TWI283173B - Fabrication of a cartilage implant - Google Patents

Description

1283173 明說明逢政日3 ··發明所屬之技術領域、先前技術、內容、實施方式友圖式簡單說明) 【發明所屬之技術領域】 本發明關於一種軟骨植入材的製造方法，係於三維結構的基材中植入 並培養軟骨細胞。 【先前技術】 軟骨組織之自行修復能力相當有限，一旦軟骨組織受到損傷，僅能藉 由纖維軟骨（fibrocartilage)小幅度的自行修復，而纖維軟骨之生化性質、 機械性質與物理性質均較正常軟骨來的差，因此受損的軟骨組織經常走向 退化的命運。 目别針對軟月再生的療法包括·碳纖維检（carb〇n plug )、骨膜 (periosteum)、軟骨膜（periochondrium)、軟骨下骨鑽孔術（subch〇ndral drilling)以及自體軟骨細胞移植術（aut〇i〇g〇us此⑽办沉炸tranSpiantati〇n)。 然而大多數療法之效果無法達到像天然修復之軟骨的力學性質或物理性 質。因此，由於臨床上治療軟骨缺損之需要，係導致利用分離的軟骨細胞 或間葉幹細胞（mesenchymal stem cells)開發活體外製造軟骨植入材之方法。 【發明内容】 本發明係有關一種軟骨植入材。 本發明之一貫％態樣係藉由植入軟骨細胞（chondrocytes)或間葉幹細 胞（mesenchymal stem cells)至三維結構之基材（substrate)以製造一軟骨 15 1283173 植入材之方法。此基材係包含第一型膠原蛋白之任意再纏繞的①螺旋單體 (randomly rewound α-helical monomersof type I collagen)，並且可選擇性的 進一步包括第二型膠原蛋白之任意再纏繞的α-螺旋單體（randomly rew〇und a_helical monomers of type II c〇Uagen)。此細胞基材構造係放置於培養基 中。間葉幹細胞係可藉由於培養基中加入分化因子，誘導使其分化為軟骨 細胞，而當軟骨細胞於基材中增生與分化時，其將分泌細胞外基質蛋白 (extracellular matrix proteins)，例如：蛋白多醣（pr〇te〇glycan)與第二型 膠原蛋白，直到形成軟骨植入材。 軟骨細胞或間葉幹細胞、第一型膠原蛋白與第二型膠原蛋白可由二至 三種不同的動物來源製備，例如：人類的軟骨細胞可與牛的第一型膠原蛋 白與第二型膠原蛋白合併使用。軟骨細胞或間葉幹細胞與基材可放置於一 旋轉震盪培養瓶以提供適合軟骨形成之微環境（micr〇envir〇nment)。 本發明亦包括利用前述方法所製得之軟骨植入材，此軟骨植入材係包 含一軟骨細胞被包覆於三維結構之基質（matrix)，亦即軟骨植入材之細胞 卜成刀此基貝（matrix)之組成成分係不同於前述之基材（substrate)，例 如：因為降解（degradation)的緣故，基質包含較少量的第一型膠原蛋白之 任意再纏繞的α-螺旋單體，並且基質尚含有其包覆的軟骨細胞所合成的第 一型膠原蛋白。基質包覆的軟骨細胞係包括基質内部與附著與基質表面之 軟骨細胞。 本^明供一方法可有效率地製造低免疫性的（l〇W immunogenic )軟 骨植入材。本發明之實施態樣之細節將於下述說明中闡明，本發明之其他 16 1283173 特色、目的與優勢將可由發明内容與申請專利範圍而得知。 【實施方式】 本發明為製造軟骨植入材之方法，具體而言，係將軟骨細胞或間葉幹 細胞被包覆於含有第一型膠原蛋白之任意再纏繞的士螺旋單體之三維結構 基材，此類細胞-膠原蛋白構造可置於培養基中以生長成軟骨植入材。 基材可以包含僅苐一型膠原蛋白，或包含第一型膠原蛋白與第二型膠 原蛋白。第一型膠原蛋白提供本發明之軟骨植入材之結構上的支撐，第一 | 型膠原蛋白則是骨骼、皮膚以及肌腱的基本組成成分，也是成熟瘢痕 (cicatrix)，即疤痕（scar)，之主要膠原蛋白類型，第一型膠原蛋白可從肌 腱組織中萃取並純化（Lai，美國專利第5,876,444號，1999年）。