JP2002525043A - 改良粘膜下組織グラフト構成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 温血脊椎動物の粘膜下組織とあらかじめ選択した真核細胞群とを含んでなる改良組織グラフト構成物が記載されている。本発明により、改良組織グラフト構成物を用いて損傷または病気の組織をin vivo修復することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 ＜発明の分野＞ 本発明は腸組織由来組織グラフト、および損傷または病気の組織の修復におけ
るそれらの使用に関するものである。より詳細に述べるならば、本発明は、あら
かじめ選択した細胞集団を植え付けて上記組織グラフト構成物の修復能力を高め
た腸粘膜下組織グラフトに関する。

【０００２】 ＜発明の背景および概要＞ 本発明は、損傷または病気の組織の修復のために使用する組織グラフト構成物
としての、あらかじめ選択した細胞集団と組み合わせた脊椎動物の粘膜下組織由
来膠原性基質に向けられている。本発明に基づいて使用するための膠原性基質は
、高度に保存されたコラーゲン、糖タンパク質、プロテオグリカン、およびグリ
コサミノグリカンをそれらの天然構造のまま天然濃度で含む。本発明に使用する
細胞外膠原性基質は温血脊椎動物の粘膜下組織から誘導される。

【０００３】 本発明によると、上記粘膜下組織は、温血脊椎動物の消化器、呼吸器、腸、泌
尿器または生殖器を含む温血脊椎動物組織から分離される。腸粘膜下組織の調製
は米国特許第4,902,508号に記載されクレームされている。その開示は、本明細書
に明確に引用により援用される。膀胱粘膜下組織およびその調製は米国特許第5,
554,389号に記載されており、その開示は本願に明確に援用される。胃粘膜下組
織も同様な組織処理法によって得られ、特徴づけられる。このような記載は１９
９６年１２月１０月に出願された胃粘膜下組織由来組織グラフトと題する米国特
許出願第 60/032,683号にある。つまり、胃粘膜下組織は腸粘膜下組織の調製法に
類似の方法で胃切片から調製される。胃粘膜下組織の切片をまず最初に縦方向の
ワイピング運動を利用した擦りむきによって外側層（特に平滑筋層）と粘膜層の
管腔部分とを除去する。得られた粘膜下組織は厚さ約１００ないし約２００マイ
クロメーターで、主として（９８％より多い）無細胞の、好酸性染色性（Ｈ＆Ｅ
染色）細胞外基質物質からなる。

【０００４】 本発明により利用するための好ましい粘膜下組織は、腸粘膜下組織、胃粘膜下
組織、膀胱粘膜下組織、および子宮粘膜下組織である。腸粘膜下組織は好ましい
材料の一つであり、特に温血脊椎動物の腸の筋層および少なくとも粘膜層の両方
から離層した腸粘膜下組織がより好ましい。

【０００５】 組織グラフトとして、粘膜下組織はリモデリングされ、ホストに移植した際に
内因性組織の増殖を誘発する。それは血管グラフト、膀胱およびヘルニアの修復
、腱および靭帯の置換および修復、および皮膚移植にうまく用いられてきた。組
織グラフト組成物としての粘膜下組織の調製および使用は米国特許第4,902,508
号、第5,281,422号、第5,275,826号、およびその他の関連米国特許に記載されて
いる。このような用途に用いる際には、グラフト構成物は上記グラフト構成物に
よって置換された組織の再増殖のための基質として役立つだけでなく、内因性組
織のこの種の再増殖も促進し、誘発する。このリモデリングプロセスにおける一
般的事象としては、広範かつ非常に速やかな血管新生、肉芽間葉細胞の増殖、移
植腸粘膜下組織材料の生体内分解／吸収、および免疫拒絶の欠如がある。内因性
組織の形成を誘発するためにシート状および流動状の粘膜下組織を使用すること
が米国特許第5,281,422号および第5,275,826号に記載され、クレームされている
。これらの開示は本明細書に明確に引用により援用される。

【０００６】 粘膜下組織は、例えばブタ、ウシおよびヒツジまたはその他の温血脊椎動物等
の食肉生産のために飼育される動物から採取される腸組織を含む種々のソースか
ら得られる。この組織はその天然の形のままでも、または粉砕され、一部消化さ
れた流動状でも用いられる。脊椎動物の粘膜下組織は市場における食肉生産処理
の豊富な副産物であり、そのため、特に粘膜下組織をその天然の層状構造で用い
る際には、低コストの細胞増殖基質となる。

【０００７】 本発明により調製された粘膜下組織グラフト構成物は、in vivo で見いだされ
る基質環境に近い優れた細胞増殖基質を与える実質的には無細胞の基質である。
粘膜下組織の天然組成および構造は、細胞の付着および増殖を促進する独特な細
胞増殖基質を与える。

【０００８】 温血脊椎動物の腸の粘膜下組織を含んでなる組成物をシート形または流動形で
組織グラフト基質として使用できることは報告されている。米国特許第4,902,50
8号は、高適合性、高破裂圧点、および効果的な孔隙率を含む優れた機械的特性
によって特徴づけられる組織グラフト組成物を記載している。これらの特性のた
めに、このような組成物は血管および結合組織グラフト構成物として使用できる
。このような用途に用いる際に、好ましいグラフト構成物は、上記グラフト構成
物によって置換された組織の in vivo 再増殖のための基質としてはたらく。米
国特許第 5,275,826号は流動化脊椎動物粘膜下組織を注入可能または移植可能の
組織グラフトとして利用することを記載している。 本発明は粘膜下組織グラフト構成物に関し、また、移植可能または注入可能組
織グラフト構成物としての脊椎動物粘膜下組織の機能的特性を高めまたは拡大す
る方法に関する。本発明の改善組織グラフト構成物は、このグラフト構成物をホ
ストに移植または注入する前に、あらかじめ選択された、または予め指定された
細胞型を in vitro で上記粘膜下組織に植え付けることによって調製される。

【０００９】 ＜好ましい実施態様の詳細な説明＞ 本発明は外側平滑筋層および粘膜層の管腔部分の両方から離層された脊椎動物
粘膜下組織を含んでなる改良組織グラフト構成物に向けられている。この改良は
、あらかじめ選択した細胞集団を実質的に無細胞の粘膜下組織基質に添加するこ
とを含む。粘膜下組織と組み合わせる細胞は、修復すべき組織の細胞型に基づい
て選択される。一実施態様において、あらかじめ選択した細胞は上皮、内皮また
は軟骨組織から分離した一次細胞を含んでなる。

【００１０】 身体には、再生の可能性が証明されていない複雑な分化構造の組み合わせを含
む領域が幾つかある。これらの領域は一般的には治癒が非常に困難で、これら構
造のダメージは重大な疾病を起こし、死を招くこともよくある。このような領域
の例として、他のもののほかに、食道、中枢神経系、皮膚およびその付属器が挙
げられる。

【００１１】 あらかじめ選択した細胞集団と粘膜下組織基質との組み合わせは、改良組織グ
ラフト構成物を与える。それはどちらか一つの成分を治療剤として用いた場合と
比較して、驚くべく改良された創傷治癒力およびより良い組織機能の回復を示す
。さらに、添加細胞を植え付けた粘膜下組織を含んでなる組成物を、上記構成物
を侵された領域に移植する前に培養することができる。腸粘膜下組織は、普通は
in vitro 培養が難しい一次細胞をも含む種々様々の細胞の増殖および発育を補
助することができる。粘膜下組織はこのような細胞増殖補助能力を有するため、
ホストに移植する前に細胞集団が増殖する機会が与えられる。一実施態様におい
て、治療すべき患者から分離した自己細胞が粘膜下組織に植え付けられる。

【００１２】 本発明により、 in vitro 培養された真核細胞の増殖を補助し、組織の分化を
誘発する方法および組成物が提供される。概してこの方法は in vitro にて、真
核細胞と脊椎動物粘膜下組織由来膠原性基質とを、真核細胞の増殖を誘発する条
件のもとで接触させることを含んでなる。細胞培養に関して本明細書で用いられ
る用語“接触する”とは、粘膜下組織と培養細胞との直接的および間接的接触、
例えば液体連通等、を含むものとする。ここに用いる用語“真核細胞増殖を誘発
する条件”とは、現在使用できる細胞培養法のなかで真核細胞増殖のために最適
と考えられる、滅菌技術、温度および栄養供給等の環境条件を指す。真核細胞培
養に用いられる最適細胞培養条件は、或る程度は特定の細胞種に依存するとはい
え、一般的には細胞増殖条件は技術的によく知られている。しかし、多くの種類
の分化細胞はまだ培養困難と考えられている（すなわちランゲルハンス島、肝細
胞、軟骨細胞、骨芽細胞等）。

【００１３】 本細胞培養基質の膠原性基質の成分は脊椎動物粘膜下組織から誘導され、自然
に結合した細胞外基質タンパク質、糖タンパク質およびその他の因子を含んでな
る。膠原性基質は温血脊椎動物の腸粘膜下組織を備えるのが好ましい。温血脊椎
動物の小腸は、本発明に使用する細胞培養基質の特に好ましいソースである。

【００１４】 適切な腸粘膜下組織は、一般的には、筋層および粘膜の少なくとも管腔部分か
ら離層された粘膜下層を含んでなる。本発明の好適一実施態様において、腸粘膜
下組織は、粘膜下層と、粘膜筋板および緻密層を含む粘膜の基底部とを含んでな
り、これらの層は厚さおよび精細度が脊椎動物種によって変わることが知られて
いる。

【００１５】 本発明にて使用する粘膜下組織の製法は、米国特許第 4,902,508号に記載され
ている。この開示は、本明細書に明確に引用により援用される。好ましくはブタ
、ヒツジまたはウシの種類から採取した、ただしその他の種類を排除するもので
はない、脊椎動物腸の切片を、長手方向のワイピング運動を用いて擦りむき、平
滑筋組織からなる外側層、および最も内側の層、すなわち粘膜の管腔部分を取り
除く。粘膜下組織を生理食塩液ですすぎ、任意に滅菌する。それは水和状態また
は脱水状態で保存することができる。凍結乾燥または空気乾燥した粘膜下組織は
再水和され、その細胞増殖活性を著しく損失することなく本発明によって使用で
きる。

