CN105363073B - 含生物活性因子的组织工程软骨支架及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明是提供一种含生物活性因子的组织工程软骨支架及其制备方法和应用，制备方法，包括以下步骤：(1)将I型胶原溶液以体积比1∶2比例平铺在丝素蛋白支架上，真空冷冻干燥，得到丝素蛋白胶原双层支架；(2)将得到的丝素蛋白胶原双层支架浸泡于20～200μg/mL甲状旁腺激素相关肽溶液中，于30～40℃孵育0.5～2小时。本发明所述的一种含生物活性因子的组织工程软骨支架，丝素蛋白胶原双层支架可以有效的缓释甲状旁腺激素相关肽，能够抑制骨软骨损伤修复过程中的软骨钙化现象，从而提高软骨修复质量。

Description

含生物活性因子的组织工程软骨支架及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物材料制备领域，特别涉及一种含生物活性因子的组织工程软骨支架的制备方法与应用。

背景技术

关节软骨能减少相邻两骨间的摩擦，缓冲运动时产生的震动，所以由体育运动造成的软骨损伤极为普遍。有数据表明，单美国的软骨相关手术每年就有超过40万例。由于软骨无血管、无神经，传统观点认为软骨损伤无法自发修复，如果不采取外加手段干预治疗，会导致进一步的软骨磨损，甚至引发骨关节炎，对其结构和功能造成不可逆的损害，严重影响患者的生活工作质量。目前临床治疗表层软骨损伤的保守治疗方法包括关节腔灌洗清创术，微骨折术等只能减轻关节疼痛和暂时缓解临床症状，并不能有效地促进软骨组织的修复再生，阻止病程的发展。因此，寻找新型的、可有效促进软骨生理性再生修复的方法具有极其重要的临床意义。

近年来，随着组织工程和再生医学技术的不断成熟，为提高软骨的修复质量带来崭新的机会。天然生物材料Ⅰ型胶原，由于其免疫原性低，生物相容性好，降解速率可控等优点，被广泛用于软骨组织工程支架的制备。

甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)是甲状腺激素家族中的一员，作为钙化抑制因子参与生长板发育过程。甲状旁腺激素相关肽由173个氨基酸组成，其活性片段1-34与甲状旁腺激素(PTH)一致。

现有技术中组织工程软骨支架的在软骨修复过程中会出现软骨钙化的缺点，骨软骨损伤的修复效果较差。

发明内容

本发明是提供一种含生物活性因子的组织工程软骨支架的制备方法，即复合活性因子甲状旁腺激素相关肽的丝素蛋白胶原双层支架，其可以解决现有技术中的软骨修复过程中会出现软骨钙化的缺点，有效提高骨软骨损伤的修复效果。

