivas para CD13, CD29, CD44, CD71, CD90, CD105,
CD271 y Stro1; y negativas para CD34 y CD45.
\vskip1.000000\baselineskip
Para inducir la diferenciación condrogénica se
llevaron 250.000 células en pase 1 (p1) de cultivo a un tubo de
propileno de 15 ml (Becton Dickinson) y se centrifugaron a 450 g
durante 10 minutos. Los precipitados celulares se cultivaron durante
12 días en medio condroinductor, compuesto de DMEM con 10 ng/ml
TGF-beta1 (R&D Systems), 100 nM dexametasona, 50
microgramos/ml ácido ascórbico, 100 microgramos/ml piruvato sódico,
40 microgramos/ml prolina (Sigma), e ITS-plus (6,25
microgramos/ml insulina bovina, 6,25 microgramos/ml transferrina,
6,25 microgramos/ml ácido selénico, 5,35 microgramos/ml ácido
linoleico, 1,25 microgramos/ml albúmina de suero bovino;
Collaborative Biomedical Products).
Con el fin de evaluar la diferenciación
condrogénica, los precipitados celulares se procesaron para el
análisis microscópico en parafina para histología convencional. Las
secciones en parafina se procesaron para la tinción con azul
alciano, que marca específicamente proteoglicanos de la matriz
cartilaginosa, y para la immunohistoquímica frente a los colágenos
I, II y X. El mareaje para colágeno I fue positivo en el hueso
regenerado, mientras que en el cartílago nuevo se encontró mareaje
positivo de los colágenos II y X.
Además, se analizó la expresión génica de los
colágenos I, II y X, de Sox9 y de agrecano mediante
RT-PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la analgesia o anestesia de los animales,
según se indicó anteriormente, realizamos el rasurado de las dos
rodillas y la desinfección del campo quirúrgico.
Abordamos la articulación por incisión
parapatelar medial y rechazo de la rótula hacia el exterior, para
luego provocar una lesión osteocondral en el cóndilo femoral en la
zona de carga, con un trocar de 3x3 mm. Las lesiones de este tamaño
excluyen la reparación espontánea. Se lavó el defecto con suero
fisiológico y en la rodilla derecha situación experimental se
implantó la membrana colagénica, previamente recubierta con
fibronectina, adsorbida por vacío con 2x10^{6} MSCs de MO
obtenidas anteriormente.
El transportador celular tiene unas dimensiones
de 2 x 2 x 1 mm y está formado por fibras de colágeno I y III
dispuestas de tal forma que, en la cara superior (cara que se coloca
hacia el espacio sinovial), aparecen entrelazadas de forma más
tupida y, en la inferior, que se coloca hacia las paredes y suelo de
la lesión osteocondral, las fibras aparecen más laxas, dejando un
espacio medio de 250 \mum, donde el 83% de las células adsorbidas
anidan. Este biomaterial es comercial
(Chondro-Gide®, Geistlich Pharma, Suiza) y está
siendo utilizado ampliamente en cirugía clínica de rodilla. El
implante se realiza sin ningún tipo de pegamento o sutura,
eliminando así cualquier tipo de interferencia en el estudio,
reduciendo la morbilidad y el tiempo de intervención.
La rodilla control se implanta con la membrana
sin células y se interviene de la misma forma. Finalmente, se
suturan ambas heridas y se suministra al animal analgésico y
antibiótico por vía subcutánea durante 5 días en
post-operatorio. Los conejos se sacrificaron por
sobredosis de pentobarbital sódico a las 4, 12, y 24 semanas de la
cirugía, a fin de evaluar los resultados de la regeneración,
mediante un examen macroscópico e histológico de la lesión,
siguiendo los parámetros habituales (evaluación de Wakitani).
Claims (29)
1. Composición que comprende células madre
mesenquimales y una membrana compuesta que presenta al menos dos
capas con distinta estructura, siendo la capa inferior porosa y la
capa superior compacta.
2. Composición según la reivindicación anterior
donde el origen de las células madre mesenquimales es la médula
ósea.
3. Composición según la reivindicación anterior
donde las células madre mesenquimales son positivas para CD13, CD29,
CD44, CD71, CD90, CD105, CD271 y Stro1; y negativas para CD34 y
CD45.
4. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores donde por cada mm^{2} de membrana hay
entre 250.000 y 2.000.000 células.
5. Composición según la reivindicación anterior
donde por cada mm^{2} de membrana hay entre 400.000 y 1.000.000
células.
6. Composición según cualquiera de las dos
reivindicaciones anteriores donde por cada mm^{2} de membrana hay
entre 450.000 y 600.000 células.
7. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores donde la membrana compuesta comprende al
menos una capa compacta que comprende poros cuyo diámetro es menor
de 35 \mum y una capa porosa que comprende poros cuyo diámetro es
de entre 35 y 300 \mum.
8. Composición según la reivindicación anterior
donde los poros de la capa porosa tienen entre 4 y 14 millones de
\mum^{3} de volumen medio.
9. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores donde la membrana bifásica comprende
colágeno.
10. Composición según la reivindicación anterior
donde el colágeno es de tipo I y III.
11. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores donde entre el 70% y el 90% de las
células se sitúan en la capa porosa de la membrana.
12. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores donde la membrana está recubierta con
una molécula de la matriz extracelular.
13. Composición según la reivindicación anterior
donde la molécula de la matriz extracelular es fibronectina,
laminina o colágeno.
14. Composición según la reivindicación anterior
donde la molécula de la matriz extracelular es fibronectina.
15. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores donde la membrana imita la forma de una
lesión osteocondral y presenta unas dimensiones iguales o mayores a
las de la lesión, de forma que la membrana, en posición superpuesta
a la lesión, sobresale respecto de dicha lesión en una magnitud
menor de 2 mm.
16. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores donde dicha composición es una
composición farmacéutica.
17. Composición según la reivindicación anterior
que además comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable.
18. Composición según cualquiera de las dos
reivindicaciones anteriores que además comprende otro principio
activo.
19. Uso de la composición según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores para la preparación de un
medicamento.
20. Uso según la reivindicación anterior para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de una lesión de
cartílago.
21. Uso de la composición según la
reivindicación anterior para la preparación de un medicamento para
la regeneración del cartílago.
22. Uso según la reivindicación 19 para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de una lesión de
hueso.
23. Uso de la composición según la
reivindicación anterior para la preparación de un medicamento para
la regeneración del hueso.
24. Uso según la reivindicación 19 para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de una lesión
osteocondral.
25. Uso según la reivindicación anterior para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de la
osteoartritis.
26. Método para la obtención de la composición
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 que comprende las
siguientes etapas:
- a)
- obtener una muestra aislada de médula ósea de un sujeto,
- b)
- cultivar las células madre mesenquimales de la médula ósea obtenidas en la etapa (a),
- c)
- introducir las células cultivadas en la etapa (b) en una membrana compuesta mediante vacío.
\vskip1.000000\baselineskip
27. Método para la obtención de la composición
según la reivindicación anterior donde la membrana compuesta de la
etapa (c) está recubierta con una molécula de la matriz
extracelular.
28. Método para la obtención de la composición
según la reivindicación anterior donde la molécula de la matriz
extracelular es fibronectina, laminina o colágeno.
29. Método para la obtención de la composición
según la reivindicación anterior donde la molécula de la matriz
extracelular es fibronectina.
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