【００１６】 本発明の粘膜下組織成分は、あらかじめ選択した細胞を付加する前に、グルタ
ルアルデヒドなめし、酸性ｐＨにおけるホルムアルデヒドなめし、プロピレンオ
キシド処理、ガスプラズマ滅菌法、ガンマ照射、電子ビーム、過酢酸滅菌等、従
来の滅菌技術を用いて滅菌できる。粘膜下組織の機械的強度、構造およびバイオ
トロピック特性に悪影響を与えない滅菌技術が好ましい。例えば、強いガンマ照
射は粘膜下組織シートの強度低下をおこすかも知れない。好ましい滅菌技術は、
グラフトを、過酢酸、１〜４Ｍｒａｄｓガンマ照射（１〜２.５Ｍｒａｄｓのガ
ンマ照射がより好ましい）またはガスプラズマ滅菌にかけること等がある。過酢
酸滅菌が最も好ましい滅菌法である。一般的には、粘膜下組織を２種類以上の滅
菌法で滅菌する。粘膜下組織を、例えば化学的処理によって滅菌した後、上記組
織をプラスチックまたはホイルラップに包み、再び電子ビームまたはガンマ照射
滅菌技術を用いて滅菌することができる。

【００１７】 本発明により使用するために指定される粘膜下組織は流動形でもよい。粘膜下
組織は組織を粉砕し、任意にそれをプロテアーゼ消化することによって流動化し
、均質溶液を生成することができる。流動化粘膜下組織の製法は米国特許第 5,2
75,826号に記載されている。その開示は本明細書に明確に引用により援用される
。流動化粘膜下組織は、採取した粘膜下組織をちぎったり、切ったり、すりつぶ
したり、または剪断することにより粘膜下組織を粉砕して調製される。したがっ
て、粘膜下組織片を高速ブレンダーで剪断するとか、凍結または凍結乾燥状態の
粘膜下組織をすりつぶすことによって粘膜下組織の粉末を生成することができる
。その後これに水または緩衝生理食塩液を加えて液体、ゲル、またはペースト様
粘稠度の粘膜下組織液にすることができる。流動化粘膜下組織組成物をさらに酸
性ｐＨで、トリプシンまたはペプシン等のプロテアーゼで、粘膜下組織成分の全
部または大部分が溶解するのに十分な時間処理し、任意に濾過し、部分的に溶解
した粘膜下組織の均質溶液を生成することができる。

【００１８】 本発明によって使用するための流動化粘膜下組織の粘度は、粘膜下組織成分濃
度および水和度の制御によって調節することができる。その粘度は２５℃で約２
から約３００,０００ｃｐｓまでの範囲に調節できる。ゲル等、より高い粘度の組
成物は、粘膜下組織消化溶液から、この溶液のｐＨを約６.０ないし約７.０に調
節することによって調製される。

【００１９】 本出願人は、粘膜下組織を含んでなる組成物が真核細胞の in vitro における
発育または増殖の補助に役立つことを見いだした。本発明により、粘膜下組織を
、その天然のシート様構造を含む種々の形で、ゲル基質として、技術的に容認さ
れる公知の細胞／組織培養培地への添加物として、または培養器のコーティング
等、種々の形状の細胞培養気質として用いることができ、粘膜下組織基質と接触
する細胞の増殖を支持し、促進する生理学的により適した基質を提供することが
できる。粘膜下組織は、細胞付着のための表面を提供し、細胞の分化も誘発する
。粘膜下組織は細胞培養の用途に利用する前に滅菌することが好ましいが、細胞
培養系に抗生物質が含まれる場合は非滅菌粘膜下組織を用いることができる。

【００２０】 好ましい一実施態様において、細胞を、真核細胞増殖を誘発する条件下で脊椎
動物粘膜下組織のシート上に直接植え付ける。粘膜下組織の多孔性により、細胞
の栄養素は粘膜下組織基質を通過して拡散することができる。したがって、例え
ば、細胞は粘膜下組織の管腔表面または管腔とは反対側の表面のどちらかに培養
できる。管腔表面は臓器ソースの管腔に面する粘膜下組織面であり、一般的には
in vivo で内側粘膜層に隣接し、一方、管腔とは反対側の表面は、臓器の管腔
から離れた側に面する粘膜下組織面で、普通は in vivo で平滑筋組織と接触し
ている。

【００２１】 脊椎動物粘膜下組織の固体シート上で培養される細胞は、粘膜下組織シートの
どちら側でそれら細胞が増殖するかによって、異なる増殖パターン、並びに粘膜
下組織増殖基質との異なる相互作用を示す。本発明による腸粘膜下組織シートに
培養された組織／細胞の組織学的検査から、管腔とは反対側の表面に植え付けら
れた細胞は、粘膜下組織の表面に沿って発育／増殖するだけでなく、より速やか
にその粘膜下組織そのものに侵入し、そのなかで増殖することがわかる。管腔表
面は管腔とは反対側より緻密な基質を含んでなり、したがって細胞は管腔側に侵
入することは難しい。管腔表面に植え付けられた細胞は、その基質に付着するが
、概してその表面を通過しない。しかし或る種類の細胞は管腔とは反対側も管腔
側も、ともに通過することができる（例えば扁平上皮癌細胞および線維芽細胞）
。その上、例えばラット胎児細胞等、或る種の細胞種は、管腔側に植え付けられ
ると増殖して多層細胞を形成する。この多層細胞は、分化して in vivo におけ
る細胞の機能特性をあらわすことができ、上記多層におけるそれらの位置を示唆
する。

【００２２】 本発明の一実施態様において、本発明による細胞増殖基質は、流動形の粘膜下
組織から形成される。流動化粘膜下組織はゲル化して固体または半固体の基質を
形成することができる。真核細胞をその基質の表面に直接植え付け、真核細胞増
殖を誘発する条件下で培養する。

【００２３】 本発明の細胞増殖基質は、ミネラル類、アミノ酸類、糖類、ペプチド類、タン
パク質、または細胞増殖を容易にするラミニンおよびフィブロネクチン等の細胞
増殖を容易化する糖タンパク質、および上皮増殖因子、血小板由来増殖因子、変
換増殖因子ベータ、または線維芽細胞増殖因子等の増殖因子類を含む栄養素類と
組み合わせることができる。好ましい一実施態様において、流動化または粉末状
粘膜下組織を用いて標準真核細胞培養培地を補充し、in vitro で培養した細胞
の増殖を維持し、誘発する上記標準培地の能力を高めることができる。 本発明により、温血脊椎動物の粘膜下組織と組み合わせた真核細胞集団の in
vitro 増殖を促進する細胞培養組成物が提供される。上記組成物は、培養細胞の
最適増殖に必要な栄養素、および任意に増殖因子類を含んでなる。本発明の粘膜
下組織基質は、商業的に入手できる細胞培養液体培地（血清をベースとするもの
でも無血清でもよい）とともに用いることができる。本発明によって増殖する際
、増殖細胞は粘膜下組織と直接接触するかまたは粘膜下組織と単に液体連通する
のみでもよい。本発明の細胞増殖組成物を用いて未分化の幹細胞、並びにランゲ
ルハンス島、肝細胞および軟骨細胞等の分化した細胞類の増殖を促進することが
期待される。さらに、上記の細胞増殖組成物は分化した細胞の増殖を促進する一
方、このような細胞の分化した状態を維持すると考えられる。

【００２４】 多くの in vivo 微小環境に移植されると、粘膜下組織はホスト組織の増殖、
適した組織構造（例えば腱、靭帯、骨、関節軟骨、動脈および静脈）のリモデリ
ングおよび再生を誘発し得ることが広く文献化されている。内因性組織形成を誘
発するためのこのようなシート形および流動化組織の使用は、米国特許第 5,281
,422 号 および第 5,275,826号に記載され、クレームされている。これらの開示
は本明細書に明確に引用により援用される。 本発明の一実施態様において、温血脊椎動物の粘膜下組織を含んでなるグラフ
ト組成物の組織置換能力は、移植前に、その組織に種々の細胞型を植え付けるこ
とによってさらに高まり、拡大される。例えば、粘膜下組織に内皮細胞またはケ
ラチノサイトを植え付け、それぞれ血管グラフトまたは皮膚置換物として用いる
ことができる。一実施態様において、上記粘膜下組織にランゲルハンス島細胞を
植え付け、補助膵臓として用いる。或いは、粘膜下組織に間葉細胞（幹細胞）を
最初に植え付け、細胞集団を拡大し、その後ホストに移植する。粘膜下細胞は遺
伝的に改変した細胞をホストの特定位置に導くための運搬担体としても役立つ。
本発明によって使用する粘膜下組織は流動形でも本来の固体形でもよい。任意に
、粘膜下組織に真核細胞を植え付けた後、そのグラフト組成物を真核細胞増殖を
誘発する条件下に置き、上記グラフトをホストに移植する前に上記植え付けた細
胞の集団をさらに増大させることができる。

【００２５】 一実施態様において、粘膜下組織を含んでなる組成物および増殖細胞集団を、
ホストに移植する生体適合性基質に包むことができる。包む基質は、包まれた細
胞に栄養素が拡散でき、包まれた細胞の産生物質が上記包まれた細胞からホスト
細胞に拡散できるような構造を有する。生きている細胞を包む適切な生体適合性
ポリマー類は当業者には公知である。例えばポリシラン／アルギネート封入プロ
セスは既にF.LimおよびA.Sunによって報告された（Science、 ２１０巻、９０８
−９１０ページ）。実際、本発明によって、増殖する細胞集団を粘膜下組織基質
に包み、人工器官として移植するために、脊椎動物の粘膜下組織そのものが好都
合に用られる。

