ES2239608T3

ES2239608T3 - Reparacion in vitro de defectos de hueso y/o cartilago.

Info

Publication number: ES2239608T3
Application number: ES00953086T
Authority: ES
Inventors: Kurt Osther; Peter Storgaard
Original assignee: Interface Biotech AS
Current assignee: Interface Biotech AS
Priority date: 1999-07-28
Filing date: 2000-07-25
Publication date: 2005-10-01
Anticipated expiration: 2020-07-25
Also published as: EP1441028A2; EP1441028A3; NO20020439L; CZ2002341A3; CA2378079A1; NO20020439D0; ATE290353T1; NZ517199A; JP2003505143A; DE60018576D1; US20020082623A1; EP1206225A2; WO2001006949A3; AU779472B2; WO2001006949B1; DE60018576T2; CA2378079C; EP1206225B1; WO2001006949A2; AU6566000A

Abstract

Membrana de cartílago que tiene al menos una parte de superficie que lleva una composición que comprende al menos una molécula de estimulación, que induce una transducción de señales en los condroblastos / condrocitos y que se selecciona del grupo que consiste en proteínas de colágeno, tales como el colágeno de los tipos II, VI, IX y XI, proteoglucanos tales como agregados de proteoglucanos (aggregans), decorina, fibromodulina y biglucano y proteínas no colagenosas tales como crioprecipitado, fibronectina, vitronectina, fibrinógeno, fibrillina, kistrina, equistatina, factor de von Willebrand, tenascina y ancorina CII.

Description

Reparación in vitro de defectos de hueso y/o cartílago.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método y a los materiales para la reparación in vivo de defectos de cartílago o defectos de hueso y cartílago en las articulaciones de los mamíferos, tales como seres humanos y caballos.

Antecedentes de la invención

Se realizan más de un millón de artroplastias totales y procedimientos artroscópicos humanos cada año en los EE.UU. y Europa en conjunto. Se incluyen en estas cifras, en los EE.UU., aproximadamente 90.000 artroplastias totales de rodilla y alrededor de 50.000 procedimientos para reparar defectos en la rodilla sola por año (En: Praemer, A., Fumer, S., Rice, D.P., Musculoskeletal Conditions in the United States, Park Ridge, III.: American Academy of Orthopaedic Surgeons, 1992, 125).

Entre las diferentes razas de caballos en los EE.UU. y en Europa, existen aproximadamente cinco millones de "caros" caballos de carreras purasangre registrados, utilizados en carreras de caballos, de los cuales un 60% aproximado pertenece directa o indirectamente a propietarios de caballos de los EE.UU. De todas las razas, los purasangre son los que padecen con más frecuencia enfermedad articular degenerativa, principalmente en forma de osteocondritis disecante (OCD). La articulación afectada con más frecuencia es la denominada articulación rotuliana equina (articulación femororrotuliana, pata trasera). La edad más común de los caballos y especialmente de los caballos de carreras para desarrollar OCD es de entre 1 y 6 años de edad. Cuanto antes comienza el entrenamiento de los purasangre (1 año de edad o menos), con más frecuencia aparecerá el trastorno.

En general, se utiliza cirugía, incluyendo la intervención artroscópica, en la mayoría de los casos que presentan síntomas. Alrededor del 64% de los caballos tratados vuelven a su uso anterior (carreras, etc.). Aproximadamente el 35% de los caballos no pueden volver a su uso previo en carreras o tienen menos posibilidades de obtener los niveles previos en las carreras.

Un segundo estado que puede observarse, descrito como OCD, es la fragmentación en la parte posterior del menudillo fuera del aspecto proximal o plantar de la primera falange o hueso de la cuartilla. Un tercer estado, a menudo relacionado traumatismos, de los caballos de carreras es el daño del cartílago en los cóndilos del hueso de la caña, que realmente no es una verdadera OCD. La OCD en las articulaciones de los hombros suele afectar a grandes zonas de la superficie de la articulación y es común la osteoartritis secundaria.

El tratamiento médico o farmacológico sólo tiene un efecto limitado y se dirige principalmente a mantener el caballo sin dolor. Los fármacos son normalmente fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE). La cirugía del hombro es difícil debido a la profundidad de la articulación por debajo de los músculos de esa zona.

Se ha probado el efecto sobre la reparación de cartílago articular equino en articulaciones tratadas con glucosaminoglucano polisulfatado (PSGAG) o hialuronato sódico (SH) en la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad del Estado de Ohio, Columbus, Ohio. Los resultados de este estudio no indicaron un efecto beneficioso sobre los parámetros clínicos, el aspecto a simple vista o el aspecto microscópico de los defectos, cuando se comparó con los controles de solución salina. Algunas pruebas procedentes de este estudio sugieren que el PDGAG intraarticular puede tener un efecto perjudicial sobre la cicatrización del cartílago articular.

La aparición de lesiones quísticas subcondrales, también denominadas quistes óseos o lesiones óseas similares a quistes, son anomalías reconocidas comúnmente de los huesos y las articulaciones que pueden producir o no cojera. Los quistes más problemáticos son los quistes articulares. Existe una controversia sobre si estas lesiones son una osteocondritis de manifestación secundaria a un traumatismo de la articulación o una combinación de tensión y traumatismo.

El cartílago articular humano no puede experimentar autorreparación puesto que los condrocitos pierden su capacidad mitótica durante el primer año de vida. Los defectos de cartílago articular, especialmente en las articulaciones que soportan peso, se deteriorarán de manera previsible hacia osteoartritis. Ningún método convencional puede prevenir este deterioro.

La perforación del hueso subcondral puede conducir a la formación de fibrocartílago, que no es elástico y sólo puede considerarse una reparación temporal que se degrada lentamente. Los estudios con animales han indicado que la introducción de condrocitos en proliferación tales como condrocitos articulares puede reconstruir de manera fiable defectos de la articulación (Robinson D., et al., Isr. Med. Assoc. J., 2000, 2:290).

La implantación de condrocitos autólogos (ACI) ha demostrado ser clínicamente eficaz en la reconstitución del cartílago de tipo hialino para lesiones condrales de espesor total, patológicas y aisladas de rodilla humana. Varios autores han realizado la implantación de condrocitos en seres humanos con excelentes resultados (Brittberg et al., 1994 New Engl. J. Med.; Minas, T., Am. J. Orthop. 1998, 11:739).

Un método para el tratamiento de regeneración de cartílago sería una ventaja y podría realizarse en una fase inicial de un daño articular, reduciendo el número de seres humanos que necesitan cirugía de sustitución de cadera artificial. Previamente, se han intentado la limpieza o renovación de la superficie utilizando la perforación subcondral, abrasión, etc., mediante lo cual se extirpa el cartílago enfermo e incluso el hueso subcondral (Insalt, J., Clin. Orthop. 1974, 101:61; Ficat, R.P., et al., Clin Orthop. 1979, 144:74; Johnson, L.L., En: (McGinty, J.B., Ed.) Operative Arthroscopy, Nueva York, Raven Press, 1991, 341).

Se han utilizado otros métodos tales como la sutura de un colgajo perióstico (por ejemplo, extraído de la tibia) sobre el defecto, o bien como procedimiento de tratamiento en sí mismo, o bien se han utilizado en como combinación con la implantación de condrocitos cultivados (por ejemplo, autólogos). Los métodos que utilizan esta combinación se han desarrollado principalmente por Brittberg et al., (Brittberg, M., et al., New Engl. J. Med., 1994, 331:889).

Las células cultivadas utilizando los métodos descritos Brittberg et al., New Engl. J. Med., 1994, 331:889 se utilizan para la implantación autóloga en las articulaciones de la rodilla de los pacientes. Kurt Osther et al. han descrito, en la patente de los EE.UU. número 5.759.190, el uso de una barrera hacia el hueso que puede utilizarse, en teoría, en el tipo de osteoartritis de lesiones con el fin de prevenir la hemorragia y la proliferación de células madre procedentes del hueso esponjoso denudado subyacente. La barrera se compone de colágeno de tipo I.

