ES2209107T3 - Matriz colageno-polisacarida para la reparacion de huesos y cartilago. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan una matriz y un procedimiento para prepararla para soportar el crecimiento de tejido, tal como hueso, cartílago o tejido blando. Se hace reaccionar un polisacárido con un agente oxidante para abrir los anillos de azúcar del polisacárido para formar grupos aldehído. Los grupos aldehído se hacen reaccionar para formar enlaces covalentes con el colágeno.

Description

Matriz colágeno-polisacárida para la reparación de hueso y cartílago.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a las matrices entrecruzadas colágeno-polisacáridas para la reparación terapéutica de tejido, tal como hueso, cartílago y tejido blando; procedimientos de producción de tales matrices; y describe cómo se utilizan los mismos en los procedimientos de reparación de tejido. La presente invención proporciona una matriz entrecruzada colágeno-polisacárida que se administra sola o en combinación con otras actividades terapéuticas, tal como factores de crecimiento para la reparación de tejido. La presente invención también proporciona una matriz entrecruzada colágeno-polisacárida que comprende, adicionalmente, fibrina.

Antecedentes de la invención

Existe una demanda clínica de una matriz de injertación ósea que ofrezca propiedades osteoconductoras iguales a las del hueso autógeno y que pueda producirse en cantidades ilimitadas. Aunque existe disponibilidad de algunos sustitutos de hueso, muchos de ellos consisten en materiales de difícil manejo físico y malas características de resorción que complican su utilización y evaluación radiográfica.

Similarmente, no existe un producto comercial consistentemente efectivo que permita el mantenimiento del fenotipo de condrocito del tejido cartilaginoso, a pesar de años de investigación extensiva. Entre las estrategias anteriores de facilitación de la reparación de cartílago dañado se incluyen el transplante de cartílago ya existente procedente del huésped y/o la implantación de dispositivos prostéticos. Las limitaciones de estos procedimientos son la disponibilidad de tejido donante y la limitada vida útil de los implantes prostéticos. Más recientemente, se ha utilizado el cultivo ex vivo de condrocitos maduros sobre soportes poliméricos en un intento de generar material de injerto de cartílago, aunque esto todavía no ha sido aceptado ampliamente, en parte porque involucra dos procedimientos quirúrgicos: uno para la recolección de los condrocitos, y el segundo, para implantarlos después de su expansión in vitro.

Los colágenos y glicosaminoglicanos son dos clases de biomaterial adecuadas para su utilización en regeneración ósea. Se han utilizado matrices basadas en colágeno en la injertación ósea. El colágeno tipo I tiene buenas propiedades de adhesividad celular, en particular para células osteoblásticas formadoras de hueso. El colágeno tiene la capacidad de servir como material activo o como material inerte de andamiaje para el crecimiento.

El ácido hialurónico es un componente natural de la matriz extracelular del cartílago, y se esteriliza fácilmente, es biodegradable y puede ser producido en un amplio rango de consistencias y formatos. Generalmente es biocompatible y sus características de resorción pueden controlarse mediante la manipulación de los monómeros para formas de polímero, más habitualmente a través de la esterificación de los grupos carboxílicos de los residuos de ácido glucurónico.

El dextrán sulfato es un derivado poliónico de dextrano similar a un glicosaminoglicano, el cual se ha demostrado que es útil como biomaterial y como fármaco para el tratamiento de la hiperlipidemia. Se produce por esterificación del dextrano, un polímero hidrofílico de la glucosa sintetizado por ciertas cepas bacterianas.

La solicitud de patente internacional nº WO 96/25961 da a conocer una matriz resorbible para la reconstrucción de tejido cartilaginoso, que comprende fibras de colágeno y un glicosaminoglicano.

El pegamento biológico que comprende fibrina tiene una larga historia como dispositivo médico de adhesión de tejidos, y se cree que está comercialmente disponible en Europa (patente estadounidense nº 5.260.420, expedida el 9 de noviembre, 1993). Un obstáculo que limita su aplicación es sus cortos tiempos de rotación y residencia, el cual se encuentra entre pocos días y unas cuantas semanas, dependiendo del sitio de implantación. Se ha dado a conocer la incorporación de fibras de colágeno en el pegamento de fibrina (Sierra et al., 1993, Trans. Soc. Biomater., vol. 16:257 y patente estadounidense nº 5.290.552). Sin embargo, se requieren tiempos de coagulación más largos para las composiciones de colágeno/fibrina en comparación con la fibrina sola.

Mientras que estos materiales han sido utilizados separadamente o en combinación con otros materiales, hasta el momento no se han dado a conocer combinaciones y procedimientos para realizar combinaciones de tales materiales con el fin de formar una matriz ventajosa para la reparación de hueso, cartílago, y/o tejido blando que no utilice agentes entrecruzantes o de unión iónica externos. Sigue existiendo una necesidad de matrices biodegradables y biocompatibles que mantengan su integridad estructural y que puedan utilizarse para reparar tejidos sin recurrir a procedimientos de cultivo ex vivo no deseables.

Sumario de la invención

La presente invención da a conocer matrices entrecruzadas colágeno-polisacáridas, procedimientos para la preparación de tales matrices. También se describen los procedimientos de utilización de las matrices en la reparación de tejido, tal como, hueso, cartílago y tejido blando. El colágeno puede ser colágeno purificado, nativo o modificado de cualquier tipo. En una realización, el colágeno es colágeno tipo I, y en otra realización, el colágeno es colágeno tipo II.

El tipo de polisacáridos que pueden utilizarse incluye el ácido hialurónico, condroitina sulfato, dermatán sulfato, keratán sulfato, heparano, heparán sulfato, dextrano, sulfato dextrano, alginato, y otros polisacáridos de cadena larga. En una realización preferida, el polisacárido es ácido hialurónico.

Puede utilizarse una matriz entrecruzada colágeno-polisacárida de la presente invención por sí sola para dirigir el crecimiento del tejido; en combinación con un factor de crecimiento para inducir el crecimiento de tejido; en combinación con fibrina para anclar la matriz en los sitios con defectos del tejido, o en combinación con factor de crecimiento y fibrina.

Entre los factores de crecimiento que pueden utilizarse en una matriz de la presente invención se incluyen, pero sin limitación, miembros de la superfamilia TGF-\beta, incluyendo TGF-\beta1, 2 y 3, proteínas morfogenéticas óseas (BMP), factores de crecimiento/diferenciación (GDF), y ADMP-1; miembros de la familia de factores de crecimiento fibroblástico, incluyendo factor de crecimiento fibroblástico ácido y básico (FGF-1 y -2); miembros de la familia de proteínas del erizo, incluyendo el erizo indio, erizo sónico y erizo del desierto; miembros de la familia del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), incluyendo IGF-I y -II; miembros de la familia del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), incluyendo PDGF-AB, PDGF-BB y PDGF-AA; miembros de la familia de las interleuquinas (IL), incluyendo IL-1 a 6; y miembros de la familia del factor estimulante de colonias (CSF), incluyendo CSF-1, G-CSF, y GM-CSF.

El procedimiento para la preparación de la matriz colágeno-polisacárida de la presente invención comprende las etapas de oxidación de un polisacárido exógeno para formar un polisacárido exógeno modificado con grupos aldehído, y la reacción del polisacárido exógeno modificado con colágeno bajo condiciones tales que los grupos aldehído reaccionan covalentemente con colágeno para formar una matriz entrecruzada. El procedimiento puede comprender, adicionalmente, la etapa de adición de un factor de crecimiento a la matriz. Puede añadirse un factor de crecimiento antes o después de la etapa de reacción del polisacárido modificado con el colágeno.