第二型膠原 蛋白則是軟骨的主要膠原蛋白類型，第二型膠原蛋白可以幫助保持軟骨細 胞或間葉幹細胞的增生與分化能力，第二型膠原蛋白可以如下述由軟骨組 織中萃取並純化。 本發明之方法中’第一型膠原蛋白與第二型膠原蛋白的α_螺旋單體係於鲁 基材中任意再纏繞。由此基材巾所包覆並生長的軟骨細胞或間葉幹細胞所_ 形成的軟骨植入材具有出乎意外的低免疫性。任意再纏繞之第一型膠原蛋 白或第二型縣蛋自的―旋單體係可如下述方法製備：⑴將第—型或 第二型膠原蛋白溶解於酸性溶液以解開其三維螺旋結構，並且利用蛋白酶 部分消化（digest) ’以及⑵使解開之第一型或第二型膠原蛋白的α_螺旋 單體任意重新纏繞，參見美國專利第5,876,444號》當製作含有第一型或第 二型夥原蛋白之基材時，第二型對第-型的比值，較佳係介於重量比^2 17 1283173 (例如1··1·2, 1··1·5與1:1.7)的範圍間。當解開的第一型或第二型膠原蛋白 的〜螺旋單體混合時，第一型膠原蛋白單體可與第二型膠原蛋白單體一起 纏繞形成雜交寡聚合物（hybrid oligomers)。 軟骨細胞或間葉幹細胞可分別從關節軟骨與骨髓中獨立出來，細胞培 養至次高緻密度（subconfluence)後種植於前述之基材中。使用的細胞數量 與基材量可根據熟習此技術之人士之經驗或依照下述之範例來執行。將此 細胞基材構造置於培養基中使其生長，若使用間葉幹細胞來製造軟骨植入 材，則培養基内應加入分化因子（例如：IL-1與德沙美松（dexamethas㈣ 以誘導間葉幹細胞分化成軟骨細胞。此構造係可培養於一旋轉震盪的彡立養 槪，並且出乎意外的，此構造置於旋轉震盪的培養瓶中較置於靜態培養瓶 中生長迅速。軟骨植入材的形成需要數週，軟骨植入材可放置於一密封、 無菌之含有組織培養基之箱子，於室溫中保存數天，再移植、鑄模以及植 入患者身上。當軟骨植入材運送至患者處但不會立即使用時，可再次於前 述環境下儲存數天。 本發明亦包含_前述方法所製得之軟·人i即使錄骨植入材 利用不同動物來源的軟骨細胞或間葉幹細胞、第_型膠原蛋白與第二型膠 原蛋白’此軟骨植入材用於修復軟骨缺損時(例如：動關節（diarthr〇tic j〇ints) 以及脊椎間盤（intervertebral disk))，仍具有低免疫性，例如：由兔子關節 軟骨所分離出的軟骨細胞，可與由大鼠（rat)尾巴所分離出的第一型膠原 蛋白以及兔子軟骨㈣二鄉縣自互祕合赠造齡植讀。出乎意 外地，此植入材可用來修復兔子膝關節的軟骨缺損。 1283173 以下之實施例僅供說明，而不宜以任何方式縮限本發明所揭露之範 命相4不需進一步闡述，熟席本領域者均能依據本文之描述充分實施本 發明’本文中所引述之著作均以全文檢附於參考資料中。 19 1283173 (guanidine-HCl)移除醣蛋白後，用 〇·5Μ 醋酸（acetic acid)與 lmg/ml胃蛋白酶（pepsin)溶解萃取物。加入〇.9M NaCl以沉澱 膠原蛋白，用70%酒精清洗數次以充分去除酸與鹽份，之後溶於 1M NaCl 與 0·05 M Tris 緩衝液（ρΗ7·4)。增加 NaCl 到 3·5Μ 以 獲得沉澱，將上清液移去，加入4.5MNaCl以沉澱第二型膠原蛋 白，將沉澱物用70%酒精清洗數次後，再次溶解於lOmM之醋酸 到最終濃度為2〜4 mg/ml。 (3) 分離與培養軟骨細胞 由新生的紐西蘭白兔之關節軟骨分離出軟骨細胞（Lai， Doctoral Thesis of Medical Sciences, Faculty of Medicine, Harvard University，1993)，將組織切片隔夜培養於含有lmg/mi玻璃糖醛 酸酶（hyaluronidase)與lmg/ml蛋白酶之Hank’s平衡鹽溶液 (Hank，s Balance Salt Solution (HBSS))。