【００２６】 粘膜下組織は、該粘膜下組織上に in vitro で培養した細胞の分化を補助する
生理的環境を提供する。例えば、粘膜下組織を含んでなる細胞培養基質を当業者
には公知の標準細胞培養技術と組み合わせて用い、移植の必要なホストに移植す
るための組織グラフトを in vitro 生産することができる。そのような組織の細
胞は粘膜下組織グラフト構成物内の該細胞の種類および位置に基づいて正しい自
然の機能を行う。

【００２７】 組織グラフトを形成する in vitro における方法は、真核細胞を温血脊椎動物
の粘膜下組織を含んでなる細胞増殖基質に植え付け、真核細胞の増殖を誘発する
条件下でその細胞を in vitro 培養する諸段階を含んでなる。好都合なことに、
上記組織の細胞が固有の自然の機能を行っている組織グラフト構成物を in vitr
o 合成することにより、移植前に in vitro で増殖し得る最初は小さい細胞集団
から、組織グラフトを形成することができる。

【００２８】 本発明の一実施態様により、改良組織グラフト構成物が得られる。上記組織グ
ラフト構成物は脊椎動物腸組織の筋層および粘膜の少なくとも管腔部分の両方か
ら離層された粘膜下組織層と、あらかじめ選択した細胞集団とを組み合わせて含
む。一実施態様では、あらかじめ選択した細胞集団は結合組織前駆細胞を含む。
腸粘膜下組織は前駆細胞の分化を誘発し、損傷組織の修復を助ける細胞を形成す
ることができる。好都合なことに、前駆細胞集団を植え付けた粘膜下組織は種々
の異なる in vivo 部位に移植され、該前駆細胞はその環境に適した細胞型に分
化する。例えば上記組成物を軟骨または骨に隣接して移植すると、グラフト構成
物は軟骨または骨にリモデリングする。

【００２９】 一実施態様によると、脊椎動物の粘膜下組織を一次細胞と組み合わせることに
よって改良脊椎動物粘膜下組織グラフト構成物が形成される。一実施態様におい
て、改良組織グラフト構成物は外側平滑筋層および粘膜の管腔部分の両方から離
層された脊椎動物粘膜下組織と添加された一次細胞とを含んでなる。より詳細に
述べれば、一実施態様において脊椎動物粘膜下組織は脊椎動物腸組織の筋層およ
び粘膜層の少なくとも管腔部分の両方から離層された粘膜下層を含んでなる。本
発明の改良グラフト構成物は、修復を必要とする in vivo 部位に移植され、内
因性組織の修復を促進する。一次細胞は内皮、ケラチノサイト、軟骨細胞、上皮
および間葉細胞からなる群から選択できる。一般的には、粘膜下組織は固体状で
あるが、別の実施態様では使用粘膜下組織は流動化粘膜下組織である。粘膜下組
織は、組織の粉砕によっておよび／または粘膜下組織を酵素で該粘膜下組織を可
溶化するのに十分な時間消化することによって流動化することができる。

【００３０】 一実施態様において、本発明の改良組織グラフト構成物は、脊椎動物腸組織の
筋層および粘膜層の少なくとも管腔部分両方から離層された粘膜下層と、内皮細
胞、ケラチノサイトおよび間葉細胞からなる群から選択される一次細胞集団とを
含んでなる。さらに、あらかじめ選択される細胞の種類には、遺伝的に改変され
た細胞も含まれる。例えば、細胞は、損傷または病気組織の修復を高めるタンパ
ク質を発現する遺伝子を含むように改変される。

【００３１】 本発明はさらに、関節軟骨欠損を修復する粘膜下組織グラフトの能力を高める
方法を提供する。上記方法は、該グラフト構成物を移植または注入する前に、脊
椎動物粘膜下組織に軟骨細胞を植え付ける段階を含む。よって、本発明の一実施
態様において、関節軟骨欠損の修復のための組成物は、脊椎動物腸組織の筋層お
よび粘膜層の少なくとも管腔部分両方から離層され、一次軟骨細胞を付加した粘
膜下層を含んでなる。

【００３２】 本発明は、上皮構造（例えば歯周囲構造または食道）欠損を修復する脊椎動物
粘膜下組織グラフト構成物の能力を高める方法であって、グラフト構成物をホス
トに移植または注入する前に粘膜下組織に一次上皮細胞を植え付ける段階を含む
方法も提供する。これらの組織の修復法はその他に、上記グラフト材料をホスト
に移植または注入する前に、上記植え付けされたグラフト構成物を細胞の増殖を
誘発する条件下に置く段階を含むことができる。よって本発明の一実施態様にお
いて、歯周囲構造または食道の修復のための組成物は、脊椎動物腸組織の筋層お
よび粘膜層の少なくとも管腔部分両方から離層され、一次上皮細胞、より詳細に
は一次歯肉上皮細胞および一次食道上皮細胞からなる群から選択される一次上皮
細胞を付加した粘膜下層を含んでなる。

【００３３】 ＜例１＞ 粘膜下組織の滅菌 細胞培養技術は厳密な無菌条件のもとで行われなければならないから、培養系
に抗生物質が含まれない場合は、細胞培養基質として使用するためには粘膜下組
織を無菌的に調製せねばならない。粘膜下組織のバイオトロピック特性に対する
滅菌の効果を評価するために多くの滅菌法が研究されている。組織の機械的強度
およびバイオトロピック特性を著しく弱めない滅菌技術が好ましい。腸粘膜下組
織のための滅菌法、すなわち過酢酸滅菌、２.５Ｍｒａｄガンマ照射、１.０Ｍｒ
ａｄガンマ照射、Ｅｘｓｐｏｒ滅菌（Alcide、 ノーフォーク、コネチカット州）
およびこれらの滅菌法の種々の組み合わせを評価した。ガンマ照射は、60コバル
ト−ガンマチェンバーを用いて水和粘膜下組織に対して行われた。Ｅｘｓｐｏｒ
滅菌は製造会社の説明書により、滅菌剤量（ｍｌ）と腸粘膜下組織（ｇ）との比
を１０対１として用いて行われた。

【００３４】 種々の細胞型（例えば、ＩＭＲ−９０、ＦＲ、ＨＴ−２９、ＲＰＥＣ）を滅菌
ずみ粘膜下組織に植え付け、それらの増殖特性を１、３、７および１４日目に分
析した。全ての細胞型で得られた結果は、ガンマ照射または過酢酸処理によって
滅菌した粘膜下組織由来増殖基質は細胞の付着および増殖の程度を若干支援する
ことを示した。しかし、過酢酸滅菌粘膜下組織由来基質に植え付けた細胞は付着
、生存性、増殖速度および分化速度の増加を示した。過酢酸は細胞培養基質とし
ての粘膜下組織を調製するためには好ましい滅菌法であるようにみえる。

【００３５】 ＜例２＞ 粘膜下組織の過酢酸滅菌 粘膜下組織を過酢酸／エタノール溶液に、１０：１（過酢酸溶液ｍｌ：粘膜下
組織ｇｒａｍ）またはそれ以上の比を用いて、室温で２時間浸す。過酢酸／エタ
ノール溶液は４％エタノール、０.１％（容量：容量）過酢酸を含み、その他は
水である。０.１％過酢酸成分は、市場で入手できる表１に明確に示される３５
％過酢酸保存溶液を希釈したものである。上記粘膜下組織を過酢酸溶液に浸しな
がら回転装置で振とうする。２時間後、過酢酸溶液を流し去り、代わりに等量の
乳酸リンゲル溶液または燐酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）を入れ、１５分間（振とうし
ながら）浸す。粘膜下組織を乳酸リンゲル溶液またはＰＢＳで４回以上洗い、滅
菌水でさらに１５分間すすぐ。

【００３６】 表１： ３５％過酢酸溶液の化学組成物 組成物、重量％ 過酢酸 35.5 過酸化水素 6.8 酢酸 39.3 硫酸 1.0 水 17.4 過酸化アセチル 0.0 安定剤 500PPM 典型的活性酸素分析、重量％ 過酸としての活性酸素 7.47 Ｈ_２Ｏ_２としての活性酸素 2.40 総活性酸素 10.67

【００３７】 本発明およびその特徴および有益性のよりよい理解のために、下記の特定の例
を提供する。これらの特殊の例は本発明を説明するためのものであり、制限する
ものではないことは当然である。

【００３８】 ＜例３＞ 滅菌粘膜下組織上における種々の細胞型の増殖特性 米国特許第 4,902,508号に記載されているように、安楽死させたばかりのブタ
から小腸粘膜下組織を採取、調製した。種々の技術（ガンマ照射、過酢酸等）に
よる滅菌後、上記粘膜下組織をポリプロピレン枠内に固定して細胞増殖のための
平面領域（５０ｍｍ²）を作成した。その枠を培養培地に沈め、粘膜下組織の両
面に培地の栄養素を接近させた。種々の細胞型を粘膜下組織に植え付け（３×１
０⁴細胞／粘膜下組織片）、それから３７℃にて５％ＣＯ₂、９５％Ｏ₂空気のイ
ンキュベーター中に置いた。種々の時間経過後、細胞を接種した粘膜下組織を１
０％中性緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィンに埋封し、切片にした。その後
種々の組織的および免疫組織化学的染色法を用いて細胞増殖特性を調べた。

【００３９】 現在までに、粘膜下組織を増殖基質として用い、次の細胞系の増殖特性を研究
した。

【表１】

【００４０】 表２は、粘膜下組織由来細胞培養基質に培養する種々の細胞型と、それぞれの
特定の培地条件とをまとめたものである。選択した培地は、標準細胞培養条件下
で（すなわちプラスチック製の組織培養フラスコ中）各細胞型が増殖するための
最適または最適に近い条件を示す。全ての細胞調製は、５％ＣＯ₂／空気の湿潤
な雰囲気において３７℃にて培養された。

【００４１】

【表２】

【００４２】 腸粘膜下組織の管腔側および管腔とは反対側の両方における細胞増殖を研究し
た。増殖基質としての腸粘膜下組織は側面性（sidedness）を示した。すなわち
細胞を腸粘膜下組織の管腔とは反対側に培養した場合と、管腔側に培養した場合
とでは、細胞／基質の相互作用が異なる。ラットＦＲ細胞等の細胞型を管腔側に
植え付けた際、細胞は基質表面に付着し、増殖して細胞多層を形成する。代わり
に、ＦＲ細胞を管腔とは反対側に植え付けた場合は、細胞は表面に沿って増殖す
るだけでなく、粘膜下組織基質内にも侵入する。