La fibrina utilizada en una matriz colágeno-polisacárida de la presente invención se prepara poniendo en contacto una matriz preformada con una fuente de fibrinógeno y trombina, o mediante la combinación de fibrinógeno y trombina con el polisacárido exógeno modificado y colágeno en el momento de la reacción. Alternativamente, pueden añadirse fibrinógeno y trombina de una matriz colágeno- polisacárida a otra matriz colágeno-polisacárida preformada. Por lo tanto, la presente invención también comprende un procedimiento para preparar una matriz colágeno-polisacárida entrecruzada que comprende fibrina.

La presente invención es de utilidad en los procedimientos que utilizan una matriz colágeno-polisacárida entrecruzada para conducir el crecimiento de tejido al administrar la matriz en los sitios donde se desea la reparación del mismo. Puede administrarse la matriz en combinación con un factor de crecimiento con el fin de inducir el crecimiento de tejido en los sitios donde se desea la reparación. Puede administrarse una matriz que comprenda, adicionalmente, fibrina con el fin de anclar la matriz en los sitios deseados, tal como, en los sitios con defectos del tejido.

En su utilización en este comentario, "reparación" se define como crecimiento de tejido nuevo. El tejido nuevo puede ser o no ser idéntico fenotípica o genotípicamente al tejido original perdido. En su utilización en este documento, "regeneración de tejido" significa que el tejido nuevo que ha crecido es idéntico al tejido perdido. La reparación de tejido también puede ser el resultado de la sustitución de tejido perdido con tejidos no idénticos, por ejemplo, la sustitución de cartílago articular hialino con fibrocartílago en un defecto articular. Las propiedades celulares básicas involucradas en la reparación incluyen la adhesión, proliferación, migración y diferenciación.

Por "conducción", se hace referencia a que el tejido huésped, por ejemplo, hueso, cartílago o tejido blando, crece por extensión de tejido existente sobre la matriz colágeno-polisacárida entrecruzada, o hacia el interior de la misma. En la conducción, las células de reparación se mueven sobre la matriz y hacia su interior, sintetizando y remodelando nuevo tejido idéntico al tejido huésped circundante. Por inducción se hace referencia a que se estimula el crecimiento y diferenciación de células madre de reparación. Estas células madre continúan sintetizando y remodelando nuevo tejido, haciendo que sea continuo con el tejido huésped circundante.

En su utilización en este documento, un defecto del tejido puede ser el resultado de una condición congénita, trauma, cirugía, cáncer u otra enfermedad.

En su utilización en esta discusión, un polisacárido exógeno se refiere a un polisacárido libre.

Pueden variarse las proporciones entre colágeno y polisacárido con el fin de cambiar las propiedades físicas y biológicas de la matriz. Una proporción más elevada de colágeno resultará en una matriz más porosa y esponjosa. Una mayor proporción de polisacárido resultará en una matriz más similar a un gel.

Descripción de las realizaciones preferidas

El procedimiento para la preparación de una matriz de la presente invención comprende las etapas de apertura de anillos de azúcar de un polisacárido exógeno y de oxidación de los grupos hidroxilo terminales de aldehídos utilizando, por ejemplo, peryodato sódico o potásico como agente oxidante selectivo. La cantidad de grupos aldehído producidos de esta manera puede controlarse estequiométricamente. Típicamente, pueden abrirse de esta manera entre, aproximadamente, 1% y 50% de los anillos. Más preferiblemente, se abren entre, aproximadamente, 1 y 5% de los anillos para formar grupos aldehído. Estos grupos aldehído pueden formar entrecruzamientos covalentes con el colágeno en sitios amina en las cadenas peptídicas del colágeno. Debido a que los grupos aldehído se forman in situ sin la adición de un compuesto entrecruzante separado, se cree que la distancia intermolecular entre el esqueleto de la cadena polisacárida y la cadena de colágeno, la cual está entrecruzada con ella, es menor que la distancia correspondiente utilizando un compuesto entrecruzante. De acuerdo con lo anterior, los esqueletos polisacárido y de colágeno están unidos de manera relativamente íntima, lo que da lugar a una estructura ventajosa para el fin de proporcionar una matriz que soporte, conduzca o induzca el crecimiento de hueso, cartílago o tejido blando.

El producto de partida para la producción del colágeno puede ser colágeno purificado, nativo o modificado de cualquier tipo. Un colágeno preferido para el crecimiento óseo es el colágeno tipo I, mientras que un colágeno preferido para el crecimiento de cartílago es el colágeno tipo II. El colágeno puede entrecruzarse o no entrecruzarse, pero es preferible que el colágeno no esté entrecruzado, para proporcionar mayor accesibilidad a los grupos laterales para su entrecruzamiento con los grupos aldehído de los polisacáridos. Si se utiliza colágeno tipo I para la reparación de tejido donde se desee enmascarar el sitio inherente de adhesión celular, tal como en la reparación de cartílago, pueden enmascararse los sitios de adhesión mediante el uso de polisacáridos no adherentes a células para permitir la mayor interacción y adhesión célula-célula.

El tipo de polisacáridos que pueden utilizarse incluye ácido hialurónico, condroitín sulfato, dermatán, dextrán sulfato, alginato, y otros polisacáridos de cadena larga. Típicamente, el polisacárido tendrá un peso molecular medio de aproximadamente 1.000 a 10.000.000 DA.

Los reactivos para abrir los anillos de azúcar en el polisacárido exógeno pueden ser cualquier agente oxidante selectivo que oxide un grupo hidroxilo terminal a aldehído, tal como periyodato potásico o sódico. Otros reactivos incluyen oxidasas específicas de azúcares.

El polisacárido preferido es el ácido hialurónico. La proporción relativa de polisacárido a colágeno conferirá diversas características físicas y biológicas a la matriz. La proporción entre polisacárido y colágeno puede caracterizarse como proporción molar o como proporción en peso. Típicamente, la proporción en peso de colágeno a polisacárido está entre 99:1 y, aproximadamente, 1:99. Esto representa una proporción molar aproximada de 99,9:0,1 a 1:9, respectivamente, suponiendo un peso molecular medio de 1.000.000 daltons para el ácido hialurónico y de 100.000 daltons para el colágeno. La proporción molar puede variar dependiendo del peso molecular real del polisacárido y colágeno utilizados. En una realización preferida dada a conocer en este documento, la proporción en peso de colágeno a polisacárido está entre 9:1 y aproximadamente 1:9.

Pueden modificarse las proporciones entre colágeno y polisacárido con el fin de modificar las propiedades físicas y biológicas de la matriz. Biológicamente, una mayor proporción de colágeno tipo I imitará de manera más fidedigna la composición y arquitectura del hueso, mientras que una mayor proporción de colágeno tipo II imitará mejor la composición del cartílago. Las células formadoras de hueso interaccionarán con sitios específicos de adhesión celular en el colágeno y se dividirán, migrarán y diferenciarán para formar hueso nuevo.

Alternativamente, el incremento en la proporción de polisacárido, preferiblemente ácido hialurónico, imitará mejor una matriz de cartílago natural. Además, una mayor proporción de polisacárido enmascarará algunos sitios específicos de adhesión celular en el colágeno y favorecerá otras interacciones célula-célula y de agregación celular que son importantes durante el desarrollo del tejido cartilaginoso.

