ES2362021B1 - Procedimiento para la obtención de un producto de ingeniería tisular orientado a la regeneración de tejido cartilaginoso. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la obtención de un producto
de ingeniería tisular orientado a la regeneración de tejido
cartilaginoso.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la obtención de un producto de ingeniería tisular
orientado a la regeneración de tejido cartilaginoso, comprendiendo
dicho producto células mesenquimales expandidas de médula ósea, una
matriz no celular y un gel de fibrina, comprendiendo procedimiento
las etapas de: (a) expandir las células mesenquimales; (b) conjugar
las células mesenquimales a la matriz; (c) lavar el producto
obtenido en la etapa (b); y (d) mezclar el producto obtenido en la
etapa (c) con un gel de fibrina.
Description
Procedimiento para la obtención de un producto
de ingeniería tisular orientado a la regeneración de tejido
cartilaginoso.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de un producto de ingeniería
tisular orientado a la regeneración de tejido cartilaginoso
articular. Más en particular, la presente invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de un producto que comprende
principalmente células mesenquimales, de origen óseo, expandidas,
inmovilizadas sobre soportes y copolimerizadas y fijadas en la zona
de implantación mediante geles de fibrina y/o encaje mecánico. El
procedimiento de la presente invención puede comprender además una
etapa de congelación del producto de ingeniería tisular obtenido,
con el objetivo de disponer de copias de seguridad del mismo.
Debido a la limitada capacidad de regeneración
del cartílago articular, los defectos causados por enfermedades
degenerativas o traumatismos representan un problema clínico no
resuelto. En este tipo de patologías, la aparición de las lesiones
está asociada a dolor, pérdida de movilidad y discapacidad
progresiva asociada a la aparición de artritis o artrosis. Estas
circunstancias inciden de forma grave en la calidad de vida de las
personas afectadas.
Los tratamientos más comunes de este tipo de
lesiones son la mosaicoplastia, el trasplante autólogo de
condrocitos, el trasplante heterólogo de tejido osteocondral, y la
artroplastia de abrasión o perforaciones. Estas técnicas, muestran
como factor común el aporte de células especializadas a la zona
lesionada para favorecer la regeneración/substitución del tejido
dañado.
Entre los tratamientos con mayores Indices de
éxito se encuentra la artroplastia de abrasión o perforaciones. Esta
aproximación se basa en inducir mediante sangrado la invasión de
células mesenquimales de médula ósea desde el hueso subcondral hacia
la zona lesionada, con el objetivo que reparen la lesión (Mitchell N
y otros. The resurfacing of adult rabbit articular cartilage by
múltiple perforations through the subchondral bone. J Bone Joint
Surg Am. 1976; 58(2): 230-3.24, Levy A y
otros. Chondral delamination of the knee in soccer players. Am J
Sports Med. 1996; 24). El éxito de esta técnica depende de la
correcta integración, proliferación y diferenciación de las células
mesenquimales en la zona a reparar. Debido a la gran variabilidad
inherente a la técnica, el resultado de este tipo de tratamientos es
poco previsible. En consecuencia, frecuentemente se obtiene una
reparación en base a fibrocartilago en lugar de cartílago hialino,
lo que conlleva limitaciones en la calidad y durabilidad de la
terapia (Pelmari K y otros. Do we really need cartilage tissue
engineering?. Swiss Med WKLY 2009; 139:41-42;
Kreuz PC y otros. Results after microfracture of
full-thickness chondral defects in different
compartments in the knee. Osteoarthritis. Cartilage. 2006;
14(11):1119-25; Temenoff JS y otros. Review:
tissue engineering for regeneration of articular cartilage.
Biomaterials. 2000; 431-40.
Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar
nuevas tecnologías que resuelvan los problemas de la técnica
anterior. La presente invención da conocer una nueva alternativa
terapéutica basada en la ingeniería tisular. Esta aproximación se
fundamenta en la utilización de un producto que comprende una
matriz, en base a materiales sintéticos o biomateriales, combinadas
con células e hidrogeles que induce la regeneración de los tejidos
cartilaginosos dañados.
Las matrices empleadas en la presente invención
deben mostrar características particulares que les permitan realizar
su función de soporte para la reconstrucción del tejido diana. Estas
deben ser biocompatibles, con adecuadas propiedades mecánicas con
respecto a la zona de implantación, con integridad estructural y
deben ser bioabsorbibles. Por otro lado, estas matrices, deben ser
capaces de generar un entorno biológico que garantice el aporte de
nutrientes a las células para asegurar que estas puedan realizar su
función regeneradora. A las anteriores características debe añadirse
que una matriz orientada a la regeneración de tejidos cartilaginosos
debería poseer capacidad de inducir la diferenciación de las células
madre hacia condrocitos y que en esta matriz esta especie celular se
vea inducida a fabricar tejido
cartilaginoso.
cartilaginoso.
El otro componente del producto de ingeniería
tisular de la presente invención, las células, también debe
presentar una serie de características particulares tales como
facilidad y seguridad en su obtención, provenir de una fuente segura
desde el punto de vista citogenético y tener propiedades de
multipotencialidad, que permitan su diferenciación hacia las células
responsables de la producción de tejido cartilaginoso, los
condrocitos.