【００４３】 脊椎動物腸粘膜下組織の管腔側の緻密層は、緻密な結合組織基質となり、選択
した細胞型（すなわち内皮および上皮細胞）の単層または多層形成をより容易に
する。これに対して、管腔とは反対側はより疎な結合組織構造を示し、それは基
質構造内への細胞侵入をより容易に助ける（すなわち線維芽細胞）。

【００４４】 ＩＭＲ−９０線維芽細胞は、腸粘膜下組織の管腔とは反対側、または管腔側に
植え付けた際すみやかに付着性になり、その基質成分全体に拡がった。これらの
細胞は、それらに特徴的な紡錘形を示し、細胞外基質成分内に大きい水泡核を示
す。しかし、３Ｔ３線維芽細胞は腸粘膜下組織に植え付けた際、最小の付着性お
よび増殖能を示した。

【００４５】 内皮細胞は、３日以内に腸粘膜下組織の緻密層表面に沿って紡錘形細胞の融合
単層を形成した。その後、この単層は、より緻密になり、若干の細胞は基質成分
間に挿し込まれた。興味深いことに、基質成分に侵入したいくつかの内皮細胞は
、天然腸の固有の血管をあらわす構造の、管腔に沿った内張りを形成した。

【００４６】 現在までに、増殖基質として腸粘膜下組織を用い、下記の一次細胞株の増殖特
性を研究した。

【００４７】 ＜細胞株＞ ラット心筋 ブタ平滑筋（大動脈） ブタ内皮（大動脈） ウサギ平滑筋（大動脈） ウサギ内皮（大動脈） ブタ平滑筋および内皮（混合＆同時培養） ヒト骨芽細胞 ヒト内皮細胞

【００４８】 一次細胞株は、微生物から採取して培養した細胞である。これらの細胞を（細
胞数を増やすための）標準 in vitro 細胞培養技術を用いて継代培養し（２−３
回）、その後の使用時まで凍結した。上に列挙した細胞株の各々を融解し、腸粘
膜下組織の存在下で培養し、組織学的に検査を行った。培養した細胞株集団の各
々は、増殖し、組織検査によって確認されたように、それらの分化した外観を保
持していた。例えば腸粘膜下組織において７〜１４日間培養後、ヒト骨芽細胞は
燐灰石結晶を蓄積し続け、ホルモン等の骨原性刺激に反応し、ラット心筋細胞は
それらの収攣性を保持し、ブタ平滑筋細胞は平滑筋アクチンを保有し、また、ブ
タ内皮細胞は第８因子を作った。

【００４９】 ＜例４＞ 腫瘍細胞増殖モデル系としての腸粘膜下組織細胞培養基質 In vitro 培養した、ＳＣＣ−１２（W. Greenlee、パードュー大学から取得）
として知られる、ヒトの顔の扁平上皮細胞癌から確立された細胞系の形態学およ
び侵襲性を研究した。皮膚細胞（例えばスイス３Ｔ３マウス線維芽細胞のガンマ
照射またはマイトマイシンＣ処理フィーダー層）のための標準細胞培養条件下で
増殖すると、平らな細胞の単層が形成される。しかし腸粘膜下組織の管腔とは反
対側の表面に植え付けると、ＳＣＣ−１２細胞は組織検査で、粘膜下組織基質成
分を活発に分解し、腸粘膜下組織を侵襲することがみられた。

【００５０】 ＳＣＣ−１２細胞を、滅菌粘膜下組織の管腔とは反対側、または管腔側表面の
どちらかに植え付け（３×１０⁴細胞／０.８ｃｍ²腸粘膜下組織）、５％ウシ胎
児血清、４ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含むＤＭ
ＥＭからなる増殖培地に浮遊させた。３、７、１４および２１日の時点において
、標準組織学的方法を用いて増殖特性を分析した。３日目に、細胞は強い付着性
を示し、腸粘膜下組織の表面に沿って連続層（厚さ１〜２細胞）を形成した。形
態学的に、それら細胞は丸く、細胞外基質生成物を盛んに産生していた。７日後
、細胞が腸粘膜下組織の管腔とは反対側に侵入する能力と管腔側に侵入する能力
との間に顕著な差が認められた。腸粘膜下組織の管腔表面に沿った細胞層は密度
が増加するだけのようにみえた。それに対して、管腔とは反対側に植え付けられ
た細胞は、粘膜下組織基質成分の活発な分解および３０ｎｍまでの侵入を示した
。より長く時間を置くと、より深い侵入度において細胞の数が増大し、腸粘膜下
組織がより盛んに分解した。ＳＣＣ−１２細胞は、腸粘膜下組織に管腔とは反対
側からも、管腔側からも活発に侵入するとはいえ、ＳＣＣ−１２細胞を管腔とは
反対側に置いた場合により大きい侵入が観察された。

【００５１】 ＜例５＞ 腸粘膜下組織の細胞分化の支援 ＦＲ上皮細胞は腸粘膜下組織の管腔側（緻密層）に培養した場合に層状多層を
形成する。腸粘膜下組織に隣接する細胞は円柱形で、多層の表面に近くなるとだ
んだん平らになる。１４日後、接着斑（desmosome）に似た構造が確認され、その
細胞層は、パンサイトケラチン抗体（pan cytokeratin antibody）よってサイト
ケラチンが陽性に染まった。その上、正常の健康状態の際に上皮細胞が in vivo
で行うように、上皮細胞が支持基質生成物（基底膜の可能性あり）を産生して
いるように見えた。これらの知見は、腸粘膜下組織が自然の上皮細胞成熟および
分化プロセスを支援していることを示唆する。

【００５２】 粘膜下組織増殖基質の管腔側（緻密層）に増殖したＦＲ細胞に認められた層化
は、腸粘膜下組織が in vitro 細胞分化を援助、誘発することの証拠である。Ｆ
Ｒ細胞の細胞分化の誘発を証明するために、免疫組織化学および免疫蛍光分析を
行い、腸粘膜下組織の存在下および不在下で培養したＦＲ細胞によるサイトケラ
チンの産生を検出した。サイトケラチンは、ケラチノサイトとして知られる細胞
に分化した上皮細胞によって産生される主要細胞内構造タンパク質である。免疫
組織化学は、腸粘膜下組織上に増殖したＦＲ細胞をプロテアーゼ消化、ホルマリ
ン固定し、パラフィン埋封した切片で、一次抗体として抗パンサイトケラチン（
Ｃ２９３１、シグマ、セントルイス、ミズーリ州）を用いて行われた。免疫学的
検出は、アビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）法およびビオゲネックス（Biogen
ex）超高感度StriAviGenキット（ベクターラボラトリーズ、バーリンガム、カナ
ダ）を用いて行われた。ラット皮膚生検を示す組織切片および腸粘膜下組織に増
殖したＨＴ２９をそれぞれ陽性および陰性対照として分析に含めた。

【００５３】 結果は、ＦＲ細胞多層に沿ってサイトケラチン染色が徐々に変化することを示
し、多層の表面の細胞が最も強く染まっていた。同様な陽性染色パターンがラッ
ト皮膚の上皮層を形成する細胞に認められた。しかし、腸粘膜下組織上に培養し
たＨＴ２９細胞をあらわす標本にはサイトケラチンは検出されなかった。

【００５４】 サイトケラチンの免疫蛍光分析を、フローサイトメトリーを用いて行い、ＦＲ
細胞系が標準培養条件下で（腸粘膜下組織は存在せず）分化の産物であるサイト
ケラチンを発現するかどうかを確認した。スイス３Ｔ３線維芽細胞（３Ｔ３）お
よび扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ−１２）細胞系がそれぞれ陰性および陽性コントロ
ールとして分析に含まれた。細胞を組織培養フラスコから採取し、冷メタノール
前処理を行って透過可能とし、抗パンサイトケラチン抗体の存在下で種々の希釈
でインキュベートした（コントロールとして、抗パンサイトケラチン抗体（anti
-pan cytokeratin antibody）が存在しない試料も含む）。その後、フルオレッ
セインイソチオシアネートと結合したヤギ抗マウス抗体（ＧＡＭ−ＦＩＴＣ）を
加え、免疫学的検出を容易にした。それから細胞標本をＥＰＩＣＳ Ｅｌｉｔｅ
フローサイトメトリー（クルターコーポレーション（Coulter Corp.）、ハイア
レア、フロリダ州）で、空冷アルゴンレーザーによる４８８ｎｍ励起を用いて分
析した。蛍光発光を帯域フィルターにより５２５ｎｍで測定した。未処理の細胞
と、ＧＡＭ−ＦＩＴＣで処理しただけの細胞とをも分析し、バックグラウンド蛍
光レベルを決定した。表３は、間接免疫蛍光染色後の各細胞型のＦＩＴＣ蛍光の
相対的パーセントを示す。データが示すように、標準培養条件下で粘膜下組織基
質が存在しない場合は、陽性コントロールＳＣＣ−１２細胞系のみがサイトケラ
チンを発現し、ＦＲ細胞系はサイトケラチンを発現しない。