Los factores de crecimiento que pueden utilizarse con una matriz de la presente invención incluyen, pero sin limitación, miembros de la superfamilia TGF-\beta, incluyendo TGF-\beta1, 2 y 3, las proteínas morfogenéticas óseas (BMP), los factores de crecimiento/diferenciación (GDF), y ADMP-1; miembros de la familia del factor de crecimiento fibroblástico, incluyendo el factor de crecimiento fibroblástico ácido y básico (FGF-1 y -2); miembros de la familia de proteínas del erizo, incluyendo el erizo indio, erizo sónico y erizo del desierto; miembros de la familia del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), incluyendo IGF-I y -II; miembros de la familia del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), incluyendo PDGF-AB, PDGF-BB y PDGF-AA; miembros de la familia de las interleuquinas (IL), incluyendo IL-1 a -6; y miembros de la familia de factores estimulantes de colonias (CSF), incluyendo CSF-1, G-CSF, y GM-CSF. Las preparaciones de factores de crecimiento se obtienen comercialmente o se aislan y purifican a partir de tejido o de fuentes recombinantes. Los factores de crecimiento pueden introducirse en matrices de colágeno/HA/fibrina en un rango amplio de dosis (rango de fentogramos a miligramos). Factores tales como el coste, seguridad y el perfil de liberación deseado del factor de crecimiento dictarán la cantidad de factor de crecimiento que se añada a la matriz.

La trombina actúa como un catalizador para que el fibrinógeno dé lugar a la fibrina. En la presente invención, se añade fibrina al fibrinógeno en una cantidad suficiente para catalizar la polimerización del fibrinógeno que se utiliza. En una realización, se combinan primero el fibrinógeno y la fibrina y, a continuación, se añaden rápidamente a una matriz entrecruzada preformada colágeno-polisacárida, la cual puede añadirse también a otra matriz preformada colágeno-polisacárida. En otra realización de la presente invención, se añaden el fibrinógeno y la trombina individualmente a una reacción que contiene polisacárido exógeno oxidado y colágeno. En esta realización, es deseable mantener separados el fibrinógeno y la trombina, así como el polisacárido exógeno oxidado y el colágeno, hasta la reacción final.

La concentración de fibrinógeno utilizada en la formación de la matriz es preferiblemente de 10 mg/ml o mayor. La trombina se añade al fibrinógeno en un intervalo aproximado de concentración entre 0,01 unidades NIH y 100 unidades NIH/ml, y preferiblemente entre aproximadamente 0,1-2,0 unidades NIH/ml. La trombina se encuentra comercialmente disponible en una diversidad de fuentes, incluyendo Calbiochem-Novabiochem, San Diego, CA. El fibrinógeno puede derivarse de plasma autólogo del paciente, o de fuentes comerciales, tal como Calbiochem-Novabiochem, San Diego, CA.

Puede darse cualquier forma a las matrices de acuerdo con la presente invención, mediante liofilización, o laminado en húmedo y secado al aire en moldes de la forma deseada. El material liofilizado o laminado en húmedo con elevada proporción de polisacáridos se le puede proporcionar la forma de gel viscoso para su inyección o aplicación directa en una fractura.

La utilidad de las matrices de acuerdo con la presente invención puede demostrarse mediante ensayos in vitro e in vivo. Para los ensayos in vitro, se siembran en las matrices, células primarias de bóveda craneal de feto de rata, recogidas mediante una serie de digestiones con colagenasas, según el procedimiento de Wong y Cohn (PNAS USA 72:3167-3171, 1975), o células de cartílago epifiseal primario de rata, Thyberg y Moskalewski (Cell Tissue Res. 204:77-94, 1979), o condrocitos articulares de conejo, recogidos mediante el procedimiento de Blein-Sella, O. et al., (Methods Mol. Biol., 43:169-175, 1995), y se cultivan bajo condiciones convencionales durante 1-4 semanas. A continuación, se procesan los cultivos y se evalúan histológicamente.

Puede determinarse la capacidad conductora de las matrices de la presente invención mediante su éxito en dar soporte a la adhesión, migración, proliferación y diferenciación de médula ósea primaria de rata y células estromales, así como condrocitos primarios de rata tratados con ácido retinoico o condrocitos de conejo. Las células de médula ósea y células estromales de médula ósea se asemejan mucho a las células madre de condrocitos en etapa temprana y que se encuentran en la médula ósea subcondral de los defectos de espesor total. La médula ósea se recoge de los huesos largos de ratas de Lewis consanguíneas de 2-3 semanas de edad y se añaden directamente a una matriz y se cultivan durante 2 semanas bajo condiciones estándar. La población de células estromales adherentes que crece a partir de estos cultivos se cultivan y congelan previamente a su utilización. Se utilizan células de hasta seis pasos en cultivo para el cultivo o siembra sobre la matriz.

Los condrocitos tratados con ácido retinoico representan las últimas etapas de la condrogénesis. Se lleva a cabo el tratamiento con ácido retinoico de células primarias previamente a su cultivo o siembra de las células en una matriz candidata (Dietz, U. et al., 1993, J. Cell Biol. 52(1):57-68).

En un procedimiento alternativo, se combinan estudios in vitro de los condrocitos de etapas tempranas y tardías para permitir que las células estromales preparen las matrices y a continuación se sustituyan con condrocitos más maduros. De esta manera, puede ensayarse la evolución de las matrices durante las etapas tempranas de condrogénesis con el fin de detectar efectos sobre etapas posteriores del proceso.

Se realiza un seguimiento de la adhesión y proliferación celular sobre la matriz mediante un ensayo MTS que puede medir el número y viabilidad celular a partir de la actividad mitocondrial. Se cultivan células estromales o condrocitos sobre matrices durante 6-18 horas en presencia o ausencia de suero para análisis de adhesión, y durante 1-2 semanas para una evaluación de la proliferación.

Para el ensayo de migración celular, se recubren o aplican las matrices sobre cultivos de membrana porosa Trans-well (Corning). Las células estromales se siembran sobre las matrices en la cámara superior del Trans-well y se introduce un quimoatrayente (factor de crecimiento, PDGF) en la cámara inferior. Tras 12-18 horas de cultivo se cuantifican mediante ensayo MTS las células que han migrado a través de la matriz hasta la cara inferior de la membrana Trans-well. Se retiran las matrices de la cámara superior y se procesan histológicamente para evaluar el grado de infiltración.

Los análisis de marcadores de diferenciación relevantes en la condrogénesis y osteogénesis se evalúan a nivel transcripcional y proteico. Entre los marcadores específicos que pueden analizarse se incluyen: 1) colágeno tipo II e isoformas IIA y IIB; 2) proteoglicano aggrecan; 3) colágeno tipo IX, X y XI; 4) colágeno tipo I; 5) proteína matricial de cartílago (CMP); 6) factor transcripcional Cart-1; 7) fibronectina (isoformas EDA, EDB); 8) proteoglicano decorin; 9) proteína de enlace; 10) proteoglicano NG-2; 11) proteoglicano biglycan; 12) fosfatasa alcalina. La diferenciación puede medirse mediante análisis Northern/PCR, Western blotting o mediante marcaje metabólico de células.

Para el análisis Northern/PCR, se aisla el ARN mediante procedimientos estándar a partir de células estromales o de condrocitos cultivados sobre matrices compuestas. Pueden utilizarse ensayos de curso temporal para determinar los períodos de cultivo óptimos, los cuales varían entre 1 y 6 semanas dependiendo del tipo celular. Se analiza el ARN aislado mediante gel Northern y técnicas de hibridación con sondas amplificadas por PCR o ADNc. El análisis Northern se cuantifica mediante escaneo densitométrico de autorradiografías y normalización respecto a las señales génicas de propio mantenimiento("housekeeping") (G3PDH). Puede complementarse el análisis Northern con análisis PCR cuantitativo utilizando cebadores generados a partir de secuencias ADNc publicadas de los genes a analizar.

