PT968012E

PT968012E - Dispositivo osteogénicos e método para seu uso patra a reparação de osso

Info

Publication number: PT968012E
Application number: PT98913183T
Authority: PT
Inventors: David C Rueger; Marjorie M Tucker; An-Cheng Chang
Original assignee: Stryker Corp
Priority date: 1997-03-20
Filing date: 1998-03-20
Publication date: 2007-01-31
Also published as: JP2001516262A; AU6779598A; WO1998041246A2; EP0968012A2; US7041641B2; ES2273412T3; EP1719532A2; DE69835810T2; WO1998041246A3; EP1719531A2; EP0968012B1; US20010014662A1; DE69835810D1; CA2284098C; JP2014221427A; JP2009131649A; JP2012161635A; DK0968012T3; US20060177475A1; CA2284098A1

Description

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Descrição "Dispositivos osteogénicos e métodos para o seu uso para a * reparação do osso"

Campo da Invenção A invenção aqui revelada diz respeito a materiais e usos para reparar defeitos do osso e cartilagem utilizando proteínas osteogénicas.

Antecedentes da Invenção

Foi agora identificada uma classe de proteínas que é competente para actuar como verdadeiros morfogénios de tecido condrogénico. Isto é, estas proteínas são capazes por elas próprias de induzir a proliferação e a diferenciação de células progenitoras no osso funcional, cartilagem, tendão, e/ ou tecido ligamentoso. Esta classe de proteínas é aqui referida como "proteínas osteogénicas" ou "proteínas morfogénicas", ou "morfogénios", incluem membros da família das proteínas morfogénicas do osso (BMP) que foram inicialmente identificadas pela sua capacidade de induzirem morfogenese do osso ectópíca, endocondral. As proteínas osteogénicas são geralmente classificadas no estado da técnica como um subgrupo da superfamília TGF-β de factores de crescimento (Hogan (1996) Genes & Development 10: 1580-1594). Membros da família morfogénica de proteínas incluem a proteína 1 osteogénica de mamífero (OP-1, também conhecida como BMP-7, e a homóloga da Drosófila 60 A) , proteína -2 osteogénica (OP-2, também conhecida como BMP-8), proteína osteogénica -3 (OP-3), BMP-2A (também conhecida por BMP-2 ou CBMP-2A, e a homóloga da Drosófila DPP) , BMP-3, BMP-4 (também conhecias como BMP-2B ou CBMP- 2 2Β) , ΒΜΡ-5, ΒΜΡ-6 e ο seu homólogo de murino Vgr-1, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, GDF3 (também conhecido como Vgr2), GDF8, GDF9, GDF10, GDF11, GDF12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, GDF-5 (também conhecido como CDMP-1 ou MP52), GDF-6 (também conhecido como CDMP-2), GDF-7 (também conhecido como CDMP-3), o homólogo de Xenopus Vgl e NODAL, ONIVIN, SCREW, ADMP, e NEURAL. Os membros desta família codificam para cadeias de polipéptidos secretados que partilham características estruturais comuns, incluindo o processamento a partir de uma "pro-forma" de precursor para dar uma cadeia de polipéptido maduro competente para dimerizar e contendo um dominio activo carboxílico terminal, de aproximadamente 97-106 aminoácidos. Todos os membros partilham um padrão que se conserva de cisteínas neste domínio e a forma activa destas proteínas pode ser um homodímero ligado por ligações dissulfureto de um único membro da família ou um heterodímero de dois membros diferentes (vidé por ex. Massague (1990) Annu. Rev. Cell Biol. 6:597; Sampath, et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:13198). Ver também, U. S. 5,011,691; U. S. 5,266,683, Ozkaynak et al. (1990) EMBO J. 9: 2085-2093, Wharton et al. (1991) PNAS 88: 9214-9218), (Ozkaynak (1992) J. Biol. Chem. 267:25220-25227 e U.S. 5,266,683); (Celeste et al. (1991) PNAS 87: 9843-9847); (Lyons et al. (1989) PNAS 86:4554-4558). Estas revelações descrevem sequências de aminoácidos e ADN, assim como as características químicas e físicas destas proteínas osteogénícas. Ver também, Wozney et al. (1988) Science 242: 1528-1534); BMP 9 (W093/00432, publicada em 7 de Janeiro, 1993); DPP (Padgett et al. (1987) Nature 325: 81-84; e Vg-1 (Weeks (1987) Cell 51: 861-867).

Assim, proteínas osteogénicas verdadeiras capazes de induzir a cascata acima mencionada de acontecimentos morfogénicos resultando em formação óssea endocondral, foram agora identificadas, isoladas, e clonadas. Quer sejam 3 de ocorrência natural ou preparados sinteticamente estes factores osteogénicos, quando implantados num mamífero em associação com uma matriz ou substrato que permite ligação, proliferação e diferenciação de células progenitoras migratórias podem induzir o recrutamento de células progenitoras acessíveis e estimulam a sua proliferação, induzindo deste modo diferenciação em condrócitos e osteoblastos, e induzindo ainda diferenciação de cartilagem intermédia, vascularização, formação de osso, remodelação, e, finalmente diferenciação da medula. Além disso numerosos especialistas demonstraram a capacidade destas proteínas osteogénicas, quando misturadas com materiais originários de matrizes naturais, tais como colagénio ou materiais preparados sinteticamente de matriz polimérica para induzir formação do osso, incluindo formação óssea endocondral, em condições em que uma verdadeira substituição óssea não ocorreria. Por exemplo, quando combinada com um material de matriz estas proteínas osteogénicas induzem a formação de novo osso em grandes defeitos segmentais do osso, fusões da medula e fracturas.

Matrizes de origem natural, tais como colagénio, pode ser substituída com materiais inertes, tais como plástico, mas o plástico não é adequado uma vez que não é absorvido e encontra-se limitado a aplicações que necessitam configurações geométricas simples. Até à data, polímeros biodegradáveis e copolímeros foram também utilizados como matrizes misturadas com proteínas osteogénicas para a reparação de defeitos que não sejam de articulações. Enquanto que tais matrizes podem ultrapassar algumas das insuficiências acima descritas, a utilização destas matrizes necessita da determinação e controlo de características tais como química de polímeros, tamanho de partícula, biocompatibilidade e outras particularidades críticas para uma operacionalidade. Por exemplo, os poros 4 têm que ser formados no polímero de uma maneira que assegura a adsorção de proteína à matriz e biodegradação da matriz. Por isso antes da utilização da matriz polimérica é necessário executar um passo extra de tratamento do polímero para induzir a formação de poros do tamanho adequado.

Dispositivos osteogénicos padrão, que incluem tanto colagénio ou matrizes poliméricas misturadas com proteína osteogénica prestam-se menos a uma manipulação durante a cirurgia. Dispositivos osteogénicos padrão possuem muitas vezes uma consistência arenosa, seca e podem ser eliminados por lavagem sempre que o local do defeito é irrigado durante a cirurgia, e/ ou pelo sangue e/ ou outros fluidos que se infiltram no local após cirurgia. A adição de determinados materiais a estas composições podem auxiliar na disponibilização de uma composição mais manejável para manipulação durante a cirurgia. As patentes de invenção dos Estados Unidos Nos. 5,385,887; 5,520,923; 5,597,897 e o pedido de patente de invenção internacional WO 95/24210 descreve composições contendo uma matriz polimérica sintética, proteína osteogénica, e um suporte para uma tal finalidade. Contudo, tais composições têm estado limitadas a matrizes sintéticas poliméricas devido a um desejo de ultrapassar determinadas reacções imunológicas alegadamente adversas contempladas para estarem associadas com outros tipos de matrizes especialmente matizes biológicas derivadas, incluindo algumas formas de colagénio. Por isso, estas composições sofrem das mesmas questões descritas acima para serem postas em prática para optimizar a química dos polímeros, tamanho de partícula, biocompatibilidade, etc., a W094/13653 descreve formulações para induzir o crescimento do osso compreendendo TGF-β, TCP e um suporte, tal como colagénio, CMC e derivados de celulose, WO 94/20133 descreve tecidos de vedantes que compreendem cola 5 de fibrina, osso desmineralizado e BMPs. Existe ainda a necessidade de composições e métodos para reparar defeitos do osso e da cartilagem que disponibilizam uma maior facilidade de manipulação durante a cirurgia e que não se baseiam em matrizes de polímeros sintéticas. Existe também a necessidade de métodos e composições que podem aumentar a velocidade e a qualidade de formação de osso novo e cartilagem.

Neste contexto, é um objectivo da presente invenção disponibilizar dispositivos osteogénicos melhorados e métodos para a sua utilização para reparar defeitos do osso, defeitos da cartilagem e/ ou defeitos osteocondricos que: são mais fáceis de manipular durante a cirurgia, rodear as questões da química de polímeros, tamanho de partícula e biocompatibilidade associada com a utilização de matrizes poliméricas sintéticas; e que permitem acelerar a formação óssea e uma reparação mais estável da cartilagem utilizando novas doses de proteína osteogénica que pode ser conseguida utilizando dispositivos e métodos do estado da técnica. É ainda um objectivo da presente invenção disponibilizar dispositivos osteogénicos e métodos e seu uso na reparação de defeitos não cicatrizantes e que não se encontram em articulações e para promover a reparação da cartilagem articular em defeitos condrais ou osteocondricos. Contudo ou outro objecto da presente invenção consiste em disponibilizar dispositivos e utilizações de dispositivos para a reparação do osso e defeitos de cartilagem sem intervenção cirúrgica. Estes e outros objectos com juntamente com vantagens e características da invenção aqui revelada tornar-se-ão evidentes a partir da descrição, figuras e reivindicações que se seguem. 6

Sumário da Invenção A presente invenção é baseada no facto de que misturando uma proteína osteogénica e uma matriz não sintética, não polimérica, tal como colagénio ou fosfato tricálcico-β (β-TCP) com um agente de ligação seleccionado a partir do grupo que consiste em carboximetilcelulose e um seu sal de sódio, em que o agente ligante possui uma viscosidade de cerca de 10-200 cP e um grau de substituição de 0,65-0,90 vai dar origem a um dispositivo osteogénico melhorado com capacidade de reparação do osso e da cartilagem melhoradas. Tais dispositivos melhorados podem não só acelerar a velocidade de reparação como estes dispositivos podem também promover a formação de tecido de reparação de elevada qualidade, estável, particularmente um tecido de cartilagem. Adicionalmente, os anteriores benefícios podem ser conseguidos utilizando significativamente menos proteína osteogénica do que a requerida pelos dispositivos osteogénicos padrão. Não desejando estar limitado pela teoria as propriedades anteriores inesperadas podem provavelmente ser atribuídas a uma interacção complementar ou sinergistica entre a matriz não polimérica e o dito agente de ligação. Tendo em vista as tecnologias ortopédicas e reconstrutivas estes factos são inesperados e até agora não foram considerados.

Num aspecto, esta invenção dísponibiliza um novo dispositivo para induzir a formação óssea local e cartilagem compreendendo proteína osteogénica, matriz derivada de material não sintético, não polimérico e um agente ligante seleccionado a partir do grupo que consiste em carboximetilcelulose e um sal de sódio, em que o agente de ligação possui uma viscosidade de cerca de 10-200 cP e um grau de substituição de 0,65-0,90. Como aqui contemplado o dispositivo compreende preferencialmente proteínas osteogénicas tal como, mas não limitadas a OP-1, OP-2, BMP- 7 2, ΒΜΡ-4, ΒΜΡ-5 e ΒΜΡ-6. Actualmente uma proteína osteogénica preferida é OP-1. Quando aqui utilizados os temos "morfogénio", "morfogénio do osso", "proteína morfogénica do osso", "BMP", "proteína osteogénica" e "factor osteogénico" abrangem uma classe de proteínas tipificadas pela proteína osteogénica humana 1 (HOP-1).

Sequências nucleotidicas e de aminoácidos para hOP-1 encontram-se disponibilizadas nas Seq. ID Nos. 1 e 2, respectivamente. Por razões de facilidade de descrição, hOP-1 é aqui mencionada como uma proteína osteogénica representativa. Será contudo considerado pelo perito da técnica que a OP-1 é meramente representativa da classe TGF-β dos verdadeiros morfogénios do tecido competentes para actuar como proteínas osteogénicas, e não se pretende que seja limitativa do âmbito da descrição. Outras proteínas conhecidas e úteis incluem BMP-2, BMP-3, BMP-3b, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP15, GDF-1 , GDF-2 , GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, . GDF-12, NODAL, UNIVIN, SCREW, ADMP, NEURAL e variantes de aminoácidos osteogenicamente activos. Numa concretização preferida as proteínas úteis na invenção incluem espécies biologicamente activas variantes de quaisquer destas proteínas incluindo variantes de sequências de aminoácidos conservadas, proteínas codificadas por variantes de sequências nucleotidicas degeneradas e proteínas osteogenicamente activas que partilham o esqueleto conservado de sete cisternas como aqui definido e codificado por uma sequência de AND competente para hibridizar-se numa sequência de ADN que codifica para uma proteína osteogénica aqui revelada, incluindo sem limitação OP-1, BMP-5, BMP-6, BMP-2, BMP-4 ou GDF-5, GDF-6 ou GDF-7. Numa outra concretização, proteínas osteogénicas úteis incluem aquelas que partilham o domínio das sete cisteínas e partilhando pelo menos uma homologia 8 de 70% na sequência de aminoácidos (semelhança) no domínio activo do terminal C, como aqui definido. Ainda noutra concretização, as proteínas osteogénicas da invenção podem ser definidas como proteínas osteogenicamente activas possuindo qualquer uma das sequências genéricas aqui definidas, incluindo OPX (Seq ID NO:3) e sequências genéricas 7 e 8, ou sequências genéricas 9 e 10. A OPX acomoda as homologias entre as várias espécies das proteínas osteogénicas OP-1 e OP-2, e é descrita pela sequência de aminoácidos apresentada abaixo e na Seq ID N°: 3. A sequência genérica 9 é uma sequência de 96 aminoácidos contendo o esqueleto de seis cisternas definida por hOP-1 (resíduos 335-431 da Seq ID N° 2) e em que os resíduos acomodam as homologias de OP-1, OP-2, OP-3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-15, GDF-1, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, UNIVIN, NODAL, DORSALIN, NURAL, SCREW e ADMP. Cada um dos resíduos não cisteínicos é seleccionado independentemente a partir do resíduo correspondente neste grupo referido de proteínas. A sequência genérica 10 é uma sequência de 102 aminoácidos que incluem uma sequência de 5aminoácidos adicionada ao terminal N da sequência genérica 9 e define o esqueleto de sete cisternas da hOP-1 (330-431 Seq ID N° 2). Sequências genéricas 7 e 8 são sequências de 96 e 102 aminoácidos, respectivamente contendo ou seis esqueletos de cisterna (Sequência genérica 7) ou o esqueleto de sete cisternas (sequência genérica 8) definida por hOP-1 e em que os resíduos não cisteínicos restantes acumulam as homologias de OP-1, OP-2, OP-3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, 60 A, DPP, Vgl, BMPS, BMP6, Vgr-1, e GDF-1.

Como ensinado abaixo as matrizes preferidas são materiais não sintéticos, não poliméricos e podem ser de origem natural ou derivados de materiais biológicos. Exemplos de matrizes preferidas incluem, mas não estão 9 limitados a colagénio, osso desmineralizado e β-TCP. Uma matriz actualmente preferida é o colagénio. Uma outra matriz preferida correntemente é β-TCP. Assim, os dispositivos da presente invenção não compreendem como componente primários matrizes poliméricas sintéticas tais como homopolímeros ou copolímeros de ácido a-hidróxi acético e/ ou ácido α-hidróxi propiónico, incluindo as suas misturas racémicas.

Em relação aos agentes de ligação, os presentes dispositivos compreendem agentes úteis como formadores de geles, para aumentar a viscosidade, agentes de suspensão e/ ou emulsionantes em que o dito agente é seleccionado a partir do grupo que consiste em carbóximetilcelulose e um seu sal, em que o agente de ligação possui uma viscosidade de cerca de 10-200 cP e um grau de substituição de 0,65-0,90. O dito agente de ligação é alquilcelulose, especialmente metilceluloses tais como carbóximetilcelulose. Outros agentes de ligação que são aqui descritos podem ser outras gomas de celulose, alginato de sódio, dextranos e pó de gelatina. Outro agente de ligação aqui descrito pode ser cola de fibrina.

Quando aqui utilizado o termo "cola de fibrina" significa uma composição compreendendo fibrinogénio de mamífero e trombina. Em determinadas concretizações os dispositivos melhorados da presente invenção compreendem ainda um agente molhante, tal como mas não limitado a soluções salinas ou outras soluções fisiológicas aquosas.

Os dispositivos melhorados da presente invenção podem assumir uma variedade de configurações. A configuração vai depender em parte do tipo de agente ligante e agente molhante utilizado. Como aqui revelado uma concretização altamente preferida pode possuir uma consistência de massa de vidraceiro. Esta configuração particular é especialmente adequada para tratar defeitos abertos de 10 acordo com os métodos da presente invenção. Outra concretização actualmente preferida do dispositivo osteogénico melhorado pode possuir uma consistência de fluido viscoso. Esta configuração particular é especialmente adequada para o tratamento de defeitos fechados de acordo com os métodos aqui descritos. Dependendo apenas da configuração do dispositivo melhorado o seu fornecimento pode ser conseguido, através de uma variedade de modos de administração. Por exemplo uma massa pode ser empacotada em e/ ou à volta do defeito ou extrudida como uma conta a partir de um aparelho de orifício largo. Alternativamente, um líquido viscoso pode ser injectado para e/ ou à volta do defeito, ou alternativamente escovado e/ ou pintado sobre a(s) superfície(s) com defeito. A exploração de uma variedade destas concretizações possíveis para reparar o osso e defeitos de cartilagem é aqui exemplificada.

Entre as características do agente de ligação seleccionado a partir do grupo que consiste em carbóximetilcelulose e um seu sal de sódio em que o agente ligante possui uma viscosidade de cerca de 10-200 cP e um grau de substituição de 0,65-0,90 é uma capacidade para tornar o dispositivo:

Dobrável, possível de tomar forma e/ ou maleável; injectável; aderente ao osso, cartilagem, músculo e outros tecidos; resistente à desintegração por lavagem e/ ou irrigação durante a cirurgia; e, resistente ao deslocamento durante a cirurgia, suturação e pós- operatório, para mencionar apenas alguns. Adicionalmente, em determinadas concretizações preferidas o dito agente de ligação pode assumir as características anteriormente mencionadas e beneficiar, quando presentes em baixas proporções. Por exemplo, um dispositivo actualmente preferido compreende aproximadamente 1 parte de agente ligante e aproximadamente 5 partes de matriz. Outras concretizações preferidas compreendem aproximadamente 1 parte de agente ligante e aproximadamente 10 partes de matriz, enquanto que ainda outros compreendem aproximadamente 1 parte de agente ligante e aproximadamente 25 partes de matriz. Outros dispositivo actualmente preferido compreende aproximadamente 3 partes de agente ligante para 5 partes de matriz. Determinados agentes de ligação podem ser utilizados em proporções iguais ou maiores relativamente à matriz. Outro dispositivo actualmente preferido compreende 1 parte de agente ligante e 3 partes de matriz. Como aqui exemplificado dispositivos melhorados de proporções largamente divergentes podem induzir formação de osso e de cartilagem. São aqui exemplificados dispositivos melhorados possuindo partes do agente ligante para partes de matriz variando de aproximadamente 1:1 a 4:1, assim como de aproximadamente 1:2 a 1:5 e 1:10 a 1.25, assim como 1.25 a 1:50. Qualquer proporção do agente ligante em relação à matriz pode ser utilizado para realizar a presente invenção.

Além disso, a presente invenção contemple que um dispositivo osteogénico pode compreender mais do que uma material de matriz em combinação; as proporções relativas podem ser variadas para conseguir o resultado clínico desejado e pode ser determinado em rotina utilizando a perícia vulgar. A matriz actualmente preferida é o colagénio, especialmente colagénio de bovino. Outra matriz adequada é osso desmineralizado. No entanto, outras matrizes adequadas são hidróxoapatites (Hap) ou razões molares de cálcio (Ca/Pj , porosidade e cristalinidade; cerâmicas bioactivas; cerâmicas de fosfato de cálcio para nomear apenas algumas. Adicionalmente misturas do anterior em que razões de HAp/ fosfato tricálcico são manipuladas 12 são também aqui contempladas. Numa concretização particular preferida, a matriz de fosfato tricálcico β (β-TCP).

Num outro aspecto, a presente invenção utiliza o dispositivo aqui descrito para induzir a formação de osso local ou de cartilagem para reparar o osso, cartilagem ou defeitos osteocondricos. Os presentes usos estão contemplados como úteis para induzir a formação de pelo menos osso endocondral, osso intramembranoso, e cartilagem articular. Como aqui descrito, utilizações para a reparação incluem o tratamento tanto de defeitos fechados como de abertos com os dispositivos osteogénicos melhorados acima descritos. Como ensinado aqui, as utilizações da presente invenção podem ser efectuadas utilizando os dispositivos melhorados que têm o volume suficiente para encher o local defeituoso, assim como a utilização de dispositivos melhorados que não o têm. Além disso, como resultado desta invenção encontram-se agora disponíveis para promover a reparação de osso e/ ou cartilagem sem ser necessário intervenção cirúrgica. Disponibilidade para tais usos possui implicações para indivíduos comprometidos, tais como indivíduos diabéticos, fumadores, obesos e outros, cuja saúde geral e fluxo sanguíneo deteriorado para as suas extremidades se encontra em risco quando é necessária uma intervenção cirúrgica. Exemplos de defeitos incluem, mas não estão limitados a defeitos de tamanho crítico, defeitos de tamanho não crítico, fracturas em locais não articulados, fracturas, defeitos osteocondricos, defeitos condricos e defeitos periodontais.

Num outro aspecto a presente invenção fornece um kit para realizar os usos acima descritos. Como aqui contemplado uma concretização de um kit para induzir formação local de osso ou formação de cartilagem compreende um dispositivo melhorado em que a proteína osteogénica e matriz encontram-se empacotados no mesmo receptáculo. 13

Noutras concret i zaçõe-s, a proteína osteogénica, matriz e agente de ligação encontram-se no mesmo receptáculo. Ainda numa outra concretização o agente molhante é também disponibilizado e empacotado separadamente das outras componentes do kit.

Uma vez que a presente invenção disponibiliza aos especialistas materiais melhorados e utilizações para a reparação de osso e de cartilagem, incluindo a reparação de cartilagem articular presente em juntas de mamíferos, ultrapassa problemas que seriam de outro modo encontrados utilizando os métodos e os dispositivos do estado da técnica. Por exemplo, a presente invenção pode induzir a formação de cartilagem bona fide hialina em vez de fibrocartilagem num local defeituoso. Formas de cartilagem hialina funcional na superfície de articulação do osso num local defeituoso e que não degenera ao longo do tempo para fibrocartilagem. Em contraste, os métodos do estado da técnica resultam geralmente por último no desenvolvimento de fibrocartilagem no local defeituoso. Ao contrário da cartilagem hialina, falta à fibrocartilagem a capacidade fisiológica de recuperar as articulações até à sua completa capacidade. Assim, quando os dispositivos osteogénicos melhorados são utilizados de acordo com os presentes métodos, o especialista pode restaurar substancialmente um defeito osteocondral ou condral numa junta de articulação funcional e evitar a formação indesejável de fibrocartilagem típica de métodos do estado da técnica anterior. Como aqui contemplado, a invenção ainda incorpora materiais de substituição alogéníca para reparar tecidos avasculares numa junta do esqueleto que resulta na formação de tecidos de substituição mecanicamente e funcionalmente viáveis numa junta.

Resumindo, os usos, dispositivos, e kits da presente invenção podem ser utilizados para induzir formação 14 endocondral ou formação de osso intrairiembranoso para reparar os defeitos dos ossos que não se curam espontaneamente, assim como para promover e aumentar a velocidade e/ ou qualidade da formação do novo osso, particularmente na reparação de fracturas e fusões, incluindo fusões da medula. Os usos, dispositivos, e kits também podem induzir a reparação de defeitos osteocondricos e/ ou subcondrais, i.e. podem induzir a formação de novo osso e/ ou a cartilagem da superfície de recobrimento. A presente invenção é particularmente adequada para utilização na reparação de defeitos que resultam de doenças deteriorantes ou degenerativas tais como, mas não limitadas a osteocondríte dessicans. É também particularmente adequada para a utilização em doentes que necessitam de cirurgias repetitivas reconstrutivas, assim como doentes de cancro. Outras aplicações incluem, mas não estão limitadas a reparação prostética, fusão da medula, escoliose, reparação craniana/ facial e reparação massiva alográfica.