El papel principal en el éxito de una implantación de condrocitos autólogos depende profundamente del estado de los condrocitos que van a implantarse. Es de principal importancia que el cultivo de condrocitos sea viable e inducible tanto para la proliferación y, cuando se implanta, para poder proporcionar una producción de matriz suficiente (Mayhew, T.A., Tissue Engl. 1998, 4:325). Es importante que los condrocitos que van a implantarse se cultiven con los métodos de cultivo más suaves y estrictos, evitando el daño enzimático innecesario de la membrana celular, y al mismo tiempo, obteniéndose el cultivo de condrocitos más óptimo posible para producir una cartílago articular hialino sano. El uso del método de cultivo celular, que es más suave para con los condrocitos es de suma importancia con el fin de obtener una cartílago para implante suficientemente sano, que pueda interaccionar con el cartílago circundante in situ. Incluso igualmente importante es crear una estructura de cartílago óptima como parte de la reparación de defectos osteoartríticos.

La invención proporciona membranas que van a utilizarse para el tratamiento de defectos de cartílago o de cartílago y hueso en mamíferos. Las invenciones también proporcionan nuevos métodos para el tratamiento de defectos de cartílago o de cartílago y hueso en mamíferos.

Sumario de la invención

Esta solicitud da a conocer un método y los materiales para la reparación in vivo de defectos de cartílago y defectos de hueso y cartílago en las articulaciones de mamíferos, tales como seres humanos y caballos.

En consecuencia, en un primer aspecto, la invención se refiere a una membrana de cartílago que tiene al menos una parte de superficie que lleva una composición que comprende al menos una molécula de estimulación que puede inducir una transducción de señales en condroblastos / condrocitos, dando como resultado que los condroblastos / condrocitos produzcan y secreten los componentes de la matriz, que forman el cartílago hialino o más específicamente cartílago articular hialino.

En otro aspecto, la invención se refiere a una membrana de interfase con una primera parte de superficie y una segunda parte de superficie que llevan ambas una composición que comprende al menos una molécula de estimulación que puede inducir una transducción de señales en condroblastos / condrocitos y osteoblastos / osteocitos.

Todavía en otro aspecto, la invención se refiere a un método para la reparación in vivo de defectos de cartílago en las articulaciones en mamíferos, que comprende aplicar sobre una cavidad sin cartílago de una articulación, una membrana de cartílago con una primera parte de superficie de la cual que da a la cavidad sin cartílago, llevando la primera parte de superficie de la membrana de cartílago una composición que comprende al menos una molécula de estimulación que puede inducir una transducción de señales en condroblastos / condrocitos, introducir, en la cavidad sin cartílago entre la membrana de cartílago, el cartílago y la interfase, una suspensión de condroblastos / condrocitos, y; unir una parte de la primera parte de superficie de la membrana de cartílago a la superficie articular circundante de modo que se encierre de manera estanca la suspensión de condroblastos / condrocitos en la cavidad sin cartílago utilizando una parte sellante, permitiendo así que la suspensión de condroblastos / condrocitos produzca y secrete los componentes de la matriz característicos para la hialina.

Adicionalmente, la invención se refiere a un método para la reparación in vivo de defectos de hueso y cartílago en las articulaciones de mamíferos, tales como articulaciones osteoartríticas, que comprende aplicar, sobre una cavidad sin hueso y bajo una cavidad sin cartílago de una articulación, una membrana de interfase con una primera parte de superficie que da a la cavidad sin hueso, llevando la primera parte de superficie de la membrana de interfase una composición que comprende al menos una molécula de estimulación que puede inducir una transducción de señales en osteoblastos / osteocitos y llevando la segunda parte de superficie una composición que comprende al menos una molécula de estimulación que puede inducir una transducción de señales en condroblastos / condrocitos,

\newpage

introducir en el intersticio entre la primera parte de superficie de la membrana de interfase y el hueso, una suspensión de osteoblastos / osteocitos,

unir una parte de la primera parte de la membrana de interfase a la superficie de interfase circundante, de modo que se encierre de manera estanca la suspensión de osteoblastos / osteocitos en la cavidad sin hueso utilizando una parte sellante, permitiendo así que la suspensión de osteoblastos / osteocitos produzca y secrete los componentes de la matriz característicos para el tejido óseo;

aplicar sobre la cavidad sin cartílago, una membrana de cartílago con una primera parte de superficie que da a la segunda parte de superficie de la membrana de interfase, llevando la primera parte de superficie de la membrana de cartílago una composición que comprende al menos una molécula de estimulación que puede inducir una transducción de señales en condroblastos / condrocitos, dando como resultado que los condroblastos / condrocitos produzcan y secreten los componentes de la matriz que forman el cartílago hialino,

introducir en la cavidad sin cartílago entre la membrana de interfase, la membrana de cartílago y el cartílago, una suspensión de condroblastos / condrocitos,

unir una parte de la membrana de cartílago a la superficie articular circundante de modo que se encierre de manera estanca la suspensión de condroblastos / condrocitos en la cavidad sin cartílago, permitiendo así que la suspensión de condroblastos / condrocitos produzca y secrete los componentes de la matriz que forman la hialina.

Además, mediante el uso de la presente invención es posible proporcionar un método para la reparación in vivo de defectos de hueso y cartílago en las articulaciones de mamíferos, utilizando la artroscopia, tal como en articulaciones osteoartríticas. Tal método puede comprender tratar una membrana de interfase con un primer componente de parte sellante, aplicar sobre una cavidad sin hueso y bajo una cavidad sin cartílago de una articulación, una membrana de interfase con una primera parte de superficie que da a la cavidad sin hueso, llevando la primera parte de superficie de la membrana de interfase una composición que comprende al menos una molécula de estimulación que puede inducir una transducción de señales en osteoblastos / osteocitos, y la segunda parte de superficie, que lleva una composición que comprende al menos una molécula de estimulación que puede inducir una transducción de señales en condroblastos / condrocitos,

introducir, en el intersticio entre la primera parte de superficie de la membrana de interfase y el hueso, una suspensión de osteoblastos / osteocitos,

unir una parte de la primera parte de la membrana de interfase a la superficie de interfase circundante, de modo que se encierre de manera estanca la suspensión de osteoblastos / osteocitos en la cavidad sin hueso utilizando una segunda parte sellante, permitiendo así que la suspensión de osteoblastos / osteocitos produzca y secrete los componentes de la matriz característicos para el tejido óseo;

introducir, en la cavidad sin cartílago entre la membrana de interfase y la superficie articular, una suspensión de condroblastos / condrocitos, permitiendo así que la suspensión de condroblastos / condrocitos produzca y secrete los componentes de la matriz característicos para la hialina.

Un método de preparación de suspensiones de condroblastos / condrocitos o de osteoblastos / osteocitos puede comprender recoger células mesenquimatosas y/o precursoras mesenquimatosas de una fuente tal como la médula ósea, pericondrio, periostio, sangre, vasos sanguíneos o músculo; añadir las células recogidas a un matraz de cultivo celular que comprende al menos un medio de crecimiento; hacer crecer las células recogidas hasta que se formen unidades formadoras de colonias, con un tamaño del número de células de un orden que oscila entre 10 - 20.000 células/clon, con un fenotipo fibroblástico (UFC-f); transferir las células UFC-f a un nuevo matraz de cultivo celular que comprende al menos un medio de selección para la diferenciación de las UFC-f en condroblastos / condrocitos, osteoblastos / osteocitos o mioblastos / miotubos; y recoger las células diferenciadas.

Breve descripción de los dibujos

La presente invención se ilustra adicionalmente con referencia a los dibujos, en los que

La figura 1 muestra una realización de la presente invención aplicable para el tratamiento de defectos de cartílago. La figura muestra la anatomía de un cartílago normal y un defecto de cartílago.

La figura 2 muestra otra realización de la presente invención aplicable para el tratamiento de defectos de cartílago y hueso. La figura muestra la anatomía de cartílago y hueso normales y defectos del cartílago y el hueso.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a un método y a los materiales para la reparación in vivo de defectos de cartílago o de hueso y cartílago en mamíferos, tales como seres humanos y caballos. Las células de condroblastos / condrocitos y las células de osteoblastos / osteocitos utilizadas en la presente invención son células obtenidas de un mamífero, tal como un ser humano, caballo, cerdo o terneros, preferiblemente células autólogas.