Para el Western blotting, se aislan lisados proteicos solubilizados de células cultivadas sobre matrices compuestas mediante técnicas estándar (Spiro R.C., et al., 1991, J. Cell. Biol., 115:1463-1473). Tras el lisado de las células, se extraen las matrices en desnaturalizantes más fuertes (urea 8 M, GnHCL) para eliminar y examinar las proteínas incorporadas o unidas a la matriz. Se analizan las muestras de proteínas mediante técnicas estándar de Western blotting utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos.

Para el marcaje metabólico celular, se marcan metabólicamente con isótopos radioactivos como ^{35}SO_{4}, ^{35}S-metionina o aminoácidos marcados con ^{3}H/^{14}C mediante técnicas estándar, células cultivadas sobre una matriz compuesta (Spiro et al., supra). Se inmunoprecitan cuantitativamente las proteínas solubilizadas celulares y asociadas a la matriz con anticuerpos específicos de la proteína de interés y se analizan por SDS-PAGE (Spiro et al., supra). Se lleva a cabo la cuantificación de los resultados mediante escaneo densitométrico de autorradiografías y las señales se normalizan respecto a equivalentes celulares o a una proteína de mantenimiento celular tal como la actina.

Adicionalmente, puede examinarse la capacidad de una matriz de la presente invención para dar soporte a la diferenciación condrogénica in vivo en un modelo de implante de tejido blando de rata consanguínea. Se siembran a densidad elevada células de médula ósea o células estromales de rata, descritas anteriormente, sobre matrices, se cultivan durante la noche en medio MEM que contiene suero FBS al 10% y antibióticos, a continuación se transfieren a cámaras de difusión Millipore y se implantan intraperitonealmente o subcutáneamente en ratas receptoras de 8 semanas de edad. Se recolectan las cámaras tras 3 semanas y se evalúan histológicamente para la formación de cartílago.

Se utiliza un modelo de transplante en ratas de cría exogénica para evaluar la capacidad de las matrices compuestas de mantener el fenotipo cartílago in vivo. Se siembran condrocitos de cartílago costal y se cultivan durante la noche en medio Ham F-12 que contiene suero de rata al 1% y antibióticos. Se implantan entonces las matrices sembradas en bolsas de los músculos tibiales-posteriores generadas mediante la disección roma en ratas macho Sprague-Dawley de 8 semanas de edad. Se extraen explantes a los 14 y 28 días y se evalúan histológicamente en cuanto a la compatibilidad de la matriz, crecimiento de cartílago, y mantenimiento del fenotipo diferenciado basándose en la tinción para aggrecan y colágeno tipo II.

Además, la capacidad de una matriz de la presente invención de interaccionar con proteínas de la matriz extracelular (proteoglicanos, proteínas y factores de crecimiento) que se encuentran en el suero circundante, en líquido tisular, o en productos de secreción de células madre de condrocitos, se correlacionan con el potencial conductor de condrocitos de una matriz. La interacción de las matrices de la presente invención con proteínas de la matriz extracelular puede medirse por medios conocidos por los expertos en la materia tal como Western blotting, técnicas de coelectroforesis de afinidad y técnicas de ensayo de unión.

Para ensayar la unión de proteínas séricas a una matriz de la presente invención, se incuba la matriz en medios de cultivos que contienen cantidades crecientes de suero (diversas especies y fuentes). Tras lavar, se eluyen las proteínas unidas mediante ebullición en tampón de muestra para SDS-PAGE y la matriz insolubilizada se elimina por centrifugación. El análisis SDS-PAGE se utiliza para documentar preliminarmente el patrón de unión de las matrices. A continuación, se lleva a cabo un Western blotting para identificar componentes unidos específicamente, tal como fibronectina y vitronectina.

Se utiliza la coelectroforesis de afinidad para analizar la unión de proteoglicanos a una matriz de la presente invención. Se introduce proteoglicano (aggregan) marcado con ^{35}SO_{4} o yodado, el cual se ha aislado de vacas y ratas (u otras fuentes), en geles ACE (Lee, M.K. et al., 1991, 88:2768-2772) que contienen matrices compuestas o andamiajes de colágeno solos. Se toma la afinidad de unión de aggrecan para los andamiajes de colágeno, con y sin ácido hialurónico o dextrán sulfato, como una medida de la capacidad de las matrices compuestas de organizar una matriz de cartílago.

Una evaluación de las interacciones proteicas con matrices compuestas basadas en colágeno puede verse potencialmente dificultada por el gran exceso de proteína colágeno. Los andamiajes de colágeno tienen suficiente integridad estructural inherente y están entrecruzados en grado suficiente para evitar su solubilización completa, pero algo de proteína colágeno puede solubilizarse en el tampón de muestra para SDS-PAGE. De esta manera, esto podría entorpecer la visualización de otras proteínas unidas, en particular de los colágenos sintetizados celularmente, y podría causar también mucho ruido de fondo en los análisis de Western blot. Por lo tanto, un enfoque alternativo es la utilización de proteínas marcadas radioactivamente o biotiniladas para el análisis de unión. Las proteínas séricas pueden biotinilarse previamente a la incubación con las matrices compuestas y, a continuación, revelarse con reactivos basados en avidina. Ambos enfoques permiten la visualización de componentes asociados a la matriz sin la interferencia de la proteína colágeno de andamiaje.

Alternativamente, el cambio en expresión de colágeno tipo I a tipo II y el procesamiento del transcrito del colágeno tipo II desde la isoforma de tipo IIA a la de tipo IIb (Sandell, L.J. et al., 1991, J. Cell Biol. 114:1307-1319) se miden por medios conocidos por los expertos en la materia con el fin de determinar el grado de diferenciación a lo largo de una ruta de generación de condrocitos. Además, la expresión del proteoglicano asociado al cartílago, aggrecan (Schmid, T.M. et al., 1985, J. Cell Biol. 100:598-605 y Kuettner K.E. 1992, Clin. Biochem. 25:155-163) y un factor transcripcional de homeoproteína de cartílago (Cart-1) parecen ser marcadores para células comprometidas en el linaje condrocítico.

Para los ensayos in vivo, se evalúan las matrices en cuanto a su capacidad de dar soporte a la cicatrización ósea en un modelo de defecto craneal de rata mediante la implantación en un defecto de 5 mm por 3 mm generado en huesos parietales de ratas Sprague-Dawley de 6 semanas de edad. Se evalúan los defectos a los 28 días mediante análisis radiográfico e histológico.

El modelo in vivo para la reparación de cartílago es un defecto de cartílago articular de espesor total en el conejo (Amiel et al., 1985, J. Bone Joint Surg. 67A:911). Se generan defectos que miden, aproximadamente, 3,7 mm en diámetro y 5 mm de profundidad en el centro de los condilos femorales mediales de conejos blancos New Zealand macho adultos. A continuación, los defectos se rellenan con matriz o se dejan sin rellenar, como controles. Los defectos se evalúan morfológica e histológicamente a las 6 y 12 semanas.

Pueden utilizarse las matrices de la presente invención para el tratamiento de defectos óseos y/o de cartílago asociados con la resección quirúrgica, tal como fusiones espinales; trauma; enfermedad; infección; cáncer o defectos genéticos. Las matrices de acuerdo con la presente invención pueden administrarse por implantación, aplicación directa, o por inyección, dependiendo de la aplicación que se pretenda de la matriz, sus propiedades físicas, y la proporción en peso de colágeno a polisacárido en la matriz.