Breve Descrição das Figuras

Os objectos anteriores e outros objectos e características da invenção, assim como a própria invenção pode ser mais facilmente compreendida a partir da descrição seguinte, quando lida conjuntamente com as figuras em anexo em que: A figura 1 é um gráfico representando as propriedades coesivas de partes variadas (p/p) de um agente ligante para partes (p/p) de dispositivo padrão OP. A figura 2 é um gráfico que representa o efeito de vários volumes de agente molhante na integridade de um dispôs itl \7"O osteogénico melhorado. 15

Descrição Detalhada e Concretizações Preferidas

De modo a descrever de forma mais clara e concisa a matéria de facto da invenção desenvolvida as definições seguintes pretendem fornecer orientação, quanto ao significado de termos específicos utilizados na descrição escrita seguinte e nas reivindicações em anexo. "Formação óssea" significa a formação de osso endocondral para formação de osso intramerabranoso. Nos seres humanos a formação óssea inicia-se durante as primeiras 6-8 semanas do desenvolvimento fetal. Células embrionárias progenitoras de origem mesenquimal migram para locais pré-determinados, onde (a) ou condensam, proliferam e diferenciam-se em células formadoras de osso (osteoblastos), um processo observado no crânio e referido como "formação óssea intramembranosa;", ou, (b) .condensam, proliferam e diferenciam-se em células que formam a cartilagem (condroblastos) como intermediários que são posteriormente substituídos com células formadoras do osso. Mais especificamente células estaminais mesenquimais diferenciam-se em condrócitos. Os condrócitos tornam-se calcificados, sofrem hipertrofia e são substituídos por osso recentemente formado constituído por osteoblastos diferenciados que se encontram agora presentes no local. Posteriormente o osso mineralizado é remodelado extensivamente sendo depois ocupado por um ossículo preenchido por elementos da medula óssea funcionais. Este processo é observado em ossos compridos e referido como "formação óssea endocondral". Na vida pós-fetal, o osso possui a capacidade de se reparar a ele próprio quando ferido, mimetizando o processo celular de desenvolvimento embriónico endocondral do osso. Isto é as células progenitoras estaminais mesenquimais da medula óssea, periósteo, e músculo podem ser induzidas para migrarem para 16 o local do defeito e iniciarem a cascata de acontecimentos descrita acima. Aí acumulam, proliferam e diferenciam-se em cartilagem que é posteriormente substituída por osso recentemente formado. "Osso" diz respeito a um tecido conjuntivo calcificado (mineralizado) compreendendo primaríamente um compósito de cálcio depositado e fosfato na forma de hidróxiapatite, colagénio (basicamente do tipo de colagénio do tipo I) e células do osso tais como osteoblastos, osteócitos e osteoclastos, assim como tecido de medula óssea que se forma no interior do osso verdadeiramente endocondral. 0 tecido ósseo difere significativamente de outros tecidos, incluindo tecido de cartilagem. Especificamente o tecido ósseo é tecido vascularizado composto por células e um meio bifásico compreendendo um composto inorgânico mineralizado (basicamente de cristais de hidróxiapatite) e um componente orgânico (basicamente colagénio do tipo I) . Glicosaminoglicanos constituem menos do que 2% deste componente orgânico e menos do que 1% do próprio meio bifásico, ou de tecido ósseo per se. Além disso, em relação ao tecido da cartilagem, o colagénio presente no tecido do osso existe numa disposição paralela altamente organizada. Defeitos do osso provenientes de etiologias degenerativas, traumáticas, ou cancerosas colocam um desafio formidável ao cirurgião plástico. É particularmente difícil a reconstrução ou reparação de partes do esqueleto que compreendem uma parte do tecido multi-complexo, tal como ocorre nas articulações dos mamíferos. "Formação de cartilagem" significa formação de tecido conjuntivo contendo condrócitos impregnados numa rede extracelular compreendendo fibrilas ou colagénio (predominantemente colagénio do tipo II, conjuntamente com outros tipos menores, tal como os tipos IX e XI), vários proteoglicanos, outras proteínas e água. "Cartilagem 17 articular" diz respeito especificamente a hialina ou a cartilagem articular, a um tecido não vascular não mineralizado que cobre as superfícies de articulação das partes dos ossos nas articulações e permite o movimento em articulações sem contacto directo osso a osso, prevenindo assim o desgaste e a danificação de superfícies opostas. Cartilagem articular normal saudável é referida como "hialina", i.e. possuindo uma aparência característica de vidro fosco. Em condições fisiológicas tecidos de cartilagem articular repousam na superfície óssea mineralizada subjacente designada como osso subcondral, que contém ossículos altamente vascularizados. Esta cartilagem articular ou hialina encontrada na extremidade dos ossos da articulação é um tecido especializado histologicamente distinto e é responsável pela distribuição da carga da resistência a forças compressivas, e ao deslizamento suave que é parte de uma função da articulação. Cartilagem articular possui poucas ou nenhumas propriedades de auto-regeneração. Assim, se a cartilagem articular é rasgada ou desgastada na espessura ou é danificada em função do tempo, doença, ou trauma, a sua capacidade de proteger a superfície óssea subjacente fica comprometida. Na cartilagem articular normal, em tecido sujeito a um trauma repetido, por exemplo devido à fricção entre ossos não alinhados em contacto uns com os outros, ou doenças das articulações caracterizadas por uma perda de cartilagem articular, por ex. osteoartríte ocorre um desequilíbrio entre a síntese e a degradação.

Outros tipos de cartilagem em juntas do esqueleto incluem fibrocartilagem e cartilagem elástica. Articulações secundárias são formadas por discos ou fibrocartilagens que ligam vértebras na coluna vertebral. Na fibro cartilagem, a rede de mucopolissacarídeos encontra-se interligada com feixes de colagénio proeminentes e os condrócitos 18 encontram-se mais largamente dispersos do que na cartilagem de hialina. A cartilagem elástica contém fibras de colagénio que são histologicamente semelhantes a fibras de elastina. Tecido de cartilagem contém fibras de colagénio que são histologicamente semelhantes a fibras de elastina, tecido de cartilagem, incluindo cartilagem articular, ao contrário de outros tecidos conjuntivos, falta-lhe vasos sanguíneos, nervos, linfa e membrana basal. A cartilagem é composta por condrócitos, que sintetizam um meio extracelular abundante composto por água, colagénios, proteoglicanos e proteínas e lípidos não colagénicos. 0 colagénio serve para prender proteoglicanos e para fornecer força de tracção ao tecido. 0 colagénio do tipo II é predominantemente colagénio no tecido da cartilagem. Os proteoglicanos são compostos por um número variável de cadeias de glicosaminoglicanos, sulfato de queratina, sulfato de condroitina e/ ou sulfato de dermatano, e oligossacáridos ligados em N e 0 covalentemente a um núcleo proteico.

Cartilagem articular ou hialina pode ser distinguida de outras formas de cartilagem tanto através da sua morfologia e da sua bioquímica. Determinados colagénios tais como os tecidos cartilaginosos fibróticos, que ocorrem em tecido de cicatrização, por exemplo, são quelóide e tipicamente do tipo tecido de cicatrização, i.e., compostos por capilares e feixes desorganizados, abundantes e irregulares de colagénio do Tipo I e Tipo II. Em contraste, cartilagem articular é caracterizada morfologicamente por zonas superficiais em função de zonas médias em função de zonas profundas que apresentam uma gradação característica de especificidades da superfície do tecido à base do tecido adjacente ao osso. Na zona superficial, por exemplo, os condrócitos são aplanados e situam-se paralelamente à superfície impregnada numa rede extracelular que contém 19 colagénio disposto tangencialmente e alguns proteoglícanos. Na zona média os condrócitos são esféricos e rodeados por uma rede extracelular rica em proteoglicanos e fibras de colagénio organizadas obliquamente. Na zona profunda, próxima do osso, as fibras de colagénio encontram-se orientadas verticalmente. Os proteoglicanos ricos em sulfato de queratina aumentam de concentração com o aumento da distância a partir da superfície da cartilagem. Para uma descrição detalhada da micro estrutura da cartilagem articular ver por exemplo, (Aydelotte e Kuettner, (1988), Conn. Tiss. Res. 18:205; Zanetti et al., (1985), J. Cell Biol. 101:53; e Poole et al., (1984), J. Anat. 138:13. Colagénio bioquímico articular pode ser identificado pela presença do colagénio de Tipo II e Tipo IX, assim como pela presença de proteoglicanos bem caracterizados, e pela ausência do colagénio do Tipo X, que se encontra associado a formação óssea endocondral. São reconhecidos dois tipos de defeitos em superfícies articulares, i.e., defeitos de espessura completa e efeitos superficiais. Estes defeitos diferem não só na extensão do dano físico da cartilagem, mas também na natureza da resposta de reparação que cada tipo de lesão pode provocar. Efeitos de espessura completa também aqui referidos como "defeitos osteocondricos", de uma superfície articulada incluem danos na superfície hialina, a camada de cartilagem calcificada e o tecido ósseo subcondral com os seus vasos sanguíneos e medula óssea. Defeitos de espessura completa podem provocar uma dor forte, uma vez que a placa óssea contém extremidades de nervos sensitivos. Tais defeitos resultam geralmente de traumas graves e/ ou durante as fases avançadas de doença degenerativa das articulações, tal como a osteoartrite. Defeitos de espessura completa podem ocasionalmente conduzir a hemorragia e a indução de uma reacção de reparação pelo 20 osso subcondral. Contudo, em tais casos o tecido de reparação formado é de um tipo de cartilagem vascularizada fibrosa com propriedades biomecânicas insuficientes e não persiste numa base a longo termo. Em contraste, os defeitos superficiais no tecido da cartilagem articular encontram-se restringidos ao próprio tecido da cartilagem. Tais defeitos, também referidos como defeitos "condricos" ou "subcondrais", são notórios, porque não se curam e não apresentam propensão para reacções de reparação. Os defeitos superficiais podem aparecer como fissuras, pivots, ou fissuras na superfície da cartilagem. Não contêm vasos sanguíneos (pontos de sangue), tais como os observados em defeitos de espessura completa. Defeitos superficiais não podem possuir nenhuma causa conhecida, mas são frequentemente o resultado de desarranjos mecânicos que conduzem a um desgaste do tecido cartilaginoso. Tais desarranjos mecânicos podem ser causados por um trauma na articulação, por ex. um deslocamento do tecido cartilaginoso de Tom para a articulação, meniscosectotomia, um relaxamento da articulação por m ligamento de tom, características malignas de articulações, ou fractura óssea, ou por doenças hereditárias. Defeitos superficiais são também característicos de doenças de articulações degenerativas em fases iniciais, tal como a osteoartrite. Uma vez que o tecido da cartilagem não tem nervos nem é vascularizado, os defeitos superficiais não se curam e degeneram frequentemente em defeitos de espessura completa. "Defeito" ou "local de defeito" como aqui contemplado pode definir uma quebra estrutural óssea que necessita de reparação. 0 defeito pode ainda definir um efeito osteocondral, incluindo uma quebra estrutural do osso e da cartilagem que se situa sobre ele. Um defeito pode assumir a configuração de um "vazio", que é compreendido para significar um defeito tridimensional, tal como por exemplo, 21 uma falha, uma cavidade, um buraco ou outra quebra substancial da integridade estrutural de um osso ou de uma articulação. Um defeito pode ser o resultado de um acidente, doença, manipulação cirúrgica, e/ ou falha prostética. Em determinadas concretizações, o defeito é um vazio possuindo um volume incapaz de reparação endógena ou espontânea. Tais defeitos são geralmente duas vezes o diâmetro do osso em causa e também são chamados como defeitos de "tamanho crítico". Por exemplo num modelo canino de defeito do cúbito, os estado da técnica reconhece estes defeitos como sendo aproximadamente 3-4 cm, geralmente pelo menos aproximadamente 2,5 cm, falha incapaz de reparação espontânea. Ver por exemplo Schmitz et al. , Clinicai Orthopaedics and Related Research 205:299-308 (1986); e Vukicevie et al., in Advances ín Molecular and Cell Biology, Vol.6, pág. 207-224 (1983) (JAI Press, Inc.).

Em modelos de defeitos segmentais do coelho e do macaco, a falha é aproximadamente 1,5 cm e 2,0 cm respectivamente. Noutras concretizações, o defeito é um defeito segmentário de dimensões não críticas. Geralmente estas são capazes de efectuar alguma reparação espontânea, quase mecanicamente inferior aquelas tornadas possíveis pela realização da presente inovação.

Noutras concretizações determinadas, o defeito é um defeito osteocondral, tal como um tampão osteocondral. Tal defeito atravessa completamente a cartilagem situada acima e entra, pelo menos em parte, a estrutura óssea subjacente. Em contraste, um defeito condral ou subcondral atravessa situada acima, em parte, ou completamente respectivamente, mas não envolve o osso subjacente. Outros defeitos susceptíveis de reparação utilizando a presente invenção incluem, mas não estão limitadas a fracturas não articulares; cavidades do osso; ressecção de tumor; fracturas frescas (com desvios ou sem desvios); 22 anormalidades cranianas/faciais; defeitos periodontais e irregularidades; fusões da medula; assim como aqueles defeitos que resultam de doenças tais como o cancro, artrite, incluindo osteoartrite e outras desordens degenerativas do osso tais como osteocondrite dessicans.

Pelo termo "Reparação" entende-se formação de novo osso e/ ou de cartilagem que é suficiente para preencher parcialmente o vazio ou descontinuidade estrutural no defeito. Reparação não significa contudo, ou necessita de um processo de cura completa ou de um tratamento que é 100% eficaz para recuperar um defeito até ao seu estado mecânico, fisiológico/ estrutural antes do defeito. "Matriz", como aqui contemplado, significa um material não polimérico, não-sintético que pode actuar como um substrato osteocondutivo e possui uma estrutura de suporte sobre a qual as células infiltradas se podem ligar, proliferar e participar no processo morfogénico que culmina na formação do osso. Como aqui contemplado, a matriz não inclui materiais poliméricos, sintéticos tais como materiais sintéticos, tais como matrizes poliméricas compreendendo homopolímeros e copolímeros do ácido a-hidróxiacético e/ ou α-hidróxi- propónico, incluindo as suas misturas racémicas. Especificamente as matrizes aqui contempladas não incluem homopolímeros ou copolímeros do ácido glicólico, ácido láctico, e ácido butírico, incluindo os seus derivados. Por exemplo, a matriz da presente invenção pode ser derivada de materiais de origem biológica, ou natural. Uma matriz adequada tem que ser constituída por particular e ser porosa, sendo a porosidade uma caracteristica crítica em relação à sua eficácia para induzir formação óssea, particularmente uma formação óssea endocondral. Entende-se pelo termo "matriz" um componente estrutural ou um substrato que possui intrinsecamente uma forma tridimensional vão ocorrer determinados 23 acontecimentos celulares envolvidos na morfogénese endocondral do osso; uma matriz actua como uma estrutura de suporte para as células que se infiltram possuindo interstícios para a ligação, proliferação e diferenciação de tais células. A presente invenção contempla o facto de que um dispositivo osteogénico melhorado pode compreender uma combinação de mais do que um material de matriz; as proporções relativas podem ser variadas para atingir o resultado clínico desejado e pode ser determinado por rotina utilizando conhecimentos vulgares do estado da técnica. Actualmente uma matriz preferida é o colagénio, especialmente colagénio de bovino. Outra matriz adequada é osso desmineralizado. No entanto, outras matrizes adequadas são hidróxiapatites (Hap) com variadas razões molares de cálcio: fosfato (Ca/P), porosidade e cristalinidade; cerâmicas bioactivas; e cerâmicas de fosfato de cálcio para mencionar apenas algumas. Adicionalmente misturas do anterior em que razões de Hap/ fosfato tricálcico são manipuladas são aqui contempladas. Estas matrizes podem ser obtidas comercialmente na forma de grânulos, blocos e pós. Por exemplo, Pyrost® é um bloco Hap derivado do osso de bovino (Osteo AG, Suiça); Collapta® é uma esponja Hap contendo colagénio (Osteo Ag, Suiça); fosfatos tricálcicos (β-TCP) pode ser obtido a partir da Pharma GmbH (Alemanha) como Cerasob®, assim como da Clarkson Chromatography Products, Inc. (S. Williamsport, PA) ou Osteonics (Holanda); misturas de grânulos TCP/Hap podem ser obtidas a partir da Osteonics (Holanda); e 100% de pó Hap ou grânulos pode ser obtida da CAM (uma subsidiária da Osteotech, NJ) . Preparação e caracterização de determinadas matrizes mencionadas foram descritas extensivamente no estado da técnica e necessitam não mais de que uma experimentação de rotina e conhecimentos vulgares do estado da técnica. Ver, 24 por exemplo U.S. 4,975,526; U.S. 5,011,691; U.S. 5,171, 574; U.S. 5,266, 683; U. S. 5,354,557; e U.S. 5,468, 845.

Outras das matrizes mencionadas anteriormente foram também bem descritas no estado da técnica. Ver por exemplo tratados de biomateriais tais como LeGeros e Daculsi em Handbook of Bioactive Ceramics. II pág. 17-28 (1990, CRC Press); e outras descrições publicadas tais como Yang Cao,

Jie Weng Biomateriais 17. (1996) pág. 419-424; LeGeros Adv. Dent. Res. 2, 164 (1988); Johnson et al., J Orthopaedic Research, 1996, Vol. 14, pág. 351-369; <

Piattelli et al., Biomateriais 1996, Vol 17, pág. 1767-1770. β-TCP cerâmico sinterizado (β-fosfato tricálcico) é uma matriz actualmente preferida, o β-TCP sinterizado possui uma maior taxa de dissolução do que os Haps sinterizados e fosfato de cálcio bifásico sinterizado (BCP). A capacidade de β-TCP de suportar a formação do osso parece ser baseada, em parte no tamanho dos grânulos de Ca/P na matriz. O β-TCP sinterizado possuindo tamanhos de partículas entre 212 μιη e cerca de 425 μπ\ são os mais preferidos e podem ser obtidos da Clarkson Chromatography Products, Inc. (S. Williamsport, PA) ou Osteogenics (Holanda). Dispositivos implantados contendo partículas dimensionadas nesta gama apresentam elevadas velocidades de absorção por análise de imagem e baixas respostas inflamatórias quando implantados num local subcutâneo do rato, como descrito aqui noutro lado.

Entende-se por dispositivo "osteogénico" uma composição compreendendo pelo menos uma proteína osteogénica dispersa numa matriz. Como aqui revelado "um dispositivo osteogénico melhorado" compreende uma proteína osteogénica e uma matriz, mas não um agente de ligação; dispositivos osteogénicos padrão podem compreender um sintético, um polímero ou uma matriz como definido acima. 25

Nos exemplos e ensinamentos apresentados abaixo, dispositivos osteogénicos são designados a seguir como: dispositivos padrão, dispositivo OP, dispositivo OP-1, ou OP. Dispositivos osteogénicos melhorados são designados a seguir como: dispositivo contendo CMC, dispositivo padrão contendo CMC, dispositivo CMC/OP-1, OP-l/CMC/colagénio, OPCMC/ colagénio e dispositivo melhorado contendo cola de fibrina. Quando aqui utilizado "dispositivo de simulacro" não contém proteína osteogénica e é formulado isento de qualquer factor osteoindutivo. A presente invenção também contempla dispositivos melhorados compreendendo pelo menos duas proteínas osteogénicas diferentes e/ ou pelo menos duas matrizes diferentes como aqui definido. Ainda noutras concretizações qualquer um dos dispositivos melhorados mencionados anteriormente podem ainda compreender um agente molhante como aqui definido. Qualquer uma das concretizações podem também incluir componentes radio-opacas, tais como agentes de contraste comercialmente disponíveis. Geralmente existem três tipos bem conhecidos de tais agentes -hidróxiapatites, sulfato de bário e iodo orgânico. Dispositivos contendo componentes radio-opacos são particularmente úteis para administração do dispositivo num local de defeito fechado, como noutro lado aqui discutido. A identificação de um componente radio-opaco adequado requer apenas conhecimentos vulgares do estado da técnica e experimentação de rotina. Ver, por exemplo tratados radiográficos incluindo Ehriich e McCloskey, Patient Care in Radiography (Mosby Publisher, 1993) ; Carol, Fuch's Radiographic Exposure, Processing and Quality Control (Charles C. Thomas Publisher. 1993); e Snopek, Fundamentais of Special Radiographic Procedures, (W.B.

Saunders Company, 1992).

Concretizações preferidas de dispositivos melhorados são aderentes ao osso, cartilagem, músculo e/ ou outro 26 tecido. Possuem propriedades de manipulação melhorada e são resistentes ao deslocamento por irrigação durante a cirurgia e por suturação. De forma semelhantes são coesivos e não são eliminados por lavagem, desintegrados ou diluídos por irrigação e/ ou infiltração de fluidos corporais tais como sangue. Concretizações preferidas permanecem aderentes após a cirurgia, mesmo numa articulação. É de particular importância que dispositivos melhorados sejam facilmente confinados ao local do defeito. Funcionalmente o dispositivo osteogénico melhorado da presente invenção induz formação acelerado do osso e/ ou cartilagem, assim como uma qualidade mais elevada, um tecido de reparação mais estável e pode conseguir aqueles benefícios em doses de proteína osteogénica mais baixas do que as necessárias com um dispositivo osteogénico padrão. Assim, a mistura de proteína osteogénica com uma matriz não sintética, não polimérica e um agente de ligação possui propriedades inesperadas sobre as quais o perito na técnica pode agora capitalizar como abaixo descrito. Uma concretização actualmente preferida compreende OP-1, matriz de colagénio e o agente de ligação carboximetilcelulose (CMC). Como discutido abaixo, uma desvantagem associada ao agente de ligação, CMC é a sua eficácia mesmo quando presente em quantidades relativas baixas. Por exemplo, em determinadas concretizações exemplificadas aqui, OP-1 pode ser utilizado em quantidades que variam entre aproximadamente 1,25 a 2,50 mg por aproximadamente 1000 mg de colagénio e por aproximadamente 180 a 200 mg de CMC.

Estas matrizes e o agente de ligação como aqui descrito, exibe todas as características preferidas de manipulação anteriormente descritas associadas com um dispositivo osteogénico melhorado.

Noutras concretizações determinadas estas quantidades de proteína, matriz e agente de ligação pode ser aumentada ou 27 diminuída de acordo _ com as condições e circunstâncias relacionadas com a reparação do defeito. Um agente molhante tal como uma solução salina pode ser adicionalmente junto. Como exemplificado abaixo, uma configuração preferida para implantação num local aberto de defeito assume uma consistência pastosa. Pode ser moldada e dada uma forma pelo cirurgião antes da implantação. Esta configuração é conseguida ajustando a proporção de matriz ao agente molhante de uma maneira semelhante à aqui ensinada. Como é exemplificado em baixo, defeitos fechados podem ser injectados sem intervenção cirúrgica no local do defeito. Novamente, apenas por mero ajuste das proporções da matriz em relação ao agente de ligação e agente molhante pode-se atingir esta concretização. Actualmente, um dispositivo preferido compreende aproximadamente 1 parte de agente de ligação (p/p) a aproximadamente 5 partes de matriz (p/p). Como descrito abaixo, podem ser utilizadas outras proporções para preparar dispositivos melhorados, dependendo da natureza do agente molhante e/ ou da matriz. É claro que uma caracteristica essencial de qualquer formulação de um dispositivo osteogénico melhorado é que deve ser eficaz a fornecer pelo menos um fonte local de proteína osteogénica no local do defeito, mesmo se transiente. Como exemplificado abaixo, o teor em agente de ligação de um dispositivo osteogénico melhorado não afecta a cinética de libertação/ retenção de proteína. Isto é inesperado tendo em vista as observações contrárias de que dispositivos padrão contendo polímero falharam ao não apresentarem efeitos osteoindutivos clinicamente significativos na ausência de material sequestrante (definido para incluir materiais celulósicos) , porque a desadsorção proteica era demasiado grande. (Ver, por exemplo, U.S. 5,597,897). Como exemplificado abaixo, mesmo quando um agente de ligação como aqui definido se encontra 28 presente, a proteína está ainda desadsorvida do dispositivo da invenção no entanto efeitos osteoindutivos são facilmente visíveis. Não querendo ficar limitado à teoria, as características inesperadas e benefícios associados à presente invenção parecem ter menos a ver com uma interacção entre agente de ligação - proteína e mais com uma interacção ligação agente- matriz. Especificamente, o agente de ligação como aqui definido parece complementar e/ ou interactuar sinergisticamente com a matriz necessária pela presente invenção. Isto não foi até agora apreciado e esta combinação é desencorajada pelos ensinamentos do estado da técnica, (ver, por exemplo, US 5,520,923; 5,597,897; e WO 95/24210) . O termo dispositivo "unitário" diz respeito a um dispositivo osteogénico melhorado fornecido ao especialista como uma formulação única pré-misturada compreendendo proteína osteogénica, matriz e agente de ligação. O termo dispositivo "não unitário" diz respeito a um dispositivo osteogénico melhorado fornecido ao especialista em pelo menos duas embalagens separadas para misturar antes do uso. Tipicamente, um dispositivo não unitário compreende pelo menos um agente de ligação embalado separadamente da proteína osteogénica e da matriz. O termo "veículo" diz respeito a uma mistura de agente ligante e uma matriz, tal como definido aqui. Assim, por exemplo, um dispositivo osteogénico melhorado como aqui revelado compreende proteína osteogénica e um veículo.