離心後，用含有 1〇% 月台 牛血清（FBS)、50pg/ml 硫酸慶大黴素（gentamicin sulfate)、100 單位/ml 的盤尼西林 G 鈉（penicillin G sodium)、100 pg/ml 硫酸 鏈黴素（streptomycin sulfate ) and 0.25 gg/ml 抗真菌劑（fUngizone ) 之DMEM重新溶解細胞沉澱物。每10公分培養jdi接種5xi〇5顆 細胞，置於37°C、5%二氧化碳濃度之培養箱，每隔3到4天換 一次培養基，並讓細胞生長至次高緻密度。 (4) 製備軟骨植入材 第一型與第一型膠原蛋白均用伽瑪射線滅菌並分別溶於 20 1283173 5mM HOAc ’膠原蛋白係用胃蛋白酶部分消化以移去末端胜肽 (telopeptide)(參見例如：美國專利第5,876,444號）。將含有第 一型膠原蛋白之溶液與含有第二型膠原蛋白之溶液溫和混合均 勻’視需要將溶液加熱至30〜40°C以幫助混合，第二型對第一型 膠原蛋白的重量比為1:1〜1:2之間。 取(Ι-ΙΟ)χΙΟ6個軟骨細胞1毫升與另外含有2〜4呵偏第一型 與第二型膠原蛋白的溶液1毫升互相混合，軟骨細胞係分別接種 於24個兔子基材（即，基材内含有兔子的第一型膠原蛋白與兔子 的第二型膠原蛋白）與24個大鼠基材（即，基材内含有大鼠的第 一型膠原蛋白與兔子的第二型膠原蛋白），將混合物置於6孔或 24孔（well)的培養盤直到形成聚合物。將軟骨細胞_膠原蛋白之 構造繼續培養於含有特定養份與藥物的DM£M中，特定養分包 括：10〜20%的胎牛血清、HAM’s F-12K、0.3〜0.5mM脯氨酸 (proline)、50 〜70mg/L 維生素 C(ascorbicacid),特定藥物包括·· 硫酸慶大黴素（gentamicin sulfate)、1〇〇 units/ml 的盤尼 西林 G 鈉（penicillin G sodium)、1〇〇 pg/mi 硫酸鏈黴素 (streptomycin sulfate) and 〇·25 ㈣如抗真菌劑（fongiz〇ne)，培 養於37°C、5%二氧；f匕碳濃度之培養箱。 首先將軟骨細胞-膠原蛋白構造於靜置狀態下在培養瓶中培 養3〜5天後，將其中-半，即12個軟骨細胞-兔子基材構造與12 餘骨細胞-大鼠基材構造，移至培養瓶中以㈣—與些許程度 21 1283173 的震盪培養，另一半則繼續留在靜置的培養瓶中。每2〜4天更換 一次培養基，軟骨細胞-膠原蛋白構造在2至4個星期後逐漸形成 軟骨植入材。 將4個軟骨細胞-膠原蛋白構造，即丨個在靜置培養瓶中的軟 骨細胞-兔子基材構造、1個在靜置培養瓶中的軟骨細胞-大鼠基材 構造、1個在旋轉震盪培養瓶中的軟骨細胞·兔子基材構造，以及 1個在旋轉震盪培養瓶中的軟骨細胞-大鼠基材構造，於丨，2,3,4週 移出。將這些構造大致檢視後用10%福馬林（formalin)固定，包 埋於石臘中並以厚度為5-10微米（micron )( Sacura Sledge microtome )切片。組織切片利用蘇木精/伊紅（Hematoxylin/Eosin) 染色’並觀察軟骨細胞的分化情形（chondrogenic differentiation)。 (5)免疫組織化學分析 組織切片與第一抗體（first antibody)(抗第二型膠原蛋白 (anti-type II collagen )及抗軟骨素硫酸鹽（anti-chondrotin sulfate ))或與控制組的空白血清（contr〇l blank serum)共同培養。 第二型膠原蛋白為細胞外間質之軟骨特有的成分，軟骨素硫酸鹽 則為軟骨蛋白多醣的主要成分。此抗原-第一抗體之複合物進一步 與第二抗體…過氧化氫酶結合體（horseradish peroxidase conjugate)共同培養，第二型膠原蛋白與軟骨素硫酸鹽的含量則 藉由偵測與3,3,二氨基聯苯胺（3,3，diaminobenzidine (DAB))形 成第二抗原-抗體複合物後之呈色可以判定。 