En la presente invención, se utilizan los nombres de aminoácido definidos por el Banco de Datos de Proteínas (PDB) que se basa en la nomenclatura de la IUPAC (Nomenclatura y Simbología de la IUPAC de Aminoácidos y Péptidos (nombres de residuo), Eur. J. Biochem. 138, 9-37, (1984) junto con las correcciones en Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985). El término "residuo de aminoácido" pretende indicar un residuo de aminoácido contenido en el grupo de arginina (Arg o R), glicina (Gly o G), ácido aspártico (Asp o D), prolina (Pro o P), histidina (His o H), serina (Ser o S) y asparagina (Asn o N).

Definiciones

El término "suspensión de condroblastos / condrocitos" pretende significar una suspensión que contiene células progenitoras para los condroblastos / condrocitos, o condroblastos / condrocitos, que tras su aplicación a un defecto estimula dichas células mediante una molécula de estimulación tal como se define más adelante en el presente documento, para diferenciarse y adherirse, dando como resultado la producción y secreción de los componentes de la matriz característicos para el tejido cartilaginoso. Componentes de la matriz tales como fibrillas de colágeno de tipo II y proteoglucanos sulfatados, condroitina-6-sulfato y sulfato de queratano para la producción de cartílago hialino y cartílago articular hialino.

El término "suspensión de osteoblastos / osteocitos" pretende significar una suspensión que contiene células progenitoras para los osteoblastos / osteocitos, u osteoblastos / osteocitos, que tras su aplicación a un defecto estimula dichas células mediante una molécula de estimulación tal como se define más adelante en el presente documento, para diferenciarse y adherirse, dando como resultado la producción y secreción de los componentes característicos para el tejido óseo.

El término "membrana de cartílago" pretende significar una membrana con la capacidad para unir condroblastos / condrocitos a al menos una parte de superficie de la membrana. Preferiblemente, la membrana de cartílago puede unir una molécula de estimulación tal como se define más adelante en el presente documento y opcionalmente con una estructura que permite que los condroblastos / condrocitos en la suspensión de condroblastos / condrocitos se adhieran e invadan toda la membrana, pero no que pasen a través de la membrana. Ejemplos de membranas adecuadas son las membranas de colágeno I / III adquiridas a Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Suiza o a Baxter, Dinamarca.

El término "membrana de interfase" pretende significar una membrana con la capacidad para unir osteoblastos / osteocitos a una primera parte de superficie de la membrana de interfase y condroblastos / condrocitos a la segunda parte de superficie de la membrana de interfase. Preferiblemente, la membrana de interfase puede unir una molécula de estimulación tal como se define más adelante en el presente documento, tanto a la primera como a la segunda parte de superficie de la membrana de interfase. Opcionalmente, la membrana de interfase tiene una estructura que permite que una suspensión de osteoblastos / osteocitos se adhiera e invada la primera parte de superficie de la membrana de interfase, pero no que pase a través de la membrana de interfase. Además, la membrana de interfase tiene una estructura que permite que una suspensión de condroblastos / condrocitos se adhiera e invada la segunda parte de superficie de la membrana de interfase, pero no que pase a través de la membrana. Ejemplos de membranas adecuadas son las membranas de colágeno I / III adquiridas a Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Suiza o a Baxter,
Dinamarca.

El término "molécula de estimulación" pretenden significar un péptido y/o proteína o una fusión de los mismos, naturales o sintéticos o una mezcla de los mismos, que puede inducir una transducción de señales en los condroblastos / condrocitos y osteoblastos / osteocitos. Preferiblemente, la molécula de estimulación comprende al menos los residuos de aminoácidos, Arg-Gly-Asp, también denominado motivo RGD. Se entenderá que también podría utilizarse según la invención cualquier motivo o secuencia de residuos de aminoácidos que tenga la misma, o sustancialmente la misma, capacidad de inducción como la molécula de estimulación que comprende un motivo RGD.

El término "parte sellante" pretende significar un adhesivo que puede unir o sellar la membrana y una superficie localizada en el exterior de una zona de cartílago defectuoso y/o hueso defectuoso y encerrar una suspensión de condroblastos / condrocitos y/o de osteoblastos / osteocitos en una cavidad sin cartílago y/o una cavidad sin hueso.

El término "medio de crecimiento" pretende significar un medio de crecimiento responsable de transferir las células madre mesenquimatosas y/o las células precursoras mesenquimatosas obtenidas de un mamífero en unidades formadoras de colonias con fenotipo fibroblástico (UFC-f).

El término "medio de selección" pretende significar un medio de selección responsable de transferir las UFC-f en células más definidas tales como condroblastos / condrocitos, osteoblastos / osteocitos o mioblastos / miotubos.

Membrana de cartílago que lleva una molécula de estimulación

En un aspecto, la invención se refiere a una membrana de cartílago que lleva una molécula de estimulación para su uso en tratamientos de defectos de cartílago en mamíferos, tales como lesiones condrales o lesiones osteocondrales, osteocondritis disecante (OCD), condromalacia y osteoartritis. Ejemplos de tal membrana de cartílago se muestran en la figura 1, referencia 5 y 2, referencia 50, respectivamente. Sin embargo, las realizaciones de la membrana que se encuentran en las figuras 1 y 2 son ejemplos de membranas y la invención no debe limitarse a las mismas.

La invención se refiere a una membrana de cartílago, que tiene al menos una parte de superficie, que lleva una composición que comprende al menos una molécula de estimulación, que puede inducir una transducción de señales en condrocitos / condroblastos. Preferiblemente, la membrana de cartílago es una membrana biodegradable, no tóxica y no inmunogénica, más preferiblemente, la membrana de cartílago es porosa o sustancialmente porosa, incluso más preferiblemente, la membrana de cartílago tiene una estructura que permite que los condroblastos / condrocitos en una suspensión de condroblastos / condrocitos se adhieran e invadan toda la membrana y lo más preferiblemente, la membrana de cartílago es una membrana natural de colágeno de tipo I y/o III o una membrana sintética o una parte de las mismas. Un ejemplo de una membrana de cartílago es un colgajo perióstico extirpado de un hueso del paciente, tal como por ejemplo, la parte proximal de la tibia.

La membrana de cartílago puede impregnarse con la molécula de estimulación antes de o directamente tras la aplicación de la membrana a una superficie que va a tratarse, tal como la cavidad sin cartílago que se encuentra en la figura 1, referencia 7. Preferiblemente, la membrana de cartílago se impregna utilizando técnicas convencionales, tales como la pulverización, pintado o inmersión o cualquier otra técnica convencional.

En una realización preferida, la molécula de estimulación comprende al menos un motivo RGD. Preferiblemente, la molécula de estimulación es una proteína o un péptido naturales o sintéticos o una fusión o una mezcla de los mismos, más preferiblemente, la molécula de estimulación se selecciona del grupo que consiste en proteínas de colágeno, tales como el colágeno de los tipos II, VI, IX y XI, proteoglucanos tales como agregados de proteoglucanos (aggregans), decorina, fibromodulina y biglucano y proteínas no colagenosas tales como crioprecipitado, fibronectina, vitronectina, fibrinógeno, fibrillina, kistrina, equistatina, factor de von Willebrand, tenascina y ancorina CII, e incluso más preferiblemente, la molécula de estimulación se selecciona del grupo que consiste en colágeno de tipo II y fibronectina. Adicionalmente, la molécula de estimulación está unida a un soporte.

La concentración final de la molécula de estimulación no es crítica y depende del grado de defecto del cartílago que va a tratarse. La molécula de estimulación puede añadirse hasta una concentración final dentro del intervalo de nM a mM, preferiblemente entre 1 nM y 100 mM, y más preferiblemente 10 mM.

En otra realización de la invención, la membrana de cartílago descrita anteriormente se utiliza para la preparación de un kit que contiene la membrana de cartílago sola o en combinación con al menos una membrana de interfase tal como se define más adelante en el presente documento para el tratamiento de defectos de cartílago o defectos de cartílago y hueso. Además, el kit puede comprender otros componentes útiles para el tratamiento de los defectos de cartílago o hueso y cartílago en mamíferos, tales como lesiones condrales o lesiones osteocondrales, osteocondritis disecante (OCD), condromalacia y osteoartritis.