Adicionalmente a proteínas osteogénicas, vários factores de crescimento, hormonas, enzimas composições terapêuticas, antibióticos, ou outros agentes bioactivos podem também estar contidos num dispositivo osteogénico melhorado. Assim, vários factores de crescimento, tal como EGF, PDGF, IGF, FGF, TGF-β, e TGF-β podem ser combinados com um 29 dispositivo osteogénico melhorado e administrado ao local do defeito. Um dispositivo osteogénico melhorado pode também ser utilizado para administrar agentes quimioterapêuticos, insulina, enzimas, inibidores de enzimas e/ ou factores quimioatraentes/ quimiotácticos. "Proteína osteogénica", ou proteína morfogénica do osso é geralmente compreendida como significando uma proteína que pode induzir a cascata completa de acontecimentos morfogénicos culminando na formação de osso endocondral. Como aqui descrito noutro lugar, a classe de proteínas é tipificada pela proteína osteogénica humana (hOP-1). Outras proteínas osteogénicas úteis na prática da invenção incluem formas osteogenicamente activas de OP-1, OP-2, OP-3, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP9, DPP, Vgl, Vgr, proteína 60A, GDF-1, GDF-3, GDF-5,6,7, BMP10, BMP11, BMP13, BMP15, UNIVIN, NODAL, SCREW, ADMP ou NEURAL e suas variantes de sequências de aminoácidos. Numa concretização actualmente preferida, a proteína osteogénica inclui qualquer um de: OP-1, OP-2, OP-3, BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP9, e variantes de sequências de aminoácidos e seus homólogos, incluindo as suas espécies homólogas. Proteínas osteogénicas particularmente preferidas são aquelas compreendidas uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos uma 70% de homologia com os aminoácidos 102-106 do terminal-C, definindo o domínio de sete cisteínas conservado de OP-1 humano, e proteínas relacionadas. Determinadas concretizações preferidas da presente invenção compreende a proteína osteogénica OP-1. Certas outras concretizações preferidas compreendem OP-1 madura solubilizada numa solução salina fisiológica. Como aqui descrito noutro lado, as proteínas osteogénicas adequadas para utilização com a invenção dos requerentes pode ser identificada, através de meios de experimentação de rotina utilizando bioensaios reconhecidos pelo estado da técnica descritos por Reddi e 30

Sampath. "Homología da sequência de aminoácidos" é aqui compreendida como significando semelhança nas sequências de aminoácidos. Sequências homólogas partilham resíduos de aminoácidos idênticos ou semelhantes, em que resíduos semelhantes são substituições conservativas de, ou mutações pontuais permitidas de, correspondendo a resíduos de aminoácidos numa sequência de referência alinhada. Assim, uma sequência polipéptidica candidata que partilha 70% de uma homologia de aminoácidos com uma sequência de referência é uma em que 70% dos resíduos alinhados, ou são idênticos, ou são substituições conservativas dos resíduos correspondentes numa sequência de referência. Exemplos de variações conservativas incluem a substituição de um resíduo hidrofóbíco, tal como uma isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro, ou a substituição de um resíduo polar por outro, , tal como a substituição de arginína por lisina, ácido glutâmico, por ácido aspártico, ou glutamina por asparagina, e semelhantes. O termo "variação conservativa" também inclui a utilização de um aminoácido substituído em lugar de um aminoácido não substituto progenitor, desde que os anticorpos criados para o polipéptido substituído também reagem imunitariamente com o polipéptido não substituído.

Proteínas úteis para esta invenção incluem proteínas eucarióticas identificadas como proteínas osteogénicas (ver patente de invenção US 5,011,691) tais como as proteínas OP-1, OP-2, OP-3 e CBMP-2, assim como sequências de aminoácidos relacionadas com proteínas tais como DPP (da Drosofila), Vgl (da Xenopus), Vgr-1 (do rato) , GDF-1 (de humanos, ver Lee (1991), PNÃS 88: 4250-4254), 60A (da

Drosofila, ver Wharton et al. (1991) PNAS 88:9214-9218), dorsalina-1 (do pinto, ver Basler et al. (1993) Cell 73:687-702 e número de acesso ao GenBank L12032) e GDF-5 (do ratinho, ver Storm et al. (1994) Nature 368:639-643). 31 BMP é também preferido. Proteínas úteis adicionais incluem construções morfogénicas biosintéticas reveladas na Pat. US N° 5,011,691, por ex.,C0P-l, 3-5, 7 e 16, assim como outras proteínas conhecidas no estado da técnica. Outras proteínas incluem ainda formas osteogenicamente activas de BMP-3b (ver Takao, et al., (1996), Biochem. Biophys. Res. Comm. 219: 656-662). BMP-9 (ver WO95/33830), BMP-15 (ver W096/35710) , BMP-12 (ver WO95/16035) , CDMP-1, (ver W094/12814), CDMP-2 (ver W094/12814), BMP-10 (ver W094/26893), GDF-1 (ver W092/00382), GDF-10 (ver WO95/10539), GDF-3 (ver W094/15965) e GDF-7 (W095/01802 Outras proteínas úteis incluem ainda proteínas codificadas pelos ADNs competente para hibridizarem com um AND que codifica para uma proteína osteogénica como aqui descrita, e análogos relacionados, homólogos, muteínas (variantes biosintéticas) e semelhantes (ver abaixo). Determinadas concretizações dos dispositivos osteogénicos contemplados aqui compreendem uma funcionalidade de proteína osteogénica e/ ou ligada de forma estável à matriz. "Agente de ligação" como aqui utilizado, significa que qualquer material fisiologicamente compatível que quando misturado com proteína osteogénica promove tal reparação utilizando uma proteína menos osteogénica do que os dispositivos osteogénicos padrão. O agente de ligação preferido pode promover a reparação utilizando a mesma quantidade de proteína osteogénica que os dispositivos osteogénicos padrão, enquanto que alguns necessitam de mais para promover a reparação. Como ensinado aqui o perito na técnica pode determinar uma quantidade eficaz de proteína para utilização com qualquer outro agente de ligação adequado utilizando apenas experimentação de rotina. Entre outras características o agente de ligação preferido é a capacidade de tornar o dispositivo : 32 dobrável, possível de tomar forma e/ ou maleável; injectável; aderente ao osso, cartilagem, músculo e outros tecidos; resistente à desintegração por lavagem e/ ou irrigação durante a cirurgia; e, resistente ao deslocamento durante a cirurgia, suturação e pós- operatório, para mencionar apenas alguns. Adicionalmente, em determinadas concretizações preferidas um agente de ligação pode conseguir as características anteriormente mencionadas e benefícios, quando presente em baixas proporções. Por exemplo, um dispositivo actualmente preferido melhorado compreende aproximadamente 1 parte de agente ligante e aproximadamente 5 partes de matriz. Outro dispositivo actualmente preferido compreende aproximadamente 3 partes de agente de ligação a 5 partes de matriz. No entanto, outros dispositivos preferidos compreendem aproximadamente 1 parte de agente de ligação e aproximadamente 10 partes de matriz enquanto que outros compreendem aproximadamente 1 parte de agente de ligação e aproximadamente 25 a 50 partes de matriz. Determinados agentes de ligação podem ser utilizados em proporções iguais ou superiores relativamente à matriz, mas tais agentes deveriam ser testados como ensinado abaixo para identificar efeitos possíveis de diluição da matriz. 0 agente comercial utilizado de acordo com a invenção é carbóximetilcelulose, incluindo o seu sal de sódio, em que o agente de ligação possui uma viscosidade de cerca de 10-200 cP e um grau de substituição de 0,65-0,90. "Agente molhante", quando aqui utilizado significa qualquer solução aquosa fisiologicamente compatível, desde que não interfira com a formação de osso e/ ou de cartilagem. Em determinadas concretizações da presente invenção, o agente molhante é misturado com um dispositivo melhorado para conseguir a consistência necessária pelo modo de reparação do defeito. Como aqui ensinado, o agente 33 molhante pode ser utilizado para conseguir uma configuração pastosa, ou alternadamente uma configuração de liquido viscoso. Um agente molhante actualmente preferido é solução salina. Podem ser identificados equivalente pelo artesão utilizando não mais do que experimentação de rotina e conhecimentos vulgares no estado da técnica. Isto significa que para fazer e aplicar os usos, implantes e dispositivos da invenção, assim como outros aspectos materiais que dizem respeito à sua natureza e utilidade, incluindo, como fazer e como utilizar o assunto reivindicado será melhor compreendido pelo seguinte que constitui o melhor modo contemplado actualmente de realizar a invenção. Será considerado que a invenção não está limitada aos trabalhos dos exemplos, ou dos detalhes específicos apresentados nestes exemplos. I Considerações sobre Proteínas A Propriedades Bioquímicas, Estruturais e Funcionais de Proteínas Morfogénicas do Osso domínio que é

Proteínas de ocorrência natural identificadas e/ ou aqui consideradas como sendo osteogénicas ou proteínas morfogénicas do osso formam um subgrupo distinto com o agrupamento livre evolucionário de proteínas relacionadas com a sequência conhecidas como a família TGF-β superfamília ou família de supergenes. Os morfogénios do osso que ocorrem naturalmente partilham uma homologia substanciai de sequências de aminoácidos nas regiões C-terminais (domínios). Tipicamente as proteínas osteogénicas de ocorrência natural acima mencionadas são traduzidas como um precursor, possuindo uma sequência peptidica de sinalização de terminal N de tipicamente menos do que cerca de 30 resíduos, seguidos por um "pro" 34 quebrado para dar origem ao domínio C-terminal. 0 péptido de sinal é quebrado rapidamente por translação, num local de cisão que pode ser previsto numa dada sequência utilizando o método de Von Heijne (1986) Nucleic Acids Research 14:4683-4691. 0 pro domínio é tipicamente de cerca de três vezes maior do que o domínio de terminal C maduro completamente processado.

Em concretizações preferidas, o par de polipéptidos morfogénicos possuem sequências de aminoácidos cada uma compreendendo uma sequência que partilha uma relação definida com uma sequência de aminoácidos de um morfogénio de referência. Os aqui preferidos polipéptidos osteogénicos partilham uma relação definida com uma sequência presente na SEQ ID N° 2 OP-1 humana osteogenicamente activa. Contudo, qualquer uma ou várias das sequências biosintéticas aqui reveladas poderiam ser utilizadas como uma sequência de referência. Polipéptidos osteogénicos preferidos partilham uma relação definida com pelo menos o domínio de seis cisteínas do terminal C do OP-1 humano, resíduos 336-431 da SEQ ID N° 2. Preferencialmente, os polipéptidos osteogénicos partilham uma relação definida com pelo menos o domínio de sete cisteínas do terminal C do OP-1 humano, resíduos 330-431 da SEQ ID N° 2. Isto é, polipéptidos preferidos numa proteína dimérica com actividade morfogénica do osso compreendendo cada uma sequência que corresponde a uma sequência de referência ou é funcionalmente equivalente a ela.

Sequências funcionalmente equivalentes incluem arranjos funcionalmente equivalentes de resíduos de cisteína dispostos na sequência de referência, incluindo inserções de aminoácidos, ou delecções que alteram o arranjo linear destas cisteínas, mas que não prejudicam materialmente a sua relação na estrutura dobrada da proteína morfogénica dimérica, incluindo a sua capacidade 35 de formar tais ligações dissulfídicas intra ou inter cadeia como pode ser necessário para a actividade morfogénica. Funcionalmente, sequências equivalentes incluem ainda aquelas em que um ou vários resíduos de aminoácidos difiram do resíduo correspondente de uma sequência de referência, por ex. o domínio de sete cisteínas de terminal-C (também referido aqui como o esqueleto conservado de sete cisteínas) de OP-1 humano, desde que esta diferença não destrua a actividade morfogénica do osso. Neste contexto, são preferidos substituições conservativas dos aminoácidos correspondentes na sequência de referência. Resíduos de aminoácidos que são substituições para os resíduos correspondentes numa sequência de referência são aqueles que são fisicamente ou funcionalmente semelhantes aos resíduos correspondentes de referência, por ex. que possuem um tamanho semelhante, forma, carga eléctrica, propriedades químicas incluindo a capacidade de formar ligações covalentes ou de hidrogénio, ou semelhantes. Substituições conservativas particularmente preferidas são aquelas que preenchem os critérios definidos para uma pontuação pontual aceite in Dayhoff et al. (1978). 5 Atlas protein Sequence and Structure, Suppl. 3. Ch. 22 (pág. 354-352), Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C. 20007.

Exemplos de substituições conservativas incluem: substituições conservativas incluem tipicamente a substituição de um aminoácido por outro com características semelhantes, por ex., substituições dentro dos grupos seguintes valina, glicina; glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutâmico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; e fenilalanina, tirosina. O termo "variação conservatíva" também inclui a utilização de um aminoácido substituído em lugar de um aminoácido progenitor não substituído desde que 36 os anticorpos criados para o polipéptido substituído também reaja imunitariamente com o polipéptido não substituído.

Proteína osteogénica de origem natural na sua forma madura é um dímero glicosílado possuindo tipicamente um peso molecular aparente de cerca de 30-36 kDa como determinado por SDS-PAGE. Quando reduzido, a proteína de 30 kDa dá origem a duas unidades de péptídos glicosílados possuindo pesos moleculares aparentes de cerca de 16 kDa e 18 kDa. No estado reduzido, a proteína não possui activídade osteogénica detectável. A proteína não glicosilada que também possui actividade osteogénica possui um peso molecular aparente de cerca de 27 kDa. Quando reduzida, a proteína de 27 kDa dá origem a dois polipéptidos não glicosílados, possuindo pesos moleculares de cerca de 14 kDa a 16 kDa, capazes de induzir formação de osso endocondral num mamífero. Como descrito acima, sequências particularmente úteis incluem aquelas que compreendem o terminal C 96 ou 102 das sequências de aminoácidos da DPP (da Drosophila). Vgl (de Xenopus), Vgr-1 (de rato), as proteínas OP-1 e OP-2 (ver Pat. US N° 5,011,691 e Oppermann et al., assim como as proteínas referidas como BMP2, BMP3, BMP4 (ver W088/00205, Patente US N° 5,013, 649 e WO91/18098), BMPS e BMP6 (ver W0900/11366, PCT/US90/01630) , BMP8 e BMP9.

Outras proteínas rnorfogénicas úteis na realização da invenção incluem formas morfogenicamente activas de OP-1, OP-2, OP-3, BMP2, BMP3, BMP4, BNT5, BMP6, BMP9, GDF-5, GDF-6, GDF-7, DPP, Vgl, Vgr, proteína 60A, GDF-1, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, BMP10, BMP11, BMP13, BMP15, UNIVIN, NODAL, SCREW, ADMP ou NURAL e suas variantes de sequências de aminoácidos. Numa concretização preferida, proteína osteogénica inclui qualquer uma das OP-1, OP-2, OP-3, BMP2, BMP4, BMPS, BMP6, BMP9, e variantes da sequência de 37 aminoácidos e seus homólogos, incluindo suas espécies homólogas.

Publicações que revelam estas sequências, assim como as suas propriedades químicas e físicas, incluem: OP-1 e OP-2: US 5,011,91, US 5,266,683, Ozkaynak et al. (1990) EMBO J. 9: 2085-2093: OP3: WO94/102Q3 (PCT Us93/10520);

BMP2, BMP3, BMP4: W088/00205, Wozney et al. (1988) Science 242: 1528-1534: BMP5 e BMP 6: Celeste et al. (1991) PNAS 87:9843-9847; Vgr-1: Lyons et al. (1989) PNAS 86: 4554- 4558: DPP: Padgett et al. (1987) Nature 325. 81-84; Vg-1: Weeks (1987) Cell 51: 861-867; BMP-9: WO95/33830 (PCT/US95/07084) ; BMP10: W094/26893 (PCT/US94/05290); BMP-11: W094/26892 (PCT/US94/05288); BMP12: WO95/16035 (PCT/US94/14030); BMP-13: WO95/16035 (PCTUS94)14 030); GDF- 1: W092/00382; BMP12; WO95/16035 (PCT/US94/14030); BMP-13: WO95/16035 (PCTUS94/14030); GDF-1: W092/00382 (PCT/US91/04 0 96) e Lee et al. (1991) PNAS 88: 4250-4254; GDF-8: W094/2168 (PCT/US94/03019); GDF-9: W094/15966 (PCT/US94/00 68 5) ; GDF-10: WO95/10539 (PCT/US94/11440); GDF-11: WO96/018 45 (PCCTIUS95/08543); BMP-15: WO96/36710 (PCT/US96/06540);MP021: WO96/01316 (PCT/EP95/02552); GDF-5 (CDMP-1. MP52): W094/15949 (PCT/US94/00657) e W096/1433 (PCT/US94/12814) e WO93/16099 (PCT/EP93/00350) ; GDF-6 (CDMP-2, BMP13): W095/01801 (PCTUS94/07762) e W096/14335 e WO95/10635 (PCT/US94/14030); GDF-7 (CDMP-3,BMP12): W095/10802 (PCT/US94/07799) e WO95/10635 (PCT/US94/14030).

Numa outra concretização proteínas úteis incluem construções biosintéticas biologicamente activas, incluindo proteínas morfogénicas biosintéticas novas e proteínas quiméricas concebidas utilizando duas ou mais morfogénios conhecidos. Ver também as construções biosíntéticas reveladas na Pat. USS 5,011,691 (por ex. COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7, e COP16). 38

Em determinadas concretizações preferidas proteínas morfogénicas dos osso úteis para aqui incluem aquelas em que as sequências de aminoácidos compreendem uma sequência que partilha pelo menos 70% da homologia ou "semelhança" da sequência de aminoácidos e preferencialmente 80% da homologia ou semelhança com uma proteína morfogénica de referência seleccíonada entre as proteínas de origem natural anteriores. Preferencialmente, a proteína de referência é OP-1 humana, e a sua referência é o domínio de sete cisteínas de terminal C presente nas formas osteogenicamente activas da OP-1 humana, resíduos 330-431 da SEQ ISN° 2. Em determinadas concretizações um polipéptido suspeito de ser funcionalmente equivalente a um polipéptido morfogénico de referência é alinhado com este utilizando o método de Needleman, et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, implementado convenientemente por programas de computadores, tal como o programa Align (DNAstar, Inc) . Como mencionado acima, falhas internas e inserções de aminoácidos na sequência candidata são ignorados para o objectivo de calcular a relação definida, expressa convencionalmente como um nível de homologia da sequência de aminoácidos ou identidade, entre o candidato e as sequências de referência. "Homologia da sequência de aminoácidos" é aqui compreendida como incluindo tanto a identidade da sequência de aminoácidos e semelhança. Sequências homólogas partilham resíduos de aminoácidos idênticos e/ ou semelhantes, em que resíduos semelhantes são substituições conservativas de ou "mutações pontuais permitidas" de, correspondendo a resíduos de aminoácidos numa sequência de referência alinhada. Assim, uma sequência polipéptidica alinhada que partilha 70% de homologia de aminoácidos com uma sequencia de referência é uma em que 70% dos resíduos alinhados são idênticos a, ou são substituições conservativas dos resíduos correspondentes 39 numa sequência de referência. Numa concretização actualmente preferida, a sequência de referência é OP-1. Proteínas morfogénicas do osso úteis neste caso compreendem neste contexto uma contra parte alélica, filogenética e outras variantes da sequência de referência preferida, em que proteínas de ocorrência natural ou produzidas biosinteticamente (incluindo por ex. "muteínas" ou "proteínas mutantes"), assim como novos membros da família geral de proteínas morfogénicas, incluindo aquelas apresentadas e identificadas acima. Determinados polipéptidos morfogénicos particularmente preferidos partilham pelo menos 60% de uma identidade de aminoácidos com a sequência de referência preferida da OP-1 humana, ainda de forma mais preferida pelo menos 65% da identidade dos aminoácidos.

Noutras concretizações preferidas, a família dos polipéptidos morfogénicos do osso úteis na presente invenção, e seus membros são definidos por uma sequência de aminoácidos definida. Por exemplo, a Sequência genérica 7 (SEQ ID N°:4) e Sequência Genérica 8 (SEQ ID N°:5) revelada abaixo acomoda as homologias partilhadas entre membros da família de proteínas preferida identificada até à data, incluindo pelo menos OP-1, OP-2, OP-3, CBMP-2A, CBMP-2B, BMP-3, 60A, DPP, Vgl, BMP-5, BMP-6, Vgr-1, e GDF-1. As sequências de aminoácidos para estas proteínas são aqui descritas e/ ou no estado da técnica, como sumarizado acima. As sequências genéricas incluem tanto a identidade dos aminoácidos partilhada por estas sequências no domínio de terminal C, definido pelas seis ou sete esqueletos de cisteína (Sequências Genéricas 7 e 8, respectivamente), assim como resíduos alternativos para as posições variáveis na sequência. As sequências genéricas disponibilizam um esqueleto de cisteína apropriado, onde ligações dissulfídicas inter ou intramoleculares se podem formar, e 40 contêm determinados aminoácidos críticos prováveis para influenciar a estrutura terciária das proteínas dobradas. Adicionalmente, as sequências genéricas permitem uma cisterna adicional na posição 36 (Sequência Genérica 7) ou posição 41 (Sequência genérica 8), compreendendo assim, as sequências morfologicamente activas de OP-2 e OP-3.

Sequência Genérica 7

Leu 1 Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Giy Τφ l Xaa Xaa Xaa Xaa 5 Xaa Xaa Pro 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Tyr Cvs Xaa Gly 20 25 Xaa Cys Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 30 35 Xaa Xaa Xaa Asn ffis Aía Xaa Xaa Xaa Xaa 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 Xaa Xaa Xaa Cys Cys Xaa ' Pro Xaa Xaa Xaa 60 65 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa 70 75 Xaa Xaa Xaa Vai Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa 80 85 Xaa Met Xaa Vai Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa 90 95 em que Xaa é independentemente seleccionado num grupo de um ou vários aminoácidos especificados definidos como se segue: "Res" significa "resíduo" e Xaa no res.2 =(Tyr ou Lys) ; Xaa no res. 3= Vai ou Ile) ; Xaa no res. 4= (Ser, Asp ou Glu); Xaa 41 "Res." means "residue” and Xaa at res.2 = (Tyr or Lys); Xaa at res.3 = Valor lie); Xas at res.4 = (Ser, Asp orGIu); Xaa aí res.S = (Arg, Gin, Ser, Lys or Ala); Xaa at res.7 = (Asp or Glu); Xaa st res.8 = (Leu, Vai or lie); Xaa at res. 11 = (Gin, Leu, Asp, His, Asn or Ser); Xaa aí res. 12 = (Asp, Arg, Asn or Glu); Xaa at res. 13 = (Trp or Ser); Xaa atres.14= (lleor Vai); Xaa at res. 15 = (lie or Vai); Xaa at res.16 (Ala or Ser); Xaa at rss.18 = (Glu, Gin, Leu, Lys, Pro or Arg); Xaa at res.19 = (Giy or Ser); Xaa at res,20 = (Tyr or Phe); Xaa at res.21 = (Ala, Ser, Asp, Met, His, Gin, Leu or Gly); Xaa at res.23 = (Ty-, Asn or Phe); Xaa at res.26 = (Glu, His, Tyr, Asp, Gin, Ala or Ser); Xaa at res.28 = (Glu, Lys, Asp, Gin or Ala); Xaa at res.30 = (Ala, Ser, Pro, Gin, lie or Asn); Xaa at res,31 = (Phe, Leu or Tyr); Xaa atres.33 = (Leu, Vai or Met); Xaa at res,34 = (Asn, Asp, Ala, Thr or Pro); Xaa at res.35 = (Ser, Asp, Glu, Leu, Ala or Lys); Xaa at res,36 = (Tyr, Cys, His, Ser or lie); Xaa at res.37 = (Met, Phe, Gly or Leu); Xaa at res.38 = (Asn, Seror Lys); Xaa at res,39 = (Ala, Ser, Gly or Pro); Xaa at res.40 = (Thr, Leu or Ser); Xaa at res.44 = (lie, Vai or Thr); Xaa at res.45 = (Vai, Leu, Met or lie); Xaa at res 46 = (Gin or Arg); Xaa at res.47 = (Thr, Ala or Ser); Xaa at res.48 = (Leu or ffe); Xaa at res.4S = (Vai or Met); Xaa at res.50 = (His, Asn or Arg); Xaa at res.51 = (Phe, Leu, Asn, Ser, Ala or Vai); Xaa at res.52 = (He, Met, Asn, Ala, Vai, Gly or Leu); Xaa at res.53 = (Asn, Lys, Ala, Glu, Gly or Phe); Xaa at res.54 = (Pro, Ser or Vai); Xaa at res.55 = (Glu, Asp, Asn, Gly, Vai, Pro or Lys); Xaa af res.56 = (Thr, Ala, Vai, Lys, Asp, Tyr, Ser, Gly, Ife or His); Xaa at res.£7 = (Vai, Ala or lie); Xaa at res.58 = (Pro or Asp); Xaa at res.59 = (Lys, Leu or Glu); Xaa at res.60 = (Pro. Vai or Ala); Xaa at res. 63 = (Ala or Vai); Xaa aí res.65 = (Thr, Aía or Glu); Xaa at res.66 = (Gin, Lys, Arg or Glu); Xaa at res.67 = (Leu, Metor Vai); Xaa at res.68 = (Asn, Ser, Asp or Gly); Xaa at res.69 = (Ala, Pro or Ser); Xaa at res.70 = (lie, Thr, Vai or Leu); Xaa at res.71 = (Ser, Ala or Pro); Xaa at res.72 = (Vai, Leu, Met or lie); Xaa at res.74 = (Tyr or Phe); Xaa at res.75 = (Phe, Tyr, Leu or His); Xaa at res.76 = (Asp, Asn orteu); Xaa at res.77 = (Asp, Glu, Asn, Arg or Ser); Xaa af res.78 = (Ser, Gin, Asn, Tyr or Asp); Xaa at res.79 = (Ser, Asn, Asp, Glu or Lys); Xaa at res.80 = (Asn, Thr or Lys); Xaa at res.82 = (lie, Vai or Asn); Xaa at res.84 = (Lys or Arg); Xaa at res.85 = (Lys, Asn, Gin, His, Arg or Vai): Xaa at res.86 = (Tyr, Glu or His); Xaa at res.87 = (Arg, Gin, Glu or Pro); Xaa at res.88 = (Asn, Glu, Trp or Asp); Xaa at res.90 = (Vai, Thr, Ala or He); Xaa at res,92 = (Arg, Lys, Vai, Asp, Gin or Glu); Xaa at res.93 = (Ala, Gly, Glu or Ser); Xaa at res.95 = (Gly or Ala) and Xaa at res.97 = (His or Arg).