En un aspecto de la presente invención, se proporciona la matriz con una mayor proporción de colágeno respecto a polisacárido, tiene forma esponjosa y se implanta quirúrgicamente en un sitio donde se desee el crecimiento de nuevo tejido óseo, tal como en fusiones espinales. En un aspecto, la matriz comprende adicionalmente un factor de crecimiento, tal como BMP-2. En otro aspecto, la matriz comprende adicionalmente fibrina para facilitar el anclaje de la matriz en el sitio deseado. En otro aspecto de la presente invención, la matriz tiene una proporción más elevada de polisacárido respecto a colágeno, se le da la forma de un gel viscoso y se aplica directamente o se inyecta en un sitio en el que se desee el crecimiento de nuevo tejido óseo, tal como en el relleno de defectos óseos, reparación de fracturas y relleno de defectos periodontales. En todavía otro aspecto de la presente invención, se da a conocer la matriz con una proporción más elevada de polisacárido, se le da la forma de un gel viscoso y se inyecta directamente o se introduce a través de un procedimiento artroscópico en el sitio donde se desea el crecimiento de tejido cartilaginoso, tal como en daños al cartílago inducidos por lesión, o daños al cartílago inducidos por enfermedad, tal como en osteoartritis o artritis reumatoide.

Como apreciarán los expertos en la materia, la cantidad de matriz a administrar para conducir el crecimiento de tejido óseo o cartilaginoso depende del tamaño del defecto de hueso o cartílago a ser tratado. Como apreciarán los expertos en la materia, el coste, seguridad, y perfil de liberación deseado del factor de crecimiento dictarán el tipo y cantidad de factor de crecimiento que se aplique sobre la matriz.

Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos y no se pretende en modo alguno que sean limitativos de la invención.

Ejemplo 1

El presente ejemplo ilustra la preparación de una diversidad de matrices para su utilización en la reparación de hueso y/o cartílago. En las siguientes matrices, se utilizó colágeno tipo I como material de partida. Colágeno F semed (tipo I, insoluble) y colágeno S semed (tipo I, soluble en ácido) eran de Kensey-Nash. Se prepararon hialurónico-polialdehído, dextrano-polialdehído, dextrán sulfato/polialdehído, y condroitín sulfato/polialdehído mediante la oxidación del polisacárido relacionado, utilizando peryodato sódico de grado analítico.

En este caso, la matriz estaba basada en la reacción de los residuos amina de las proteínas colágeno con los grupos aldehído activos generados en los anillos de azúcar de los polisacáridos. Se sintetizaron matrices con diversas propiedades superficiales y actividad biológica mediante el control de la proporción de colágeno a polisacáridos, del tipo de colágeno, de los tipos de polisacáridos, así como de la densidad de los grupos aldehído generados en los polisacáridos.

Se dispersaron colágeno F semed (8,1 partes) y colágeno S semed(0,9 partes) en una solución de hialuronato/polialdehído (1 parte, 5% de las unidades repetitivas estaban oxidadas: pH 3-3,5) que contenía cianoborohidruro sódico 10 mM (NaCNBH_{3}) en un mezclador industrial a baja velocidad durante 10 segundos, y a continuación a alta velocidad durante 5 segundos más. La mezcla líquida (concentración de sólidos: 28 mg/ml) se vertió en un modelo, se incubó a temperatura ambiente durante 24 horas y se liofilizó. Esto formó una esponja que se lavó varias veces en agua destilada para eliminar completamente el NaCNBH_{3}. A continuación, se liofilizó la esponja lavada.

Se siguió el procedimiento anterior para preparar otras matrices, utilizando los siguientes materiales de partida:

Colágeno F semed (0,9 partes)	Solución hialuronato/polialdehído (1 parte, 5% de las unidades repetitivas
Colágeno S semed (0,1 partes)	están oxidadas)
	Concentración sólidos: 15 mg/ml
Colágeno F semed (0,9 partes)	Solución hialuronato/polialdehído (2 partes, 5% de las unidades repetitivas
Colágeno S semed (0,1 partes)	están oxidadas)
	Concentración sólidos: 15 mg/ml
Colágeno F semed (0,9 partes)	Solución hialuronato/polialdehído (4 partes, 5% de las unidades repetitivas
Colágeno S semed (0,1 partes)	están oxidadas)
	Concentración sólidos: 15 mg/ml
Colágeno F semed (0,9 partes)	Solución hialuronato/polialdehído (4 partes, 1% de las unidades repetitivas
Colágeno S semed (0,1 partes)	están oxidadas)
	Concentración sólidos: 15 mg/ml
Colágeno Tipo II (9 partes)	Solución hialuronato/polialdehído (1 parte, 5% de las unidades repetitivas
	están oxidadas)
	Concentración sólidos: 15 mg/ml
Colágeno Tipo II (1 parte)	Solución hialuronato/polialdehído (1 parte, 5% de las unidades repetitivas
	están oxidadas)
	Concentración sólidos: 15 mg/ml
Colágeno F semed (7 partes)	Solución hialuronato/polialdehído (1 parte, 5% de las unidades repetitivas
Colágeno tipo II (2 partes)	están oxidadas)
	Concentración sólidos: 15 mg/ml
Colágeno F semed (8,1 partes)	Solución dextrano/polialdehído (1 parte, 5% de las unidades repetitivas
Colágeno S semed (0,9 partes)	están oxidadas)
	Concentración sólidos: 28 mg/ml
Colágeno F semed (8,1 partes)	Solución dextrán sulfato/polialdehído (1 parte, 5% de las unidades repetiti-
Colágeno S semed (0,9 partes)	vas están oxidadas)
	Concentración sólidos: 28 mg/ml
Colágeno F semed (8,1 partes)	Solución condroitín sulfato/polialdehído (1 parte, 5% de las unidades repeti-
Colágeno S semed (0,9 partes)	tivas están oxidadas)
	Concentración sólidos: 28 mg/ml
Colágeno F semed (0,9 partes)	Solución hialuronato/polialdehído (4 partes, 5% de las unidades repetitivas
Colágeno S semed (0,1 partes)	están oxidadas)
	Concentración sólidos: 15 mg/ml

Ejemplo 2

Se evaluaron las matrices del Ejemplo 1 en cuanto a su capacidad de dar soporte a la cicatrización ósea en un modelo de defecto craneal de rata. Se implantó una matriz de la presente invención que comprendía 1 parte de colágeno (colágeno F semed 0,9 partes: semed 0,1 partes) por 1 parte de solución hialuronato/polialdehído (5% de las unidades repetitivas estaban oxidadas, concentración de sólidos: 15 mg/ml) en un defecto de 5 mm por 3 mm generado en el hueso parietal de ratas Sprague-Dawley macho de 6 semanas de edad. Se evaluaron los defectos a los 28 días mediante análisis radiográfico e histológico.

El análisis radiográfico de los defectos sugirió que se había dado cicatrización ósea significativa respecto a defectos sin rellenar. Todos los defectos rellenos de matriz eran completamente radiodensos, sin que el defecto tuviese bordes diferenciados, lo que indicaba una cicatrización completa. Los defectos sin rellenar aparecieron como áreas ovoides radiolúcidas con bordes redondeados, sugiriendo una cicatrización mínima.

La evaluación histológica se correlacionaba con los resultados radiográficos. Se rellenaron los defectos con un parche continuo de tejido óseo que era normal en cuanto a celularidad y estructura, con espacios medulares presuntivos y médula hematopoyética en maduración. Se observaron trazas de material residual del implante, además de una infiltración inflamatoria crónica moderada. En algunas áreas, el hueso nuevo se había depositado dentro de los intersticios del material del implante y las superficies óseas se encontraban recubiertas con osteoblastos activos.

Estos resultados demuestran que la implantación de una matriz colágena polisacárido-polialdehído permitió la conducción de la formación ósea de hueso normal reparable en este modelo crítico de un defecto.