【００５５】

【表３】

【００５６】 ＜例６＞ ハムスター膵島の分離 ハムスターの膵島をGotohらが以前に記述した方法（Transportation ４３巻、
７２５−７３０ページ（１９８７））で分離した。つまり、齢６〜８週のゴール
デンハムスター（Harlan、インディアナポリス、インディアナ州）をメトファン
（メトキシフルラン；Pitman-Moor；マンデレイン、イリノイ州）の吸入によっ
て麻酔した。立体顕微鏡下にて、総胆管にポリエチレンカテーテル（ＰＥ−１０
チューブ；ＣＭＳ；ヒューストン、テキサス州）を挿入した。これを介して、コ
ラゲナーゼＰ０.７ｍｇ／ｍｌを含む氷冷Ｍ−１９９メジウム（Gibco ＢＲＬか
ら商業的に入手できる）約３〜４ｍｌを、膵臓全体が膨張するまでゆっくりと注
入した。この膵臓を細切し、１００μｇ／ｍｌのペニシリンＧおよび１００μｇ
／ｍｌのストレプトマイシン（コラゲナーゼを付加せず）を含むＭ−１９９培地
中において３７℃で約５０分間消化した。消化物を氷冷Ｍ−１９９培地中で３回
洗い、無菌の５００μｍステンレス鋼メッシュ、それから１００μｍメッシュを
逐次通した。フィコール密度勾配（１.０４５、１.０７５、１.０８５および１.
１００）を介し、８００ｇで１０分間遠心分離して精製した後、頂部の二つのイ
ンターフェースから島を回収した。

【００５７】 ＜腸粘膜下組織上における膵島の培養＞ ランゲルハンス島（島細胞）を５％ＣＯおよび９５％空気を補充したインキュ
ベーター中、３７℃で、粘膜下組織細胞増殖基質上で培養した。島細胞を種々の
形状の腸粘膜下組織の存在のもとで次の操作法を用いて培養した： １．直接接触：腸粘膜下組織と培養細胞とが互いに物理的に接触する。 ２．間接接触：腸粘膜下組織と培養細胞とをステンレス鋼メッシュによって分
離する。 ３．可溶化腸粘膜下組織を培養培地に加える。 ４．細胞を、可溶化腸粘膜下組織をコーティングした培養プレート上で培養す
る。そのコーティングは、可溶化腸粘膜下組織１ｍｌを３５ｍｍ培養プレートに
入れ、３７℃で２時間加熱し、過剰の腸粘膜下組織液を吸引して除去し、塗布プ
レートを培養培地で１回洗うという方法によって塗布される。

【００５８】 直接接触培養法では、約１×１ｃｍの腸粘膜下組織膜を、緻密層を上に向けて
ステンレス鋼メッシュの上に置いた。分離した島をその後上記膜上に置き、Ｍ−
１９９培地（Gibco ＢＲＬから商業的に入手できる）中で７日間連続して培養し
た。細胞の増殖を２日おきに立体顕微鏡で検査し、コントロール群（粘膜下組織
なしで培養）と比較した。

【００５９】 ＜同時培養前の粘膜下組織の滅菌＞ １．腸粘膜下組織由来の細胞培養基質を数種類の方法、すなわち過酢酸処理ま
たはガンマ照射で滅菌した。ガンマ照射した膜および自然の（腸粘膜下組織の分
離後、何らの処理もしない）膜は、それらが同時培養前に、培養培地で十分再水
和されたことを条件として、細胞培養基質として直接用いることができる（自然
の膜は、抗生物質の存在下で培養されなければならない）。残留過酢酸は細胞に
は有毒であるから、過酢酸滅菌膜を先ず洗って、培養前に残留過酢酸を除去しな
ければならない。一般的には過酢酸滅菌組織を多量の培地に２４時間浸し、その
後同じ培地でよく洗う。

【００６０】 ２．溶解形の腸粘膜下組織を０.１Ｍ酢酸（ＡＡ−粘膜下組織）または燐酸緩
衝生理食塩液（ＰＢＳ−粘膜下組織）中６.５％クロロホルムに対して、室温で
２時間透析することによって滅菌した。腸粘膜下組織を取り出す前に、透析チュ
ーブの外側を７０％アルコールですすぐことによって、そのチューブの外側表面
を無菌にする。透析チューブは、分子量カットオフ１２,０００〜１４,０００を
有するから、チューブ内部に保持されるタンパク質は１４,０００より大きい分
子量を有するものである。

【００６１】 ＜結果＞ コントロール群（粘膜下組織の不在下で培養した島）において、７日間の培養
の試験は、線維芽細胞が島細胞の全面に生長したことを示した。

【００６２】 腸粘膜下組織を含んでなる増殖基質に島細胞を培養した際、繊維芽細胞の島細
胞全面への生長は生じなかった。腸粘膜下組織直接培養系においては、島には島
カプセル（capsule）の周囲に多数の細胞が疎な状態で満ちた。繊維芽細胞不在
において、細胞はそのカプセルから移動し、膜の上で細胞増殖が起きた。腸粘膜
下組織によって被覆された培養器で島細胞を培養した場合も、島カプセルからの
上皮様細胞の移動が容易になるようにみえた。コーティング表面へのさらなる付
着および上皮様細胞の単層の形成が認められた。

【００６３】 これらのデータは、粘膜下組織基質を用いて、際線維芽細胞の過生長なしに、
島細胞の in vitro 増殖を促進することができることを示している。こうして、
島細胞を膵臓組織から分離し、島細胞の増殖を誘発する条件のもとで、温血脊椎
動物の腸粘膜下組織を含んでなる細胞増殖基質と接触し、線維芽細胞を同時増殖
させることなく in vitro 増殖させることができる。これらの島細胞培養組成物
は線維芽細胞の過生長から実質的に自由な状態を保ち続ける。

【００６４】 ＜例７＞ 創傷治癒を改善し、組織リモデリングを促進する腸粘膜下組織の能力は、前に
開示されている。しかし或る種の組織は組織損傷後の修復が遅く、或るいは粘膜
下組織のみでは所望速度の回復ができない程ひどく（例えば火傷患者）損傷を受
ける場合もある。あらかじめ選択した細胞集団と粘膜下組織基質とを組み合わせ
ると、粘膜下組織グラフト構成物の修復能力が高まることが見いだされた。一実
施態様において、粘膜下組織と、身体の修復すべき損傷組織または病気の組織に
特異的な一次細胞培養物とを組み合わせる。あらかじめ選択した細胞集団と粘膜
下組織基質との組み合わせは、驚くほど改善された創傷治癒を示し、いずれかの
成分のみを治療剤として用いた場合に比してその後の機能回復がより優れている
組織グラフト構成物を提供する。

【００６５】 イヌモデルにおいて数本の歯から歯肉（ガム）およびより深い歯周囲構造を完
全に除去する研究を行った。歯槽骨にまで広がったその欠損領域を、腸粘膜下組
織だけ、アロダーム（Alloderm）（ヒト皮膚に由来する市販品）、または腸粘膜
下組織と一次自己歯肉上皮細胞との複合物で処理した。結果は、腸粘膜下組織プ
ラス一次上皮細胞複合物で処理した部位が最も良く治癒し、培養した上皮細胞か
らなる完全な上皮細胞集団があって、上皮下結合組織層が欠如した結合組織支持
構造を置換していた。腸粘膜下組織のみ、またはアロダームで処理した部位は、
複合物構造で処理した部位に見られるものと比較して、より少ない上皮細胞成分
を有するより典型的な瘢痕組織型反応を生じた。この研究は複合物の優れた治癒
力を示した。

【００６６】 さらに、食道修復デバイスとして有用であることがわかっている８層腸粘膜下
組織層構造上に一次食道上皮細胞を増殖させた。多層粘膜下構造の製法は米国特
許第 5,711,969号に完全に記載されている。この開示は本明細書に明確に援用さ
れる。 ＜例８＞ 最近ブタにおいて完了した大規模な研究は、腸粘膜下組織を剥片厚みの皮膚グ
ラフト（実質的には自己グラフトをあらわす）と組み合わせた際、ＳＴＳＧのみ
の使用に比較して、剥片厚みの皮膚グラフト（ＳＴＳＧ）の“採皮”率が改良さ
れる。この腸粘膜下組織プラス薄いＳＴＳＧの組み合わせは、全厚み（full thi
ckness）の皮膚損傷の治療における特殊な要求を満たす。詳細に述べれば、グラ
フト採取部位に深い創傷を残し、かなり重大な病的状態とその後の瘢痕を伴う厚
い（０.０１０インチより厚い）ＳＴＳＧ採取の代わりに、薄い（０.０１０イン
チ未満）ＳＴＳＧを採取し、腸粘膜下組織担体とともに用いてこの種の創傷を治
癒することができる。この種の研究は、腸粘膜下組織プラス一次上皮細胞複合物
の有用性および、そのどちらかの単独使用にまさる有益性を示すものである。

【００６７】 ＜例９＞ 関節軟骨欠損の修復における腸粘膜下組織の使用 関節軟骨は修復能力が限られているため、ひとたび外傷または病気によって損
傷を受けた際には、それは悪化して、変形性関節炎になる恐れがある。人工物に
よる関節置換は選択可能な治療法であるとはいえ、その耐用寿命は限られており
、欠損した移植物を置換するのは難しい処置である。そのため、変形性関節炎の
発生を遅らせ、好ましくは阻止するために、局所的または早期の軟骨損傷を治療
する方法として生物学的な表面再形成法が開発された。

【００６８】 最近、軟骨細胞を単独でまたは担体に入れて軟骨欠損部に移植するやり方に興
味が高まりつつある。初期研究は、分離した軟骨細胞が欠損部に組み込まれるこ
とを証明した。しかし、固定がよくないために失敗率が２８〜６１％であった。
軟骨細胞インプラントに骨膜をかがり縫いすると成功率は増加した。ただし、こ
の技術は、技術的要求が高く、隣接軟骨を損傷しうる。担体内の軟骨細胞の植え
付けは、欠損部における細胞固定の改善に役立っている。ウサギの欠損を修復す
るために軟骨性組織−ポリグリコール酸ポリマー複合物を用いるFreedらによる
最近の研究は有望な結果を示したが、その欠陥部は体重を支える関節部分ではな
く、しかもその研究は短期間のものであった。 ブタ小腸粘膜下組織は、移植した際に組織リモデリングを誘発する吸収性生物
材料である。この材料を in vitro 軟骨形成のための適切な基質として使用する
ための研究が行われた。こうして形成された軟骨をその後損傷関節の表面再形成
のために用いることができる。粘膜下組織−軟骨性組織複合物を関節軟骨全厚み
の損傷に移植した。４週間後、上記複合物は生きており、そのヒアリン様外観を
保持していた。ただし、線維性血管および線維軟骨性組織も存在していた。腸粘
膜下組織のみを受けた欠損は、主として線維性血管組織を含んでおり、一方未移
植の欠損には線維軟骨が充満し、粘膜下組織−軟骨性組織−表面再形成欠損部の
評価は粘膜下組織充填欠損部の評価より著しく良かったが、未充填欠損部との差
はなかった。しかし複合物充填欠損部における修復組織は、未充填欠損部に比べ
て著しく高い評価を得た。このパイロット研究は、粘膜下組織−軟骨性組織グラ
フトが関節の再表面化に有用であることを示唆している。