Por lo tanto, la presente invención da a conocer
un procedimiento de preparación de un producto de ingeniería tisular
orientado a la regeneración de cartílago. Dicho procedimiento se
fundamenta en la obtención y utilización de células mesenquimales
expandidas, de origen autólogo, procedentes de médula ósea. Estas
células se expanden y se inmovilizan sobre soportes en base a
polímeros sintéticos o biomateriales. y el conjunto obtenido se
implanta y fija en la zona de lesión mediante geles de fibrina y/o
encaje mecánico.
Una de las ventajas con respecto a los
tratamientos basados en el autoinjerto, tales como la condroplastia
o el sangrado subcondral, es que utilizando el producto preparado
mediante el procedimiento de la presente invención no es necesario
someter al receptor de la terapia a una o varias intervenciones de
cirugía artroscópica para la extracción del material biológico
necesario para la regeneración de la articulación dañada. El
material celular necesario se obtiene mediante la extracción de
médula ósea, que se realiza de forma ambulatoria. Esta aproximación,
por lo tanto, evita las complicaciones potenciales derivadas de la
obtención de material condral autólogo tales como los dolores,
sangrados, molestias o complicaciones debido a infecciones.
Otra ventaja respecto a la técnica de
artroplastia de abrasión o perforaciones aplicada en lesiones de
pequeño tamaño, que consistente en lesionar el hueso subcondral para
facilitar el aporte de células regenereradoras, es que utilizando el
producto preparado mediante el procedimiento de la presente
invención se puede aplicar una dosis celular conocida y
perfectamente caracterizada, lo que permite realizar un tratamiento
reproducible a los pacientes sometidos a esta terapia.
Otra ventaja adicional es que es posible
implantar un producto totalmente adaptado a la topología de la
lesión.
En este aspecto, la presente invención da a
conocer un procedimiento mediante el que las matrices se conjugan
mediante un proceso de inmovilización a un producto celular
enriquecido en células mesenquimales. Dicho producto celular con
reconocida capacidad condroinductora, se obtiene mediante una
selección y posterior expansión in vitro de estas células.
Con el procedimiento de la presente invención es posible, mediante
la manipulación del proceso de expansión de las células, generar un
amplio intervalo de cantidades de injerto cartilaginoso que facilita
el tratamiento de lesiones de diverso tamaño y origen. Esto hace que
sea aplicable en un amplio abanico de aplicaciones terapéuticas,
cuyo objetivo es la recuperación del cartílago dañado.
Otra de las características del procedimiento de
la presente invención es que el crecimiento de las células se lleva
a cabo con suplementos de medios de cultivo de origen humano, lo que
facilita la expansión rápida de dichas células, y evita posibles
efectos adversos derivados del contacto de las células con
componentes no humanos (o humanizados). Una ventaja del
procedimiento de la presente invención es que, una vez finalizada la
expansión, se lleva a cabo una criopreservación de parte de las
células con el objetivo de reservar dosis para ser utilizadas en
futuros tratamientos.
Por otra parte, la conjugación de las células
mesenquimales a las biomatrices mediante un proceso de colonización
permite la localización de las células con potencial condrogénico en
la zona a regenerar. Esta característica, diferente a otras
aplicaciones tales como la artroplastia de abrasión o perforaciones,
asegura la actividad celular reparadora en la zona a tratar y, a
diferencia de otras aproximaciones de ingeniería tisular, garantiza
la permanencia de las células madre en la zona de la lesión donde
deben realizar la labor reparadora. Finalmente, el amalgamado de
estas partículas con células mesenquimales mediante geles de fibrina
permite dotar al conjunto de plasticidad y capacidad de manipulación
facilitando a su vez la inmovilización de la mezcla en la zona a
tratar evitando así la falta de coherencia estructural con el
entorno a regenerar.
La presente invención da a conocer un
procedimiento para la obtención de un producto de ingeniería tisular
orientado a la regeneración de tejido cartilaginoso, comprendiendo
dicho producto células mesenquimales expandidas de médula ósea, una
matriz no celular y un componente en base a hidrogeles. Dicho
procedimiento comprende las etapas de:
- (a)
- expandir las células mesenquimales;
- (b)
- conjugar las células mesenquimales a la matriz;
- (c)
- lavar el producto obtenido en la etapa (b); y
- (d)
- mezclar con un gel de fibrina.
\vskip1.000000\baselineskip
La expansión de las células mesenquimales se
realiza de una forma conocida por los expertos en la materia, con el
objetivo de obtener la cantidad de células necesarias para realizar
la conjugación a la matriz, que dependerá del tamaño de la lesión a
tratar. Una vez obtenida dicha cantidad necesaria, se inicia la
etapa de conjugación de dichas células a la matriz. Esta conjugación
se puede realizar mediante sistemas agitados o no agitados.
Las células mesenquimales obtenidas en la etapa
de expansión se resuspenden en medio de cultivo DMEM complementado
con suero a una concentración en el intervalo de 1x10^{3} a
1x10^{7} células por mililitro. Si es necesario se pueden
conservan dichas células mediante criopreservación para ser
utilizadas en el futuro.