Ejemplo 3

El presente ejemplo ilustra la osteoconducción y osteoinducción de matrices CN/HA de la presente invención. En un aspecto, se examinó la osteoconducción mediante la implantación de una matriz CN/HA sola en un defecto craneal de rata, con evaluación radiográfica e histológica de la formación ósea tras 1, 2, 3 y 4 semanas. En otro aspecto, se examinó la osteoinducción mediante la implantación intramuscular de matrices CN/HA que contenían proteína morfogenética ósea (BMP), con posterior evaluación histológica y bioquímica de la formación ósea ectópica.

Materiales y procedimientos Preparación de una matriz con BMP y sin ella

Se preparó una matriz entrecruzada colágeno-hialuronato 9:1 como se ha descrito en el Ejemplo 1, y se liofilizó. Para la preparación de una matriz con factor de crecimiento, se disolvió y añadió BMP (obtenida de Intermedic Orthopedics, Denver, CO.) a la matriz liofilizada hasta una concentración final de 0,1% (50 \mug por cada 50 \mul de matriz). A continuación, la combinación matriz/factor de crecimiento se liofilizó una segunda vez, previamente a su implantación en el defecto craneal.

Osteoconducción en defectos craneales de rata

Con el fin de evaluar la capacidad de una matriz colágeno-ácido hialurónico (andamiajes CN/HA) para dar soporte al crecimiento de tejido óseo, se implantaron andamiajes CN/HA en defectos generados en huesos parietales de ratas Sprague-Dawley macho de 6 semanas de edad, siguiendo una modificación de un procedimiento previamente descrito (Mulliken, J.B. et al., 1980, Reconstru. Surg. 65:553-559). Brevemente, se generaron defectos rectangulares bilaterales de, aproximadamente, 5 mm por 3 mm, utilizando un taladro Dremel de baja velocidad con accesorio grabador, bajo irrigación constante durante el taladrado. Los defectos izquierdos se rellenaron con una pieza seca pre-cortada de andamiaje CN/HA, y los defectos derechos se dejaron sin rellenar y sirvieron como controles sin tratar. Los animales se sacrificaron tras 7, 14, 21 y 28 días, y se extrajeron las calotas craneales y se fijaron en formol al 10% tamponado a neutralidad.

Inducción de hueso ectópico intramuscular

Con el fin de evaluar la capacidad de los andamiajes CN/HA de entregar factores de crecimiento osteoinductivos, se introdujeron implantes de CN/HA que contenían proteína morfogenética ósea (BMP) en bolsas bilaterales generadas en los músculos tibiales de ratas Sprague-Dawley macho de 4 semanas de edad. A cada matriz CN/HA se le aplicó 50 \mug de BMP mediante absorción y liofilización posterior, y la extremidad contralateral recibió implantes de CN/HA sin BMP. Se sacrificaron los animales tras 21 días, y se extrajeron del tejido circundante los materiales implantados. Los tejidos extraídos se cortaron en dos trozos: un trozo se extrajo y ensayó para la fosfatasa alcalina (Lowry et al., 1954, J. Biol. Chem. 207:19 y Sampath, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. 78:7599-7603), y el otro trozo, fijado en formol al 10% tamponado hasta la neutralidad, se descalcificó y procesó para su evaluación histológica. Se tiñeron con hematoxilina y eosina, secciones en parafina de 6 \mum de grosor y se examinaron para la formación ectópica de hueso, inflamación, y aparición de implante residual. La actividad de fosfatasa alcalina se expresó en unidades en las que 1 unidad es igual a nmoles de p-nitrofenol producido (a partir de sustrato p-nitrofenilfosfato) por minuto a 37ºC.

Evaluación radiográfica

Se registraron en película X-Omat-TL (Kodak), radiografías fijadas de bóvedas craneales tomadas con una unidad de rayos X Faxitron (Hewlett-Packard, Modelo 43855A). Se cuantificaron los calcos de las áreas radiolúcidas con el fin de calcular el % de reducción en el tamaño del defecto en comparación con los defectos no tratados.

Evaluación histológica

Se descalcificaron en Formical (American Histology, Lodi, CA) los especímenes de implantes craneales e intramusculares. Se realizaron cortes transversales gruesos a través del centro aproximado de los defectos craneales, previamente a su procesado. Se tiñeron con hematoxilina y eosina, secciones en parafina de 6 \mum del centro de los defectos o tejidos extraídos. Se evaluaron los tejidos para su biocompatibilidad (inflamación), persistencia de implante residual y formación de hueso nuevo. Se registró subjetivamente la cicatrización ósea de los defectos craneales en una escala lineal de 1 a 5, basada en la anchura de defecto cubierta con hueso reparador.

Resultados Osteoconducción de las matrices CN/HA

Los defectos craneales no tratados típicamente demostraron una reparación ósea mínima durante el período de 4 semanas.

Las radiografías de las bóvedas craneales extraídas mostraron un ligero redondeamiento de los defectos rectangulares no rellenos tras 28 días, indicando cierta reparación ósea dese los márgenes cortados. Histológicamente, los defectos no rellenos tras 1, 2, 3 y 4 semanas se habían recubierto con un banda delgada de tejido fibroso, con evidencia a las 2 semanas de una pequeña cantidad de tejido óseo de reparación en los extremos cortados del hueso lamelar de bóveda craneal. El hueso reparativo tenía características celulares y de tinción normales. Típicamente, los defectos craneales no tratados eran mínimamente proliferativos y no exhibieron una respuesta inflamatoria significativa.

En comparación, los defectos rellenos con matrices CN/HA mostraron una radioopacidad en crecimiento progresivo a lo largo de 4 semanas. Tras 4 semanas, los defectos tratados eran completa o casi completamente radiodensos. Se muestra en la tabla I los % de reducción en área de defecto en los defectos tratados en comparación con los controles no tratados.

TABLA I Sumario de la evaluación radiográfica e histológica

1

Similarmente, la evaluación histológica mostró la formación creciente de hueso reparativo durante el período de 4 semanas (ver tabla 1). Se observó una formación mínima de hueso reparativa en el hueso parietal cortado tras 1 semana. El crecimiento de tejido fibroso estuvo acompañado por una infiltración celular inflamatoria crónica difusa. En algunas áreas, se había dado una condensación del tejido fibroso que asemejaba la deposición osteoide. En este momento temprano, la mayor parte del defecto se encontraba relleno con la malla reticular del material matricial CN/HA.

A las dos semanas, se observaron cantidades variables de formación de hueso nuevo, y 3 de los 6 defectos estaban completamente, o casi completamente, recubiertos por tejido nuevo muy joven del hueso. El hueso nuevo era de apariencia histológica normal, y parecía que había incorporado material de implante en su sustancia. Las primeras etapas de acreción osteoide y ósea parecían estar en progreso en la región central de la matriz CN/HA en el interior de un tejido fibroso vascularizado. En este momento, se asoció una respuesta inflamatoria crónica generalmente moderada con las matrices CH/HA.

Similarmente, 4 de los 6 defectos tratados con CN/HA a las 3 semanas estaban esencialmente recubiertos por completo con tejido óseo, y los 2 especímenes restantes exhibían una modesta reparación ósea. El hueso nuevo contenía osteocitos en las lagunas óseas, líneas de resorción inversa, numerosas superficies óseas revestidas de osteoblastos, y espacios medulares en maduración. También se observaron en la periferia del hueso recién formado, pequeñas cantidades de material matricial residual en asociación con tejido fibroso y una respuesta inflamatoria crónica moderada.