【００６９】 一実施態様において、軟骨細胞を in vitro 培養して腸粘膜下組織の表面に細
胞層を形成せしめ、それから移植して骨内方成長を支持し、その間粘膜下組織は
生体内に吸収される。このような構成物は重なり合う軟骨の一体性を損なうこと
なくグラフトの固定を促進する。

【００７０】 ＜材料および方法＞ 軟骨細胞の培養 腸粘膜下組織を二層織物シートとして調製し、−２０℃で保存した。使用の１
週間前に、腸粘膜下組織を抗生物質（１００,００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１０
ｍｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、２５μｇ／ｍｌフンギゾーン（fungizone
）；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、バーリントン、カナダ）を３回交換して浸潤し、Ｈａ
ｍのＦ１２（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）で３回洗い、生検パンチ（Premier Medical P
roducts、ノリスタウン、ＰＡ）を用いて４ｍｍ円板に切り、直接移植に用いるか
、細胞培養のために用いた。

【００７１】 軟骨細胞を得るために、ニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）ウサギ（雄、２
ｋｇ）の後膝関節を切開し、関節軟骨の表在部分を切り裂いて捨てた。残ってい
る軟骨（下１／３）を採取し、０.２５％プロテイナーゼ（シグマケミカル社、
セントルイス、ＭＯ）で１時間、その後０.１％コラゲナーゼ（コラゲナーゼＡ
、ベーリンガー・マンハイム、ラヴァル、カナダ）で４時間逐次消化することに
よって細胞を分離した。²⁷軟骨細胞を、５％正常ウサギ血清（ＮＲＳ）を補充し
たＨａｍ’ｓＦ１２に再懸濁し、腸粘膜下組織上で培養した（２×１０⁵細胞／
円板形織布シート腸粘膜下組織）。ウサギ血清はＮＲＳウサギの心臓穿刺によっ
て得た（トロント大学、トロント、カナダ）。それを加熱不活性化し（６０℃、
３０分間）、滅菌濾過し、−２０℃で保存した。

【００７２】 ５日目に、培地を２０％ＮＲＳと１００μｇ／ｍｌアスコルビン酸（ＡＡ）を
補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）に代え
た。培地を２〜３日おきに交換した。１４日目に１０ｍＭ β−グリセロホスフ
ェート（β−ＧＰ）も培地に加えた。培養物を８週間まで種々の時点に採取し、
分析した。

【００７３】 培養物の組織学的評価 培養物を１０％ホルマリン中で固定し、パラフィンに埋封した。５ミクロン切
片をＨ＆Ｅで染色して細胞充実性を評価し、トルイジンブルーで染色して硫酸プ
ロテオグリカンの存在を評価した。または、石灰化を評価するためにvon Kossa
染色を行った。齢８週培養物の厚さをＱ５００ＭＣ画像分析装置（ライカ カナダ
社、ウィロウデール、カナダ）を用いて形態計測的に測定した。切片あたり最低
１０箇所の点および培養物あたり３切片を測定した。

【００７４】 ＤＮＡおよびプロテオグリカンの定量 “受け取ったままのもの（as received）”（−２０℃で保存されていたもの
）および８週間培養後の両方の、齢８週の腸粘膜下組織−軟骨培養物と、４ｍｍ
円板の腸粘膜下組織と、ウサギの深部軟骨とのＤＮＡおよびプロテオグリカンを
定量した。試料をＰＢＳですすぎ、凍結乾燥し、それらの乾燥重量を測定した。
それらをパパイン（２０ｍＭ酢酸アンモニウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭジチ
オスレイトール中８０μｇ／ｍｌ；シグマ、セントルイス、ＭＯ）にて６５℃で
最低１８時間消化した。

【００７５】 消化物中のＤＮＡ含有量はヘキスト３３２５８色素（Polyscience Inc.、ウォ
リントン、ＰＡ）を用い、当業者に公知の技術を用いるフルオロメトリーにより
測定した。ＰＢＳ中のウシ胸腺ＤＮＡ（Pharmacia、モントリオール、カナダ）
を用いて標準曲線を作成した。

【００７６】 プロテオグリカンの量は、当業者に公知の技術を用いるジメチルメチレンブル
ー色素（ポリサイエンシズ社）結合試験を用いてパパイン消化物のグリコサミノ
グリカン（ＧＡＧ）を測定することによって評価した。この試験は９６ウェル−
プレートで行われ、５２５ｎｍの吸光度を自動プレートリーダー（Titrek Multi
scan、 InterSciences Inc.、フィンランド）によって測定した。コンドロイチン
硫酸（シグマ）を用いて標準曲線を作成した。全数値を乾燥重量に標準化した。

【００７７】 腸粘膜下組織上に形成された軟骨性組織のＧＡＧおよびＤＮＡ含有量は、腸粘
膜下組織（細胞の不在下で８週間培養した粘膜下組織）の寄与を補正することに
よって推定した。

【００７８】 プロテオグリカン分析 プロテオグリカンのサイズを調べるために、８週培養物、深部関節軟骨および
腸粘膜下組織から、プロテアーゼインヒビター類（５ｍＭ Ｎ−エチルマレイミ
ド、５０ｍＭベンザミジンＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１Ｍ ６−アミノヘ
キサン酸）を含む４ＭグアニジンＨＣｌ（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５.８
）でプロテオグリカン（ＰＧ）を抽出し、氷冷エタノールの３容量で沈殿させた
。各試料の３０マイクログラムを、０.８％の浸水水平アガロースゲルを用いて
分離した。そのゲルを０.１Ｎ酢酸中０.００２％トルイジンブルーで３０分間染
色し、０.１Ｎ酢酸で洗った。

【００７９】 コラーゲン分析 代表的培養物を［¹⁴Ｃ］プロリン（１０μＣｉ／ｍｌ、Ｌ−［¹⁴Ｃ（Ｕ）］プ
ロリン、ドュポン ＮＥＮ、ボストン、ＭＡ）で２４時間標識化した。コラーゲ
ンを４℃で２４時間、ぺプシン（１００μｇ／ｍｌ ０.１Ｎ酢酸；Worthington
Biochemical Corp.、フリーホールド、ＮＹ）で抽出した。上記ペプシン抽出物
を５％ドデシル硫酸−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で分離し
、オートラジオグラフィーのために調製するか、またはウエスタンブロット（We
stern blot）分析を行うためにニトロセルロースに移した。Ｉ型またはII型コラ
ーゲンの存在を、Ｉ型コラーゲンと反応する抗体（ポリクローナル；Southern Bi
otechnology Associates Inc.、バーミンガム、ＡＬ）、またはII型コラーゲン
と反応する抗体（モノクローナル抗体 ＣIIＣＩ；Developmental Studies Hybri
doma Bank、ボルチモア、ＭＤ）を用いてウエスタンブロット法によって測定した
。反応性は、アルカリホスファターゼ（ビオラド、ミシソーガ、カナダ）と結合
したアフィニティー精製二次抗体を用いて検出した。基質および色素反応のため
にニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
燐酸を加えた（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）。

【００８０】 In vivo 表面再形成の研究 １３匹のＮＺＷウサギ（雌４.５ｋｇ）を実験群７匹および対照群６匹の２群
に分けた。ウサギをアセプロマジン（１ｍｇ／ｋｇ皮下）およびソムノトール（
２５ｍｇ／ｋｇ静脈内）で麻酔した。後膝関節を、外側縦方向傍膝蓋骨切開によ
って露出し、膝蓋骨を脱臼させた。実験群で両側切開を行い、対照群では一側切
開を行った。周囲軟骨の損傷を最小にするために、使い捨ての生検パンチを用い
て、遠位大腿骨の滑車溝の関節軟骨に４ｍｍ直径の欠損を作った。電気ドリル（
可変速度回転ドリル、シアーズ９２４３７５型）を用いてその欠損を軟骨下骨に
まで延ばした。

【００８１】 実験群の動物は、一つの膝に腸粘膜下組織−軟骨性組織移植を受け、反対側の
膝には腸粘膜下組織のみを受けた。腸粘膜下組織−軟骨性組織複合物は、移植前
に８週間培養したものである。移植片を欠損部に圧入し、移植片の表面が関節表
面と同一レベルになるようにした。対照群の動物に作られた欠損は、埋めずにお
いた。膝蓋骨を減らし、カプセルおよび皮膚を縫合して閉じた。動物たちは自由
に活動できるようにした。食物および水は自由に摂取することができた。ウサギ
を４週間目にＴ６１の過量投与によって殺し、膝関節を採取した。

【００８２】 欠損の組織学的評価 遠位大腿骨を１０％緩衝ホルマリンで固定し、級付きエタノール中で脱石灰し
ないように（undecalcified）処理し、スプール（Spurr）樹脂に変形埋入した。
５ミクロン厚さの切片を切り、Ｈ＆Ｅまたはトルイジンブルーで染色した。組織
学的特徴は、O'Driscollら、J.Bone Joint Surg.[Am.]７０−Ａ、５９５ページ（
１９８８）、およびBen-Yishay ら、組織工学、１巻、１１９ページ（１９９５
）から採用した採点法によって評価した（最大スコア＝１３）。表１を参照され
たい。つまり、次の特徴を評価した。（ａ）欠損を充填する組織（組織の種類、
染色特性および修復組織の表面の外観）、（ｂ）隣接軟骨および骨との融合、（
ｃ）欠損の充填、および（ｄ）隣接組織が変性変化を示したかどうかである。ヒ
アリン様軟骨性組織と線維軟骨性組織との差は、組織学的特徴、およびコラーゲ
ン線維が偏光顕微鏡によって見ることができるか、これは線維軟骨の特徴である
が、に基づいていた。データをスチュデントｔ検定によって統計的に分析し、ｐ
値＜０.０５で有意性を判定した。