[0057] Generic Sequence 8 (SEQ ID NO: 5) includes all of Generic Sequence 7 and in addítion includes the following A Sequência Genérica 8 (SEQ ID N°: 5) inclui tudo da Sequência Genérica 7 e adicionalmente inclui a seguinte sequência (SEQ ID N°8) no seu terminal N:

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5

Neste contexto, começando com o resíduo 7, cada "Xaa" na Sequência Genérica 8 é um aminoácido especifico definido como para a Sequência Genérica 7, com a distinção de que cada número do resíduo descrito para a Sequência Genérica 7 é deslocado de 5 na Sequência Genérica 8. Assim, "Xaa no res.2=(Tyr ou Lys)" na Sequência Genérica 7 refere-se a Xaa no res. 7 na Sequência Genérica 8. Na Sequência Genérica 8, Xaa no res. 20 (Lys, Arg, ala ou Gin); Xaa no res. 3= (Lys, Arg ou Met); Xaa no res. 4= (His, Arg ou Gin); e Xaa no res.5=(Glu, Ser, His, Gly, Arg, Pro, Thr, ou Tyr).

Numa outra concretização proteínas osteogénicas úteis incluem aquelas cefinídas pelas Sequências Genéricas 9 e 10 definidas como se segue. 42

Especificamente, as sequências genéricas 9 e 10 são sequências de aminoácidos compósitas das proteínas seguintes:OP-1 humana, 0P-2 humana, OP-3 humana, BMP-2 humana, BMP-3 humana, BMP-4 humana, BMP-5 humana, BMP-6 humana, BMP-8, humana, BMP-9 humana, BMP-10 humana, BMP-11 humana, Drosofila 60A, Xenopus Vg-1, ouriço do mar, UNIVIN, CDMP1-humano, (GDF5- de rato), CDMP-2 (GDF-6 de rato, BMP-13 humano), CDMP-3 humano (rato GDF-7, BMP-12 humano), rato GDF-3, GDF-1 humano, rato GDF-1, DOSALIN de galinha, dpp, Drosofila SCREW, NODAL de rato, GDF-8 de rato, GDF-8 humano, GDF-9 de rato, GDF-10 de rato, GDF-11 humano, GDF-11 de rato, BMP-15 humano, e BMP3b de rato. Tal como a Sequência Genérica 7, a Sequência Genérica 9 acomoda o esqueleto de seis cisteinas de terminal C 15, e o BMP3b de rato. Tal como a Sequência Genérica 7, a Sequência Genérica 9 acomoda o esqueleto de seis cisteinas de terminal C e, tal como a sequência genérica 8, a sequência Genérica 10 acomoda o esqueleto de sete cisteinas.

Sequência Genérica 9 (SEQ ID N°: 6) XZB XSH X8ã Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 S 10 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xk Pro Xaa Xsa Xaa 15 20 Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Gly Xaa Cys Xaa 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 40 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 45 50 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 55 60 Xaa Cys Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 75 80 A.H2 Xaa Xaa Xaa Xaa Xsa Xaa Xaa Xaa. Xaa 85 90 Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa 95 43

Em que Xaa é independentemente seleccionado no grupo de um ou vários aminoácidos especificados definidos como se segue: "Res." Significa "resíduo" e Xaa no res.l= (Phef Leu ou Glu); Xaa no res.2= (Tyr, Phe, His, Arg, Thr, Lys, Gin, Vai ou wherein each Xaa is independently selected from a group of one or more specified amino acids defined as foilows; "Res. “ means "residue" and Xaa at res. 1 = (Phe, Leu or Glu); Xaa at res 2 = (Tyr, Phe, His, Arg, Thr, Lys, Gin,Vai or Glu); Xaa at res. 3 = (Vai, lie. Leu or Asp); Xaa at res. 4 = (Ser, Asp, Glu, Asn or Phe); Xaa at res. 5 = (Phe or Glu); Xaa at res. 6 = (Arg, Gin, Lys, Ser, Glu, Ala or Asn); Xaa at res. 7 = (Asp, Glu, Leu, Ala or Gin); Xaa at res. 8 = (Leu, Vai, Met, lie or Phe); Xaa at res. 9 = (Gly, His or Lys); Xaa at res. 10 = (Trp onVIef); Xaa at res. 1 1 = (Gin, Leu, His, Glu, Asn, Asp, Ser or Gly); Xaa at res, 12 = (Asp, Asn, Ser, Lys, Arg, Glu or His); Xaa ai res. 13 = (Trp or Ser); Xaa at res. 14 = (lleor Vai); Xaa at res. 15 = (lleor Vai); Xaa at res, 16 = (Ala, Ser, Tyr or Trp); Xaa atres. 18 = (Glu, Lys, Gin, Met, Pro, Leu, Arg, His or Lys); Xaa at res, 19 = (Gly, Glu, Asp, Lys, Ser, Gin, Arg or Phe); Xaa at res. 20 = (Tyr or Phe); Xaa at res, 21 = (Ala, Ser, Gly, Met, Gin, His, Glu, Asp, Leu, Asn, Lys orThr); Xaa at res. 22 = (Ala or Pro); Xaa at res. 23 = (Tyr, Phe. Asn, Ala or Arg); Xaa at ras. 24 = (Tyr, His, Glu, Phe or Arg); Xaa at res. 26 = (Glu, Asp, Ala, Ser, Tyr, His, Lys, Arg, Gin or Gly); Xaa at res. 28 = (Glu, Asp, Leu, Vai, Lys, Gly, Thr, Ala or Gin); Xaa at res. 30 = (Ala, Ser, lie, Asn, Pro, Glu, Asp, Phe, Gin or Leu); Xaa atres. 31 - (Phe, Tyr, Leu, Asn, Gly orArg); Xaa at res. 32 = (Pro, Ser, Ala orVal); Xaa at res. 33 = (Leu, Met, Glu, Phe or Vai); Xaa at res. 34 = (Asn. Asp, Thr, Gly, Ala, Arg, Leu or Pro); Xaa at res, 35 = (Ser, Ala, Glu, Asp, Thr, Leu, Lys, Gin or His); Xaa atres. 36 = (Tyr, His, Cys, lie, Arg, Asp, Asn, Lys, Ser, Glu or Gly), Xaa at res. 37 = (Met Leu, Phe, Vai, Gly or Tyr); Xaa at res. 38 = (Asn, Glu, Thr, Pro, Lys, His, Gly, Met, Vai or Arg); Xaa at res. 39 = (Ala, Ser, Gly, Pro or Phe); Xaa at res. 40 = (Thr. Ser, Leu, Pro, His or Met); Xaa at res. 41= (Asn, Lys, Vai, Thr or Gin); Xaa at res. 42 = (His, Tyr or Lys); Xaa at res. 43 = (Ala; Thr, Leu or Tyr), Xaa at res. 44 = (lie, Thr, Vai, Phe, Tyr, Met or Pro); Xaa at res. 45 = (Vat, Leu, Met, lie or His); Xaa at res. 46 = (Gin, Arg or Thr); Xaa at res. 47 = (Thr, Ser, AJa, Asn or His); Xaa at res. 48 = (Leu, Asn or lie); Xaa at res. 49 = (Vai, Met, Leu, Pro or lie); Xaa at res. 50 = (His, Asn, Arg, Lys, Tyr or Gin);. Xaa at res. 51 = (Phe, Leu, Ser; Asn, Met, Ala, Arg, Glu. Gly or Gin); Xaa at res. 52 = (lie, Met, Leu, Vai, Lys, Gin, Ala or Tyr); Xaa at res. 53 = (Asn, Phe, Lys, Glu, Asp, Ala, Gin, Gly, Leu or Vai); Xaa at res. 54 = (Pro, Asn, Ser, Vai or Asp); Xaa at res. 55 = (Glu, Asp, Asn, Lys. Arg, Ser, Gly, Thr, Gin, Pro or His); Xaa aí res. 56= (Thr, His. Tyr, Ala, lie, Lys, Asp, Ser, Gly or Arg); Xaa at res. 57 = (Vai, lie, Thr, Ala, Leu or Ser); Xaa at res. 58 = (Pro, Gly, Ser, Asp or Ala); Xaa at res 59= (Lys. Leu. Pro, Ala, Ser, Glu, Arg or Gly); Xaa at res. 60 = (Pro, Ala, Vai, Thr or Ser); Xaa at res- 61 = (Cys. Vai or Ser); Xaa at res. 63 = (Ala, Vai or Thr); Xaa at res. 65 = (Thr, Ala, Glu, vai, Gly, Asp orTyr); Xaa atres. 66= (Gin. Lys; Glu, Arg orVal); Xaa atres. 67 = (Leu, Met, Thr or Tyr); Xaa atres. 68 = (Asn, Sor, Gly, Thr. Asp. Glu, Lys or Vai); Xaa at res. 69 = (Ala, Pro, Gly or Ser); Xaa at res. 70 =(lle, Thr, Leu or Vai)-, Xaa at res. 71 = (Ser, Pro, Ala, Thr. Asn or Gly); Xaa at res 72 = (Vai, lie, Leu or Met); Xaa at res. 74 = (Tyr. Phe, Arg. Thr. Tyr or Met); Xaa aí res, 75 = (Phe, Tyr, His, Leu, tle. Lys, Gin or Vai); Xaa at res. 76 = (Asp, Leu, Asn or Glu); Xaa at res. 77 = (Asp, Ser, Arg, Asn, Glu, Ala, Lys, Gly or Pro); Xaa at res. 78 = (Ser, Asn, Asp, Tyr, AJa, Gly, Gin, Met, Glu, Asn or Lys); Xaa at res. 79 = (Ser, Asn, Glu, Asp, Vai, Lys, Gly, Gin or Arg); Xaa at res 80 = (Asn, Lys. Thr, Pro, Vai, He, Arg, Ser or Gin); Xaa at res. 81 = (Vai, lie, Thr or Ala); Xaa at res. 82 = (He, Asn, Vai, Leu, Tyr, Asp or Ala); Xaa at res. 83 = (Leu, Tyr, Lys or lie); Xaa at res. 84 = (Lys, Arg, Asn, Tyr, Phe, Thr, Glu or Gly); Xaa at res. 85 = (Lys, Arg, His, Gin, Asn, Glu orVal); Xaa atres. 86 = (Tyr, His, Gtu or lie); Xaa at res. 87 = (Arg, Glu, Gin, Pro or Lys); Xaa at res. 88 = (Asn, Asp, Ala, Glu, Gly or Lys); Xaa at res. 89 = (Met or Ala); Xaa at res. 90 =(Val, lie, Ala, Thr, Ser or Lys); Xaa at res 91 = (Vai or Ala); Xaa at res. 92 = (Arg, Lys, Gin, Asp, Glu, Vai, Ala, Ser orThr); Xaa at res. 93 = (Ala, Ser, Glu, Gly, Arg or Thr); Xaa at res. 95 = (Gly, Ala or Thr); Xaa at res. 97 = (His, Arg, Gly, Leu or Ser). Further, afterres. 53 in rBMP3b and mGDF-10 there is an lie; after res. 54 in GDF-1 there is a T; after res. 54 in BMP3 íhere is a V; after res. 78 in BMP-8 and Dorsalin there is a G; after res. 37 in hGDF-1 there is Pro, Gly, Gly, Pro.

[0060] Generic Sequence 10 (SEG ID NO: 7) includes all of Generic Sequence 9 (SEG ID NO: 6) and in addition includes the following sequence (SEG ID NO: 9) at its N-terminus: SEQ ID N° 9

Cys

Xaa

Xaa 5 1 44

Neste contexto, começando com o resíduo 6, cada "Xaa" na Sequencia Genérica 10 é um aminoácido especificado definido como para a Sequência genérica 9, com a distinção de que cada número de resíduo descrito para a Sequência Genérica 9 é deslocado de 5 na Sequencia Genérica 10. Assim, "Xaa no res.1=(Tyr, Phe, His, Arg, Thr, Lys, Gin, Vai ou Glu)" na

Sequência Genérica 9 refere-se a Xaa no res. 6 na Sequência Genérica 10. Na Sequência Genérica 10, Xaa no res.2= (Lys, Arg, Gin, Ser, His, Glu, Ala, ou Cvs); Xaa no res.3=(Lys, Arg, Met, Lys, Thr, Leu, Tyr, ou Ala); Xaa no res. 4=(His, Gin, Arg, Lys, Thr, Leu, Vai, Pro, ou Tyr) ; e Xaa no res. 5= (Gin, Thr, His, Arg, Pro, Ser, Ala, Gin, Asn, Tyr, Lys, Asp, ou Leu).

Como referido acima, sequências de polipéptidos morfogénicas do osso actualmente preferidas úteis nesta invenção possuem uma identidade superior a 60%, preferencialmente maior do que uma identidade de 65% com a sequência de aminoácido definindo a sequência de referencia preferida de hOP-1. Estas sequências particularmente preferidas incluem variantes da contra-parte alélica e filogenética das proteínas OP-1 e OP-2, incluindo a proteína 60A da Drosofila. Neste contexto, em determinadas concentrações preferidas proteínas úteis morfogénicas incluem proteínas activas compreendendo pares de cadeias de polipéptidos na sequência de aminoácidos aqui referida como "OPX" (SEQ ID N°3), que define o esqueleto de sete cisteínas Xaa numa dada posição é independentemente seleccionada nos resíduos que ocorrem na posição correspondente na sequência de terminal C OP-1 ou OP-2 do rato ou humana. 45

Cya Xaa Xaa Hia Glu Leu Tyr Vai Ser Phe Xaa Asp Leu Gly Trp Xaa Asp Trp 1 5 .10 IS

Xaa Ile Ala Pro Xaa Gly Tyr Xaa Ala Tyr Tyr Cya Glu Gly Glu Cya Xaa Phe Pro 20 25 30 35

Leu Xaa Ser Xaa Met Asn Ala Thr Aen His Ala Ile Xaa Gin Xaa Leu Vai Hia Xaa 40 45 50 55

Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Vai Pro LyB Xaa Cye Cyo Ala Pro Thr Xaa Leu Xaa Ala 60 65 30

Xaa Ser Vai Leu Tyr Xaa Asp Xaa Ser Xaa Aen Vai Ile Leu Xaa Lye Xaa Arg 75 80 85 30

Aen Mec Vai Vai Xaa Ala Cys Gly Cye Hie 35 100 em que Xaa no res.2=(Lys ou Arg) ; Xaa no res.3=(Lys ou

Arg) r Xaa no res.11=(Arg ou Gin) ; Xaa no res.16=(Gin ou Leu) f Xaa no res.19=(Ile ou Vai) ; Xaa no res. 23=(Glu ou Gin) T Xaa no res.26=(Ala ou Ser) ; Xaa ou res.35=(Ala ou Ser) r Xaa no res.39=(Asn ou Asp) ; Xaa no res.41=(Tyr ou Cys) r Xaa no res.50=(Vai ou Leu) ; Xaa no res.52=(Ser ou Thr) t Xaa no res.56=(Phe ou Leu) , Xaa no res.57=(Ile ou Met) / Xaa no res.58=(Asn ou Lys) ; Xaa no res. 60= (Glu, Asp ou Asn); Xaa no res.61= (Thr , Ala ou Vai) ; Xaa no res. 65=(Pro ou Ala); Xaa no res. 71=(Gin ou Lys); Xaa no res.73=(Asn ou Ser); Xaa no res.75=(Ile ou Thr); Xaa no res.80=(Phe ou Thyr); Xaa ou res.82=(Asp ou Ser); Xaa no res.84=(Ser ou Asn); Xaa no res.89=(Lys ou Arg); Xaa no res.91=(Tyr ou His); e Xaa no res. 97=(Arg ou Lys).

Ainda noutra concretização preferida, proteínas úteis osteogenicamente activas possuem cadeias polipéptidicas com sequências de aminoácidos compreendendo uma sequência codificada por um ácido nucleico que hibridiza sob condições de hibridação baixas, médias, ou de elevada severidade com ADN ou ARN que codifica para as sequências morfogénicas de referência, por ex. sequências de terminal C definindo os domínios de sete cisteínas conservado de 0P-1, OP-2, BMP-2, 4, 5, 6, 60A, GDF3, GDF6, GDF7 e 46 semelhantes. Quando aqui utilizado, condições de híbridação altamente severas são definidas como sendo uma hibridação de acordo com técnicas conhecidas em 40% formamida, 5X SSPE, 5X solução de Denhardt, e 0,1% de SDS a 37°C de um dia para o outro, e lavando em 0,1 X SSPE, 0,1% SDS a 50°C. Condições de severidade padrão estão bem caracterizadas nos textos de referência de clonagem molecular disponíveis comercialmente. Ver, por exemplo Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed. ed. por Sambrook, Fritsch e Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I e II (D. N. Glover ed. , 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed., 1984): Nucleic Acid Hybridízation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); e B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984).

Como referido acima as proteínas úteis na presente invenção são geralmente proteínas diméricas compreendendo um par dobrado dos polipéptidos acima. Tais proteínas morfogénicas são inactivas quando reduzidas, mas são activas como homodímeros oxidados e quando oxidados em combinação com outros desta invenção para produzir heterodímeros. Assim, membros de um par dobrado de polipéptidos morfogénicos numa proteína morfogenicamente activa podem ser seleccíonados independentemente a partir de quaisquer dos polipéptidos específicos mencionados acima.

As proteínas morfogénicas do osso úteis nos materiais e métodos desta invenção incluem proteínas compreendendo qualquer uma das cadeias dos polipéptidos descritas acima, quando isoladas de fontes de ocorrência natural, ou produzidas por ADN recombinante ou técnicas sintéticas, e incluem variantes de contra partes alélicas e filogenéticas destas proteínas, assim como suas proteínas e várias construções truncadas e de fusão. Mutantes de delecção ou adição são também concebidos para ser activos, incluindo 47 aqueles que podem alterar o domínio conservado de seis' ou sete cisternas de termina V, desde que a alteração não quebre funcionalmente a relação destas cisteínas na estrutura dobrada. Neste contexto, tais formas activas são consideradas as equivalentes das construções especificamente descritas reveladas aqui. As proteínas podem incluir formas que possuem variados padrões de glicosilação, de terminais N variados, uma família de proteínas relacionadas possuindo regiões de homologia da sequência de aminoácidos e formas activas truncadas ou mutadas de proteínas nativas ou biosintéticas, produzidas por expressão do AND recombinante em células hospedeiras.

As proteínas morfogénicas do osso aqui contempladas podem ser expressas a partir de cADN truncado ou de ADNs sintéticos em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, e purificadas, quebradas, novamente dobradas e dimerizadas para formar composições morfogenicamente activas. Células hospedeiras actualmente preferidas incluem sem limitação procariontes incluindo E. coli, ou eucariontes incluindo leveduras, ou células de mamíferos, tais como células CHO, COS ou BSC. Um perito da técnica vai considerar que podem ser utilizadas com vantagem outras células hospedeiras. Descrições detalhadas das proteínas morfogénicas do osso úteis na prática desta invenção incluem como fazer, utilizar e testá-las no que diz respeito à actividade osteogénica são reveladas em numerosas publicações incluindo as patentes de invenção US Nos 5.266.683 e 5.011.691.

Assim, tendo em vista esta revelação e o conhecimento disponível no estado da técnica, os engenheiros genéticos peritos podem isolar genes de cADN ou livrarias genómicas de várias espécies biológicas diferentes, que codificam sequências de aminoácidos adequadas, ou oligonucleótidos, e depois podem expressá-los em vários tipos de células 48 hospedeiras, incluindo tanto procariontes e eucariontes para produzir grandes quantidades de proteínas activas capazes de estimular morfogenese do osso endocondral num mamífero. II. Considerações sobre Agentes de Ligação

Como já explicado, "agente de ligação" quando aqui utilizado significa qualquer material fisiologicamente compatível do grupo que consiste em carboximetil-celulose e um seu sal de sódio, em que o agente de ligação possui uma viscosidade de cerca de 10-200 cP e um grau de substituição de 0,65-0,90 que quando misturado com proteína osteogénica e matriz como aqui definido promove a formação de osso e/ ou cartilagem. Em determinadas concretizações correntemente preferidas, os ditos agentes de ligação promovem tal reparação utilizando proteína menos osteogénica do que os dispositivos osteogénicos padrão. Entre as outras características do agente de ligação preferido como aqui descrito está a capacidade de tornar o dispositivo: dobrável, possível de tomar forma e/ ou maleável; injectável; aderente ao osso, cartilagem, músculo e outros tecidos; resistente à desintegração por lavagem e/ ou irrigação durante a cirurgia; e, resistente ao deslocamento durante a cirurgia, suturação e pós- operatório, para mencionar apenas alguns. Adicionalmente, numa determinada concretização preferida um agente de ligação pode conseguir as caracteristicas anteriormente mencionadas e benefícios, quando presente em proporções relativamente baixas. Por exemplo, um dispositivo actualmente preferido melhorado compreende aproximadamente 1 parte de agente ligante e aproximadamente 5 partes de matriz. Outro dispositivo actualmente preferido compreende aproximadamente 1 parte de 49 agente de ligação e 3 partes de matriz. Como exemplificado aqui, dispositivos melhorados de proporções largamente divergentes podem induzir formação de osso e de cartilagem. Encontram-se aqui exemplificados dispositivos melhorados possuindo partes de agente ligante e partes de matriz variando de aproximadamente 1:1 a 4:1 até e incluindo pelo menos 10:1, assim como aproximadamente 1:2 a 1:5 até e incluindo pelo menos 1:10 e incluindo ainda 1:25 a 1:50. Qualquer proporção de agente de ligação em relação à matriz pode ser utilizado para realizar a presente invenção. Tudo o que é necessário é misturar o agente ligante com matriz e proteína osteogénica de modo a conseguir formação de osso e de cartilagem. Como discutido abaixo, o agente de ligação pode ser utilizado em proporções iguais ou superiores relativamente à matriz, mas tais agentes deverão ser testados como ensinado aqui para medir efeitos possíveis de diluição da matriz.

Os agentes ligantes aqui considerados como úteis são seleccionados a partir do grupo que consiste em carboximetilcelulose e um seu sal de sódio, em que o agente ligante possui uma viscosidade de cerca de 10-200 cP e um grau de substituição de 0,65-0,90 como exemplificado e descrito abaixo, outros agentes ligantes incluem, mas não estão limitados a dextrano, manitol, óleo mineral, óleo de sésamo e suas misturas. Como aqui exemplificado e descrito abaixo, outros agentes ligantes incluem, mas não estão limitados a dextrano, manitol, óleo mineral, óleo de sésamo e suas misturas. Fínalmente, outro agente de ligação aqui descrito é cola de fibrina, que compreende uma mistura de fibrogénio de mamíferos e trombina. Como aqui exemplificado, cola de fibrina pode compreender largas gamas de fibrinogénio e trombina, por exemplo parte da cola de fibrina e 25 partes 50 de β-TCP, o teor em trombina pode variar entre cerca de 2,0 U a 25 U, 5 U a 10 U e cerca de 2,5 U a 5 U. 0 teor em fibrinogénio pode variar entre cerca de 40 mg por 1000 mg de β-TCP, por exemplo num dispositivo melhorado contendo colagénio, o teor do fibrinogénio pode variar de cerca de 20 mg por 1000 mg de colagénio a cerca de 180 mg por 1000 mg de colagénio, por exemplo.