A las 4 semanas, 5 de los 6 defectos estaban completamente, o casi completamente, recubiertos con tejido óseo reparativo. La remodelación y maduración del tejido óseo se había dado aparentemente como hueso lamelar, y había espacios medulares hematopoyéticos en el interior del tejido óseo. Se asoció una inflamación muy moderada, consistente en una infiltración celular inflamatoria crónica difusa, con fragmentos residuales de matriz CN/HA y tejido fibroso en algunas áreas adyacentes al hueso nuevo.

Formación ósea ectópica inducida por andamiajes de CN/HA con BMP

Tras 21 días, la implantación intramuscular de CN/HA dio soporte al crecimiento de un tejido fibroso fino dentro de los intersticios de la matriz del andamiaje y provocó una respuesta inflamatoria celular crónica entre suave y moderada. Los implantes se encontraban rodeados por tejido muscular de apariencia histológica normal y por una cápsula ligeramente engrosada de tejido fibroso fino. También había unas cuantas células gigantes multinucleadas, situadas periféricamente al material de implante.

En contraste, los andamiajes de CN/HA con 50 \mug de BMP indujeron la formación extensiva de hueso ectópico tras su implantación en bolsas de músculo tibial de rata durante 21 días. Se habían formado islotes de hueso nuevo en toda la matriz de CN/HA en el interior de tejido fibrovascular. El tejido óseo en la región central del implante parecía ser menos madura que el tejido óseo presente en la periferia del implante. Las espículas de tejido óseo de interconexión contenían líneas de resorción ósea, osteocitos en las lagunas, y muchas áreas presuntivas de médula hematopoyética. También había unos cuantos condrocitos dispersos en el interior del hueso nuevo. Sólo podían discernirse trazas de material matricial residual en el interior del osículo óseo. En la periferia había una cápsula de tejido fibroso engrosado que contenía algunas células inflamatorias crónicas. La actividad específica de fosfatasa alcalina en explantes de andamiajes de CN/HA de 21 días que contenían 50 \mug de BMP era de 22 \pm 6 unidades, mientras que no se detectó fosfatasa alcalina (< 1 unidad) en explantes de CN/HA solo.

Las matrices CN/HA (implantes) solas eran osteoconductoras y dieron soporte a la formación de hueso nuevo al implantarlas en defectos craneales de rata. Los implantes de CN/HA estaban compuestos de una malla reticular de fibras colágenas con una estructura de canales que promovía el crecimiento celular en todo el implante. La formación de hueso nuevo era evidente a las 2 semanas, de acuerdo con la evaluación radiográfica e histológica. Tras 4 semanas, los defectos estaban casi completamente rellenos con nuevo tejido óseo, en comparación con los defectos no tratados, los cuales típicamente estaban recubiertos con una banda delgada de tejido fibroso con reparación ósea mínima. Tras 4 semanas, sólo había pequeñas cantidades de material de implante CN/HA residual, la mayor parte del implante se había resorbido o se había incorporado en el hueso de nueva formación. Las matrices demostraron una buena biocompatibilidad y no provocaron respuesta inflamatoria significativa. Las matrices de CN/HA por sí solas sirvieron como andamiaje para la regeneración de tejido, promoviendo el reclutamiento de tejido fibroso mesenquimal hacia el defecto y la deposición posterior de osteoide y hueso.

Las matrices CN/HA implantadas intramuscularmente en la rata fueron bien toleradas y promovieron el crecimiento de tejido fibrovascular tras 21 días. Cuando las matrices CN/HA contenían 50 \mug de BMP, se indujo la formación extensiva de hueso ectópico. Aunque era evidente la formación de tejido óseo nuevo en todo el implante, el osículo parecía estar más maduro en la periferia. De manera similar a la matriz CN/HA sola implantada en defectos craneales, prácticamente toda la matriz más BMP había sido resorbida o incorporada en el hueso nuevo. Estos resultados indican que las matrices CN/HA son vehículos de distribución adecuados para factores osteoinductores y dan soporte a la cascada de sucesos que tiene lugar a medida que las células mesenquimales se diferencian para formar hueso. La eficiencia de las matrices CN/HA en la distribución de factores osteoinductores puede confirmarse mediante un estudio in vivo de dosis-respuesta de BMP.

Ejemplo 4

El presente ejemplo ilustra que una matriz de la presente invención puede dar soporte al mantenimiento del fenotipo condrocito in vitro.

Se sembraron condrocitos primarios de rata producidos mediante el procedimiento de Blein-Sella O. et al., supra, en una matriz preparada mediante el procedimiento dado a conocer en el Ejemplo 1, el cual comprende 1 parte de colágeno (0,9 partes de colágeno F semed: 0,1 partes semed) por cada 1 parte de solución de hialuronato/polialdehído (5% de las unidades repetitivas estaban oxidadas, concentración de sólidos: 15 mg/ml) y se cultivaron bajo condiciones convencionales durante 1-4 semanas. A continuación, se procesaron los cultivos y se evaluaron histológicamente. Los resultados muestran que las células craneales sembradas en la matriz crecen y continúan expresando fosfatasa alcalina, un marcador de células formadoras de hueso. Los condrocitos sembrados en la matriz también proliferan y sintetizan una matriz extracelular de tinción metacromática indicativa de un contenido elevado en proteoglicanos, el cual es típico del fenotipo condrocito.

Ejemplo 5

Las matrices preparadas mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, las cuales comprenden diversas proporciones de colágeno a polisacárido, se implantan en un defecto de cartílago articular de espesor total de conejo, como describen Amiel et al., supra. Se generan defectos que miden, aproximadamente, 3,7 mm de diámetro y 5 mm de profundidad en el centro de los cóndilos femorales medios de conejos New Zealand blancos macho adultos. A continuación, los defectos se rellenan con matriz o se dejan sin rellenar, como controles. Se evalúan los defectos morfológicamente e histológicamente a las 6 y 12 semanas.

Ejemplo 6

El presente ejemplo ilustra el efecto del colágeno y el hialuronato sobre la coagulación de la fibrina.

El efecto del gel colágeno/hialuronato sobre el tiempo de coagulación del fibrinógeno se evaluó de la manera siguiente: se introdujeron 0,5 ml de solución purificada de fibrinógeno (30 mg/ml, PBS) en un tubo de vidrio de 10 ml y se incubó al baño maría a 37ºC durante 5 minutos. Se añadieron 0,1 ml de una solución de CaCl_{2} (0,2 M) que contenía 0,5 NIH U de trombina y diversas concentraciones de colágeno y hialuronato-polialdehído y se mezclaron con barra de agitación. Se registró el tiempo requerido para la formación de gel sobre la barra de agitacióncomo el tiempo de coagulación. Se muestran los resultados en la tabla 1.

TABLA 1 Tiempo de coagulación de la fibrina en presencia de colágeno e hialuronato

2

Ejemplo 7

El presente ejemplo ilustra la formación tridimensional del andamiaje de una matriz entrecruzada de colágeno-hialuronato que comprende fibrinógeno y trombina en medio de cultivo de tejido.

Este experimento se llevó a cabo con una llave de paso de tres vías equipada con un adaptador macho de tipo "luer slip", al cual se le habían conectado dos jeringas. La jeringa A contenía 5 ml de fibrinógeno e hialuronato-polialdehído (20 mg/ml de cada, en medio DMEM), la jeringa B contenía trombina (2 NIH U/ml, en medio DMEM) y suspensión de colágeno S semed (Kensey Nash) (20 mg/ml, en medio DMEM) que había sido pre-mezclado en un mezclador industrial hasta un diámetro de fibra de, aproximadamente, 50 mm. Se mezcló rápidamente el contenido de las dos jeringas entre las mismas y el contenido se introdujo en una jeringa que, a continuación, se vertió con una inclinación de 60º en una solución salina tamponada con fosfato (PBS) (40 ml en un vaso de precipitados de vidrio de 100 ml), y se vertió el contenido en la solución de PBS. El vertido completo, incluyendo la mezcla, se completó en 10 segundos. No se observó disolución del gel formado de esta manera tras incubación a temperatura ambiente o a 37ºC.