Membrana de interfase que lleva una molécula de estimulación

En otra realización, la invención se refiere a una membrana de interfase, tal como se definió anteriormente, que lleva una molécula de estimulación para el tratamiento de un mamífero que tiene un defecto de cartílago y hueso, tal como lesiones condrales o lesiones osteocondrales, osteocondritis disecante (OCD), condromalacia y osteoartritis. Un ejemplo de tal membrana de interfase se muestra en la figura 2, referencia 21. Sin embargo, la realización de la membrana 21 que se encuentra en la figura 2 es sólo un ejemplo y la invención no debe limitarse al mismo.

La invención se refiere a una membrana de interfase con al menos dos partes de superficie diferentes, una primera y una segunda parte de superficie, que lleva al menos una molécula de estimulación que puede inducir una transducción de señales en condroblastos / condrocitos y osteoblastos / osteocitos. La primera parte de superficie de la membrana de interfase tiene la capacidad para unir osteoblastos / osteocitos, por ejemplo figura 2, referencia 22, y la segunda parte de superficie de la membrana de interfase tiene la capacidad para unir condroblastos / condrocitos, por ejemplo figura 2, referencia 26. Preferiblemente, la membrana de interfase es una membrana biodegradable, no tóxica y no inmunogénica, más preferiblemente, la membrana de interfase es porosa o sustancialmente porosa, incluso más preferiblemente, la membrana de interfase tiene una estructura que permite que los condroblastos / condrocitos en la suspensión de condroblastos / condrocitos se adhieran e invadan un lado de la membrana de interfase, pero no pasen a través de la membrana de interfase e incluso más preferiblemente, la membrana de interfase es una membrana natural o sintética de colágeno de tipo I y/o III o una parte de la misma. Un ejemplo de una membrana de interfase es un colgajo perióstico extirpado de un hueso del paciente, tal como por ejemplo, la parte proximal de la
tibia.

La membrana de interfase puede impregnarse con la molécula de estimulación antes de o tras la aplicación de la membrana de interfase a una superficie que va a tratarse, tal como por ejemplo, la cavidad sin hueso que se encuentra en la figura 2, referencia 23. Preferiblemente, la membrana de interfase se impregna utilizando técnicas convencionales, tales como la pulverización, pintado o inmersión o cualquier otra técnica convencional.

En una realización preferida, la molécula de estimulación comprende al menos un motivo RGD, preferiblemente, la molécula de estimulación es una proteína o un péptido naturales o sintéticos o una fusión o una mezcla de los mismos, más preferiblemente, la molécula de estimulación se selecciona del grupo que consiste en proteínas de colágeno, tales como el colágeno de los tipos II, VI, IX y XI, proteoglucanos tales como agregados de proteoglucanos (aggregans), decorina, fibromodulina y biglucano y proteínas no colagenosas tales como crioprecipitado, fibronectina, vitronectina, fibrinógeno, fibrillina, kistrina, equistatina, factor de von Willebrand, tenascina y ancorina CII, e incluso más preferiblemente, la molécula de estimulación se selecciona del grupo que consiste en colágeno de tipo II y fibronectina. Adicionalmente, la molécula de estimulación está unida a un soporte.

La concentración final de la molécula de estimulación no es crítica y depende del grado de defecto que va a tratarse. La molécula de estimulación puede añadirse hasta una concentración final dentro del intervalo de nM a mM, preferiblemente entre 1 nM y 100 mM, y más preferiblemente 10 mM.

Según otra realización de la invención, la membrana de interfase puede utilizarse para el tratamiento de defectos de hueso y cartílago, utilizando artroscopia. La membrana de interfase utilizada para la artroscopia comprende al menos un primer componente de parte sellante, tal como se define más adelante en el presente documento.

Las características adicionales de la membrana de interfase utilizada en la artroscopia son tal como se definieron anteriormente para la membrana de interfase utilizada para el tratamiento de defectos de hueso y cartílago, tales como lesiones condrales o lesiones osteocondrales, osteocondritis disecante (OCD), condromalacia y osteoartritis.

En otra realización de la invención, la membrana de interfase se utiliza para la preparación de un kit que contiene la membrana de interfase sola o en combinación con al menos una membrana de cartílago para el tratamiento de defectos de hueso o defectos de hueso y cartílago. Además, el kit puede comprender otros componentes útiles para el tratamiento de los defectos de cartílago o hueso y cartílago en mamíferos, tales como lesiones condrales o lesiones osteocondrales, osteocondritis disecante (OCD), condromalacia y osteoartritis.

Método para la propagación de células madre de mamífero mesenquimatosas multipotentes que van a utilizarse para el tratamiento de defectos de cartílago o cartílago y hueso en mamíferos

A continuación, se describe un método para la propagación de células precursoras y/o células madre de mamífero mesenquimatosas multipotentes y su diferenciación en condroblastos / condrocitos, osteoblastos / osteocitos, fibroblastos, mioblastos / miocitos y adipoblastos / adipocitos, sin el uso de enzimas, tales como colagenasa. Las células diferenciadas pueden utilizarse para el tratamiento de defectos de cartílago y/o hueso y cartílago en mamíferos.

El método comprende recoger células precursoras y/o mesenquimatosas de una fuente tal como la médula ósea, pericondrio, periostio, sangre, vasos sanguíneos o músculo;

añadir las células recogidas a un matraz de cultivo celular que comprende al menos un medio de crecimiento tal como se definió anteriormente en el término "medio de crecimiento";

hacer crecer las células recogidas hasta que se formen unidades formadoras de colonias, con un tamaño del número de células de un orden que oscila entre 10 - 20.000 células/clon, con un fenotipo fibroblástico (UFC-f);

transferir las células UFC-f a un nuevo matraz de cultivo celular que comprende al menos un medio de selección tal como se definió anteriormente para la diferenciación adicional en condroblastos / condrocitos, osteoblastos / osteocitos o mioblastos / miotubos;

recoger las células diferenciadas y preparar las suspensiones de condroblastos / condrocitos o de osteoblastos / osteocitos.

Preferiblemente, las suspensiones de condroblastos / condrocitos o de osteocitos / osteoblastos pueden utilizarse para el tratamiento de defectos de cartílago y/o de hueso y cartílago en mamíferos. El periodo de cultivo depende del estadio y de las condiciones de las células precursoras y/o mesenquimatosas recogidas de los mamíferos y, por tanto, es difícil definir el periodo de tiempo utilizado para la propagación de las células precursoras y/o mesenquimatosas en el medio de crecimiento y de selección para diferenciarse en condroblastos / condrocitos u osteoblastos / osteocitos. Las células inmaduras se preparan mediante el medio de selección, en el que la composición de aminoácidos y factores hormonales, de crecimiento y de diferenciación es más específica para la selección que para el crecimiento. Podría ser cierto lote de suero bovino fetal a una concentración más elevada que la utilizada convencionalmente (más del 10%), hasta el 30% v/v, que se ha probado para determinar su capacidad para diferenciar células en condroblastos / condrocitos, o se ha probado para determinar su capacidad para diferenciar células en osteoblastos / osteocitos. Se han identificado internamente dichos lotes de suero bovino fetal que muestran estos patrones de selección. Hasta que tenga que probarse adicionalmente un nuevo lote o nuevos lotes de suero bovino fetal para la diferenciación de las células. Las células se identifican por PCR cuantitativa del ARNm (Lane Smith, R., et al., J. Rehab. Research and Development, marzo / abril de 2000, vol. 37), y en el caso de las líneas de condrocitos, las células se prueban utilizando anticuerpos monoclonales tales como el anticuerpo monoclonal de ratón Ac-1 contra el colágeno de tipo II (Clon 5B2.5) (Lab. Vision Corp, Fremont, California).

El uso de medio con suero bovino fetal identificado como "calidad de selección" suficiente conduce a ciertas diferenciaciones de las células precursoras. Otros factores, tales como los factores físicos, por ejemplo, la adhesión a ciertos materiales de plástico o la adhesión a factores de adhesión celulares o no celulares, también ayudan a la diferenciación de las células.

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Preferiblemente, las suspensiones de condroblastos / condrocitos y de osteoblastos / osteocitos contienen medio de cultivo convencional, tal como por ejemplo, DMEM/F12, suero tal como suero bovino fetal o suero autólogo, preferiblemente un suero que no sea inmunogénico y más preferiblemente, las suspensiones de condroblastos / condrocitos y de osteoblastos / osteocitos comprenden células de condroblastos / condrocitos y de osteoblastos / osteocitos, respectivamente, dentro del intervalo de 100.000 a 10 millones de células/ml de las suspensiones celulares totales.