Considerando os ensinamentos aqui apresentados, o perito pode identificar equivalentes adequados dos agentes de ligação identificados acima utilizando experimentação meramente de rotina e conhecimentos vulgares do estado da técnica. Candidatos a agentes de ligação adequados podem ser identificados, caracterizados, testados e depois utilizados em dispositivos osteogénicos como apresentado abaixo.

Assim, o perito da técnica pode identificar candidatos a agentes de ligação correspondentes e podem reconhecer de modo semelhante equivalentes dos agentes de ligação preferidos especificamente aqui identificados utilizando apenas conhecimentos de rotina e experimentação de rotina. Tendo identificado um candidato adequado(s), o perito no estado da técnica pode então seguir as orientações apresentadas abaixo, quanto à selecção final de um agente de ligação preferido.

Baseados nos estudos semelhantes àqueles aqui descritos exemplos de agentes de ligação adequados não se encontram limitados a: combinação de manitoi/ dextrano; dextrano sozinho; combinação de manitoi/ óleo mineral; e óleo de sésamo. Um dispositivo melhorado contendo manitoi/ dextrano foi formulado como se segue. Uma parte de dextrano 40, 3 partes ce manitoi, 1 parte de dispositivo OP. Tais dispositivos melhorados foram formulados com 2,5 g de proteína osteogénica por g de colagénio ou por 0,5 g de colagénio variando a dose de proteína osteogénica. Para 51 utilização no método da presente invenção, a formulação foi molhada com aproximadamente com 0,8 ml de solução salina por 2,5 g de dispositivo contendo manitol/ dextrano. A seguir um dispositivo contendo apenas dextrano foi formulado a partir de 4 partes de dextrano ou uma parte de dextrano para uma parte de dispositivo OP, e molhado aproximadamente com 0,8 ml de solução salina por 2,0 g de dispositivo. A seguir, um dispositivo contendo apenas foi formulado com 4 partes de dextrano ou 1 parte de dextrano para 1 parte de dispositivo OP e molhado com aproximadamente 0,8 ml de solução salina por 2,0 g de dispositivo. O dextrano pode variar de 3000 a 40000 p.m. A seguir, um dispositivo manitol/ óleo mineral foi formulado a partir de 1,5 partes manitol, 1,5 partes de óleo mineral, e 1 parte de dispositivo OP. Esta formulação não requer ser molhada. Finalmente, um dispositivo melhorado contendo óleo de sésamo foi formulado com 1 parte de óleo e 1 parte de dispositivo OP. Esta formulação não requer ser molhada. Os dispositivos melhorados acima descritos ilustram a gama de agentes de ligação específicos, proporções em dispositivos melhorados, e volumes de agente molhante que pode ser utilizado nos dispositivos melhorados da presente invenção. Proporções químicas e requisito para se molhar são variáveis, no entanto pertencem todos ao estado da técnica. Cada um dos dispositivos melhorados anteriormente mencionados induz a formação de osso (medido pelo teor em cálcio e % de osso) quando testado no bioensaio subcutâneo no rato aqui descrito. A CMC como Agente Ligante

Como aqui ensinado a carboximetilcelulose (CMC) é o agente ligante preferido. CMC encontra-se comercialmente disponível de fornecedores tais como, mas não limitados a: 52

Hercules Inc., Aqualon®Division, Delaware: FMC Corporation, Pensilvânia; British Celanese, LtcL, Reino Unido; e Henkel KgaA, Reino Unido. Carbóximetilcelulose sódio é o sal de sódio de um policarbóximetil éter de celulose com um peso molecular tipico que varia entre 90C00-700000. CMC foi identificado como um agente de ligação candidato, baseado em parte no seguinte: CMC é largamente utilizado em formulações farmacêuticas orais e tópicas como um agente para aumentar a viscosidade. CMC é também utilizado na cosmética, artigos de toilete e alimentos como um emulsionante (0,25-1,0%), agente formador de gel (4,0— 6,05), injectável (0,05-0,75%), e ligante de comprimidos (1,0-6,0%) .

Enquanto que as caracteristicas anteriores são sugestivas da sua adequabilidade como agente ligante as experiências detalhadas abaixo confirmam que CMC era adequada para a utilização nos dispositivos osteogénicos melhorados aqui revelados. Tais experiências de confirmação foram necessários porque nenhuma dos documentos anteriores são semelhantes à reparação do osso ou da cartilagem para a qual os dispositivos osteogénicos melhorados aqui revelados são úteis. Por exemplo, nenhum dos documentos anteriores necessitam de CMC acima de 6%, contudo um dispositivo melhorado possível de implantar actualmente preferido da presente invenção, compreende mais do que, aproximadamente 6% (p/p) de CMC e preferencialmente pelo menos aproximadamente 10%, mais preferencialmente aproximadamente 12-20%, com aproximadamente cerca de 16% (p/p) ou 1 parte de CMC para 5 partes de dispositivo padrão sendo actualmente o mais preferido para um dispositivo implantável. Estas percentagens aproximadas encontram-se baseadas em cálculos do que é actualmente mais preferido para um dispositivo implantável. Estas percentagens aproximadas encontram-se baseadas em cálculos do peso total 53 da matriz misturada com o agente ligante, excluindo proteína osteogénica e agente molhante. Ê importante para a prática da presente invenção o facto de vários graus de carboximetilcelulose de sódio estarem comercialmente disponíveis possuírem viscosidades diferentes. Viscosidades de vários graus de carboximetilcelulose sódio são reportados e apresentados na Tabela 1 abaixo (ver, Handbook of Pharmaceutical Excipients (2a edição) American Pharmaceutical Association & Royal Pharmaceutical Society of Great Britain).

Tabela 1. Graus de viscosidade padrão de carboximetilcelulose

Grau Concentração (%p/v) Viscosidade (cP) Baixa viscosidade 4 50-200 Viscosidade média 2 400-800 Viscosidade 1 1500-3000 elevada Vários graus de carboximetilcelulose encontram-se comercialmente disponíveis, o grau mais frequentemente utilizado tem um grau de substituição (GS) de 0,7. 0 GS é definido como o número médio de grupos hidróxilos substituídos por unidade de anidroglucose. É este GS que determina a solubilidade aquosa do polímero. 0 grau de substituição e a viscosidade padrão de uma solução aquosa da concentração mencionada é indicada em qualquer rótulo de carboximetilcelulose sódica. CMC de baixa viscosidade (Aqulon® Division, Hercules Inc., Wilmington, DE) é actualmente preferida. Os graus actualmente preferidos de substituição variam entre 0,665-0,90 (DS=0,7, Aqualon® Type 7L) . 54

Como descrito acima a CMC encontra-se disponível em vários graus- de baixa, média e elevada viscosidade. Neste aspecto a viscosidade da carboxímetilcelulose (CMC) utilizada para formular um dispositivo osteogénico melhorado foi determinado para ser crítico para a formação do osso. Ao contrário dos ensinamentos do estado da técnica foi agora descoberto que a elevada viscosidade CMC afecta de forma adversa a formação do osso quando utilizada num dispositivo osteogénico melhorado compreendendo uma matriz como aqui definido. Patente de invenção US N° 5,587,897 (" a patente 897") ensina a utilização de CMC de elevada viscosidade (2480 cP) (ver Tabela 1 acima) para induzir a formação do osso. 0 dispositivo na patente 897, necessita contudo de uma matriz polimérica sintética em vez de uma matriz biológica, tal como o colagénio. Inesperadamente, quando um material biológico tal como colagénio é utilizado como uma matriz, o dispositivo melhorado tem de ser formulado com CMC de baixa viscosidade (aproximadamente 10-50 cP, ou 50-200) de modo a induzir formação de osso e/ ou cartilagem, como ensinado aqui.

Estudo de Toxicidade Utilizando um Dispositivo CMC

Um estudo de toxicidade foi conduzido comparando um dispositivo melhorado contendo CMC em relação a um dispositivo padrão. 0 dispositivo padrão foi preparado com 2,5 mg de OP-1/ grama de matriz de colagénio. O dispositivo melhorado contendo CMC foi preparado adicionando CMC de baixa velocidade (Aqualon®) a um dispositivo padrão numa razão de 1:5 seguida por irradiação. 25 mg de aliquotas de um dispositivo padrão ou dispositivo de simulacro (i.e sem proteína osteogéníca) e 30 mg de aliquotas de CMC contendo dispositivo melhorado ou dispositivo de simulacro foram 55 implantados num local subcutâneo do rato como descrito aqui noutro lugar (um implante por animal). Três implantes de cada formulação foram removidos aos 7 dias, 14 dias, 21 dias e 28 dias após implantação, e foram avaliados hístologicamente em relação à formação de osso e cartilagem e em relação à reacção do tecido local. Não foi observada nenhuma reacção celular adversa, e não houve evidência que indicasse quaisquer efeitos adversos da CMC, como determinado avaliando a inflamação e formação fibrosa. 0 perfil histológico do dispositivo melhorado contendo CMC foi geralmente semelhante em relação ao dispositivo OP padrão. Os níveis de cálcio do soro e de fosfatase medidos utilizando os ensinamentos padrão também seguiram o do dispositivo osteogénico padrão. Finalmente utilizando a toxicidade padrão nas análises em ratos com maturidade e imaturos não foram detectadas lesões significativas.

Estudos de Bioactividade com o Dispositivo Melhorado

Com base numa série de estudos de rotina descritos abaixo, a bioactividade de um dispositivo osteogénico padrão não foi afectada de forma adversa por mistura com CMC. Pelo contrário, a bioactividade é pelo menos comparável tanto para configurações do dispositivo, mas a capacidade de manipular o dispositivo intra-operativamente e para reter o dispositivo no local do defeito durante a cirurgia e fechamento da ferida é melhorada pela CMC. Para estes estudos CMC irradiada foi adicionada ao dispositivo padrão antes da implantação. como aqui descrito. Os ratos

Resumidamente, foram efectuados dois estudos medindo a libertação in vivo de OP-1 a partir de um dispositivo padrão + /- CMC. Numa experiência, 75 mg do dispositivo irradiado +/- 15 mg de CMC irradiada foram implantados num local subcutâneo em 56 dispositivos implantados foram removidos após 1 hora, 1 dia, 3 dias e 6 dias após implantação, seguida de extracção com 8M de tampão de ureia; o teor em OP-1 foi analisado por ELISA de rotina e análise de transferência de Western. 0 dispositivo OP-1 (não implantado nos animais) foi extraído com tampão de ureia de 8 M e utilizado como um padrão interno. Em geral, a cinética da libertação in vivo de OP-1 do dispositivo padrão de OP e do dispositivo melhorado contendo CMC foram semelhantes. A observação de que não houve diferença na sequestração de OP-1 ou retenção por um dispositivo padrão em função de um dispositivo melhorado contendo uma combinação de uma matriz de colagénio e CMC é

um resultado inesperado. Foi reportado que quando com matrizes poliméricas não biológicas, a CMC actua para sequestrar a proteína osteogénica. (Ver por exemplo , US 5,597,897).

Estudos ín vitro foram também efectuados. Nestes estudos a OP-1 libertada foi medida em contraste em contrate com os estudos in vivo acima descritos, em que a OP-1 que permaneceu no dispositivo foi medida. Num estudo, 25 mg do dispositivo OP ou do dispositivo CMC foi molhada com solução salina. 1 ml de soro de bovino foi então adicionado a cada dispositivo e os dispositivos foram incubados a 37°C. 0 sobrenadante foi removido e substituído com soro fresco após 1 e 3 horas. Após 6 horas adicionou-se 8 M de ureia para extrair qualquer OP-1 ainda associado com o dispositivo. As concentrações de OP-1 no sobrenadante foram analisadas por ELISA de rotina e técnicas de transferência de Western. Tanto o dispositivo padrão OP e o dispositivo melhorado contendo CMC possuíam cinéticas semelhantes de libertação de proteína durante as seis horas estudadas. Novamente, estes resultados foram inesperados tendo em vista relatórios anteriores em que a CMC actua para sequestrar a proteína osteogénica retardando assim e/ 57 ou evitando a sua libertação de misturas com matrizes poliméricas padrão, (ver, por exemplo, US 5,597, 897).

Concluindo, a CMC não inibe substancialmente a retenção ou libertação de OP-1 a partir de um dispositivo osteogénico contendo uma matriz de coiagénio in vivo ou in vitro.

Estudos de Estabilidade

Um estudo (ver tabela 2) foi efectuado comparando a estabilidade do dispositivo padrão OP com um dispositivo padrão contendo CMC. Baseado tanto em análises in vitro e um bioensaio que forma o osso (descrito aqui noutro lugar), o dispositivo melhorado contendo CMC foi observado ser pelo menos tão estável como o dispositivo padrão, quando armazenado a 30 graus durante um ano. Os dados também sugerem que a CMC pode ser previamente misturada com um dispositivo OP padrão e no fim esterilizado para uma configuração de produto unitário. Um tal produto unitário é útil para reparar defeitos locais do osso e cartilagem como exemplificado abaixo.

Tabela 2: Estabilidade de várias Formulações do Dispositivo osteogénico

Formu lação Irradiação prévia de OP-1 recuperação* Irradi ação poste rior OP-1 recupe ração* Recuperação de OP-1 após 4 semanas Recuperação de OP-1 após 3 meses Recuperação de OP-1 após 6 meses Recuperação de OP-1 após 12 meses Dispo sitivo Padrão 91% 63% 66% 58% 47,4% 37,4% Dispo sitivo CMC 77% 57% 53% 50% 43, 5% 34,8% *Baseado no teor teórico de OP-1 de 2,5 mg/ grama 58

Durante a formulação de um dispositivo padrão contendo CMC, a CMC e proteínas osteogénicas podem ser esterilizadas separadamente, por exemplo por exposição a radiação gama e depois as componentes esterilizadas combinadas para produzir o dispositivo padrão contendo CMC. Além disso, o CMC pode ser previamente misturado com o dispositivo padrão OP e a formulação esterilizada, por exemplo, por exposição à radiação gama. 0 último processo é referido no estado da técnica como esterilização terminal e foi utilizado para esterilizar outros dispositivos osteogénicos. Ver, por exemplo PCT/US96/10377, publicado como WO 96/40297 em 19 de Dezembro de 1996, e US 5,674,292 emitida em 7 de Outubro de 1997. Quando aqui utilizado o termo "esterilização" e esterilizado diz respeito a um processo utilizando meios físicos ou químicos para eliminar substancialmente todos os organismos viáveis, especialmente microrganismos, virus e outros patogénios, associados com o dispositivo da invenção. Os dispositivos esterilizados da presente invenção possuem preferencialmente um nível de segurança de esterilidade de 10”° como determinado pelos padrões da Federal Drug Administration (FDA). No caso dos dispositivos irradiados por radiação gama, por exemplo, as dosagens adequadas de radiação necessária para esterilizar um dispositivo particular pode ser determinado facilmente consultando o texto de referência "Associate for the Advancement of medicai Instrumentation Guidelines", publicado em 1992. Aí são disponibilizadas orientações para determinar a dose de radiação necessária para assegurar uma dada segurança de esterilidade para uma carga biológica particular do dispositivo. Dosagens para esterilizar os dispositivos da invenção encontram-se preferencialmente na gama de cerca de 0,5 a cerca de 4,0 megarad e mais preferencialmente encontram-se na gama de cerca de 2,0 a cerca de 3,5 megarad. 59

Ad i c i ο nalmente, foi efectuado um estudo para avaliar a estabilidade a curto tempo de um dispositivo osteogénico ao qual foi adicionado CMC e solução salina. 0 estudo utilizou um dispositivo padrão ao qual 200 mg de CMC embalado separadamente, irradiada. Amostras de CMC contendo dispositivos melhorados foram removidos e molhados com solução salina. Após 0, 1, 3, 6 e 22 horas o OOP-1 foi extraído com tampão de ureia 8 M e analisado por HPLC de fase reversa em condições redutoras. Os extractos foram também analisados para a actividade biológica de OP-1 , um ensaio padrão baseados em células para medir a fosfatase alcalina. Os dados indicaram que a OP-1 retém a actividade biológica nestas condições. Estes dados também sugeriram que a configuração do dispositivo melhorado contendo CMC resultante da mistura destas partes de componentes ( dispositivo osteogénico/ CMC/ solução salina) é utilizável durante várias horas após ter sido preparado, desde que o especialista com tempo intra-operação significativo durante o qual o produto permanece eficaz.

Teste da Integridade do Agente Ligante e Outras Características

Foram utilizados métodos da USP do estado da técnica para a identificação e caracterização de agentes de ligação a granel tais como CMC. Os testes incluíram testes de identidade química, viscosidade, pH perda por secagem e metais pesados. Foi testado também material para carga biológica antes da esterilização, assim como endotoxinas, pH, aparência e esterilidade após radiação. Um estudo de estabilidade foi efectuado para monitorizar a viscosidade, aparência e pH do material irradiado. Todos os níveis e 60 características foram aceitáveis como determinado utilizando os métodos padrão e técnicas.

Por exemplo, CMC (Aqualon®- baixa viscosidade) foi avaliado para a carga biológica e teor em endotoxinas. Aqualon CMC. Lote FP10 12342, foi avaliado, quanto à presença de endotoxinas (LAL) utilizando o ensaios LAL cinético cromogénico da BioWhittaker (Walkersvillee, MD, 21793) .

"A carga biológica pode ser medida como se segue. Por exemplo 200 mg de amostra de CMC foram solubilizadas em 100 ml de tampão fosfato água e filtrados através de filtros de 0,45 μη. os filtros foram colocados numa placa de TSA e incubados durante 48 horas. Duas amostras de CMC solubilizada foram inoculados com 10-100 CFUs de Bacillus subtilis para serem utilizadas como controlos de crescimento. Os dados sugeriram que a carga biológica da CMC é baixa, e que a CMC não interfere na análise matando bactérias ou inibindo o crescimento celular.

Caracterização da CMC após Irradiação

Foi efectuado um estudo comparando a viscosidade de CMC antes e depois da irradiação (irradiação gama, 2,5-3,0 megarads). Os dados indicaram que como reportado na técnica, a viscosidade diminui após irradiação. Enquanto que isto não afecta a bioactividade ou a sua utilidade geral como agente ligante (ver estudos apresentados aqui), o especialista deverá tomar este aspecto em linha de conta quando faz a avaliação da viscosidade ou das propriedades fluidicas de um dispositivo melhorado osteogénico. Foi efectuado também um estudo para avaliar a estabilidade do CMC irradiado. Os resultados indicaram que a CMC irradiada era estável durante pelo menos seis meses tanto a 4 como a 30°C. A viscosidade foi medida como o parâmetro da 61 estabilidade. Análises semelhantes e avaliações podem ser efectuadas para outros agentes de ligação ou materiais de dispositivos utilizados numa formulação desejada. B. Cola de Fibrina como um Agente Ligante

Como aqui descrito, "cola de fibrina" é um outro agente de ligação. Cola de fibrina compreende uma mistura de células de mamíferos fibrinogénio e trombina. Fibrinogénio humano encontra-se comercialmente disponível em produtos tais como, mas não limitados a: Tissucol® (ImmunoAG, Viena de Áustria), Beriplase®/(Behringwerke, Marburg, Alemanha), Biocoll® (Centre de transfusion sanguine de Lille (Pours, França) e Transglutine ® (CNTS Fractionation Centre, Estrasburgo, França). A trombina humana encontra-se disponível comercialmente na ImmunoAG, Viena, Áustria. A cola de fibrina também pode ser efectuada de fibrinogénio e trombina a partir de outras fontes de mamíferos, tal como, por exemplo fontes de bovino e de murino. A cola de fibrina foi identificada como um candidato a agente de ligação baseando-se nas suas propriedades do tipo gel e as suas características de manipulação melhorada, quando misturada com um material de matriz como, por exemplo, colagénio, ou β-TCP. A cola de fibrina foi apresentada como provocando uma resposta inflamatória baixa (ver abaixo) e para promover formação de osso.

Estudo de Toxicidade Utilizando um Dispositivo de Cola de Fibrina

Foi efectuado um estudo de toxicidade comparando uma cola de fibrina contendo um dispositivo melhorado com um dispositivo padrão. 0 dispositivo padrão foi efectuado misturando 10 μg de OP-1 em 47,5% de etanol/ 0,01% de TFA e 25 mg de colagénio e liofilizando a mistura de um dia para 62 o outro. Ο dispositivo padrão foi molhado com 100 μΐ de tampão fosfato salino (PBS) antes da implantação. O dispositivo melhorado contendo a cola de fibrina foi preparado adicionando 50 μΐ, de fibrinogénio de bovino (Sigma F8630, 10 mg/ml) e 50 pL de trombina de bovino (50 U/ml) ao dispositivo padrão preparado como descrito acima imediatamente antes da implantação. O dispositivo padrão e o dispositivo padrão contendo a cola de fibrina foram então implantados foram então implantados num local subcutâneo do rato como descrito noutro lado. Os implantes foram avaliados histologicamente para a formação de osso e de cartilagem e para reacção do tecido local. O dispositivo melhorado contendo a cola de fibrina provocou uma resposta inflamatória baixa e uma baixa formação fibrosa. O perfil histológico da cola de fibrina contendo o dispositivo melhorado era geralmente semelhante ao do dispositivo padrão. Ali não parecia haver nenhuma correlação entre a resposta inflamatória e a capacidade da cola de fibrina contendo o dispositivo melhorado para promover a formação de osso.

Estudos de Bioactividade com o Dispositivo Melhorado

Foi efectuado um estudo para avaliar a cinética de libertação de OP-1 de um dispositivo melhorado contendo cola de fibrina para diferentes concentrações de trombina in vitro. Foram melhoradas as cinéticas de libertação adicionando grandes quantidades de trombina. Para este estudo, 12,5 μΐ de OP-1 numa solução de lactose a 5% foi misturada com 50 mg de β-TCP, 25 μΐ, de fibrinogénio humano, e 25 U/ml de trombina humana ou 50 U/ml de trombina humana. As misturas foram transferidas para um frasco de vidro e 1 ml de soro de vitela foi adicionado a cada um. Deixou-se então as amostras a incubar a 37°C/ 60 rpm. As amostras de 63 soro foram tomadas e analisadas por ELISA de rotina a 0-1 horas e 5-24 horas. Os resultados encontram-se sumarizados na tabela abaixo.

Tabela 2A

Cone. de Trombina % de OP-1 libertada após 0-1 horas % de OP-1 libertada após 1-3 horas % de OP-1 libertada após 3-5 horas % de OP-1 libertada após 5-24 horas %Total OP-1 libertada 25 U/mL 6,4±0,7 5,2+0,4 3,0+0,6 13,0+0,6 27,5+2,2 50 U/mL 9,9+2,1 5,8+0,7 3,310,5 15,1+1,7 34,1+4,8 III. Considerações sobre Formulação e Administração

Considerações Gerais

Os dispositivos da invenção podem ser formulados utilizando métodos de rotina. Tudo o que é necessário é a determinação da concentração final desejada da proteína osteogénica por dispositivo considerando que o volume de administração do aparelho pode ser, mas não é necessário ser inferior ao volume no local do defeito. A concentração final desejada da proteína vai depender da actividade específica da proteína, assim como do tipo, volume e/ ou localização anatómica do defeito.

Adicionalmente, a concentração final desejada da proteína pode depender da idade, sexo e/ ou estado geral de saúde do receptor. Tipicamente para um tamanho crítico de defeito segmentário aproximadamente pelo menos 2,5 cm de comprimento, foi observado 0,5-1,75 mg de proteína osteogénica utilizando o dispositivo padrão para induzir a formação de osso suficiente para reparar a falha. No caso de um tamanho não crítico do defeito ou de uma fractura fresca foi observada 0,1-0,5 mg de proteína utilizando o dispositivo padrão para reparar o defeito. Em geral, as concentrações de proteína para utilização com matrizes 64 preferidas aqui descritas podem variar de 0,4 mg a cerca de 3,0 mg por dispositivo. A optimização das dosagens requer não mais do que experimentação de rotina e está ao nível de um vulgar perito da técnica.

Como aqui exemplificado proteína osteogénica e um agente de ligação tal como a carboximetilcelulose (baixa viscosidade, Aqualon®) , ou cola de fibrina pode ser misturada para formar uma pasta. Nalgumas concretizações é adicionado solução salina ao agente de ligação para formar uma pasta ou massa em que uma proteína osteogénica, tal como OP-1 se encontra dispersa. Pode ser utilizada uma configuração da pasta para pintar as superfícies de um defeito, tal como uma cavidade. As pastas podem ser utilizadas para pintar defeitos de fracturas, defeitos condrais ou osteocondrais, assim como defeitos do osso num local de implantação prostético. Uma configuração mais fluida pode ser injectada ou extrudida para dentro ou ao longo das superfícies de um defeito, de uma forma semelhante a extrudir pasta de dentes ou vedante de um tubo, de modo que a esfera ou dispositivo seja administrado ao longo do comprimento do local do defeito. Tipicamente, o diâmetro da esfera extrudida é determinado também pelo tipo do defeito, assim como pelo volume do vazio no local do defeito.