本发明采用的技术方案是：

一种含生物活性因子的组织工程软骨支架的制备方法，

包括以下步骤：

(1)将Ⅰ型胶原溶液以体积比1:2比例平铺在丝素蛋白支架上，真空冷冻干燥，得到丝素蛋白胶原双层支架；

(2)将得到的丝素蛋白胶原双层支架浸泡于20～200μg/mL甲状旁腺激素相关肽溶液中，于30～40℃孵育0.5～2小时。

一种含生物活性因子的组织工程软骨支架，其通过上述制备方法制备得到。

一种含生物活性因子的组织工程软骨支架在制备骨软骨损伤修复物中的应用。

步骤(1)中Ⅰ型胶原溶液的浓度为5～30mg/mL。

步骤(2)中丝素蛋白胶原双层支架在甲状旁腺激素相关肽溶液中孵育的温度30～40℃，且孵育的时间为0.5～2小时。

所述步骤(1)中支架冷冻干燥的条件为-40～-110℃条件下真空冷冻干燥5～10天。

所述丝素蛋白胶原双层支架制备方法如下：

(1.1)以桑蚕蚕丝为原料，经脱胶、溶解、透析，获得丝素蛋白溶液；

(1.2)将无水羟基磷灰石与无水氯化钠颗粒1～5:1混合，以1:1～10比例加入步骤(1.1)得到的5～30％的丝素蛋白溶液；

(1.3)支架交联：0～4℃交联30～40小时,20～30℃交联3～8小时，30～40℃交联0.5～1小时，60～70℃交联1～2小时；

(1.4)将步骤(1.3)交联后的丝素蛋白支架置于灭菌单蒸水中洗去氯化钠。

所述步骤(1.2)中无水羟基磷灰石直径为20～40nm。

所述步骤(1.2)中无水羟基磷灰石与无水氯化钠颗粒的混合比例为1～5:1。

所述步骤(1.2)中无水羟基磷灰石与无水氯化钠颗粒混合物与丝素蛋白溶液比例为1:1～10。

步骤(1.1)所述丝素蛋白溶液的制备方法为：A)脱胶：将100g桑蚕蚕丝放入4～8L的2M碳酸钠水溶液中，90～100℃水浴20～60分钟，纯水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，将丝素蛋白在20～60℃烘干，获得干燥后的丝素蛋白；B)溶解：将上述干燥后的丝素蛋白溶于9～11M的溴化锂水溶液中，55～65℃水浴30～300分钟至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白的混合液；所述干燥后的丝素蛋白与溴化锂水溶液的质量体积比为0.1～0.2:1；C)透析：将含丝素蛋白的混合液用截留分子量1000～20000道尔顿的透析袋进行透析，用10倍混合液体积的无菌去离子水作为透析液在3天透析10～12次，去除溶液中的溴化锂成分，获得所述丝素蛋白溶液。

进一步，步骤(1.4)中所述灭菌单蒸水与丝素蛋白支架的体积比是1：100～200。

进一步，步骤(1.4)中所述洗去氯化钠的方法为清洗1天，换液5～10次。

进一步，所述Ⅰ型胶原溶液的制备方法为：A)从二月龄健康白猪猪腿处剥取肌腱，去除筋膜和脂肪，剪碎浸泡于体积浓度75％的乙醇水溶液中，4℃过夜；B)将步骤A的肌腱碎片用蒸馏水冲洗5遍，加入0.5mol/L的乙酸水溶液中，调节pH至1，加入胃蛋白酶，4℃放置3天，获得胶原溶胶液；所述乙酸水溶液的体积用量以肌腱碎片质量计为18.9mL/g，所述胃蛋白酶质量用量以肌腱碎片质量计为94.7mg/g；C)将步骤B获得的胶原溶胶液于4℃、4000rpm水平离心25分钟，弃上层脂肪层，将沉淀a用0.5mol/L乙酸水溶液稀释3倍体积，在超净台中用4层纱布过滤，将滤液与0.9mol/L的NaCl水溶液以体积比1：10混合，间歇震荡，4℃过夜，再在4℃、4000rpm水平离心25分钟，弃上清液及悬浮物，获得沉淀b；D)将沉淀b按下述方式之一处理，制备水溶性Ⅰ型胶原：a)将沉淀b用0.5mol/L的乙酸水溶液在4℃溶解过夜，所述乙酸水溶液与沉淀b的体积比为4：1，获得所述水溶性Ⅰ型胶原；b)将沉淀b置于直径0.25μm的再生纤维素透析袋中，以三蒸水作为透析液，每天换水4～6次，透析3天，将透析袋中透析后的沉淀置于培养皿中-80℃过夜，再于冻干机中抽干2～3天，获得所述水溶性Ⅰ型胶原。(E)用1M碳酸氢钠溶液以体积比1～4：1的比例对步骤(5)得到的5～30mg/mL的Ⅰ型胶原溶液进行中和。

步骤(2)所述甲状旁腺激素相关肽溶液选用商品化的人重组蛋白甲状旁腺激素相关肽粉末配制。

步骤(2)所述甲状旁腺激素相关肽溶液由灭菌PBS缓冲液(pH＝7.4)配制成的水溶液。

步骤(2)所述甲状旁腺激素相关肽溶液的体积用量是丝素蛋白胶原双层支架体积的10～20倍。

本发明所述的软骨支架，上层为Ⅰ型胶原层，能够诱导细胞迁移粘附，适用于骨软骨损伤中透明软骨的修复；下层为丝素蛋白-羟基磷灰石层，有利于新骨形成，适用于骨软骨损伤中软骨下骨的修复。