Otro método puede ser un sistema de cultivo celular construido a partir del concepto de utilizar la matriz de cartílago como el sistema de "unión y suministro" (o depósito) de factores de crecimiento y diferenciación para las diversas células presentes en la matriz extracelular, sin utilizar fragmentos de cartílago diseccionado y tratado enzimáticamente. Esto significa añadir factores de crecimiento y factores de diferenciación a través de suero bovino fetal o por separado. Los explantes de cartílago pueden unir estos factores mediante proteínas de unión naturales presentes en la matriz. Tal sistema de unión y suministro podría aumentar el tiempo de semivida de los diversos factores de crecimiento y diferenciación presentes en el medio de cultivo con suero bovino fetal, lo que significa que los factores de crecimiento y diferenciación están mucho más protegidos de la proteolisis cuando se unen primero a moléculas intermedias naturales de la matriz (los "vehículos" de suministro para los diversos receptores celulares). Adicionalmente, podría especularse sobre una mayor estimulación de las células mediante los factores de crecimiento y diferenciación, debido a una mayor acumulación local (mayor concentración) de los factores de crecimiento y diferenciación alrededor del borde pericelular, en los compartimentos territoriales así como en los interterritoriales, en comparación con los factores de crecimiento y diferenciación presentes en el medio convencional. Una mayor concentración local de factores de crecimiento y diferenciación, unidos a sus moléculas intermedias naturales en la matriz y más tarde "suministrados" a los receptores de unión (IGF-R, TGF-R, bFGR-R, etc.,), induce a los receptores a la formación de agregados en la membrana plasmática y la transducción de señales adicional: estimulación del crecimiento. Para el crecimiento de las diversas células estimuladas en la matriz, es un proceso mucho más suave para las células comenzar su propagación y maduración en la matriz extracelular natural, en lugar de "desprender" los condroblastos / condrocitos de sus componentes naturales de la matriz (las células "historia") mediante el método convencional de digestión con colagenasa. La capacidad de los condroblastos / condrocitos para permanecer viables en explantes de cartílago, en ausencia de suero bovino fetal o de otros factores de crecimiento añadidos, sugiere adicionalmente que los condrocitos están protegidos por la matriz extracelular. Un sistema de cultivo tisular con explantes de cartílago como material de partida para la propagación celular, tiene otras diversas ventajas con respecto a los métodos generales de cultivo de condrocitos. Tal como se mencionó anteriormente, las células derivadas de cartílago en los explantes mantienen su estado diferenciado en la matriz, mientras que continúan la estimulación celular y la propagación celular. En segundo lugar, las células no se exponen a altas concentraciones de actividad proteolítica utilizadas, por ejemplo, por la digestión con colagenasa de la matriz del cartílago. Esto significa que la matriz extracelular en el proceso de propagación de las células derivadas de cartílago se conserva y se aproxima a las condiciones in vivo.

Parte sellante

La parte sellante puede utilizarse para encerrar una suspensión de condroblastos / condrocitos en una cavidad sin cartílago y/o una suspensión de osteoblastos / osteocitos en una cavidad sin hueso. Ejemplos de partes sellantes se encuentran en la figura 1, referencia 6, que encierra la suspensión (8) de condroblastos / condrocitos en la cavidad (7) sin cartílago y la parte sellante en la figura 2, referencia (25) que encierra la suspensión (24) de osteoblastos / osteocitos en la cavidad (23) sin hueso.

Un ejemplo de parte sellante es Tisseel^{MR} (Baxter Immuno Austria, una sustancia liofilizada, inactivada frente a los virus, que consiste en fibrinógeno, plasmafibronectina, factor VII y plasminógeno), que durante su aplicación se mezcla con solución de aprotinina, trombina 4, trombina 500 y solución de cloruro de calcio, utilizando un sistema de doble jeringa conectado a una aguja de inyección roma. Adicionalmente, la "parte sellante" puede comprender una suspensión de condroblastos / condrocitos o de osteoblastos / osteocitos, con o sin una molécula de estimulación, tal como se definió anteriormente en las definiciones. Otro ejemplo de un agente sellante es CoSeal (Cohesion Technologies, palo Alto, California, EE.UU.), que también es un adhesivo biológico de dos componentes, que se parece a Tisseel, y puede utilizarse en vez de Tisseel.

Además, cuando la parte sellante es un adhesivo que comprende dos componentes diferentes, puede aplicarse uno de los componentes que comprende al menos una molécula de estimulación tal como se definió anteriormente para cubrir la zona completa de al menos un lado de la membrana. El otro componente se añade entre la parte de la membrana con parte sellante y el borde del defecto de hueso o cartílago defectuoso, tras colocarse la membrana sobre el defecto de cartílago o hueso.

Tratamiento de los defectos de cartílago

En otro aspecto, la invención se refiere a un método y a los materiales para la reparación in vivo de los defectos de cartílago en mamíferos, tales como lesiones condrales o lesiones osteocondrales, osteocondritis disecante (OCD), condromalacia y osteoartritis.

Ahora se hace referencia a la figura 1.

La parte con defecto de cartílago normalmente es una parte de superficie en la que el cartílago original se ha desgarrado. Como preparación para la reparación, el defecto se desbrida de manera que la parte de superficie con defecto de cartílago aparece como una cavidad 7 sin cartílago, que a menudo se extiende hacia abajo hasta la interfase 3, la interfase entre el cartílago 2 y el hueso 4, estando rodeada la cavidad 7 sin cartílago por cartílago 2 sano.

Después, la membrana 5 de cartílago tal como se definió anteriormente, se aplica sobre la cavidad 7 sin cartílago. La membrana 5 de cartílago normalmente se adapta en tamaño, de manera que la parte de la membrana puede suturarse a la superficie 1 articular circundante. Tras la aplicación y la sutura de la membrana 5 de cartílago, normalmente se sella el borde de la membrana a la superficie 1 articular circundante por medio de partes 6 sellantes adecuadas. El sellado no es completo; una pequeña parte de la circunferencia se deja sin sellar para permitir la implantación de una suspensión 8 de condroblastos / condrocitos. Después, la membrana 5 de cartílago se sella completamente por medio de una parte 6 sellante adecuada.

La membrana 5 de cartílago, que tiene al menos un parte de superficie, lleva una composición que comprende al menos una molécula de estimulación que puede inducir una transducción de señales en los condroblastos / condrocitos, lo que da como resultado que los condroblastos / condrocitos produzcan y secreten componentes de la matriz que forman el cartílago hialino o articular hialino. La parte de superficie de la membrana 5 de cartílago que lleva la molécula de estimulación se localiza contra la superficie 1 articular y cubre la cavidad 7 sin cartílago que comprende la suspensión 8 de condroblastos / condrocitos, tal como se definió anteriormente. Características adicionales de la "membrana de cartílago" se definieron anteriormente en Membrana de cartílago que lleva una molécula de estimulación.

En otra realización según la invención, se aplica una composición a la superficie con defecto de cartílago que forma las paredes que rodean la cavidad 7 sin cartílago antes de la aplicación de la membrana 5 de cartílago. La composición comprende al menos una molécula de estimulación, tal como se definió anteriormente, para aumentar la exposición de los condroblastos / condrocitos implantados en la suspensión 8 de condroblastos / condrocitos a la molécula de estimulación, así como la capacidad de las células de condroblastos / condrocitos implantadas para unirse al cartílago 2 circundante.

Además, la suspensión 8 de condroblastos / condrocitos se aplica simultáneamente con una suspensión que comprende la molécula de estimulación, tal como se definió anteriormente. Preferiblemente, la suspensión de condroblastos / condrocitos es una suspensión de condrocitos / condroblastos autólogos. Alternativamente, la suspensión 8 de condrocitos / condroblastos se aplica sola.

En otra realización según la invención, los condroblastos / condrocitos se incluyen en una composición que lleva la membrana 5 de cartílago y opcionalmente se aplica directamente sobre la cavidad 7 sin cartílago, con el fin de obtener un revestimiento de células que dé como resultado una capa de superficie de cartílago y una capa de transición normales.