【００８３】 ＜表１．軟骨欠損の修復のための組織学的採点スキーム＞ 欠損部の組織 主要組織の種類 ヒアリン 3 ヒアリン／線維軟骨 2 線維軟骨 1 軟骨なし 0 基質の染色 正常 3 中程度 2 軽度 1 なし 0 表面 滑らか 2 軽度破壊 1 重度破壊／線維性 0 欠損部の充填 隣接軟骨と同じ 1 凹んでいる／隆起 0 周囲組織との融合 完全 3 部分的 2 片側 1 なし 0 隣接軟骨 正常 1 変性変化 0 最大スコア 13

【００８４】 ＜結果＞ In vitro で形成された腸粘膜下組織−軟骨性組織の組織学的外観 腸粘膜下組織−軟骨性組織複合物を、培養において３、６および８週間後に組
織検査した。織られた腸粘膜下組織に付着した軟骨細胞は、細胞外基質を蓄積し
、軟骨性組織を形成した。軟骨細胞は丸く、凹窩状であった。細胞外基質はトル
イジンブルーで異調染色した。これは硫酸プロテオグリカン類の存在を示唆する
。若干の細胞が腸粘膜下組織に侵入し、これらは少量の基質によって取り囲まれ
た。Von Kossa染色は腸粘膜下組織に隣接する軟骨性組織基質に焦点性の石灰沈
着物の存在を明らかにした。いくつかの培養物では、これらは８週間までに鉱質
の連続層を形成した。培養８週間までに、軟骨性組織は平均して１５３.４±６
０.７μｍ（平均値±ＳＥ）の厚さを有した。

【００８５】 In vitro で形成された軟骨性組織のＤＮＡおよびプロテオグリカン含有量の定
量 齢８週の腸粘膜下組織−軟骨性組織培養物のＤＮＡおよびプロテオグリカンの
量を測定し、in vivo ウサギ深部軟骨と比較した（表２）。腸粘膜下組織に形成
された軟骨性組織は０.８６±０.２μｇＤＮＡ／ｍｇ乾燥重量（平均値±ＳＥ）
および８６.５±５.５μｇＧＡＧ／ｍｇ乾燥重量（平均値±ＳＥ）を含むと推定
され、一方、ウサギ深部軟骨は０.８３±０.２μｇＤＮＡ／ｍｇ乾燥重量（平均
値±ＳＥ）および１０９.６４±７.８μｇＧＡＧ／ｍｇ乾燥重量（平均値±ＳＥ
）を含んでいた。ＤＮＡの量に顕著な差はなかったが、in vivo 組織には、 in
vitro 形成組織に比して多くのＧＡＧが顕著に存在した（ｐ＝０.０３）。“受
け取ったまま”の腸粘膜下組織サンプルは、ＤＮＡ含有量は２．９０±０．２μ
ｇ／ｍｇ乾燥重量（平均値±ＳＥ）、ＧＡＧ含有量は２５．３５±５.０μｇ／
ｍｇ乾燥重量（平均値±ＳＥ）であり、一方、培養８週間後（“培養後”）に分
析した腸粘膜下組織は２.０４±０.１および８.６６±０.６μｇ／ｍｇ（平均値
±ＳＥ）のＤＮＡおよびＧＡＧ値をそれぞれ有した。

【００８６】 プロテオグリカンおよびコラーゲンの分析 大きいプロテオグリカン類および II型コラーゲンが軟骨基質に存在する主な
高分子であるから、 in vitro で形成された軟骨性組織に存在するプロテオグリ
カンおよびコラーゲンを分析して軟骨細胞の表現型がこれらの培養条件下で保持
されるかどうかを確認した。アガロースゲル電気泳動は、８週腸粘膜下組織−軟
骨性組織培養が、ウサギ深部軟骨から抽出したプロテオグリカンとサイズが同様
の、大きいプロテオグリカン集団を合成することを示した。ただしその若干は i
n vivo 組織から抽出されるものよりも大きかった。腸粘膜下組織から抽出した
プロテオグリカン類は遥かに小さく、ゲルの底部近くを２本の広いバンドとして
走っていた。

【００８７】 ８週腸粘膜下組織−軟骨性組織複合物のペプシン抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よびオートラジオグラフィーによって分析した。サイズが II 型コラーゲンのα ₁ （Ｉ）鎖に類似しているバンドが見られた。Ｉ型コラーゲンのα₂鎖に相当する
バンドは存在しなかった。多分α_１（Ｈ）鎖の二量体をあらわす、より高分子の
バンドも存在した。これらの抽出物のウェスタン ブロット分析は、 II 型コラ
ーゲンの存在を確認した。Ｉ型コラーゲンは腸粘膜下組織−軟骨性組織複合物お
よび腸粘膜下組織のみのどちらのペプシン抽出物にも検出された。II 型コラー
ゲンはウェスタン ブロット法によって腸粘膜下組織抽出物には検出されなかっ
た。

【表４】 ^aＮＡ＝該当せず。分析したウサギ深部軟骨片は１.３７から３.６５ｍｇの範囲
であった。 ^b in vitroでのウサギ深部軟骨と軟骨性組織との間に顕著な差。

【００８８】 乾燥重量およびＤＮＡおよびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量は、材料お
よび方法の部に記載したように測定した。 In vitro で形成された軟骨性組織の
データは、８週間培養後（“培養後”）の腸粘膜下組織の平均乾燥重量または平
均総ＤＮＡおよびＧＡＧ量を、腸粘膜下組織−軟骨性組織の各試料の総ＤＮＡお
よびＧＡＧそれぞれの乾燥重量から引くことによって推定した。分析は、３つの
異なる実験の各々からの少なくとも２つの異なるサンプルで行われた。データは
平均±ＳＥで表している。

【００８９】 In vivo 研究 腸粘膜下組織−軟骨性組織グラフトを受けた動物の関節は滑液流出を示さなか
った。ただし２匹のウサギでは骨棘のために関節が肥大した。欠損は全て白色組
織で埋まり、隣接軟骨は５関節で正常であり、２関節で線維化した。

【００９０】 腸粘膜下組織のみを用いて欠損を修復した７匹の動物のうち、４匹には骨棘が
発生、１匹には滑液流出があった。１匹の動物には化膿性流出液を伴う一側性敗
血症性関節炎が発生し、その関節は研究から除外した。残る６匹のウサギの欠損
は白色肉芽組織で埋まっていた。隣接軟骨は１匹を除く全動物で変性の兆候を示
した。

【００９１】 移植片を受けなかった６匹のウサギのうち４関節は特に目立つことはなく、２
関節には滑液流出があった。骨棘は見られなかった。全ての欠損は白色組織で充
填され、隣接軟骨の変性は見られなかった。

【００９２】 腸粘膜下組織−軟骨性組織移植片を受けた欠損の組織学的検査は、７欠損のう
ち６欠損にグラフト組織が存在することを示した。それらグラフトはヒアリン軟
骨の外観を維持していた。全ての移植片は、関節表面に向かう種々の量の線維性
血管組織や移植組織の上または下の線維軟骨性組織によって包囲されていた。グ
ラフトが隣接するホスト軟骨または骨に近づくと、それら２組織の間に融合が起
きた。移植片とその下にある線維軟骨との間にも融合が起きた。グラフトが抜け
落ちた１欠損部は線維軟骨で完全に充填された。

【００９３】 組織学的に、腸粘膜下組織グラフトを受けた欠損は線維性血管組織で埋められ
た。線維軟骨はないか、またはごく少量であった。線維軟骨が存在した場合、そ
れは欠損の端に存在した。残留腸粘膜下組織は１欠損に見られただけであった。
欠損の周囲の関節軟骨は欠損を充填した線維性血管組織と合流したとはいえ、関
節軟骨の端は修復組織から見分けられた。これに対して、移植片を受けなかった
関節欠損は完全に線維軟骨で埋まり、それは隣接軟骨および骨に種々の程度で接
着していた。線維軟骨はより細胞性であったから隣接関節軟骨から容易に区別す
ることができ、基質は見たところ線維性であった。コラーゲン線維は偏光のもと
で見ることができた。線維軟骨の表面は変性変化を示し、プロテオグリカンを失
っていた。

【００９４】 欠損の組織的外観の採点（表３）から、腸粘膜下組織−軟骨性組織グラフトで
再表面化された関節または移植片を受けなかった関節は腸粘膜下組織のみを植え
付けた関節より有意に優れていることが証明された（ｐ＝０.００４）。腸粘膜
下組織−軟骨性組織移植群の欠損と、未充填のままにした欠損との間には組織学
的スコアの差はなかった。しかし、欠損の修復組織の組織型および染色に関して
得られたスコアを比較すると、腸粘膜下組織−軟骨性組織移植群の方がグラフト
を受けなかった群よりも顕著に良かった（ｐ＝０.０１９）。