本发明所述的一种含生物活性因子的组织工程软骨支架，制备工艺中不接触有毒物质，未使用变性剂、促凝剂和交联剂等添加剂。

本发明所述的一种含生物活性因子的组织工程软骨支架，在丝素蛋白胶原双层支架制备完成后与甲状旁腺激素相关肽溶液复合，避免预先复合甲状旁腺激素相关肽溶液在支架冻干、灭菌时造成的活性因子失活，最大程度保证了甲状旁腺激素相关肽溶液的生物活性。

本发明所述的一种含生物活性因子的组织工程软骨支架，丝素蛋白胶原双层支架可以有效的缓释甲状旁腺激素相关肽，能够抑制骨软骨损伤修复过程中的软骨钙化现象，从而提高软骨修复质量。

附图说明

图1实施例1中一种含生物活性因子的组织工程软骨支架的图片。

图2实施例2中新西兰大白兔软骨损伤造模照片。图2A为新西兰大白兔造模为4mm×3.5mm的骨软骨缺损，图2B为缺损处植入4mm×3mm大小的组织工程软骨支架。

图3实施例2中新西兰大白兔骨软骨损伤修复16周后的大体结果。图3A为修复16周组织工程软骨支架组大体图片，图3B为修复16周空白对照组大体图片。

图4实施例2中新西兰大白兔骨软骨损伤修复16周后的组织学结果。图4A为4倍镜下组织工程软骨支架组SO染色图片，图4B为4倍镜下空白对照组SO染色图片。

图5为本发明的丝素蛋白胶原双层支架分析图谱。图5A为X衍射(XRD)图谱，图5B为傅里叶变换红外光谱(FTIR)图。

具体实施方式：

下面结合具体实施方式，详细描述本发明。应理解，这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：

(1)丝素蛋白溶液的制备：a)脱胶：将100g桑蚕蚕丝(5A级)放入5L的2M碳酸钠水溶液中，98℃水浴30分钟，纯水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，将丝素蛋白在50℃烘干，获得70g干燥后的丝素蛋白，备用；b)溶解：将上述干燥后的丝素蛋白以质量浓度16％溶于9.3M的溴化锂水溶液中，60℃水浴90分钟至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白和少量不溶性颗粒组成的混合液；c)透析：将混合液用再生纤维素透析袋(截留分子量4000道尔顿)透析，用10倍混合液体积的无菌纯水在3天透析12次，去除溶液中的溴化锂离子，获得截留液a；d)浓缩：将透析后的透析袋放入5倍体积的质量浓度50％聚乙二醇(PEG，分子量7000)水溶液，室温静置浓缩8小时，取截留液b，即获得截留液a的浓缩液；e)将截留液b在水平转子5000g，4℃，离心10min，除去底部的未溶解丝素蛋白和溴化锂中可能存在不溶性颗粒，取上清液，即获得提纯后的丝素蛋白溶液300ml，4℃保存备用。

(2)丝素蛋白-羟基磷灰石支架制备：a)取10g直径为20nm的无水羟基磷灰石与10g无水氯化钠颗粒混合，加入100ml步骤(1)得到的16％的丝素蛋白溶液，混匀；b)支架交联：将混合溶液置于4℃冰箱交联30小时,室温25℃交联5小时，37℃烘箱交联1小时，60℃烘箱交联1小时；c)将步骤(3)交联后的支架置于灭菌单蒸水中洗去氯化钠，得到丝素蛋白-羟基磷灰石多孔支架。

(3)Ⅰ型胶原溶液的制备：从二月龄健康白猪猪腿处剥取肌腱，去除筋膜和脂肪，剪碎120g，浸泡于500mL体积浓度75％的乙醇水溶液中，4℃过夜；B)将步骤A的肌腱碎片95g用蒸馏水冲洗5遍，加入0.5mol/L的乙酸水溶液1800mL中，用6M氢氧化钠水溶液调节pH至1，加入胃蛋白酶(Sigma-ALDRICH)9g，4℃放置3天，获得胶原溶胶液1800mL；C)将步骤B获得的胶原溶胶液于4℃、4000rpm水平离心25分钟，弃上层脂肪层，将沉淀a用0.5mol/L乙酸水溶液稀释3倍体积，在超净台中用4层纱布过滤，将滤液与0.9mol/L的氯化钠水溶液以体积比1：10混合，间歇震荡，4℃过夜，再在4℃、4000rpm水平离心25分钟，弃上清液及悬浮物，获得沉淀b；D)将沉淀b按下述方式之一处理，制备水溶性Ⅰ型胶原：a)将沉淀b用0.5mol/L的乙酸水溶液在4℃溶解过夜，所述乙酸水溶液与沉淀b的体积比为4：1，获得所述水溶性Ⅰ型胶原；b)将沉淀b置于直径0.25μm的再生纤维素透析袋中，以三蒸水作为透析液，每天换水4～6次，透析3天，将透析袋中透析后的沉淀置于培养皿中-80℃过夜，再于冻干机中抽干2～3天，获得所述水溶性Ⅰ型胶原62g。