Preferiblemente, la "suspensión de condroblastos / condrocitos" contiene un medio de cultivo convencional, tal como por ejemplo DMEM/F12, suero tal como suero bovino fetal o suero autólogo, preferiblemente un suero que no sea inmnogénico y más preferiblemente, la suspensión de condroblastos / condrocitos comprende células de condroblastos / condrocitos dentro del intervalo de 100.000 a 10 millones de células/ml de la suspensión de condroblastos / condrocitos total.

Ejemplos de estados que dan como resultado defectos de cartílago, que pueden tratarse según la invención, son lesiones condrales o lesiones osteocondrales, osteocondritis disecante (OCD), condromalacia y osteoartritis.

Tratamiento de defectos de hueso y cartílago

Una realización particular de la invención se refiere a un método y a los materiales para la reparación in vivo de los defectos de hueso y cartílago en mamíferos, tales como lesiones condrales o lesiones osteocondrales, osteocondritis disecante (OCD), condromalacia y osteoartritis, utilizando dos membranas.

Ahora se hace referencia a la figura 2.

Como preparación para la reparación, las partes con defecto de hueso y cartílago se desbridan, de manera que las partes con defecto de hueso y cartílago aparezcan como cavidades 23, 70 sin hueso y cartílago que se extienden a través del cartílago 20, la interfase 30 y hacia abajo hasta el hueso 40. Las cavidades 23, 70 sin hueso y cartílago están rodeadas por cartílago 20 sano, la interfase 30 y el hueso 40. La membrana 21 de interfase se aplica sobre la cavidad 23 sin hueso en el nivel de la interfase 30 por la capacidad para separar las cavidades sin cartílago 70 y sin hueso 23. La membrana 21 de interfase se aplica de manera que la primera parte 22 de superficie de la membrana 21 de interfase, que da a la cavidad 23 sin hueso y la segunda parte 26 de superficie que da a la cavidad 70 sin cartílago. La membrana 21 de interfase normalmente se adapta en tamaño, de manera que la parte de la membrana puede suturarse a la zona circundante de la interfase 30. Tras la aplicación y la sutura de la membrana 21 de interfase, normalmente se sella el borde de la membrana a la interfase 30 circundante por medio de partes 25 sellantes adecuadas. El sellado no es completo; una pequeña parte de la circunferencia se deja sin sellar para permitir la implantación de una suspensión 24 de osteoblastos / osteocitos. Tras la implantación de la suspensión 24 de osteoblastos / osteocitos, la membrana de interfase se sella completamente a la interfase 30 circundante por medio de una parte 25 sellante
adecuada.

La membrana 21 de interfase tiene al menos dos partes de superficie diferentes, una primera parte 22 y una segunda parte 26 de superficie, que llevan al menos una molécula de estimulación que puede inducir una transducción de señales. La primera parte 22 de superficie de la membrana 21 de interfase tiene la capacidad para unir osteoblastos / osteocitos y la segunda parte 26 de superficie de la membrana 21 de interfase tiene la capacidad para unir condroblastos / condrocitos.

Características adicionales de la membrana de interfase se definieron anteriormente en Membrana de interfase que lleva una molécula de estimulación.

Además, la suspensión de osteoblastos / osteocitos se aplica simultáneamente con una suspensión que comprende la molécula de estimulación, tal como se definió anteriormente. Preferiblemente, la suspensión de osteoblastos / osteocitos es una suspensión de osteoblastos / osteocitos autólogos. Alternativamente, la suspensión de osteoblastos / osteocitos se aplica sola.

Preferiblemente, la suspensión de osteoblastos / osteocitos contiene un contiene un medio de cultivo convencional, tal como por ejemplo DMEM/F12, suero tal como suero bovino fetal o suero autólogo, preferiblemente un suero que no sea inmnogénico y más preferiblemente, la suspensión de osteoblastos / osteocitos comprende células de osteoblastos / osteocitos dentro del intervalo de 100.000 a 10 millones de células/ml de la suspensión de osteoblastos / osteocitos total.

En otra realización de la invención, los osteoblastos / osteocitos en la suspensión 24 de osteoblastos / osteocitos se incluyen en una composición que lleva la parte 22 de superficie de la membrana 21 de interfase y opcionalmente se aplica directamente sobre la cavidad 23 sin hueso, con el fin de obtener un revestimiento de células que dé como resultado una capa de superficie de hueso y una capa de transición normales.

Después, la membrana 50 de cartílago tal como se definió anteriormente, se aplica sobre la cavidad 70 sin cartílago. La membrana 50 de cartílago normalmente se adapta en tamaño, de manera que la parte de la membrana puede suturarse a la superficie 10 articular circundante. Tras la aplicación y la sutura de la membrana 50 de cartílago, normalmente se sella el borde de la membrana a la superficie 10 articular circundante por medio de partes 60 sellantes adecuadas. El sellado no es completo; una pequeña parte de la circunferencia se deja sin sellar para permitir la implantación de una suspensión 80 de condroblastos / condrocitos. Después, la implantación se sella completamente a la superficie 10 articular circundante por medio de una parte 60 sellante adecuada.

La membrana 50 de cartílago tiene al menos un parte de superficie, que lleva una composición que comprende al menos una molécula de estimulación que puede inducir una transducción de señales en los condroblastos / condrocitos, lo que da como resultado que los condroblastos / condrocitos produzcan y secreten componentes de la matriz que forman el cartílago hialino o articular hialino. La parte de superficie de la membrana 50 de cartílago que lleva la molécula de estimulación se localiza contra la superficie 10 articular y cubre la cavidad 70 sin cartílago que comprende la suspensión 80 de condroblastos / condrocitos, tal como se definió anteriormente. Características adicionales de la membrana de cartílago se definieron anteriormente en Membrana de cartílago que lleva una molécula de estimulación.

La suspensión de condroblastos / condrocitos puede aplicarse simultáneamente con una suspensión que comprende la molécula de estimulación, tal como se definió anteriormente. Alternativamente, la suspensión de condroblastos / condrocitos puede aplicarse sola.

En otra realización según la invención, los condroblastos / condrocitos en la suspensión 80 de condroblastos / condrocitos se incluyen en una composición que lleva la membrana 50 de cartílago y opcionalmente se aplica directamente en la cavidad 70 sin cartílago, con el fin de obtener un revestimiento de células que dé como resultado una capa de superficie de cartílago y una capa de transición normales.

Preferiblemente, la suspensión de condroblastos / condrocitos contiene un medio de cultivo convencional, tal como por ejemplo DMEM/F12, suero tal como suero bovino fetal o suero autólogo, preferiblemente un suero que no sea inmnogénico y más preferiblemente, la suspensión de condroblastos / condrocitos comprende condroblastos / condrocitos dentro del intervalo de 100.000 a 10 millones de células/ml de la suspensión de condroblastos / condrocitos total.

Ejemplos de estados que dan como resultado defectos de hueso y cartílago, que pueden tratarse según la invención, son lesiones condrales o lesiones osteocondrales, osteocondritis disecante (OCD), condromalacia y osteoartritis

Según otra realización de la invención, el defecto de hueso y cartílago se trata utilizando artroscopia que utiliza una parte sellante de dos componentes, el componente 1 y el 2. Un ejemplo de una parte sellante de dos componentes es Tisseel Duo Quick (Baxter). La membrana 21 de interfase se trata previamente con un componente 1 de la parte sellante, por ejemplo, una solución de trombina que contiene 500 U.I. de trombina, 50 mg de proteína plasmática de mamífero, 40 moles de cloruro de calcio, 10 mg de cloruro de sodio, 3 mg de glicina y agua para inyección hasta 1 ml, tal como Tisseel Duo Quick (Baxter). Además, la parte sellante puede comprender una molécula de estimulación.