【００９５】

【表５】

【００９６】 ＜検討＞ 腸粘膜下組織に付着したウサギ軟骨細胞は、細胞外基質に蓄積し、in vitro
で軟骨性組織を形成した。これらの条件下で軟骨細胞はその表現型を維持し、ヒ
アリン軟骨の特徴である巨大分子、大プロテオグリカンおよび II 型コラーゲン
を合成した。腸粘膜下組織に近い細胞外基質には鉱質化が起きた。ウシ関節軟骨
の深部領域から得られた軟骨細胞によって形成された軟骨性組織（これはフィル
ターインサート上に培養した際、一貫して連続的鉱質層を示した）とは異なり、
腸粘膜下組織上の軟骨性組織は比較的一般的に焦点性鉱質化層のみを示した。こ
の不連続鉱質化はウサギ深部軟骨細胞をフィルターインサート上に培養した際に
も認められ（データは示されず）、腸粘膜下組織が組織鉱質化に影響を与えなか
ったことを示唆する。鉱質化の程度の変動性を説明する一つは、ウサギとウシと
の in vivo 軟骨厚さの違いである。ウシ軟骨はより厚く、深部細胞を分離する
際に軟骨の表層および中間部分の軟骨細胞が混入しそうもない。これは、ウサギ
軟骨細胞が、ウシ軟骨の深部領域から分離した軟骨細胞とは異なり、そして軟骨
の厚さ全体から分離した軟骨細胞と類似して、検出可能量のＩ型コラーゲンを合
成しなかった、という知見によって裏付けられる。Ｉ型コラーゲンはウェスタン
ブロット法によって検出されたが、オートラジオグラフでは見られなかった。こ
れはＩ型コラーゲンが腸粘膜下組織に由来することを示唆する。しかし新たに合
成された少量のコラーゲンがオートラジオグラフィーによって検出されなかった
という可能性がある。

【００９７】 In vitroで腸粘膜下組織上に生成する軟骨性組織の厚さは、腸粘膜下組織の処
理法によって影響を受けるようにみえた（データは示されず）。シート状に織ら
れた腸粘膜下組織は、軟骨性組織形成を最も一貫して支援した。これを上述の実
験に用いたのはそのためである。標準的方法で処理した腸粘膜下組織上に軟骨細
胞を置いた際、軟骨形成が薄いか、または軟骨が全く形成されない腸粘膜下組織
の粘膜表面があった。表現型軟骨細胞および基質合成の維持のためには軟骨細胞
の植え付け密度が重要であり、そして不織の腸粘膜下組織が曲がりくねったり不
規則表面を呈したりすると、腸粘膜下組織の表面上の細胞の分布は、最初は不均
一であり、これが上記の変動性を説明しうる。

【００９８】 In vitro 形成された軟骨性組織をウサギ深部軟骨と比較すると、ＤＮＡの量
には差がないのに、上記軟骨性組織のＧＡＧ量は、in vivo 組織のそれの約７９
％であることが判明した。この差は、上記複合物に対する腸粘膜下組織の寄与度
の測定方法によるものである可能性がある。受け取り時に−２０℃で保存されて
いた（“受け取ったままの”）腸粘膜下組織は、乾燥重量１ｍｇあたり約２５μ
ｇのＧＡＧを含むことが判明し、これはHoddeらが得た数値に近かった。³³しかし
、無細胞の状態で８週間培養した腸粘膜下組織は、その最初の乾燥重量を６６％
失い、ＧＡＧ含有量は乾燥重量の２.５％から０.８％に低下した。腸粘膜下組織
上に形成された軟骨性組織のＧＡＧ含有量を推定するために、我々は腸粘膜下組
織−軟骨培養中の腸粘膜下組織の組成が８週間の無細胞培養後の腸粘膜下組織の
それと同様であると仮定した。しかし、軟骨細胞は種々の基質分解酵素を産生し
得るから、残っている腸粘膜下組織が過大評価されている可能性がある。或いは
、腸粘膜下組織−軟骨性組織複合物が厚くなるにつれて、栄養素の拡散が制限さ
れ、それが軟骨細胞の生合成および基質蓄積に影響することもあり得る。

【００９９】 腸粘膜下組織上で培養された軟骨細胞によって合成されるプロテオグリカン集
団のサイズは、深部関節軟骨から分離したそれと部分的に一致した。しかし、in
vitro 集団はより大きいプロテオグリカンを含んでいた。以前の研究では、細
胞外基質に培養したウサギ軟骨細胞を刺激して、組織培養用ポリスチレン上に培
養した場合よりも大きいプロテオグリカン類を合成した。さらに、腸粘膜下組織
は線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、変換増殖因子β（ＴＧＦ−β）関連タン
パク質を含む。これらは両方とも軟骨細胞を刺激してより大きいプロテオグリカ
ンを合成することが証明されている。そこで、腸粘膜下組織が軟骨細胞に影響を
与えて、より大きいプロテオグリカンを in vitro 合成する可能性がある。

【０１００】 腸粘膜下組織−軟骨性組織複合物で表面を再形成した関節欠損は生育能力のあ
る移植片を含むとはいえ、その修復は１カ月目では最適でなかった。これは多分
、パンヌス形成を起こす不十分なグラフト固定等、技術的理由によるものであっ
た。グラフトが結合するためには良いグラフト固定が重要であると考えられる。
固定法として圧入を利用する研究者もいるが、本研究においてこのやり方は欠損
中のグラフトに凹み形状を与えてしまった。形成されたパンヌスがこの問題をさ
らに悪化させるかも知れない。その他の固定法でより良いグラフト結合が生成す
るかも知れない。例えば一つの研究においては、軟骨外グラフトを骨心に縫合し
、それから欠損部に圧入する。この方法を用いて腸粘膜下組織に、より硬い支持
体を与えると、移植片レベルを隣接軟骨表面レベルに保つことができるかも知れ
ない。

【０１０１】 腸粘膜下組織−軟骨性組織を移植した欠損と、未充填の自然修復欠損との間に
全体的組織学的スコアの差はなかったとはいえ、その欠損部の組織の型および染
色で得られるスコアは腸粘膜下組織−軟骨性組織群の方が有意に高かった。これ
は、未充填欠損が線維軟骨性修復組織のみを含んでいたのに対し、上記移植片は
ヒアリン様外観を有したためであった。線維軟骨は時間の経過につれて変性を受
けるため、より劣ると考えられる。

【０１０２】 腸粘膜下組織のみでは、欠損部に置かれた場合、骨による置換が起きなかった
。ただしこの置換が起きるための期間としては１カ月は短すぎるかも知れない。
移植を受けなかった欠損に見られるのと同様に、上記欠損に線維軟骨性充填が起
きないのは、腸粘膜下組織がこの組織の形成を阻害または阻止することを示唆す
るものである。関節欠損が軟骨下骨を破壊する際には、骨髄に存在する間葉性幹
細胞が欠損に侵潤し、分化して線維軟骨性修復組織を生成する。^1.3.42腸粘膜下
組織がこの侵潤を阻止するバリヤーとして働くことはあり得る。

【０１０３】 以上をまとめると、腸粘膜下組織は軟骨性組織のin vitro形成を援助する。腸
粘膜下組織−軟骨性組織グラフトは関節に移植されて生存し、隣接軟骨と融合す
ることができる。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１０月１０日（２０００．１０．１０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 リンドバーグ，クリスティーナ アメリカ合衆国・インディアナ州 47906・ウェスト ラファイエット・キン グ エルダー ドライブ 1838 Ｆターム(参考） 4B065 AA90X BB23 BB34 BC41 CA44 4C081 AA13 AB05 BA12 CD01 CD11 CD12 CD34 DA01 EA02

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 外側平滑筋層と粘膜の管腔部分の両方から離層された脊椎動
   物粘膜下組織と、 付加一次上皮細胞と を備える改良組織グラフト構成物。
2. 【請求項２】 前記脊椎動物粘膜下組織は、脊椎動物腸組織の筋層および粘
   膜の少なくとも管腔部分の両方から離層された粘膜下層を備える請求項１記載の
   改良組織グラフト構成物。
3. 【請求項３】 前記一次上皮細胞は、一次歯肉上皮細胞および一次食道上皮
   細胞からなる群から選択される請求項１記載の改良組織グラフト構成物。
4. 【請求項４】 前記粘膜下組織は、流動化粘膜下組織である請求項２記載の
   改良組織グラフト構成物。
5. 【請求項５】 前記流動化粘膜下組織は、前記粘膜下組織を可溶化するのに
   十分な期間の間、酵素で消化した粘膜下組織を備える請求項４記載の改良組織グ
   ラフト構成物。
6. 【請求項６】 関節軟骨欠損を修復するための組成物であって、前記組成物
   は 脊椎動物腸組織の筋層および粘膜の少なくとも管腔部分の両方から離層された
   粘膜下層と、 付加一次軟骨細胞と を備える組成物。
7. 【請求項７】 前記粘膜下組織は、流動化粘膜下組織である請求項６記載の
   組成物。
8. 【請求項８】 前記流動化粘膜下組織は、前記組織を可溶化するのに十分な
   期間の間、酵素で消化された粘膜下組織を備える請求項７記載の組成物。
9. 【請求項９】 関節軟骨欠損を修復するために脊椎動物粘膜下組織グラフト
   構成物の能力を高める方法であって、 前記脊椎動物粘膜下組織グラフト構成物をホストに移植または注入する前に、
   前記脊椎動物粘膜下組織グラフト構成物に軟骨細胞を植え付ける段階を備える前
   記方法。
10. 【請求項１０】 前記脊椎動物粘膜下組織グラフト材料をホストに移植また
    は注入する前に、前記植え付けされた脊椎動物粘膜下組織グラフト構成物を、前
    記細胞の増殖を誘発する条件にさらす段階をさらに備える請求項９記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記脊椎動物粘膜下組織は、脊椎動物腸組織の筋層および
    粘膜の少なくとも管腔部分の両方から離層された粘膜下層を備える請求項１０記
    載の方法。
12. 【請求項１２】 歯周囲欠損を修復するために脊椎動物粘膜下組織グラフト
    構成物の能力を高める方法であって、前記脊椎動物粘膜下組織グラフト構成物を
    ホストに移植または注入する前に、前記脊椎動物粘膜下組織グラフト構成物に一
    次歯肉上皮細胞を植え付ける段階を備える前記方法。
13. 【請求項１３】 前記脊椎動物粘膜下組織グラフト材料をホストに移植また
    は注入する前に、前記植え付けされた脊椎動物粘膜下組織グラフト構成物を、前
    記細胞の増殖を誘発する条件にさらす段階をさらに備える請求項１２記載の方法
    。
14. 【請求項１４】 前記脊椎動物粘膜下組織は、脊椎動物腸組織の筋層および
    粘膜の少なくとも管腔部分の両方から離層される粘膜下層を含む請求項１２記載
    の方法。