22 1283173 組織化學結果係摘要於下表一 表一軟骨細胞-膠原蛋白構造之軟骨生成（Chondrogenesis) 容器 膠原蛋白 勒才 培養時間 ~ —-—.— 1週 2週 3週— 4週 旋轉震盪 培勒瓦 大鼠基材 些微的軟骨生成 (Slight chondrogenesis) 月巴厚的軟骨生成 (Hypertrophic chondrogenesis) 肥厚的 軟骨生 成 肥厚的 軟骨生 肥厚的 軟骨生 成 旋轉震盪 培魏 兔子基材 無分化 些微的軟骨生成 肥厚的 軟骨生 成 靜置的培 大鼠基材 無分化 些微的軟骨生成 肥厚的 軟骨生 成 肥厚的 軟骨生 成 靜置的培 她 兔子基材 無分化 無分化 無分化 些· 厚的軟 骨生成 出乎意外地，在旋轉震盪培養瓶的軟骨細胞-大鼠基材構造在 第一週呈現些微的軟骨生成，而在兩週後呈現肥厚的軟骨生成。 在旋轉震盪培養瓶的軟骨細胞-兔子基材構造與在靜置培養瓶的 軟骨細胞-大鼠基材構造在兩週内呈現些微的軟骨生成，而在三週 後呈現肥厚的軟骨生成。至於在靜置培養瓶的軟骨細胞-兔子基材 構造則在三週後仍未呈現軟骨生成的現象，不過在第四周則有些 微肥厚的軟骨生成。 一般而言，相較於靜置培養，在旋轉震盪培養瓶的構造有 較多的骨窩（lacunae)形成於軟骨細胞的周圍，所有類型的軟骨 23 1283173 細胞·膠原蛋白構造多數均能在四星期内形成近似軟骨的外觀。免 疫組織化學分析結果顯示所有的肥厚的軟骨細胞_膠原蛋白構造 均含有第二型膠原蛋白與軟骨素硫酸鹽。 軟骨修復 (1)軟骨缺損與植入術 本實驗使用36隻公紐西蘭白兔，每隻體重約為2 5公斤，平 均年齡為4個月大。對兔子肌肉注射一氣胺酮（Ketamine，1〇〇毫 克/¾升0.65宅升/公斤體重）與甲笨塞嗓( 〇·30 ml/kg體重）的混合物使其麻醉昏迷，先剔除接近膝蓋部位 的皮膚上的毛髮之後用礙液清洗，利用胥賓骨内側法（評啤⑽ medml method)以接近（appr〇ach)膝蓋關節，將鑌骨分離並使 用4毫米鑽孔機將關節軟骨鑽孔，形成一個4毫米的圓形深層缺 損（涵-thictoessdefect)，於股骨内踩（medialfem〇ralc〇ndyle) 形成-孔洞，此_形缺損深度為4絲，並且延伸進入骨趙腔 的海綿骨（cancellous bone)。為避免產生干擾效應（c〇nf_der effect) ’-半的兔子在右膝關節產生缺損，另—半的兔子則在左 膝關節產生缺損。 利用上述之軟骨植入材修復缺損，其中12隻兔子以軟骨細 胞-兔子基材（CRBTCM)處理，另外12隻兔子以軟骨細胞_大鼠 基材（CRTTCM)處理’至於剩下的12隻兔子，則作為手術控制 組不以任何植人材處理，未實施手__節職為完整的膝關 24 1283173 節控制組。 1 ' 2 $ 3週觀察軟f修復狀態，每次犧牲每組三 又兔子’膝蓋關節係整塊移除並且於顯微鏡下觀察，股骨（保丽) 的末端利用福馬林ϋ定、去除料（deealdfied)以及在垂直於缺 知處之方向作矢狀切面解剖，切片係切於缺損處的中央，之後將 才不本用蘇木精/伊紅（Hematoxylin/Eosin)染色並於顯微鏡下觀察。 (2) 顯微鏡觀察 正常關節軟骨呈現半透明的白色與淺黃色的外觀，覆蓋股骨 髁（femoral condyle)的關節末端，手術形成的缺損成凹陷狀，於 第四週時填人亮自色的組織，缺損的顺可以明顯砸分出來， 在第12週時，缺損的表面成為不規則型並呈現纖維化現象。 出乎意料地，於CRBTCM與CRTTCM組中，處理手術的膝 蓋均無發現任何骨關節炎（⑽⑺时旧如），例如··骨刺 (osteophytes)、軟骨侵蝕^節囊膜增生^丽⑷卿版加丨⑽） 等的跡象。手術後4週缺損部位以白色不透明的（〇paque)組織 填入，於12週後兩組均呈現類似軟骨的組織覆蓋於手術部位，修 補的組織外觀呈半透明而且邊緣與健康的組織相結合。 (3) 組織切片 手術较制i且：一個月後發現在傷處與連結處的軟骨呈現輕微 退化，纖維化與片段化之現象，缺損處係藉由纖維母細胞 25 1283173 (fibroblast)結合零星的内生軟骨母細胞（chondroblast)來修復。 2個月後，在傷處與連結處的軟骨呈現_度至重度的軟骨退化、 纖維化與片段化之現象，缺損處係藉由纖維母細胞（fibroblast) 結合部分内生的軟骨母細胞（chondroblast)來修復。三個月後將 缺損的軟骨下骨剝除，並且以纖維組織覆蓋。 CRBTCM與CRTTCM組：在一個月德，缺損處意外地大多 以軟骨母細胞填充’軟骨細胞的型怨從圓形到多角形（polygonal) 都有，軟骨母細胞穿透到軟骨下骨層。兩組均發現在植入處底部 有輕微的發炎現象。 兩個月後，相較於第一個月有更多纖維軟骨（flbr〇cartilage) 產生，並且，在CRTTCM組比CRBTCM組發現有更多的纖維軟 骨。此外，在CRTTCM組發現於植入處有中度發炎現象，然而在 CRBTCM組的楂入處只有輕微的發炎現象。 在3個月後，於CRTTCM組與CRBTCM組的缺損處均被類 似的纖維狀軟骨修復’並且軟骨植入材較周圍的正常軟骨組織要 來的薄。在缺損的邊緣，軟倾人材與周_健康組織結合，兩 組均未發現有發炎的反應。 其他實施態樣 本說明書中描述之所有特徵可以任何方式相互組合。本說明書中的每 -種特徵可以由達到相同的、相等的或相似之目的之另—種特齡代。因 此，除非另有說明’每-個描述之特僅是這—類相當的或相似的系列 26 1283173 特徵之一個實施例。 根據上文詳述，熟習本技術領域之人員能夠輕易了解本發明的基本待 徵’並且在賴縣發明社旨和料之谓本發顿$各觀動和修改 使其適用於各種用途和條件。所以，其他實聽樣也屬於糊要求範圍。

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Claims (1)

1283173 拾、申請專利範圍 1· 一種軟骨植入材之製造方法，至少包括： 將軟骨細胞或間葉幹細胞植入-包含第〆型膠原蛋白之任意再纏轉 的α-螺旋單體之三維結構之基材；及 疋 於則述之基材t生長軟骨細胞或間葉幹細胞； 以製得軟骨植入材。 2·如申請專纖圍第i項所述之軟骨植人材之製造方法，其中前述之美材 可進v包含第一型膠原蛋白之任意再纏繞的以_螺旋單體。 3·如申％專利範圍第2項所述之軟骨植之製造方法 、甲別述之第二 型膠原蛋白係部份消化。 其中前述之第一 其中前述之第_ 4·如申請專·_3柄叙軟倾碌之製造方法 型膠原蛋白係部份消化。 5.如申請專利範圍第2項所述之軟骨植入材之製造方法， 型膠原蛋白係部份消化。 6.如申請專纖圍第2項所述之轉植人材之製造方法 、 务中前述之軟骨 細胞或間葉幹細胞、第-型膠原蛋白與第二型膠原蛋白係I、 不同的動物來源製備。 Τ、坆一種或三種 7·如申請專利範圍第2項所述之軟骨植入材之製造 其中前述之敕晋 細胞或間葉幹細胞與基材係置於一旋轉震盪培養瓶。 1283173 &如中請_第衫植人材之製造 型膠原蛋白係部份消化。 / 〃中則述之第一 9.如申請專概_丨項職錢骨植人材之製 、 細胞或間輸綱—陶細㈣之軟骨 ι〇·如申請專利範圍第i項所述之 月植入材之製造方法，其中前述之軟骨 、‘，田胞或間葉幹細胞與紐敍於—培養瓶。 1L 一種軟骨楂入材之製造方法，至少包括： 將軟骨細胞植入-包含第—型膠原蛋白之任意再纏繞的 α·螺旋單 體之三維結構之基材；及 於前述之基材中生長軟骨細胞； 以製得軟骨楂入材。 12·如申清專利範圍第η工員所述之軟骨植入材之製造方法，其中前述之基 材可進步包含第二型膠原蛋白之任意再纏繞的以.走單體。 13·如申請專利範圍帛12柄述之軟骨植入材之製造方法，其中前述之第 二型膠原蛋白係部份消化。 14·如申請專利範圍第13項所述之軟骨植入材之製造方法，其甲前述之第 型膠原蛋白係部份消化。 15·如申請專利範圍第12項所述之軟骨植入材之製造方法，其中前述之第 一型膠原蛋白係部份消化。 29 1283173 一型膠原蛋白係從不同的動物來源製備。