Como preparación para la reparación, las partes con defecto de hueso y cartílago se desbridan, de manera que las partes con defecto de hueso y cartílago aparezcan como cavidades 23, 70 sin hueso y cartílago que se extienden a través del cartílago, la interfase y hacia abajo hasta el hueso. La cavidad sin hueso y cartílago está rodeada por cartílago 20 sano, la interfase 30 y el hueso 40. Un componente 2 de la parte sellante se aplica a los bordes circundantes de la zona 30 de interfase. La membrana 21 de interfase se aplica usando artroscopia sobre la cavidad 23 sin hueso en el nivel de la interfase 30 por la capacidad para separar las cavidades sin cartílago 70 y sin hueso 23. La membrana 21 de interfase se aplica de manera que la primera parte 22 de superficie de la membrana 21 de interfase, que da a la parte 23 de la cavidad sin hueso y la segunda parte 26 de superficie que da a la cavidad 70 sin cartílago. La membrana 21 de interfase normalmente se adapta en tamaño, de manera que la parte de la membrana puede adherirse a la zona circundante de la interfase 30. Tras la aplicación de la membrana 21 de interfase, el componente 1 y 2 de la parte sellante reaccionan entre sí y a partir de un adhesivo que sella la membrana 21 de interfase a la zona 30 de interfase circundante. El sellado no es completo; una pequeña parte de la circunferencia se deja sin sellar para permitir la implantación de una suspensión 24 de osteoblastos / osteocitos. Tras la implantación de la suspensión 24 de osteoblastos / osteocitos, la membrana de interfase se sella completamente a la interfase 30 circundante por medio de una parte 25 adecuada. Después, la suspensión 80 de condroblastos / condrocitos se implanta y la superficie articular se sella mediante una parte 60 adecuada.

Los principios de la invención se ilustran adicionalmente en los dibujos adjuntos.

Las subsecciones siguientes describen los componentes que deben utilizarse en los métodos de la invención.

Materiales y métodos

Medio de crecimiento; DMEM/F12 que contiene un 20% de suero bovino fetal. DMEM/F12 se obtiene de Life Technologies Inc., Rockville, MD, EE.UU. y el suero bovino fetal de Life Technologies Inc., Rockville, MD, EE.UU.

Ejemplo 1 Suspensión de condrocitos utilizada para el tratamiento de los defectos de cartílago

Se obtiene una biopsia de cartílago de aspecto sano (200 - 500 mg) a través de una artroscopia de una zona de la articulación que soporta una carga menor, en condiciones asépticas y se coloca en un matraz estéril que contiene "Medio de transporte" (DMEM/F12 con un 20% de suero bovino fetal). El matraz que contiene el medio de transporte se entrega en un plazo de 48 horas al laboratorio de cultivo celular para el tratamiento adicional del cultivo celular.

Los condrocitos se expandieron en matraces de cultivo celular en un incubador de CO_{2} (5% de CO_{2}) a 37ºC, en medio de crecimiento, durante de 3 a 6 semanas, y más tarde se mantuvieron en DMEM/F12 con el propio suero del paciente (mamífero) inactivado por calor (intervalo del 10 - 20%) durante de 3 a 10 días. Cuando el cultivo de condrocitos se ha expandido hasta la cantidad de células necesarias para la reparación de una lesión(es) de cartílago de un paciente dado (mamífero), las células se recogen mediante tripsinización en tripsina al 0,25% en EDTA 1 mM, se lavan en medio que contiene suero bovino fetal (10 - 20%) y se centrifugan a 900 x g, durante 10 minutos, a temperatura ambiente y se resuspenden hasta alcanzar un número de células de entre 0,5 y 2 x 10^{6} células por 0,1 ml de medio de crecimiento (de 5 a 20 x 10^{6} células por 1 ml de medio de crecimiento). El recuento de células óptimo por 0,1 ml de medio de crecimiento para la implantación es de aproximadamente 1 millón de células. En general, un defecto de cartílago tiene espacio para 0,1 ml de suspensión celular por 1 cm^{2} de defecto.

Los condrocitos en entregan al cirujano ortopédico quien, en un plazo de 24 horas, implanta los condrocitos en un defecto de cartílago. Antes de la implantación, el cirujano ha colocado un colgajo perióstico o una cubierta biodegradable adecuada sobre el defecto, ha suturado y sellado el colgajo, excepto en el sitio de la inyección. Las células se inyectan entonces bajo la cubierta y el sitio de inyección se sella utilizando Tisseel Duo Quick (Baxter).

Ejemplo 2 Molécula de estimulación

Se purificó colágeno II a partir de un cultivo a gran escala de condrocitos porcinos, así como de proteoglucanos derivados de la misma fuente de cartílago porcino. El colágeno II se obtuvo de un cultivo a gran escala de condrocitos de mamífero (preferiblemente especies específicas para el receptor de las células), cultivadas como explantes en los que está presente una cantidad adecuada de colágeno II.

Ejemplo 3 Membrana que va a utilizarse para el tratamiento y uso de la membrana

Durante la cirugía abierta de rodilla, se utiliza una membrana de colágeno de tipo I / (III), adquirida a Geistlich Biomaterials, Wolhusen, Suiza o de Baxter (Dinamarca). La membrana se corta a un tamaño, que es algo más grande que el defecto de cartílago, de manera que la membrana pueda cubrir el defecto de cartílago y extenderse aproximadamente ½ cm más allá del borde del defecto. La membrana se sutura junto con el borde de cartílago. El borde entre la membrana y el cartílago se sella utilizando Tisseel Due Quick (Baxter). La membrana de colágeno tipo I se trata previamente con 1 - 5 ml de una solución de colágeno tipo II (3 - 10 mg de colágeno II/ml (Dep. Material Engineering, Drexel University, Filadelfia, Pensilvania) durante 5 - 15 minutos, a temperatura ambiente antes de su uso para la implantación.

a): Cuando se lleva a cabo cirugía artroscópica, la superficie de la membrana de colágeno I (/ III) que da al defecto de cartílago se trata previamente con el componente II; una solución de trombina que contiene: 500 U.I. de trombina, 50 mg de proteína plasmática de mamífero, 40 moles de cloruro de calcio, 10 mg de cloruro de sodio, 3 mg de glicina y agua para inyección hasta 1 ml, como por ejemplo una parte de Tisseel Duo Quick (Baxter).

b): Con la artroscopia que utiliza distensión de la articulación con gases, tales como por ejemplo, CO_{2} en lugar de distensión con soluciones tales como por ejemplo, solución de cloruro de sodio al 0,9%, el cartílago sano que crea el borde alrededor del defecto se recubre con el componente I que está compuesto de proteína coagulable, 75 - 115 mg de la misma, 70 - 110 mg de fibrinógeno, 2 - 9 mg de fibronectina, 10 - 50 U.I. de factor XIII, 40 - 120 g, 3000 KIU (unidades inhibidoras de calicreína) de aprotinina (bovina), 10 - 20 mg de albúmina de mamífero, 15 - 35 mg de glicina, 2 - 4 mg de cloruro de sodio, 4 - 8 mg de citrato de sodio, 0,2 - 0,4 mg de polisorbato 80, 15 mg de creatinina monohidratada y agua para inyección hasta 1 ml, por ejemplo, la otra composición de Tisseel.

La membrana de capa fina recubierta descrita anteriormente, descrita por "II", se inserta entonces sobre el defecto (el tamaño de la membrana es algo más grande en diámetro que el defecto) y se coloca con el recubrimiento dando al defecto. Cuando la membrana entra en contacto con el borde del cartílago recubierto del defecto descrito como recubierto con "II", los dos tipos de recubrimiento (el recubrimiento "I" y el recubrimiento "II", que son los componentes de Tisseel) darán como resultado un adhesivo biológico, uniendo así la membrana al defecto. La membrana se mantiene en su sitio insertando pequeños clavos reabsorbibles en la periferia del defecto, que anclan la membrana "sellada" al cartílago de una manera más sólida. La suspensión de condrocitos se inyecta entonces a través de una aguja en una zona de la membrana cerca del borde del defecto, y el orificio de la membrana se sella cuando se tira de la aguja, con el adhesivo biológico de dos componentes, tal como por ejemplo Tisseel Duo Quick, tal como se muestra a continuación.

Con el fin de llevar a cabo el procedimiento artroscópico descrito anteriormente, en este ejemplo se ha utilizado un adhesivo biológico de 2 componentes, en el que el componente "II" se utiliza como recubrimiento sobre la membrana que da al defecto y en el que el componente "I" se utiliza como recubrimiento sobre el borde del cartílago que rodea al defecto. El componente "II" reaccionará con el componente "I", pero no reaccionará como adhesivo con el medio que contiene el componente sérico autólogo, sino como recubrimiento con RGD hacia el medio y, por tanto, inducirá la adherencia y la producción de la matriz de los condrocitos inyectados.