Como mencionado acima, outros agentes de ligação podem ser aqui definidos para formular um dispositivo com uma configuração de massa. Como será óbvio para o perito da técnica, uma tal configuração resulta do ajustar da proporção do veiculo para o agente molhante, com menos agente molhante produzindo um dispositivo mais seco e com mais produzindo um dispositivo mais molhado. A configuração precisa do dispositivo adequada para reparar um defeito vai pelo menos depender do tipo do defeito e do tamanho do 65 defeito. 0 perito no estado da técnica vai entrar ena linha de conta com as variáveis. A .CMC como Agente de Ligação em Estudos de Formulação

Baseado nos estudos de formulação do tipo seguinte, foi estabelecido que aproximadamente 0,2 g de CMC a aproximadamente 1,0 g de dispositivo osteogénico padrão 1,0 g disponibiliza um dispositivo melhorado com as propriedades de manuseamento actualmente preferidas. Foram combinadas variadas proporções de CMC e colagénio e depois molhadas com solução salina. Cada mistura resultante de CMC e matriz foi suspensa num tubo de centrífuga cónico de 15 ml de água e colocados num agitador rotativo (100 rpm) . O tempo de sedimentação foi registado quando partículas de matriz de colagénio soltas ou libertadas sedimentaram até uma marca pré-determinada no tubo. Os dados sumarizados na Tabela 3 e na Figura 1 sugerem que uma determinada gama de aproximadamente 0,15 a 0,25 g de CMC/g pode maximizar a coesão, integridade e propriedades de manipulação.

Tabela 3: Efeito da Razão de CMC/ Colagénio no Tempo de dispersão g de CMC/ g de colagénio Tempo de sedimentação 0,20 g 19 min 0, 19 17 0, 18 6 0, 15 4 0, 12 0,5 s A quantidade preferida de solução salina para molhar o dispositivo CMC foi também estudada. Neste estudo, aproximadamente 0,2 g de CMC foram misturadas com 66 aproximadamente 1 g de dispositivo osteogénico padrão. Foram adicionadas quantidades variáveis de solução salina e a consistência do dispositivo resultante foi apontada. Os resultados qualitativos e quantitativos deste estudo encontram-se sumarizados na Tabela 4 e na Figura 2 respectivamente. Geralmente estes dados ilustram que existe uma gama volumes de agente molhante que pode acomodar o especialista possibilitando que o dispositivo retenha a sua integridade e coesão. Para um agente de ligação como a CMC os dados sugerem que mais do que aproximadamente 1,5 ml, aproximadamente 1,8 a 2,5 ml de solução salina é o volume para molhar actualmente preferido (para aproximadamente 1 grama de dispositivo misturado com aproximadamente 200 mg de um agente de ligação tal como CMC) para obter um dispositivo implantável com a consistência de massa actualmente preferida. Quantidades em excesso a estas obtêm um dispositivo injectável com a consistência fluida actualmente preferida. Como apresentado aqui noutro lugar, uma configuração de dispositivo implantável é adequada para utilização num local de defeito aberto, enquanto que uma configuração de dispositivo injectável é útil para utilização num local de defeito fechado. Em termos de equivalentes grama, aproximadamente 0,5 g a aproximadamente 3,0 g de solução salina foi determinado para dar origem a dispositivos melhorados com a consistência desejada; quanto maior for o peso, quanto mais injectável é a configuração.

Tabela 4: Operação de Molhar o Dispositivo contendo CMC 1 g de dispositivo padrão mais 200 mg de CMC Quantidade de solução salina adicionado Observações 1,5 ml Seco 1,75 Rola até uma bola; pasta 2,0 Consistência de 67 manipulação actualmente preferida: massa. Rola até uma bola. 2,5 Consistência de manipulação aceitável; ainda tipo massa. 2,75 Deixa pequenas partículas de matriz na parede do recipiente. U> o Pegajosa; pasta macia 3,5 Pegajosa; pasta macia. 3,75 Pasta solta. 4,0 Mesma consistência que acima. 4,25 Líquido

Era determinadas concretizações da presente invenção, a preparação do dispositivo osteogénico melhorado actual pode ocorrer imediatamente antes da sua administração ao local do defeito. Como aqui exemplificado, os dispositivos melhorados contendo CMC podem ser preparados no local adequado para misturar imediatamente antes da cirurgia. Numa concretização, CMC (Aqualon®) de baixa viscosidade foi empacotada e irradiada separadamente da proteína osteogénica OP-1 e matriz de colagénio. A proteína OP-1 na matriz de colagénio foi então administrada com o agente de ligação. Dispositivos preparados desta maneira foram então observados como sendo pelo menos tão biologicamente activos como o dispositivo padrão sem CMC. B. Cola de Fibrina como Agente de Ligação - Estudos de Formulação

Baseado nos estudos dos tipos seguintes foi estabelecido que aproximadamente 500 μΐ de fibrinogénio (80 mg/ml em PBS a pH 7,4) e 500 μΐ de trombina (50 U/ml ou 25 68 U/mi em 0,9% de NaCi) foi adicionada aproximadamente 1 g de β-TCP dá origem a um dispositivo melhorado com a propriedades de manipulação actualmente preferidas. Questões relacionadas com propriedades de manipulação incluem o tempo de coagulação da cola de fibrina e a consistência da cola de fibrina contendo o dispositivo melhorado. Um dispositivo possuindo uma consistência de uma massa moldável é preferida. Quando a cola coagula, torna-se mais difícil alterar a forma da massa. Um tempo de coagulação mais longo é por isso uma caracteristica preferida do dispositivo. O tempo de coagulação da cola de fibrina de bovino foi determinada misturando 20 μΐ de solução de fibrinogénio de bovino (80 mg/mL em PBS a pH 7,4) com 20 μΐ de solução de trombina de bovino (500 U/ml ou 25 U/ml em solução salina) continuamente numa barquinha utilizando uma vareta de vidro capilar. Os tempos de coagulação foram também avaliados com ou sem adição de 0,6% de solução de CaCl2. Os resultados são apresentados na tabela seguinte:

Tabela 4 A

Trombina (U/ml) Tempo de coagulação em segundos p/o de CaCl2 Tempo de coagulação em segundos com 0,6% de CaCl2 500 23±2 20+2 250 4 0+5 2 9+2 100 61±2 4 9+2 50 90±2 74+2 25 — 18 5+2 A consistência do dispositivo contendo cola de fibrina foi avaliada utilizando um dispositivo contendo β-TCP como 69 exemplo de matriz. Quantidades diferentes de cola de fibrina de bovino foram detectadas por 100 mg ou 1000 mg de grânulos de β-TCP e a consistência foi determinada. Os resultados estão sumarizados na tabela abaixo:

Tabela 4B

Quantidade de β-TCP Fibrinogénio μΤ (80 mg/mL em PBS, pH 7,4) Trombina μΤ Consistência β-TCP não completamente molhado 100 mg 12,5 12,5 (100 U/mL em solução salina p/ 0,6% CaCl2) Ligeiramente moldável 100 mg 25 25 (100 U/mL em solução salina p/ 100 mgO, 6% 0α012) Massa, moldável a 1-2 min. 100 mg 50 50 (100 U/mL em solução salina p/ 0,6% CaCl2) Massa moldável 10 0 mg 50 50 (100 U/mL em solução salina p/ 0,6% CaCl2) Coagulação muito lenta, partículas separadas 1000 mg 500 500 (100 U/mL em solução salina p/ 0, 6% CaCl2) Mistura demasiado lenta, partículas não homogéneas, partículas separadas 1000 mg 500 500 (50 U/mL em solução salina CaCl2) Ma s s a, moldável a 1-2 min. 1000 mg 500 500 (50 U/mL em solução salina CaCl2) Massa moldável a 2-3 minutos

Como se pode verificar através destes dois estudos, um dispositivo contendo cola de fibrina de aproximadamente 500 70 μΐι de fibrinogénio (80 mg/rrtL em PBS a pH 7,4) e 500 pL de trombina (50 U/mL ou 25 U/mL em 0,9% de NaCl) adicionado aproximadamente a 1 g de β-TCP possui um tempo de coagulação e consistência adequada para o dispositivo osteogénico melhorado.

Tabela 4C: Informação representativa que diz respeito à composição da cola de fibrina

Sanguine de Lille (Tours, France) 2. Tissucol® é da Immuno AG (Viena, Áustria) 3. Beriplast® é da Behringwerke (Marburg, Germany) 4. Transglutine® é de CNTS Fractionation Centre (Estrasburgo, França)

Autocolle® Tissucol® Beriplast® Trans glutine © Biocoll® Fibrinogénio (mg/mL) 50, 65 70-110 20-140 >70 116±2,4 Fibronectina (mg/mL) 4-10 2-9 5,9±0,51 Factor XIII (PEU) 25-30 10-50 35+2,88 Tromboglo-bulina em (pg/mL) 250-400 PDGF (ng/itiL) 350 TGF (ng/mL) 750 Plasminogéni ο (pg/mL) 40-120 31 Aproteinina (KlU/mL) 3000 Albumina (mg/mL) 10 1. Autocolle® e Biocolle© são do Centre de Transfusion 71

Baseado nos estudos acima descritos foi estabelecido que aproximadamente 40 mg de cola de fibrina para aproximadamente 100 mg de β-TCP dá origem a um dispositivo melhorado como aqui contemplado. Baseado nos mesmos estudos foi estabelecido que aproximadamente 20 mg de cola de fibrina para 1000 mg de colagénio dão origem a um dispositivo com as propriedades preferidas aqui apresentadas. Geralmente, os dados sugerem que uma gama de aproximadamente 20-220 mg de cola de fibrina/ 1000 mg de matriz podem maximizar a coesão, integridade e propriedades de manipulação dependendo das circunstâncias precisas e da utilização pretendida. IV. Considerações sobre Outros Materiais

Em determinadas concretizações da invenção, o material da matriz preferido é β-TCP. Caracteristicas preferidas de um material não sintético, não polimérico para utilização como matriz na invenção reivindicada incluem, mas não estão limitadas a: elevada velocidade de absorção da matriz pelo tecido circundante e uma resposta inflamatória baixa. Como discutido acima β-TCP cerâmico sinterizado possuindo tamanhos de partícula que vão desde 212 μπι a cerca de 425 pm são actualmente mais preferidas, mas outros tamanhos de partículas podem ser utilizados para realizar a presente invenção. 72 Método de Análise de Imagem A velocidade de absorção da matriz de β-TCP foi determinada utilizando um método de análise de imagem padrão. Análise de imagem é um método de avaliar a distribuição de tamanho de partículas de grânulos de Ca/P. 0 tamanho de partículas de grânulos de CaP é comparado antes e depois da implantação em ratos. Os tecidos moles dos explantes foram dissolvidos com hipoclorito de sódio, e os grânulos de Ca/P restantes foram lavados várias vezes com água e secos à temperatura ambiente. As partículas são misturadas com glicerol e montadas sobre lamelas de vidro. 0 tamanho de partícula é determinado por microscopia utilizando um sistema de análise de imagem padrão, tal como Bioquant OS/2 ligado a uma câmara de vídeo ao microscópio. São seleccionadas matrizes com a indicação da área e o diâmetro mais longo para expressarem as dimensões das partículas individuais. Foram escolhidas e medidas as imagens das partículas apresentando escalas de cinzento de 0 a 88 num nível de 256. Os dados em bruto das partículas individuais foram utilizados para calcular a média e desvio padrão. Pelo menos 50 partículas são medidas em cada conjunto de dados.

Estudo subcutâneo de Rato

No estudo apresentado abaixo, β-TCP é formulado (Clarkson, #211096, BD=0,86, 212-425 μια, 9/6/97) é formulado numa pasta de CMC/ sangue com ou sem 10 pg de OP-1 e implantado em locais subcutâneos do rato. Os implantes são removidos após 6 e 12 semanas in vivo e analisados utilizando o método de análise de imagem descrito acima. Os resultados para as seis semanas encontram-se sumarizados na Tabela 4D abaixo. Os resultados indicam que após seis 73 semanas o tamanho de β-TCP diminui de 33 4 pm a 18 4 μιη (sem OP-1) e para 1,66 μηα (com OP-1) . A diferença no tamanho entre amostras de OP-1 tratadas e não tratadas não é significativa. Contudo, existe uma redução de cerca de 50% no diâmetro de β-TCP após seis semanas.

Tabela 4 D

Absorção in vivo de β-TCP às seis semanas Amostras (n=4) Tempo in vivo OP-1 (Mg) Tamanho de partícula (μιη) Área da partícula (mm2) β-TCPZCMGZ sangue Seis semanas 0 184129 0,02210,008 β-TCPZCMCZ sangue Seis semanas 10 166122 0,01610,004 β-TCP sozinho (212-425 μπι) 334116 0,06810,007

Tabela 4E: Fonte e Composição de Alguns Materiais preferidos para a Matriz e Componentes Preferidos da Cola de Fibrina

Item Fonte Composição CaZP partículas Cia rkson Chromatography Products Inc. (S. Wiliamsport, PA) Gama de 50-200 μιη, por exemplo, hidróxiapatite (Caio (P04)6(OH)2 ou β-TCP (Ca3(P04) 2 Fibrinogénio de bovino Sigma (F8630) (St. Louis. MO) 75% proteína, 10% de citrato de sódio, 15% NaCl 74

Trombina humana Iromuno AG (Viena Áustria) 500 U ou 4U por frasco, reconstituído em 2 mL 4 0 rnM de CaCla Grânulos de p-TCP Clarkson Chromatography Products Inc. (S. Wíliamsport, PA) Gama de 50-2000 pm, a composição é (Ca3(P04) 2) Soro de vitela Life Technologies (16170-078) (Gaithersburg MD) n. a. Trombina de bovino Sigma (T4648) (St. Louis MO) 50-100 0/ m de proteína Trombina de rato Sigma (T5772) (St. Louis MO) 100 U/mg de proteína Fíbrinogénio de rato Sigma (F67 55) (St. Louis MO) 70% proteína, 12% de citrato de sódio, 18% NaCl

Inflamação

Em geral pode ser assumido que pequenas partículas vão ser absorvidas mais rapidamente do que partículas maiores. Os resultados indicam que sem OP-1, β-TCP (212-425 μιη) provocou uma resposta inflamatória levemente elevada. Contudo, a reacção inflamatória foi reduzida à medida que a dose de OP-1 aumentou de 10 pm para 20 pg. Estudos animais prévios mostraram que pequenas partículas inferiores a 10 μιη provocou uma elevada resposta inflamatória. Por isso, a utilização de β-TCP sinterizado (100%) partículas do tamanho de 212 a 425 μιη é um equilíbrio entre a velocidade de absorção, baixa inflamação, e capacidade para suportar a formação de osso no modelo subcutâneo do rato. 75 V. Bioensaio A Bioensaio de Actividade Osteogénica: Formação endocondral do Osso e Propriedades Relacionadas A seguir apresenta-se a título de exemplo protocolos para identificar e caracterizar bona fide proteínas osteogénicas ou morfogénicas do osso, assim como dispositivos osteogénicos no âmbito da invenção da requerente. 0 bioensaio reconhecido no estado da técnica para a indução do osso como descrito por Sampath e Reddi (Proc. Nat 1. Acad. Sei. USA (1983) 80:6591-6595) e Pat. Us N° 4,968,590 é utilizada para estabelecer a eficácia da dos protocolos de purificação. Resumidamente, este ensaio consiste na deposição de amostras teste em locais subcutâneos em ratos aceitadores alogénicos com anestesia de éter. É efectuada uma incisão vertical (1 cm) em condições estéreis na pele sobre a região toráxica, e uma bolsa é preparada por dissecção brusca. Em determinadas circunstâncias aproximadamente 255 mg da amostra teste é implantada profundamente dentro da bolsa e a incisão é fechada com uma mola metálica da pele. O local heterotrópico permite o estudo da indução do osso sem as ambiguidades possíveis resultando do uso de locais ortotópicos.

As reacções celulares sequenciais que ocorrem no local heterotrópico são complexas. A cascata em multipassos de formação de osso endocondral inclui: formação de fibrina e fibronectina na matriz implantada, quimiotaxis de células, proliferação de fibroblastos, diferenciação em condroblastos, formação de cartilagem, invasão vascular, formação de osso, remodelação e diferenciação da medula óssea. Em ratos este modelo de bioensaio exibe uma 76 progressão controlada através das fases de desenvolvimento do osso endocondral induzido pela matriz incluindo: (1) infiltração transiente por leucócitos polimorfonucleares no dia um; (2) migração das células mesenquimais e proliferação nos dias dois e três (3) aparecimento de condrócitos nos dias cinco e seis; (4) formação da matriz da cartilagem no dia sete; (5) calcificação da cartilagem no dia oito; (6) invasão vascular, aparecimento de osteoblastos, e formação de osso novo nos dias nove e dez; (7) aparecimento de remodelação osteoblástica e osso nos dias doze a dezoito; e (8) diferenciação de medula óssea hematopoiética no ossiculo no dia vinte e um. É preferido o seccionamento histológico e coloração para determinar a extensão da osteogénese nos implantes. A coloração com azul de toluidina ou hemotoxilina/ eosina demonstra claramente o desenvolvimento final do osso endocondral. Bioensaios de 12 dias são suficientes para determinar se a actividade induzida pelo osso se encontra associada com a amostra teste.

Adicionalmente a actividade da fosfatase alcalina pode ser utilizada como um marcador para a osteogénese. A actividade enzimática pode ser determinada espectrofotometricamente após homogeneização do material teste cortado. Os picos de actividade a 9-10 dias in vivo e declina lentamente depois. Amostras que não mostram nenhum desenvolvimento do osso por histologia não deverão ter actividade à fosfatase alcalina nestas condições do ensaio. O ensaio é útil para a quantificação e obtenção de uma estimativa muito rápida da formação óssea após as amostras teste terem sido removidas do rato. Por exemplo, amostras contendo proteína osteogénica em vários níveis de pureza foram testadas para determinar a dose mais eficaz/ nível de pureza, de modo a procurar uma formulação que poderia ser produzida à escala industrial. Os resultados são medidos 77 pelo nível de fosfõtase alcalina e a avaliação histológica pode ser representada como "unidades formadoras do osso". Uma unidade formadora do osso representa a quantidade de proteína que é necessária para metade da actividade necessária para a formação de osso no dia 12. Adicionalmente podem ser construídas curvas de doses para induzir actividade de osso in vivo em cada passo de um esquema de purificação ensaiando várias concentrações de proteína. Neste contexto, o perito da técnica pode construir curvas representativas de doses utilizando apenas experimentação de rotina. B. Formação de Cartilagem: Imunohistoquímica, Histologia e Microscopia de Luz Polarizada 1. Imunohistoquímica e Histologia

Resumidamente é bem conhecido do estado da técnica que a identificação de cartilagem articular bona fide pode ser conseguida utilizando parâmetros ultraestruturais e/ ou parâmetros bioquímicos. Por exemplo, a cartilagem articular forma uma camada contínua de tecido de cartilagem possuindo zonas identificáveis. A zona superficial é caracterizada por condrócitos possuindo uma morfologia achatada e uma rede extracelular que não cora, ou é pouco corada com azul de toluidina indicando a ausência relativa de proteoglicanos sulfatados. 0 azul de toluidina é vulgarmente utilizado para corar o osso e cartilagem. É um processo de coloração metacromático que dá origem a diferentes cores baseadas na presença de cargas negativas espaçadas densamente nos tecidos que conduzem a agregação e polímerização do corante que passa da cor azul para a cor púrpura. 0 osso é corado de azul enquanto que a cartilagem com os seus acídicos mucopolissacarídeos é corada de 78 púrpura escura. Condrócitos nas zonas médias e profundas possuem uma aparência esférica e a matriz contém proteogiicanos sulfatados abundantes, como evidenciado pela coloração com azul de toluidina. Fibras de colagénio encontram-se presentes de forma difusa através da matriz. Os condrócitos possuem um retículo endoplásmico grosseiro abundante e estão rodeados por uma rede extracelular. A rede pericelular contém numerosas fibras finas de colagénio não ligadas. 0 colagénio na rede interterritorial é menos compactado e embebido em material amorfo electronicamente translúcido, semelhante a cartilagem articular. Fibras de colagénio na região interterritorial da rede exibem a ligação periódica característica de fibras de colagénio na zona interterritorial do tecido da cartilagem. A coloração de Von Kossa apresenta uma coloração negra densa do tecido mineralizado. A mancha representa claramente o osso existente e o osso recentemente regenerado através da deposição de prata e sais de cálcio. Tipicamente a contra mancha é Safranina 0 que cora a cartilagem de vermelho- laranja. Osso novo e existente pode ser facilmente distinguido morfologicamente em secções coradas adequadamente. Safranin 0/ Verde rápido é capaz de distinguir mais características do que o azul de toluidina. Safranina O é um corante básico que cora os mucopolissacáridos na cartilagem articular de vermelho-laranja e o osso subcondral subjacente apenas levemente. 0 verde rápido é um corante acídico que cora o citoplasma de cinzento -verde. Esta coloração nãc é só capaz de identificar claramente a cartilagem existente e regenerada, mas também pode distinguir diferenças entre duas regiões no tecido reparador indicando diferenças no teor de proteogiicanos.

Os corantes hematoxilina/ eosina que representam o osso de vermelho escuro e a cartilagem rica em hidrato de 79 carbono apenas muito levemente, também pode ser utilizada. Masson Trichrome pode ser capaz de distinguir diferenças no tecido reparador. Cartilagem e tecido reparador rico em polissacáridos, músculo, e eritrócitos são corados de vermelho, enquanto que o colagénio do osso corou de azul.

Avaliações histológicas podem também envolver avaliação de: teor em glicosaminoglicano na cartilagem de reparação; morfologia da cartilagem e condrócito; e integridade estrutural e morfologia na interface do defeito. A morfologia de reparação da cartilagem pode ser identificada pela cartilagem formada: articular em função de fibrótico por avaliação do teor de glicosaminoglicano, grau de deposição da cartilagem e semelhantes.

Avaliações histológicas utilizando as metodologias padrão bem caracterizadas no estado da técnica também permitem a avaliação de novo osso e formação de medula óssea. Ver, por exemplo Pat. US N° 5,266,683.

Adicionalmente, é bem conhecido no estado da técnica que bioquimicamente a presença do tipo B e do colagénio do tipo IX no tecido da cartilagem é indicativo do fenótipo diferenciado dos condrócitos, A presença do colagénio do tipo II e/ ou tipo IX pode ser determinada por electroforese em gel padrão, análise de transferência de Western e/ ou coloração imunohisto-química utilizando por exemplo anticorpo comercialmente disponível como descrito abaixo. Outros marcadores bioquímicos incluem hematoxilina, eosina, trícoma de Goldner e Safranina-O. Métodos imunohistoquímicos, tal como o seguinte podem ser utilizados para identificar a formação de tecido de cartilagem, incluindo cartilagem articular. São preparadas secções de tecido utilizando impregnação de rotina e técnicas de seccionamento conhecidas no estado da técnica. Epitopos para o colagénio do tipo II são primeiro expostos por tratamento com protease. Por exemplo, espécimen de 80 tecido são pré-tratados com 1 mg/ml de pronase do tipo XIV da Sigma (St. Louis, MO; número do catálogo P5147) em tampão tris salino (TBS) durante aproximadamente 10 min à temperatura ambiente. Os especimenes são então lavados em TBS com 0,2% de glicina. Os espécimen encontram-se bloqueados durante 30 min, numa solução de tampão tris salino contendo 1% de Tween 20 (TBST) e albumina do soro de bovino (BSA), e lavado com TBST. Os especimenes são então incubados com colagénio purificado por afinidade com anticorpos policlonais cabra anti-humano dos tipos I e II durante aproximadamente 1 h, ou de um dia para o outro à temperatura ambiente. Em certos exemplos apresentados abaixo, o anticorpo do colagénio cabra anti-humano do tipo I foi obtido a partir de Southern Biotechnology Associates (Birmingham, Alabama), número do catálogo 310-01, por exemplo, número de lote L055-X916; o anticorpo do colagénio de cabra anti-humano do tipo II foi também obtido de Southern Biotechnology Associates (Birmingham, Alabama), número do catálogo 1320-01, por exemplo número de lote C153-T826. Os anticorpos do colagénio anti-humanos dos tipos I e II gerados em rato ou coelho também podem ser utilizados. O perito na técnica vai considerar as circunstâncias nas quais a utilização de uma espécie em relação à outra é adequada. Para determinados exemplos apresentados abaixo, as concentrações dos anticorpos de colagénio de cabra anti-humano dos tipos I e II utilizados para a incubação é por exemplo, 20 pg/ml para cada anticorpo diluído em 1% de BSA em TBST. Após incubação com anticorpos os espécimen são lavados com TBST e mantidos num banho. É então adicionado um anticorpo de ligação disponível comercialmente. Por exemplo especimenes tratados com colagénios dos tipos I e II de cabra anti-humanos podem ser incubados com anticorpo de ligação de cabra da BioGenex Laboratories (San Ramon, CA); número de catálogo HK209-5G) 81 durante pelo menos 10 min à temperatura ambiente. Para aquelas amostras incubadas com anticorpos de rato e de coelho, pode ser utilizado como anticorpo de ligação um kit Dako LSAB2 número K0610 da Dako Corporation (Carpinteria, CA). Os especímenes são então novamente lavados com TBST e mantidos num banho. Deixa-se a seguir incubar os especímenes com estreptavidina/ fosfatase alcalina disponível comercialmente de qualquer uma das fontes acima identificadas durante pelo menos aproximadamente 10 min à temperatura ambiente. Os especímenes são novamente lavados com TSB. Os especímenes são então desenvolvidos por tratamento com uma solução apropriada de substrato durante aproximadamente 10 min ou menos. Por exemplo, para uma detecção de fosfatase alcalina, utiliza-se aproximadamente 100 μΐ de lavamesole 50X. Para o desenvolvimento da cor é utilizado Fast Red da Dako Corporation. Após o desenvolvimento, os especímenes são contrastados por lavagem durante 2 min com hematoxilina da Harris e 1% de carbonato de lítio. Os especímenes são então montados num meio de montagem aquoso, e a formação de cartilagem é avaliada posteriormente. A coloração de colagénios do tipo I e II é útil para determinar a fronteira entre osso subcondral regenerado e tecido de reparação. Geralmente o tecido reparador é fibroso e cora menos intensamente. Adicionalmente o osso subcondral formado recentemente pode ser identificado pela localização do colagénio do tipo II nas pequenas espículas da restante cartilagem. Azul de toluidina e Safranina-0 são também úteis para corar proteoglicanos acídicos numa camada de cartilagem, assim como tecidos de reparação.