A continuación, se dispensa la suspensión
celular de forma estéril en una bolsa o frasco de cultivo
previamente cargada con la matriz, que puede estar dotado de un
agitador pendular, conjugar las células mesenquimales a la matriz.
La relación entre el número de células por centímetro cúbico está en
el intervalo de 1x10^{2} a 1x10^{8} células por centímetro
cúbico de matriz. Posteriormente, se deja incubar durante 1 a 24
horas a una temperatura de 35-38ºC, saturación de
CO_{2} del 2,5-7,5%, y humedad relativa superior
al 90%. En el caso de emplear agitación, las condiciones de
agitación empleadas para garantizar el anclaje de las células son de
1 a 120 revoluciones por minuto.
A continuación, la suspensión de células
mesenquimales inmovilizadas sobre la matriz, obtenida en la etapa
(b) se lava varias veces utilizando una solución salina fisiológica
y se dispensa de forma estéril en una bolsa de conservación.
En la etapa (d) del procedimiento de la presente
invención el producto obtenido en la etapa (c) se mezcla de forma
estéril con un gel de fibrina en una relación de 0,1 a 10 unidades
volumétricas de solución de fibrinógeno por cada
0,1-10 unidades volumétricas de solución de trombina
y 0,1-10 unidades volumétricas de matriz colonizada,
obtenida en la etapa (c).
La presente invención se describirá a
continuación con más detalles en referencia a ejemplos de
realización. Estos ejemplos, sin embargo, no están destinados a
limitar el alcance técnico de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron 12x10^{6} células mesenquimales
de médula ósea mediante expansión utilizando un medio de cultivo
libre de suero animal y se inocularon en un frasco de cultivo. Se
utilizó un medio en base a DMEM suplementado con suero humano al 10%
(v/v). Se fijó la concentración celular a 6x10^{5} células por
mililitro. La suspensión celular se añadió de forma estéril a un
segundo frasco de material plástico dotado de agitador pendular,
donde previamente se añadió 1 centímetro cúbico de matriz. Las
6x10^{6} células restantes se criopreservaron con el objetivo de
poder realizar nuevos tratamientos, en caso que sea necesario.
La incubación se realizó en las siguientes
condiciones: temperatura de 37ºC, saturación de CO_{2} del 5%, y
humedad relativa del 95%; a continuación se inició un ciclo de
agitación de 24 horas de duración a una velocidad de entre
120-200 rpm. Transcurrido este tiempo, el producto
obtenido se lavó con el objetivo de eliminar restos celulares y el
medio de cultivo. Esta operación se llevó a cabo empleando una
solución salina fisiológica y se envasó el producto obtenido en una
bolsa estéril.
En el momento previo de la aplicación del
producto al paciente, se realiza un amalgamado de las matrices con
un gel de fibrina. Para realizar esta operación se emplea una
relación volumétrica consistente en una unidad de solución de
fibrinógeno por una unidad volumétrica de solución de trombina y una
unidad volumétrica de matriz ósea colonizada. Realizado el
amalgamado se dota al conjunto de la forma que le permite adaptarse
a la distribución espacial de la lesión y se emplaza en la
misma.
Si bien la invención se ha descrito con respecto
a un ejemplo de realización preferente, éste no se debe considerar
limitativo de la presente invención, que se definirá por la
interpretación más amplia de las siguientes reivindicaciones.
Claims (7)
1. Procedimiento para la obtención de un
producto de ingeniería tisular orientado a la regeneración de tejido
cartilaginoso, comprendiendo dicho producto células mesenquimales
expandidas de médula ósea, una matriz no celular y un gel de
fibrina, comprendiendo procedimiento las etapas de:
- (a)
- expandir las células mesenquimales;
- (b)
- conjugar las células mesenquimales a la matriz;
- (c)
- lavar el producto obtenido en la etapa (b); y
- (d)
- mezclar el producto obtenido en la etapa (c) con un gel de fibrina;
caracterizado porque dicha matriz es un
biomaterial.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1,
caracterizado porque la etapa (b) se realiza mediante un
sistema agitado o no agitado.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque además comprende una etapa de
criopreservación de las células mesenquimales expandidas para ser
utilizadas en el futuro.
4. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la relación
entre el número de células por centímetro cúbico de matriz en la
etapa (b) está en el intervalo de 1x10^{2} a 1x10^{8} células
por centímetro cúbico de matriz.
5. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en la etapa
(b) se realiza durante 1 a 24 horas, a una temperatura de
35-38ºC, una saturación de CO_{2} de
2,5-7,5%, y una humedad relativa superior al
90%.
6. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en la etapa
(c) se lava varias veces utilizando una solución salina
fisiológica.
7. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el mezclado
con un gel de fibrina de la etapa (d) se realiza en una relación de
0,1 a 10 unidades volumétricas de solución de fibrinógeno por cada
0,1-10 unidades volumétricas de solución de trombina
y 0,1-10 unidades volumétricas de matriz colonizada,
obtenida en la etapa (c) .
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