El adhesivo de 2 componentes Tisseel también puede utilizarse como recubrimiento sobre la parte de membrana que da hacia el defecto, pero será más difícil de manejar cuando se inserta. Otra alternativa es recubrir el borde del cartílago que rodea al defecto con el adhesivo de dos componentes. En este caso, también será difícil manejar la colocación de la membrana sobre el defecto.

Tisseel Duo Quick consiste en

I:: proteína coagulable, 75 - 115 mg de la misma, 70 - 110 mg de fibrinógeno, 2 - 9 mg de fibronectina, 10 - 50 U.I. de factor XIII, 40 - 120 g, 3000 KIU de aprotinina (bovina), 10 - 20 mg de albúmina de mamífero, 15 - 35 mg de glicina, 2 - 4 mg de cloruro de sodio, 4 - 8 mg de citrato de sodio, 0,2 - 0,4 mg de polisorbato 80, 15 mg de creatinina monohidratada y agua para inyección hasta 1 ml.

II:: La solución de trombina contiene: 500 U.I. de trombina, 50 mg de proteína plasmática de mamífero, 40 moles de cloruro de calcio, 10 mg de cloruro de sodio, 3 mg de glicina y agua para inyección hasta 1 ml.

Ejemplo 4 Condrogénesis de células en el cambium mediante proteínas que contienen motivos RGD

Se examinaron dos muestras de colgajo perióstico procedentes de cerdos con dos enfoques de medio de cultivo diferentes, siendo uno el medio de crecimiento y denominado "medio condicionado", que consiste en el medio de crecimiento y un 1 - 20% v/v de colágeno II. Este medio condicionado se utilizó como capaz de llevar a cabo la transducción. Una vez completado el condicionamiento del medio, este medio condicionado se congeló a -20ºC hasta su utilización.

El medio de crecimiento se utilizó como el medio de control que no puede inducir la formación de condrocitos en la capa de cambium de un colgajo perióstico.

Se colocaron dos muestras de un colgajo perióstico, de ½ x ½ cm de tamaño obtenidas de la parte media de la tibia de un cerdo, en dos placas de cultivo tisular. El medio condicionado se descongeló, se centrífugo a 3000 rpm durante 20 minutos y se filtró de manera estéril a través de un filtro de 0,8 my y posteriormente se aplicó a una de las muestras de periostio. Se incubó a 37ºC en un incubador de CO_{2} durante un periodo de 4 semanas.

Un colgajo perióstico, de ½ x ½ cm de tamaño obtenido de la parte media de la tibia del mismo animal se utilizó para el experimento control. Estas muestras se incubaron a 37ºC en un incubador de CO_{2} durante un periodo de 4 semanas.

Las dos muestras de colgajo perióstico se fijaron mediante la técnica de fijado convencional en formaldehído y se tiñeron con diversas tinciones habituales incluyendo safranina, y se sometieron a examen al microscopio.

Ejemplo 5 Diferenciación de células precursoras y/o madre

En primer lugar, el aspirado de hueso esponjoso de fémur que contiene tanto células precursoras hematopoyéticas como células precursoras y/o madre del estroma de la médula ósea se colocaron en botellas de tejido de cultivo celular con diluciones aproximadas. Se estimularon células de la médula individuales y formadoras de colonias durante 24 horas (incubación primaria) con medio de crecimiento. Tras la primera incubación, las células no adherentes, tales como las células hematopoyéticas así como las no hematopoyéticas se retiraron suavemente sustituyendo el sobrenadante por nuevo medio. Las células adherentes se estimularon adicionalmente 1 semana con el medio de crecimiento anterior que indujo varias unidades formadoras de colonias, con tamaños del número celular que oscilan en el orden de 10 - 20.000 células/clon y con fenotipo fibroblástico (UFC-f).

Tras la proliferación de estas células en el medio de crecimiento durante otra semana o más (dependiendo del material del donante) algunos cultivos celulares se transfirieron a los medios de selección, que son más específicos para la selección que para el crecimiento. Podría ser cierto lote de suero bovino fetal a una concentración más elevada que la utilizada convencionalmente (más del 10%), hasta el 30% v/v, que se ha probado para determinar su capacidad para diferenciar células en condroblastos / condrocitos, o se ha probado para determinar su capacidad para diferenciar células en osteoblastos / osteocitos. Se han identificado internamente dichos lotes de suero bovino fetal que muestran estos patrones de selección. Hasta que tenga que probarse adicionalmente un nuevo lote o nuevos lotes de suero bovino fetal para la diferenciación de las células. Las células se identifican por PCR cuantitativa del ARNm (Lane Smith, R., et al., J. Rehab. Research and Development, marzo / abril de 2000, vol. 37), y en el caso de las líneas de condrocitos, las células se prueban utilizando anticuerpos monoclonales tales como el anticuerpo monoclonal de ratón Ac-1 contra el colágeno de tipo II (Clon 5B2.5) (Lab. Vision Corp, Fremont, California) para la diferenciación adicional y la "maduración celular" (2 - 4 semanas en el medio de selección).

Adicionalmente, se demostró que las células de hueso desarrolladas producen matriz mineralizada, condroblastos / condrocitos para formar lagunas características en las que la matriz se tiñó metacromática con colorante tal como safranina-O.

Claims

1. Membrana de cartílago que tiene al menos una parte de superficie que lleva una composición que comprende al menos una molécula de estimulación, que induce una transducción de señales en los condroblastos / condrocitos y que se selecciona del grupo que consiste en proteínas de colágeno, tales como el colágeno de los tipos II, VI, IX y XI, proteoglucanos tales como agregados de proteoglucanos (aggregans), decorina, fibromodulina y biglucano y proteínas no colagenosas tales como crioprecipitado, fibronectina, vitronectina, fibrinógeno, fibrillina, kistrina, equistatina, factor de von Willebrand, tenascina y ancorina CII.

2. Membrana de cartílago según la reivindicación 1, que es una membrana biodegradable, no tóxica y no inmunogénica.

3. Membrana de cartílago según las reivindicaciones 1 ó 2, en la que el material de membrana es poroso o sustancialmente poroso.

4. Membrana de cartílago según la reivindicación 3, en la que la membrana es una membrana de colágeno de tipo I natural o sintético o parte de la misma.

5. Membrana de interfase con una primera parte de superficie y una segunda parte de superficie, que llevan ambas una composición que comprende al menos una molécula de estimulación, que induce una transducción de señales en los condroblastos / condrocitos y en osteoblastos / osteocitos y que se selecciona del grupo que consiste en proteínas de colágeno, tales como el colágeno de los tipos II, VI, IX y XI, proteoglucanos tales como agregados de proteoglucanos (aggregans), decorina, fibromodulina y biglucano y proteínas no colagenosas tales como crioprecipitado, fibronectina, vitronectina, fibrinógeno, fibrillina, kistrina, equistatina, factor de von Willebrand, tenascina y ancorina CII.

6. Membrana de interfase según la reivindicación 5, que es una membrana biodegradable, no tóxica y no inmunogénica.

7. Membrana de interfase según las reivindicaciones 5 ó 6, en la que el material de membrana es poroso o sustancialmente poroso.

8. Membrana de interfase según la reivindicación 7, en la que la membrana es una membrana de colágeno de tipo I natural o sintético o parte de la misma.

9. Membrana según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8, en la que la molécula de estimulación comprende al menos un motivo RGD.

10. Membrana según la reivindicación 9, en la que la molécula de estimulación es una proteína o péptido naturales o sintéticos, o una fusión o una mezcla de los mismos.

11. Membrana según la reivindicación 10, en la que la molécula de estimulación se selecciona del grupo que consiste en colágeno de tipo II y fibronectina.

12. Membrana según la reivindicación 11, en la que la molécula de estimulación está unida a un soporte.

13. Kit para reparar cartílago, que comprende al menos una membrana de cartílago según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4 y al menos una molécula de estimulación según cualquiera de las reivindicaciones 1, 9 - 12.

14. Kit según la reivindicación 13, que comprende al menos una membrana de interfase según las reivindicaciones 5 - 8.

15. Uso de al menos una membrana según las reivindicaciones 1 - 12, para la preparación de un kit según las reivindicaciones 13 ó 14, para el tratamiento de un mamífero que tiene defectos de cartílago o defectos de cartílago y hueso.