Microscopia de Luz Polarizada A microscopia de luz polarizada pode ser utilizada para aceder à interdigitação da fibrilas na junção entre as 82 margens do tecido de reparação e a cartilagem articular residual adjacente ao defeito. Tal microscopia pode ser efectuada utilizando secções de Safranina-0 coradas de um defeito. Em certas circunstâncias a microscopia de luz polarizada oferece ao perito da técnica uma visão mais exacta do processo de reparação. Por exemplo, utilizando microscopia de luz, o tecido de reparação na periferia de um defeito bem aposto com a cartilagem residual. Utilizando microscopia de luz polarizada, contudo pode ser observado que as fibrilas de colagénio não se encontram bem integradas com as da cartilagem residual. Falta de continuidade das fibrilas entre a cartilagem de reparação e persistente é indicativa de uma reparação sub-óptima. Assim, quando se avalia qualitativamente a interface entre a cartilagem de reparação e a cartilagem residual viável, a continuidade fibrilar é avaliada preferencialmente utilizando microscopia de luz polarizada como exemplificado abaixo (ver também, Shapiro et al., Journal of Bone and Joint Surgery 7_5:532-553 (1993)). A realização da invenção será mais bem compreendida a partir dos exemplos seguintes, que são apresentados meramente a titulo de exemplo e não são limitativos de algum modo da invenção. VI. Estudos Animais: Métodos de Uso de Dispositivos

Osteogénicos Melhorados A Reparação de Defeitos Segmentais de Tamanho Critico Utilizando Dispositivos Osteogénicos Melhorados Contendo Carboximetílcelulose 1. Experiência 1: Configuração do Dispositivo Unitário (cães) 83

Este estudo ilustra a eficácia de OP-1 combinada com uma matriz de colagénio e carboximetilcelulose para reparar defeitos segmentais críticos do cúbito no modelo canino reconhecido no estado da técnica.

Resumidamente, os dados apresentados abaixo indicam uma cura radiográfica comparável em locais que receberam um dispositivo CMC/OP-1 relativamente aos defeitos segmentais tratados com o dispositivo OP padrão. 0 último grau radiográfico para defeitos (máximo=6,0) tratados com CMC/OP-1 foi 5,33 ± 0,58 comparado com 4,67 ±0,58 para o defeito que recebe o dispositivo padrão OP-1. Em geral, a formação de novo osso foi já evidente às duas semanas após operação em todos os defeitos. 0 osso novo continuou a densificar, consolidar-se e a remodelar-se até ao sacrifício às 12 semanas após operação. A carga média para a quebra dos defeitos tratados com o dispositivo CMC/OP-1 foi de 59,33 N ± 26,77. isto foi de 70% da carga média para a quebra dos lados opostos que receberam os implantes padrão de OP-1. Histologicamente o volume final, qualidade e grau de remodelação foram pelo menos equivalentes em defeitos tratados com o dispositivo CMC/OP-1 e OP-1 padrão, apesar de uma variação na formação final de osso novo e grau de remodelação ter sido notada em comparações de animal para animal. Isto significa que o grau histológico para os defeitos tratados com o dispositivo padrão de OP-1 foi de 11,41 ± 0,95 de 16 pontos totais possíveis.

Descrição do Dispositivo de Teste

Como já mencionado, dispositivos padrão consistiram em proteína osteogénica humana recombinante 1 (rhOP-1) misturada com uma matriz de colagénio do osso de bovino do tipo I numa proporção de 2,5 mg de rhOP-1 por grama de matriz de matriz de colagénio. O dispositivo melhorado 84 consistiu em rhOP-1 misturado com uma matriz de colagénio do osso de bovino do tipo I e carboximetilcelulose (CMC) . Os dispositivos unitários foram fornecidos m vials estéreis.

Como anteriormente descrito, o dispositivo actualmente preferido contendo CMC para defeitos abertos possui uma consistência de massa. 0 dispositivo unitário CMC/OP-1 foi colocado seco numa pequena taça e misturado com solução salina. Utilizando os dedos o especialista misturou e formou o dispositivo de acordo com a forma geral do defeito e depois colocou o dispositivo no local do defeito. Foi reportado que o dispositivo melhorado foi manipulado mais facilmente e formado e não se pegou às luvas cirúrgicas. 0 dispositivo manteve a sua integridade quando colocado no defeito durante a irrigação e durante/ após a sutura.

Desenho Experimental Cães adultos macho sem raça definida foram utilizados devido às suas bem conhecidas caracteristicas de reparação do osso e remodelação. Todos os animais tinham pelo menos dois anos e pesavam 40 a 50 libras. Todos os animais foram fornecidos por Martin Creek Kennels, USDA número 71-B-108, Willowford, AK. Foi dada especial atenção na selecção de animais de tamanho uniforme e peso para limitar a variabilidade na geometria do osso e carga. Os animais foram rastreados radiograficamente antes da operação para assegurar tamanho adequado, maturidade do esqueleto, e que não existiam anormalidades ósseas óbvias.

Foi utilizado um total de 3 cães adultos machos. Foram criados defeitos segmentais no cúbitc bilaterais de 2,5 cm. Todos os defeitos do lado direito receberam o dispositivo melhorado (dispositivo CMC/OP-1). Todos os defeitos do lado esquerdo receberam o dispositivo padrão 85 OP-1. Foram efectuadas radiografias duas vezes por semana para estudar a progressão da cura e foram avaliados numa escala de 0-6. No sacrifício todos os cúbitos foram recuperados en bloc e aqueles que se tinham curado o suficiente, avaliados por manipulação manual, foram testados, quanto à torsão mecanicamente. Os segmentos foram avaliados por histologia, quanto à resposta do tecido, arquitectura do osso e remodelação, e qualidade e quantidade de novo osso formado e cura; a avaliação foi feita numa escala de 0-16.

Cirurgia

Utilizando técnicas assépticas padrão foi efectuada a cirurgia sob anestesia utilizando gás halotano. Foi efectuada uma incisão lateral de aproximadamente 4,0 cm de comprimento e exposição do cúbito foi obtida utilizando uma dissecção brusca e precisa. Foi criado um defeito osteoperiosteal no cúbito médio utilizando uma serra oscilante. Este defeito foi cerca de 2-2,5 vezes o diâmetro do eixo médio e representa um defeito de tamanho crítico, i.e. o defeito não se iria curar espontaneamente. Medições intra-operatórias foram efectuadas ao segmento do osso removido. O rádio foi mantido por razões de estabilidade mecânica, mas não foi utilizada nenhuma fixação interna ou externa. O local foi irrigado com solução salina para remover detritos de osso e células da medula derramadas. Depois o local foi seco e foi conseguida homeostase, os implantes foram colocados cuidadosamente nos defeitos. Os tecidos moles foram fechados meticulosamente em camadas para conter o implante. 0 processo foi então repetido no lado lateral oposto.

Radiografias 86 86 Radiografias dos membros anteriores foram obtidas duas vezes por semana até às oito semanas após a cirurgia e depois na altura do sacrifício doze semanas após a operação. Foram utilizados tempos de exposição padrão e intensidades, e foram utilizados sacos de areia pa ra posicionar as extremidades de uma maneira consistente. Foram avaliadas as radiografias e comparadas com radiografias anteriores para avaliar a qualidade e velocidade da cura do defeito. A avaliação das radiografias foi efectuada de acordo com a escala seguinte:

Tabela 5

Escala de Avaliação Radiográfica Grau:

Sem alteração a partir da aparência pós-operatória imediata 0 Traços de material denso à radiação no defeito 1 Radiodensidade floculenta com manchas de calcinação 2 Defeito ligado em pelo menos um ponto com material de densidade à radiação não uniforme 3

Defeito ligado tanto em ambos os lados médios e laterais com material de densidade à radiação não uniforme, a extremidade cortada do córtex permanece visível 5 Defeito ligado por osso novo uniforme; as extremidades cortadas do córtex deixam de ser visíveis 6

Sacrifício

No final do período de estudo, os animais foram sacrificados utilizando uma overdose de barbiturato intravenosa. O cúbito e o rádio foram recuperados ímedíatamente en bloc e colocados em fraldas impregnadas com solução salina. Ambos os cúbitos foram macrofotografados e foram tiradas radiografias de contacto. Os tecidos moles foram dissecados cuidadosamente e 87 retirados do local do defeito. Uma serra arrefecida com água foi utilizada para cortar o cúbito até a um comprimento uniforme de 9 cm com o local do defeito centrado no meio do espécimen de teste.

Teste Mecânico

Imediatamente após o seccionamento, se a cura foi considerada suficiente por manipulação manual, os especímenes foram testados quanto à quebra por torsão utilizando procedimentos de rotina numa máquina de teste hidráulica MTS de loop fechado (Minneapolis, MN) operada com um controlo de batimento com uma velocidade deslocamento constante de 50 mm/min. Resumidamente, cada extremidade do segmento do osso foi montada numa manga de alumínio cilíndrico e cementada com metilmetacrilato. Uma das extremidades foi fixada rigidamente e a outra foi rodada no sentido contrário aos ponteiros do relógio. Uma vez que o cúbito do cão possui uma ligeira curvatura, os especímenes foram montados de maneira a manter a rotação do espécimen coaxial com a do dispositivo teste. A força de torção foi aplicada com um braço nivelador de 6 cm com um sistema de teste de materiais servo-hidráulico. Foram efectuados registos simultâneos do deslocamento do implante de acordo com o medido pelo controlador do batimento da máquina, enquanto que a carga foi registada pela célula de carga. Foram geradas curvas força, deslocamento angular a partir das quais o momento e deformação angular até à quebra foram obtidos, e a absorção de energia até à quebra foi calculada como a área sob a curva carga - deslocamento.

Histologia

Os especímenes individuais foram fixos por imersão em solução tamponizada com 10% de formalina imediatamente a 88 seguir ao teste mecânico, ou após o seccionamento em especímenes não testados. Os especímenes foram divididos com uma serra de diamante arrefecida com água bisectando o especímenes ao longo do seu eixo mais longo. Este procedimento resultou em duas porções de cada especímenes para diferentes preparações histológicas, incluindo secções de base não descalcifiçadas e secções de micrótomo não descalcifiçadas. A seguir à fixação os especímenes designados para secção não descalcifiçadas foram desidratados em soluções de álcool etílico graduadas de 70% a 100%. Os especímenes foram então colocados em monómero de metilmetacrilato e deixados a polimerizar. As secções de base foram obtidas cortando os especímenes numa serra de seccionamento de elevada velocidade arrefecida com água Mark V CS600-A (Grandby, CT) em secções de aproximadamente de 7 00 a 1000 μιη de espessura. As secções foram montadas em laminas acrílicas e trituradas até espessura de 100 μιη utilizando uma roda metalúrgica de trituração, e foram tiradas microradiografias utilizando técnicas padrão. A seguir à microradiografia, as secções foram novamente trituradas até aproximadamente 50 μπι e coradas com fuxina básica e azul de toluidina para avaliação histológica que avaliou os parâmetros seguintes de reparação: qualidade da união, aparência e qualidade do osso cortical e esponjoso, a presença de elementos de medula óssea, remodelação do osso e resposta inflamatória. A avaliação dos parâmetros histológicos estava de acordo com a escala seguinte:

Tabela 6

Escala de avaliação histológica

Qualidade da Sem sinal de união fibrosa ou outra 0 União: união União fibrosa 1 União osteocondral 2 89

União do osso 3 União do osso com reorganização dos córtexes 4 Desenvolvimento do córtex Nenhum presente no defeito 0 Densificação de limites 1 Formação reconhecível 2 Córtexes intactos, mas não completos 3 Formação completa de córtexes 4 normais Material residual do implante / Arquitectura interna Grande quantidades de material do 0 implante visível Quantidade moderada de material do implante visível 1 Pequena quantidade de implante 2 residual Material/ arquitectura não organizada Nenhum implante residual/ retorno da medula 3 Cavidade/ alguns elementos de medula Elementos de medula normal e arquitectura 4 Resposta Inflamatória Severa 0 Severa/ moderada 1 Resposta moderada 2 Moderada 3 Sem resposta 4 Pontos Totais 16

Resultados

Avaliação Radioqráfica

Neste estudo não existiram diferenças significativas nas caracteristicas cura radiográfica do osso dos locais que receberam um dispositivo CMC/OP-1, quando comparada com defeitos segmentais tratados com dispositivo padrão OP. Em geral, foi evidente a nova formação de osso em todos os defeitos tão cedo como às duas semanas após operação. 0 osso novo continuou a densificar, a consolidar-se e a remodelar-se até ao sacrifício às 12 semanas depois da operação. O desenvolvimento do novo córtex com formação 90 cedo de cavidade medular ocorreu entre as avaliações das 6 e 8 semanas. A avaliação radiográfica final de defeitos tratados com o dispositivo CMC/OP-1 foi de 5,33 ± 0,58. A avaliação final radiográfica de defeitos que receberam o dispositivo OP-1 foi de 4,67 + 0,58. A título de exemplo, são apresentadas abaixo observações especificas representativas para um dos testes em animais.

Defeito Direito (dispositivo CMC/QP-1) Às duas semanas de pós operação, traços de material denso à radiação estavam presentes no defeito direito, mas o defeito não se encontrava completamente unido ou cheio com novo osso. Às quatro semanas após operação, a quantidade e densidade à radiação do novo osso aumentou significativamente. O defeito estava unido, mas o novo osso não se encontrava bem contido. Houve alguma consolidação de osso novo ao longo das fronteiras periósteas. Tinha-se formado uma quantidade equivalente de osso novo comparada com o defeito esquerdo deste animal. Às seis semanas após a operação, a densidade à radiação do novo osso aumentou e o defeito encontrava-se completamente unido e cheio extensivamente com novo osso. Era evidente a remodelação precoce com as extremidades do osso hospedeiro a começarem a incorporar o novo osso. Às oito semanas após operação o novo osso continuou a remodelar-se e o novo volume do osso aproximou-se melhor aos limites do defeito. As extremidades do osso hospedeiro foram incorporadas com o osso novo com densificação do osso novo ao longo das fronteiras sugerindo formação de novo córtex. Não houve evidência radiográfica de qualquer material residual do suporte. No sacrifício encontrava-se presente uma região rádio transparente no centro do defeito do lado direito, mas a densificação dos limites do osso novo era sugestiva da formação de novo 91 córtex. A avaliação radiográfica final foi 5 de 6 pontos possíveis.

Defeito Esquerdo (dispositivo QP-1) Às duas semanas após a operação traços de material denso à radiação encontravam-se presentes nos defeitos, mas o defeito não se encontrava unido ou cheio com osso novo. Às quatro semanas após a operação, a quantidade e densidade à radiação do osso novo aumentou significativamente e o defeito ficou unido e encheu-se com novo osso. Às seis semanas após a operação a densidade à radiação do osso novo aumentou e o defeito estava completamente unido e cheio extensivamente com osso novo. Foi evidente uma remodelação precoce e o volume do osso novo aproximou-se melhor dos limites do defeito. 0 osso novo era denso de maneira uniforme e as extremidades do osso hospedeiro estavam a começar a incorporar. Às oito semanas após operação o osso novo continuou a remodelar-se, as extremidades do osso hospedeiro foram incorporadas e a densificação do osso novo tinha começado ao longo dos limites do defeito. Na altura do sacrifício a densificação do osso novo ao longo dos limites do defeito era sugestiva de uma reformação precoce de novos córtexes. A densidade do osso novo no centro do defeito era maior era maior do que a do osso novo que se tinha formado no defeito do lado direito, apesar de não haverem diferenças significativas na aparência radiográfica dos lados direito e esquerdo neste animal. A avaliação radiográfica final foi de 5 entre 6 pontos possíveis.

Observações Grosseiras

Tanto os especímenes direitos e esquerdos de todos os animais possuíam aparências grosseiras semelhantes. Em dois animais, o defeito direito e esquerdo encontravam-se firmemente unidos e possuíam aproximadamente o mesmo volume 92 de osso novo. Num terceiro animal, tanto o lado esquerdo como o lado direito possuíam um novo volume do osso semelhantes, mas o lado esquerdo não se encontrava completamente unido.

Teste Mecânico A carga média para a quebra de defeitos tratados com o dispositivo CMP/OP-1 foi de 59,33 N ± 26,77 (n=3). A carga média para a quebra era de 7 9% da carga média dos lados contra-laterais, que receberam os dispositivos padrão OP-1. Isto representava 91% da força dos controlos intactos testados previamente. A deformação média angular foi de 38,22 ± 0,69 graus. A energia média absorvida até à quebra foi de 97,47 ± 47,21 Nm graus. A carga média até à quebra dos defeitos tratados com o dispositivo padrão OP-1 foi de 75, 39 N ± 1,88 (n=2). Isto representou 115% da força dos controlos intactos testados previamente. A deformação angular média foi de 59,06 ± 27,8 graus. A energia média absorvida até à quebra foi de 93,40 ± 17,49 Nm graus. Como verificado um defeito tratado com o dispositivo padrão OP-1 não foi detectado devido à grande instabilidade.

Histologia

Em geral, foi observada uma formação normal de osso consistente com os defeitos tratados com o dispositivo padrão rhOP-1 com uma matriz de colagénio. Tanto o volume final e qualidade e grau de remodelação foram equivalentes em comparação com CMC/OP-1 e dispositivos padrão OP-1. Uma variação na formação final de osso novo e grau de remodelação foi observada em comparações de animal para animal. A avaliação histológica média para os defeitos tratados com dispositivo CMC/OP-1 foi de 12,67+ 1,04 de uma 93 pontuação total possível de 16 pontos. A avaliação histológica média para os defeitos tratados com dispositivo padrão OP-1 foi de 11,41 ± 0,95 de uma pontuação total possível de 16 pontos.

Geralmente tanto o defeito do lado direito como do lado esquerdo encontravam-se ligados por um grande volume de osso novo. O osso novo estava a iniciar a reorganização e possuía características lamelares. Ao longo dos limites do defeito, o osso novo tornou-se mais denso e era sugestivo de novos córtexes. Em determinadas circunstâncias a remodelação não estava tão uniformemente avançada do lado esquerdo como do lado direito. O volume de osso novo no lado esquerdo era ligeiramente menor do que à direita em determinadas circunstâncias. No centro de todos os defeitos o retorno de componentes medulares tornou-se evidente.

Concluindo, dispositivos osteogénicos melhorados (configuração unitária) foram utilizados para reparar defeitos segmentais de tamanho crítico. Velocidades de reparação do osso endocondral, indícios de resistência mecânica, indícios radiográficos e indícios histológicos sugeriram um resultado dos dispositivos melhorados na reparação de defeitos pelo menos comparável aos dispositivos osteogénicos padrão. 2. Experiência 2: Resposta da dose de OP-1 Utilizando uma Configuração Não Unitária do Dispositivo (cães)

Este estudo ilustra a eficácia do dispositivo osteogénico padrão misturado com carboximetilcelulose (CMC) utilizando tanto formulações padrão e com doses baixas de OP-1 para curar defeitos segmentais grandes de tamanho crítico no modelo de defeito segmentai no cúbito do canino.

Como descrito abaixo em detalhe, foram utilizadas várias doses de OP-1 neste estudo. Resumidamente, verificou-se que as formulações de baixa dosagem do 94 dispositivo de OP-1 sem CMC eram eficazes na indução da formação de osso novo, mas menos do que no dispositivo OP-1 de dose padrão. Contudo e inesperadamente, os defeito tratados com o dispositivo de baixa dosagem contendo CMC demonstraram formação de osso mais cedo e de maior volumes quando comparado com o dispositivo OP-1 de baixa dosagem sem CMC. 0 dispositivo OP-1 de baixa dosagem padrão foi preparado combinando 1 g de um dispositivo OP-1 com 3,2 ml de solução salina estéril. 0 dispositivo padrão ou de baixa dose de OP-1 contendo CMC foi preparado combinando 1 g de dispositivo de OP-1 com 0,2 g de CMC e aproximadamente 2 ml de solução estéril salina. Os dispositivos foram preparados intra-operacionalmente. Radiograficamente, locais tratados com doses padrão de OP-1 com e sem CMC possuíam aparências radiográficas semelhantes. Locais de doses padrão de OP-1 possuíam formação de osso novo mais cedo e maiores volumes comparados com os locais de baixa dosagem. Os resultados histológicos demonstraram uma cura mais avançada dos defeitos segmentais do osso em locais tratados com dispositivo contendo CMC comparado com o dispositivo padrão OP-1. Locais tratados com dispositivo OP-1 de baixa dosagem contendo CMC conseguiram um grau equivalente de remodelação e incorporação com o osso hospedeiro relativamente aos locais tratados com o dispositivo OP-1 de dose padrão, mas o volume de osso novo induzido era menor. Locais de defeitos tratados com dispositivo de dose padrão contendo CMC obtiveram a maior carga de torsão média até à quebra às doze semanas após a operação comparada com todos os grupos de tratamento (61,91 ±35, 37 N, 95% da força, de torsão dos controlos intactos). A força de torsão do dispositivo de baixa dosagem contendo locais CMC foi semelhante à do dispositivo padrão OP-1, possuindo 78% da força do cúbito intacto e 99% da força dos locais previamente testados tratados com o dispositivo padrão. Em contraste, a força de 95 torsâo dos locais OP-1 de baixa dosagem foi apenas de 44% da força de torsâo do cúbito intacto e 56% dos defeitos segmentais previamente testados tratados com o dispositivo padrão OP-1.

Material Teste 0 dispositivo padrão OP-1 (designado por OP na Tabela 11) consistiu em proteína osteogénica recombinante humana 1 (rhOP-1) misturada com matriz de colagénio do osso de bovino do tipo I numa proporção de 2,5 mg de rhOP-l/g de matriz de colagénio. Um dispositivo CMC (dose padrão designado 0P-1/CMC, OPCMC na Tabela 11) consistiu num dispositivo OP-1 combinado com carboximetilcelulose. 0 dispositivo de baixa dosagem OP-1 consistiu em 1,25 mg de rHOP-l/g de matriz de colagénio (designado por LOP na

Tabela 10). Cada dispositivo OP-1 tanto na dose padrão como na baixa dosagem consistiu em 1 g de dispositivo embalado separadamente da CMC. A CMC foi embalada 200 mg por frasco. Isto contrasta com o dispositivo unitário descrito acima em que a CMC se encontrava embalada conjuntamente com os outros componentes da matriz de colagénio e proteína osteogénica.

Desenho Experimental

Foi utilizado um total de 12 cães adultos sem raça definida. Foram criados defeitos segmentais bilaterais de 2,5 cm de tamanho critico do cúbito. Os defeitos do lado direito de seis animais receberam o dispositivo padrão QP-1. 0 lado esquerdo dos defeitos deste grupo recebeu os dispositivos de dose padrão OP-l/CMC. O segundo grupo de seis animais recebeu os dispositivos OP-1 de baixa dosagem no defeito do lado direito e recebeu os dispositivos de 96 baixa dosagem OP-1/ CMC nos defeitos do lado esquerdo. Foram tiradas radiografia duas vezes por semana para estudar a progressão da cura. No sacrifício foram todos recuperados en bloc e testados, quanto à torsão mecanicamente. Segmentos do cúbito foram avaliados por histologia, quanto à resposta do tecido, implante residual, e qualidade e quantidade de formação de osso novo e cura. Modelo Animal

Como descrito abaixo, foram utilizados cães adultos machos sem raça definida devido ao seu tamanho anatómico e reparação do osso conhecida e caracteristicas de remodelação. Todos os animais apresentavam maturidade de esqueleto e pesavam de 35 a 50 libras.