(4)丝素蛋白胶原双层支架的制备：将(3)方法提取的水溶性Ⅰ型胶原溶于去离子水中配制成浓度为10mg/mL胶原水溶液20mL，加入80mL浓度为1M的碳酸氢钠溶液进行中和。取出50mL中和后的Ⅰ型胶原溶液，平铺在步骤(2)获得的丝素蛋白支架上，置于真空干燥箱-80℃真空冷冻干燥7天，得到丝素蛋白胶原双层支架，如图5所示。

(5)一种含生物活性因子的组织工程软骨支架的制备：将(4)方法制备的丝素蛋白胶原双层支架裁剪成直径4mm、深度3.5mm的圆柱形。将10个上述支架置于直径10cm的细胞培养皿中，加入5mL由PBS(pH＝7.4)配制的浓度为100μg/mL的甲状旁腺激素相关肽(Bachem)溶液，置于细胞培养箱中于37℃浸泡1h，得到复合甲状旁腺激素相关肽的丝素蛋白胶原双层支架，即一种含生物活性因子的组织工程软骨支架，丝素蛋白胶原双层支架具有多孔海绵结构，可以大量吸收甲状旁腺激素相关肽溶液，植入软骨缺损处后，原位缓释甲状旁腺激素相关肽溶液，进行软骨缺损治疗，如图1所示。

实施例2：

(1)骨软骨损伤造模：取体重2.5～3kg成年雄性新西兰大白兔，术前10％水合氯醛(剂量4mL/kg)耳缘静脉注射和腹腔注射各半总量的方式给药麻醉。膝关节周围5cm范围剪毛，将兔仰卧在手术手术台上，四肢固定，碘伏消毒，铺无菌洞巾。取膝关节内侧切口，切开皮肤、皮下筋膜，经髌骨内侧缘切开兔膝关节，向外侧牵开髌腱和股四头肌肌腱，显露膝关节，在膝关节股骨滑车处，用骨科钻制造一个直径4mm、深度3.5mm的圆柱形骨软骨缺损，如图2所示。

(2)应用组织工程软骨支架：将实施例1中的一种含生物活性因子的组织工程软骨支架植入(1)中所造骨软骨损伤处，支架表面略低于缺损边缘。将脱位的髌骨从支架上方小心归位，避免接触支架使其移动。严密缝合膝关节囊和肌肉筋膜组织，缝合皮肤切口。切口碘伏消毒，肌肉注射青霉素钠40万单位后，放回兔笼。术后抗生素护理，肌注青霉素40万单位，每天一次，连续3天。标准动物饲料喂养，如图3所示。

(3)修复效果评估：术后16周，使用耳缘静脉空气针将兔处死。取材包括股骨下端在内的关节面。大体观察发现组织工程软骨支架组软骨损伤处有大量白色透明新生软骨形成，与周围组织连接平滑，而空白对照组修复不佳，仍可见明显的缺损。组织学切片结果显示组织工程软骨支架组生成填充完全的、SO着色深、与周边组织连接紧密的透明软骨样组织，且软骨下骨也得到了良好的重建。而空白对照组新生组织SO着色很淡，软骨面凹陷不规则，基本为纤维组织，如图4所示。

实施例3

一种含生物活性因子的组织工程软骨支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)将浓度为5mg/mL的Ⅰ型胶原溶液以体积比1:2比例平铺在丝素蛋白支架上，真空冷冻干燥，冷冻干燥的条件为-40～℃条件下真空冷冻干燥10天，得到丝素蛋白胶原双层支架；