Ejemplo 8

El presente ejemplo ilustra la formación tridimensional de andamiaje de una matriz entrecruzada de colágeno-hialuronato que comprende fibrinógeno y trombina en agua desionizada.

El experimento se llevó a cabo con una llave de paso de tres vías equipada con un adaptador macho de tipo "luer slip", al cual se le había conectado dos jeringas. La jeringa A contenía 5 ml de fibrinógeno e hialuronato-polialdehído (20 mg/ml para cada, NaOH 12 mM), la jeringa B contenía trombina (2 NIH U/ml) y solución purificada de colágeno (Collagen corporation, 3 mg/ml, HCl 12 mM). Se mezclaron rápidamente los contenidos de las dos jeringas entre las mismas y el contenido se introdujo en una jeringa que, a continuación, se vertió con una inclinación de 60º en una solución salina tamponada con fosfato (PBS) (40 ml en vaso de precipitados de vidrio de 100 ml), y el contenido se vertió en la solución de PBS. El vertido completo se completó en 10 segundos. No se observó disolución del gel formado de esta manera tras incubación a temperatura ambiente o a 37ºC.

Ejemplo 9

El presente ejemplo ilustra la evaluación de la biocompatibilidad in vivo y tiempo de residencia de una matriz entrecruzada colágeno-hialuronato que comprende fibrinógeno y trombina.

Se prepararon geles de composición diferente, según se describen en la tabla 2, mediante una llave de paso de tres vías equipada con un adaptador macho de tipo "luer slip", y dos jeringas. Tras mezclar, se introdujeron las mezclas en una placa de cultivo celular de 24 pocillos a una tasa de 0,5 ml/pocillo y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Los geles formados de esta manera se liofilizaron, se cortaron en cubos de 10 x 10 x 5 mm, y se esterilizaron con etanol. Estos especíemenes se introdujeron a continuación en bolsas generadas por disección roma en el músculo tibial de ratas Sprague Dawley macho de 4 a 5 semanas de edad. Se sacrificaron las ratas tras 3, 7 y 14 días, y los explantes se evaluaron histológicamente para su biocompatibilidad y persistencia del implante.

TABLA 2 Composiciones de las matrices para los ensayos in vivo

3

La evaluación histológica mostró una mayor persistencia de los implantes compuestos de colágeno/hialuronato y fibrina. En el día 3, la mayor parte de los implantes que comprendían fibrina y fibrina/hialuronato habían sido digeridos. En el día 7, todas las matrices basadas en fibrina habían sido completamente reabsorbidas, mientras que todavía podía observarse una pequeña cantidad de matriz de fibrina/hialuronato residual. En el día 14, sólo podían encontrarse matrices que contenían colágeno en los sitios de implante. A partir del día 7, se podían observar algunos vasos sanguíneos en matrices de fibrina/colágeno y en matrices de fibrina/colágeno/hialuronato-polialdehído, además de en las matrices control de colágeno. Además, las composiciones que comprendían hialuronato aparentemente potenciaron el crecimiento de los vasos sanguíneos.

Claims (27)

1. Procedimiento para la preparación de una matriz para dar soporte a la reparación de tejido, que comprende las etapas de oxidación de un polisacárido exógeno para formar un polisacárido exógeno modificado con grupos aldehídos, y de reacción de dicho polisacárido exógeno modificado con colágeno bajo condiciones en las que dichos grupos aldehído reaccionan covalentemente para entrecruzarse con colágeno para formar dicha matriz.

2. Procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además la adición de un factor de crecimiento a dicha matriz.

3. Procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicho factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en miembros de la superfamilia TGB-\beta; miembros de la familia BMP; factores de crecimiento/diferenciación (GDF); ADMP-1; miembros de la familia del factor de crecimiento fibroblástico; miembros de la familia de las proteínas del erizo; miembros de la familia del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF); miembros de la familia del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); miembros de la familia de las interleuquinas (IL); y miembros de la familia del factor estimulante de colonias (CSF).

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el factor de crecimiento es una proteína morfogénica ósea (BMP).

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polisacárido comprende ácido hialurónico, condroitín sulfato, dermatán sulfato, keratán sulfato, heparano, heparán sulfato, dextrano, dextrán sulfato, o alginato.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicho polisacárido comprende ácido hialurónico.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el colágeno se selecciona del grupo que consiste en colágeno tipo I y de tipo II.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha etapa de oxidación de dicho polisacárido comprende el tratamiento de dicho polisacárido con peryodato.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho colágeno y dicho polisacárido, utilizados para formar dicha matriz, están presentes en el intervalo entre 99:1 y 1:99 en peso, respectivamente.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho intervalo es 9:1 a 1:9 en peso, respectivamente.

11. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que aproximadamente 1% a 50% de las unidades repetitivas en dicho polisacárido se oxidan con el fin de que contengan grupos aldehído.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que aproximadamente 1% a 5% de las unidades repetitivas en dicho polisacárido se oxidan con el fin de que contengan grupos aldehído.

13. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha matriz se forma mediante congelamiento y liofilización.

14. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha matriz se forma mediante laminación húmeda y secado con aire.

15. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además la adición de fibrinógeno y trombina para formar fibrina en dicha matriz.

16. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el tejido se selecciona de entre el grupo que consiste en hueso, cartílago y tejido blando.

17. Matriz de soporte de la reparación de tejido, que comprende colágeno entrecruzado covalentemente a un polisacárido exógeno, en la que dicho polisacárido está entrecruzado a dicho colágeno a través de anillos oxidados de azúcar de dicho polisacárido, los cuales forman enlaces covalentes con dicho colágeno.

18. Matriz según la reivindicación 17, que comprende además un factor de crecimiento.

19. Matriz según la reivindicación 18, en el que dicho factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en miembros de la superfamilia TGF-\beta; miembros de la familia de proteínas morfogénicas óseas; factores de crecimiento/diferenciación (GDF); ADMP-1; miembros de la familia del factor de crecimiento fibroblástico; miembros de la familia de las proteínas del erizo; miembros de la familia del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF); miembros de la familia del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); miembros de la familia de las interleuquinas (IL); y miembros de la familia del factor estimulante de colonias (CSF).

20. Matriz según la reivindicación 18, en el que dicho factor de crecimiento es una proteína morfogénica ósea.

21. Matriz según la reivindicación 17, en el que dicho polisacárido comprende ácido hialurónico, condroitín sulfato, dermatán sulfato, keratán sulfato, heparano, heparán sulfato, dextrano, dextrán sulfato o alginato.

22. Matriz según la reivindicación 21, en el que dicho polisacárido es ácido hialurónico.

23. Matriz según la reivindicación 17, en el que dicha matriz comprende dicho colágeno y dicho polisacárido en una proporción en peso en el intervalo entre 99:1 y 1:99.

24. Matriz según la reivindicación 17, en el que dicho colágeno se selecciona del grupo que consiste en colágeno tipo 1 y colágeno tipo 2.

25. Matriz según la reivindicación 17, que comprende además fibrina.

26. Uso de una matriz según la reivindicación 17, para la preparación de una composición para promover el crecimiento de tejido óseo o cartilaginoso.

27. Uso de una matriz según la reivindicación 18, para la preparación de una composición para promover el crecimiento óseo.