(2)将得到的丝素蛋白胶原双层支架浸泡于20μg/mL甲状旁腺激素相关肽溶液中孵育，孵育的温度30℃，且孵育的时间为2小时，于30℃孵育2小时。

所述丝素蛋白胶原双层支架制备方法如下：

(1.1)以桑蚕蚕丝为原料，经脱胶、溶解、透析，获得丝素蛋白溶液；

(1.2)将无水羟基磷灰石与无水氯化钠颗粒1:1混合，以1～10比例加入步骤(1.1)得到的5％的丝素蛋白溶液，无水羟基磷灰石直径为20nm，无水羟基磷灰石与无水氯化钠颗粒的混合比例为1:1，无水羟基磷灰石与无水氯化钠颗粒混合物与丝素蛋白溶液比例为1：10；

(1.3)支架交联：0～4℃交联30～40小时,20～30℃交联3～8小时，30～40℃交联0.5～1小时，60～70℃交联1～2小时；

(1.4)将步骤(1.3)交联后的丝素蛋白支架置于灭菌单蒸水中洗去氯化钠。

实施例4

一种含生物活性因子的组织工程软骨支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)将Ⅰ型浓度为30mg/mL胶原溶液以体积比1:2比例平铺在丝素蛋白支架上，真空冷冻干燥，得到丝素蛋白胶原双层支架，冷冻干燥的条件为110℃条件下真空冷冻干燥5天；

(2)将得到的丝素蛋白胶原双层支架浸泡于200μg/mL甲状旁腺激素相关肽溶液中，于40℃孵育0.5小时。

所述丝素蛋白胶原双层支架制备方法如下：

(1.1)以桑蚕蚕丝为原料，经脱胶、溶解、透析，获得丝素蛋白溶液；

(1.2)将无水羟基磷灰石与无水氯化钠颗粒5:1混合，以1:1比例加入步骤(1.1)得到的30％的丝素蛋白溶液，无水羟基磷灰石直径为40nm，无水羟基磷灰石与无水氯化钠颗粒的混合比例为5:1，无水羟基磷灰石与无水氯化钠颗粒混合物与丝素蛋白溶液比例为1:1；

(1.3)支架交联：0～4℃交联30～40小时,20～30℃交联3～8小时，30～40℃交联0.5～1小时，60～70℃交联1～2小时；

(1.4)将步骤(1.3)交联后的丝素蛋白支架置于灭菌单蒸水中洗去氯化钠。

Claims (5)

1.一种含生物活性因子的组织工程软骨支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将浓度为5～30mg/mL的I型胶原溶液以体积比1∶2比例平铺在丝素蛋白支架上，真空冷冻干燥，得到丝素蛋白胶原双层支架；

(2)将得到的丝素蛋白胶原双层支架浸泡于20～200μg/mL甲状旁腺激素相关肽溶液中，于30～40℃孵育0.5～2小时；

所述丝素蛋白胶原双层支架制备方法如下：

(1.1)以桑蚕蚕丝为原料，经脱胶、溶解、透析，获得丝素蛋白溶液；

(1.2)将无水羟基磷灰石与无水氯化钠颗粒1～5∶1混合，以1∶1～10比例加入步骤(1.1)得到的5～30％的丝素蛋白溶液；

(1.3)支架交联：0～4℃交联30～40小时，20～30℃交联3～8小时，30～40℃交联0.5～1小时，60～70℃交联1～2小时；

(1.4)将步骤(1.3)交联后的丝素蛋白支架置于灭菌单蒸水中洗去氯化钠。

2.根据权利要求1所述的一种含生物活性因子的组织工程软骨支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中支架冷冻干燥的条件为-40～-110℃条件下真空冷冻干燥5～10天。

3.根据权利要求1所述的含生物活性因子的组织工程软骨支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(1.2)中无水羟基磷灰石直径为20～40nm。

4.一种含生物活性因子的组织工程软骨支架，其特征在于，通过如权利要求1至3中任意一项所述的含生物活性因子的组织工程软骨支架的制备方法制备得到。

5.一种如权利要求4所述的含生物活性因子的组织工程软骨支架在制备骨软骨损伤修复物中的应用。