Cirurgia

Utilizando técnicas de cirurgia padrão semelhantes àquelas descritas acima foi feita uma incisão lateral de aproximadamente 4 cm de comprimento e foi obtida a exposição do cúbito utilizando uma dissecção brusca e precisa. Foi criado um defeito osteoperiosteal segmentai de 2,5 cm no cúbito médio utilizando uma serra oscilante. Este defeito foi de 2-2,5 vezes o diâmetro do eixo médio e representava um defeito de tamanho critico, i.e. o defeito não iria curar-se espontaneamente. Foram efectuadas medidas intra-operacionais do segmento do osso removido. O comprimento do segmento, os dois diâmetros exteriores do segmento, e o diâmetro central do segmento foi registado em milímetros nos registos cirúrgicos. Foi mantido o rádio por questões de estabilidade mecânica. O local foi irrigado com solução salina para remover os detritos de osso e células de medula derramada. Após o local ter sido seco e se ter conseguido a homeostase, os implantes foram colocados no defeito. Os tecidos moles foram fechados em camadas para 97 conter o implante o procedimento foi então repetido do lado lateral oposto:

Radiografias

Como descrito acima, as radiografias dos membros anteriores foram tiradas duas vezes por semana até às oito semanas após operação e depois novamente no sacrifício às doze semanas após operação.

Sacrifício

Os procedimentos foram semelhantes a estes descritos acima. No final do período de estudo, os animais foram sacrificados, o cúbito e o rádio foram recuperados imedíatamente en bloc e colocados em fraldas impregnadas em solução salina. Os tecidos moles foram dissecados cuidadosamente e retirados do local do defeito. Oma serra de fita foi utilizada para cortar o cúbito até a um comprimento uniforme de 9 cm com o local do defeito centrado no meio do espécimen de teste.

Teste Mecânico

Os protocolos foram semelhantes àqueles descritos acima. Resumidamente os especímenes foram testados quanto à quebra por torsão utilizando procedimentos de rotina numa máquina de teste hidráulica MTS de loop fechado (Minneapolis, MN) operada com um controlo de batimento com uma velocidade deslocamento constante de 50 mm/min. A força de torção foi aplicada com um braço nivelador de 6 cm com um sistema de teste de materiais servo-hidráulicos. Foram efectuados registos simultâneos do deslocamento do implante de acordo com o medido pelo controlador do batimento da máquina, enquanto que a carga foi registada pela célula de carga. Foram geradas curvas força, deslocamento angular a partir das quais o momento e a deformação angular até à 98 quebra foram obtidos, e a absorção de energia até à quebra foi calculada como a área sob a curva carga - deslocamento.

Histologia

Como descrito acima, especímenes fixos designados para secções não descalcifiçadas foram desidratados em soluções de álcool etilico graduadas de 70% a 100%. Os especímenes foram então colocados em monómero de metiimetacrílato e deixados a polimerizar. As secções de base foram obtidas cortando os especímenes numa serra de seccionamento de elevada velocidade arrefecida com água em secções de aproximadamente de 700 a 1000 μπι de espessura. Estas secções foram montadas em laminas acrílicas e trituradas até espessura de 100 μπι. A seguir à microradiograf ia de rotina, as secções foram novamente trituradas até aproximadamente 50 μπι e coradas com fuxina básica e azul de toluidina para avaliação histológica que avaliou os parâmetros seguintes de reparação: qualidade da união, aparência e qualidade do osso cortical e esponjoso, a presença de elementos de medula óssea, remodelação do osso e resposta inflamatória.

Avaliação Radiográfica Às doze semanas após a operação (sacrifício) os locais da dose padrão OP-1/ CMC atingiram a avaliação média máxima radiográfica, 5,-17/6,0 pontos. A avaliação radiográfica final para os dispositivos padrão OP-1 foi de 5,00/6,0. Os locais de dose baixa OP-1 possuíam uma avaliação média radiográfica final de 3,83/6,0. Locais de baixa dosagem OP-1/ CMC possuíam uma avaliação média de 4,67/6,0. Em todos os períodos de tempo os locais da dose padrão OP-1/ CMC possuíam avaliações radiográficas médias maiores do que OP-1 padrão sem CMC. Em todos os períodos de tempo os locais 99 de baixa dosagem 0P-1/CMC possuíam avaliações médias superiores do que OP-1 de baixa dosagem sem locais CMC. A análise estatística demonstrou um efeito significativo para o tipo de implante quando todas as avaliações radiográficas foram combinadas (Kruskal-Wallis análise de variância de uma via, p=0,0049). Comparações múltiplas demonstraram que as avaliações médias dos dispositivos padrão OP-1 e de dose padrão OP-l/CMC para todos os períodos de tempo eram signíficativamente maiores do que os locais de baixa dosagem OP-1 sem CMC (para <x=0, 10 e para a=0,05, respectivamente) . Comparações múltiplas também demonstraram que as avaliações radiográficas médias dos locais de dose padrão OP-l/CMC eram significativamente maiores do que a dos locais de baixa dosagem OP-l/CMC (a=0,10). Contudo, e inesperadamente, as avaliações radiográficas médias dos dispositivos de dose padrão OP-1 não eram significativamente superiores às avaliações radiográficas médias para os locais de baixa dosagem OP-l/CMC.

Locais de baixa Dosagem sem CMC Às duas semanas após a operação, a formação de osso novo era evidente em um dos seis defeitos tratados com OP-1 de baixa dosagem. Traços de material denso à radiação encontravam-se presentes à volta do defeito, mas o osso novo não unia o defeito. A avaliação radiográfica média às duas semanas após a operação era de 0,17/6,0. Às quatro semanas após a operação no mesmo local que demonstra formação de osso novo às duas semanas demonstrou um aumento no volume de osso novo. Quatro defeitos encontravam-se unidos e um defeito estava cheio com osso novo às quatro semanas. Dois locais demonstraram pouca actividade às quatro semanas após a operação. A avaliação radiográfica média às auatro semanas foi de 1,83/6,0. Às seis semanas 100 após a operação os dois locais tratados com OP-1 de baixa dosagem foram unidos e cheios com osso novo. Os dois locais foram unidos mas foram incompleramente cheios com osso novo. Um animal demonstrou alguma formação recente de osso novo. Um animal não demonstrou nenhuma formação de osso novo. A avaliação radiográfica média às seis semanas foi de 2,83/6,0. Não foi evidente entre as seis e as oito semanas formação adicional de osso novo, mas era aparente alguma densíficação de osso novo e a ocorrência de alguma remodelação recente. A avaliação radiográfica média às oito semanas foi de 3,17/60. No sacrifício, 12 semanas após operação todos os defeitos demonstraram algum osso novo bem confinado, mas a densidade era signíficatívamente menor do que a do osso hospedeiro circundante. Ocasionalmente encontravam-se presentes transparências à radiação na junção do osso hospedeiro/ osso novo. A avaliação radiográfica média às doze semanas era 3,83/6,0.

OP-1 de Baixa Dosagem/ Locais CMC Às duas semanas após a operação foi evidente a formação recente de osso novo em três dos cinco defeitos tratados com OP-1 de baixa dosagem/CMC. O osso novo não uniu ou encheu os defeitos, mas encontrava-se bem confinado nos locais cirúrgicos. A avaliação radiográfica média às duas semanas era de 0,83/6,0. Às quatro semanas após a operação, encontrava-se presente formação de novo osso em cinco de seis defeitos, unindo e quase enchendo os defeitos. A avaliação radiográfica média às quatro semanas foi de 2,33/6,0. Às seis semanas a densidade de osso novo presente nos defeitos aumentou. Uma incorporação precoce do osso hospedeiro foi evidente em três dos seis defeitos. Um animal não demonstrou qualquer formação de osso novo bilateralmente às seis semanas. A avaliação radiográfica média nesta altura foi de 3,00/6, 00. Entre as seis e as 101 oito semanas não ocorreu formação de osso novo adicional. Remodelação precoce e incorporação do osso hospedeiro era aparente. Um animal não demonstrou quaisquer alterações na aparência radiográfica. A avaliação radiográfica média às oito semanas foi 3,33/6,0. Inesperadamente, os locais de 0P-1/CMC de baixa dosagem demonstraram mais: formação de osso novo extensa e remodelação do que os locais de baixa dosagem de OP-1 sem CMC. Nos locais em que o defeito se encontrava completamente cheio com osso novo, a densidade do osso novo era inferior ao do osso hospedeiro circundante. A avaliação radiográfica às doze semanas (sacrifício) era de 4,67/6,0.

Locais de Dispositivos Padrão OP-1

Os resultados neste estudo foram consistentes com todos os estudos prévios do- dispositivo padrão OP-1. Às duas semanas após a operação, quatro dos seis defeitos tratados com dispositivo OP-1 demonstraram formação precoce de osso novo. Em dois defeitos osso novo extenso unia os defeitos, mas o osso novo não enchia os defeitos. Globalmente, o osso novo não se encontrava bem confinado. A avaliação radiográfica média às duas semanas era de 1,50/6,0. Às seis semanas após a operação, um aumento na quantidade e densidade de osso novo ocorreu em todos os seis defeitos. O osso novo unia todos os defeitos. Em quatro dos seis locais o defeito aparecia completamente cheio com osso novo. A avaliação radiográfica média às quatro semanas era de 3,00/6,0. Às seis semanas após operação, a densidade do osso novo aumentou. O osso novo não estava bem confinado nos defeitos restantes. Geralmente, incorporação precoce nas extremidades do osso hospedeiro foi observada em três dos seis locais. A avaliação radiográfica média às seis semanas foi de 3,67/6,0. Entre as seis a oito semanas foi evidente a quase 102 incorporação completa com o osso hospedeiro em três dos seis locais, apesar da remodelação na direcção dos contornos do cúbito tivesse ocorrido em todos os defeitos. A avaliação radiográfica média às oito semanas era de 4,50/6,0. Às doze semanas após a operação (sacrifício) tinha ocorrido uma remodelação extensa, apesar do volume do osso novo não se ter ainda aproximado dos contornos do cúbito. O osso novo frequente prolongou-se frequentemente para os tecidos moles circundantes, apesar de alguma reformação dos córtices ser aparente em todos os defeitos tratados com dispositivo OP-1 padrão. A avaliação radiográfica média às doze semanas era de 5,00/6,0.

Locais de Dose Padrão de OP-l/CMC Às duas semanas após a operação era evidente a formação precoce de osso novo em quatro dos seis defeitos tratados com OP-1/ CMC. 0 osso novo estava bem confinado em apenas um dos quatro defeitos. Osso novo parecia unir e encher dois de seis defeitos. A avaliação radiográfica média às duas semanas era 1,67/6,0. Às quatro semanas após a operação tinha ocorrido a formação extensa de osso novo em todos os seis defeitos. O osso novo não estava bem confinado, mas a incorporação precoce com o osso hospedeiro foi observada em dois locais. A avaliação radiográfica média às quatro semanas era 1,67/6,0. Entre quatro a seis semanas ocorreu uma remodelação e incorporação do osso hospedeiro extensa em todos os defeitos. 0 osso novo não se encontrava bem confinado, mas a absorção do osso novo no tecido mole tínha-se iniciado. A avaliação radiográfica média às seis semanas foi de 4,33/6,0. Às seis semanas foi observada incorporação completa com o osso hospedeiro em dois locais, e formação precoce de novo córtex era evidente em pelo menos um lugar. A avaliação radiográfica média às oito semanas era de 4,67/6,0. As doze semanas após a 103 operação (sacrifício) três dos seis defeitos possuíam uma incorporação extensa com as extremidades do osso hospedeiro. 0 osso novo encontrava-se ainda presente for a dos defeitos, apesar de uma remodelação extensa ter ocorrido. A avaliação radiográfica média às doze semanas era de 5,17/6,0.

Observações Grosseiras

Locais tratados com implantes de baixa dosagem com e sem CMC demonstraram menos volume de osso novo comparado com os locais OP-1 de elevada dosagem com e sem CMC. Todos os locais de elevada dosagem estavam grosseiramente firmemente unidos, mas três dos doze locais com OP-1 de baixa dosagem não estavam ainda firmemente unidos na altura do sacrifício.

Locais de OP-1 de Baixa Dosagem sem CMC

Em todos os casos a quantidade de osso novo formado não excedeu o volume do defeito inicial. O osso novo estava bem confinado, apesar de em dois dos seis segmentos o osso não se encontrava completamente unido.

Locais OP-1/CMC de Baixa Dosagem

De forma semelhante aos defeitos tratados com OP-1 de baixa dosagem, a formação de osso novo encontrava-se bem confinada. Um dos seis locais tratados com 0P-1/CMC de baixa dosagem não se encontrava completamente unido. Tipicamente, o volume de osso novo foi menor do que o volume do defeito inicial.

Locais do Dispositivo Padrão de OP-1

De forma semelhante aos estudos anteriores, o volume de osso novo em locais tratados com o dispositivo OP-1 padrão era 2 a 3 vezes maior do que o volume do defeito 104 original. Todos os defeitos foram firmemente unidos. Em cinco dos seis defeitos o osso novo prolongava-se de forma extensa para os tecidos moles e encontrava-se fundido com o rádio. Num defeito, o volume do osso novo formado era menos do que noutros locais.

Locais de 0P-1/CMC de Dose Padrão

Volume do osso novo em cinco de seis defeitos tratados com 0P-1/CMC excederam o volume do osso hospedeiro original e prolongou-se para os tecidos moles. 0 volume do osso novo era 2 a 3 vezes o volume do defeito original. Como mencionado acima num animal foi observado um volume de osso reduzido em ambos os lados.

Teste Mecânico

Resumos dos testes mecânicos aparecem nas Tabelas 7 e 8. Inesperadamente, locais de defeitos tratados com o dispositivo 0P-1/CMC de dose padrão obtiveram a maior carga torsional média até à quebra a doze semanas após a operação comparados com todos os outros grupos de tratamento, incluindo o grupo de dispositivos padrão. A carga média até à quebra foi de 61,91 ±35,37 N (n=6). Isto representou 95% da força de torsão do cúbito intacto previamente testado e 121% da força de defeitos segmentais testados previamente tratados com dispositivo OP-1 padrão. Os locais tratados com dispositivo OP-1 padrão possuíam uma força de torsão média de 55,84 ± 37,26 N (n=6), 86% dos cúbitos de controlo intactos testados previamente, e 110% dos defeitos segmentais tratados previamente com o dispositivo OP-1. A carga média até à fractura para os locais de baixa dosagem OP-l/CMC ,era de 50,66 ± 31,68 N (n=5) , ou 78% da força de cúbitos de controlo intacto e 99% da força dos defeitos segmentais testados previamente tratados com o dispositivo padrão OP-1. A carga média até à quebra para os locais de 105 baixa dosagem de OP-1 era de 28,72 ± 14,71 N (n=4) . Isto representava 44% da força de torsão de cúbitos de controlo intactos testados previamente e 56% de defeitos segmentais testados previamente tratados com o dispositivo padrão 0P-1.

Inesperadamente, testes t de pares da carga de quebra em animais demonstraram um efeito significativo para o tipo de implante, quando comparado com dispositivos padrão de OP-1 de baixa dosagem a dispositivos OP-l/CMC de baixa dosagem (p=0,0597). A carga média de quebra para os pares de locais de OP-1 de baixa dosagem era de 28,72 ± 14,71 (4). A carga média de quebra para os pares de locais de OP-l/CMC de baixa dosagem era de 68,79 ± 18,47 (4) . Não foi encontrada nenhuma diferença significativa em pares de testes t para a carga média de quebra para dispositivos 0P-1 padrão comparados com a carga média de quebra do dispositivo de OP-l/CMC de dose padrão.

Tabela 7

Resultados dos Testes Mecânicos N° do Animal Lado Tipo de Implante Carga até à quebra Momento (Nm) o 0 Controlos intactos Angulação (graus) Energia absorvida até a quebra (Nm graus) H19 Direito LOP 35,17 2,11 53,88 36, 74 53,93 H21 Direito LOP 9,76 0,59 14,95 66,64 16, 96 H24 Direito LOP H26 Direito LOP 25,75 1,55 39,45 41,33 44,42 H30 Direito LOP H34 Direito LOP 44, 18 2,65 67,69 25,35, 41,51 Média 28,72 1,72 43, 99 42,52 39,21 Desvio padrão 14,71 0,88 22,53 17,43 15,75 Dimensão da 4 4 4 4 4 106

Amostra Hl 9 Esquerdo LOPCMC 36, 76 2,39 60,92 37,13 55, 84 H21 Esquerdo LOPCMC 57,51 3,45 88,11 52,47 59,47 H24 Esquerdo LOPCMC 1,74 0,10 2,67 5,54 0,34 H26 Esquerdo LOPCMC 82,33 4, 94 126,14 37,85 120,58 H30 Esquerdo LOPCMC ★ * * * * H34 Esquerdo LOPCMC 71, 94 4,32 110,22 42,47 127,67 Média 50,66 3,04 77, 61 35,09 72,78 Desvio padrão 31, 68 1, 90 48,54 17,62 52,46 Dimensão da Amostra 5 5 5 5 5 *espécimen não foi testado 107

Tabela 8

Resultados dos Testes Mecânicos N° do Animal Lado Tipo de Implante Carga até à quebra Momento (Nm) o 0 Controlos intactos Angulação (graus) Energia absorvida até à quebra (Nm graus) H22 Direito OP 65,44 3, 93 100,26 52,95 139,25 H23 Direito OP 2,73 0, 16 4,18 15,90 8,91 H25 Direito OP 52,78 3, 17 80,86 31,36 70,65 H28 Direito OP 27,24 1, 63 41,73 53,04 49,49 H32 Direito OP 79, 69 4,78 122,08 19, 33 57,83 H33 Direito OP 107,1 4 6,43 164,15 29,3 98,59 Média 55, 84 3, 35 85,54 33, 65 70,79 Desvio padrão 37,26 2,24 57,08 16,08 44,52 Dimensão da Amostra 6 6 6 6 H22 Esquerdo OPCMC 76, 52 4,59 117,24 44,86 150,86 H23 Esquerdo OPCMC 6, 53 0,39 10,10 68,10 10, 66 H25 Esquerdo OPCMC 50,22 3,01 76, 94 43, 94 69,48 H28 Esquerdo OPCMC 100,4 4 6,03 153,88 40,9 177,13 H32 Esquerdo OPCMC 43, 82 2,63 67,14 40,2 70,58 H33 Esquerdo OPCMC 93, 93 5, 64 143,91 43,96 156,09 Média 61, 91 3,71 94,85 46, 99 105,80 Desvio padrão 33,37 2,12 54,19 10,51 65,21 Dimensão da Amostra 6 6 6 5 6

Histologia

Inesperadamente, os locais tratados com o dispositivo de dose padrão 0P-1/CMC obtiveram a maior pontuação histológica média, 12,08/16,0 pontos. Os locais de baixa 108 dosagem OP-l/CMC conseguiram uma pontuação de 11,07/15,0, levemente superior à pontuação histológica média para os locais do dispositivo padrão OP-1, 10,88-16,0. A avaliação histológica média para os locais de baixa dosagem OP-1 foi de 9,58/16,0.

Análise estatística das avaliações histológicas médias por grupo de tratamento demonstrou um efeito significativo para o tipo de implante (Kruskal-Watlis análise de variância de uma via, p=0,0282). Comparações múltiplas de médias de grupo demonstraram que a avaliação média total para os locais OP-l/CMC de dose padrão era significativamente maior do que os locais de baixa dosagem OP-1 sem CMC (para a=0,05).

Análise estatística da avaliação da qualidade da união demonstrou um efeito significativo para o tipo de implante. Inesperadamente, a avaliação da qualidade média da união nos locais OP-l/CMC para a dose padrão (3,5/4,0) foi novamente significativamente mais elevada do que para os locais de baixa dosagem OP-1 (2,6/4,0 a a=0,05). Não foram encontradas diferenças significativas para o tipo de implante, quando se compara graus médios para o desenvolvimento o córtex, implante residual, e resposta inflamatória.

Locais OP-1 de Baixa Dosagem sem CMC A formação de osso novo era aparente em todos os defeitos tratados com OP-1 de baixa dosagem, mas a quantidade de osso novo no defeito frequentemente não enchia o defeito e não apresentava continuidade com as extremidades do osso. Num local o defeito ficou completamente unido histologicamente. O osso novo encontrava-se nas fases precoces de organização e remodelação. Algumas áreas de osso recentemente mineralizado eram também evidentes. 109

Locais QP-l/CMC de Baixa Dosagem

Os locais de OP-l/CMC de baixa dosagem possuíam uma aparência histológica semelhante comparada com a dos locais OP —1 de baixa dosagem. Contudo, e inesperadamente o osso novo apresentava continuidade com o osso hospedeiro mais frequentemente nos locais OP-l/CMC, quando comparados com os locais OP-1 de baixa dosagem. Nos casos em que o osso apresentava continuidade com o osso hospedeiro era aparente a remodelação e densificação dos limites de osso novo. Nos casos em que a cura de osso novo não era completa, era aparentes áreas de osso recentemente mineralizadas, assim como áreas de tecidos fibrosos no defeito. Em geral, o osso novo encontrava-se bem confinado. Foram observadas algumas área de remodelação avançada ao longo dos limites do defeito.

Locais dos Dispositivos Padrão OP-1

Formação extensa de osso novo unia todos os defeitos. Tinha ocorrido a densificação de novos limites do osso. Nalguns casos áreas de osso recentemente mineralizado estavam juntas a áreas de osso maduro. No centro dos defeitos encontravam-se presente ocasionalmente algumas pequenas áreas de material de suporte residual. Não foi observada nenhuma resposta inflamatória. O osso novo prolongava-se frequentemente para os tecidos moles. Ά remodelação encontrava-se mais avançada nas fronteiras defeito/ osso novo. Nestas áreas o osso tinha-se remodelado numa estrutura lamelar.

Locais OP-1/ CMC de Dose Padrão

Não havia diferenças marcadas na aparência histológica entre locais OP-1 padrão e os locais OP-l/CMC de dose padrão. Osso novo extenso unia e enchia os defeitos. A 110 remodelação mais extensa ocorreu nas fronteiras osso novo/ fronteira do osso hospedeiro. 0 osso remodelado possuía uma estrutura lamelar nestas áreas, A densificação de novos córtexes era evidente, mas não se encontrava ainda completa. Foram observadas ocasionalmente pequenas quantidades de material do suporte residual retido rodeado pela formação de osso novo. Mão havia uma resposta inflamatória associada.

Conclusão

Dispositivos osteogénicos melhorados induziram inesperadamente mais cedo e maiores volumes de formação de osso novo para baixas doses de OP-1 do que a que era induzida em dispositivos padrão de baixa dosagem. Além disso, e inesperadamente, locais de defeitos tratados com dispositivos osteogénicos melhorados obtiveram a carga média máxima de torsão até à quebra às doze semanas após a operação. Do ponto de vista histológico os dispositivos melhorados obtiveram a maior pontuação média e demonstraram mais frequentemente uma continuidade do osso novo com o osso hospedeiro. B. Reparação de Defeitos Segmentais de Tamanho Não Crítico Utilizando Dispositivos Osteogénicos Melhorados Contendo

Carbóximetilcelulose 1. Experiência 1: Tempo da Reparação de Defeitos Fechados,

Quando Tratados com um Dispositivo Unitário (cães)

Este estudo de falha não crítica foi efectuado para avaliar configurações injectáveis de dispositivos osteogénicos melhorados. 0 desenho do estudo utilizou uma falha de 3 mm num modelo de 4 semanas. O estudo avaliou a cura do defeito após injecção de uma configuração de OP- 111 1/CMC/ matriz de colagénio. 0 braço oposto de cada animal foi utilizado como controlo. Adicionalmente, o tempo de tratamento para um defeito não tratado foi avaliado a 4, 8 e 12 semanas.

Os detalhes do protocolo utilizado são resumidos abaixo.

Sistema de Teste

Foram utilizados neste estudo cães sem raça definida adultos (18) criados de propósito devido ao seu tamanho anatómico e caracteristicas de reparação do osso e remodelação conhecidas. Os animais tinham aproximadamente 2 a 4 anos de idade no inicio do estudo e pesavam 20 a 30 kg (aproximadamente). Os animais foram rastreados radiograficamente para assegurar um tamanho adequado, maturidade do esqueleto, e que não existiam anormalidades ósseas óbvias.

Descrição do Material de Teste

Formulações do dispositivo osteogénico melhorado compreendem proteína osteogénica humana recombinante-1 (rhOP-1) numa matriz de colagénio misturada com CMC. Os controlos consistiram unicamente no dispositivo de branco.

Formulação 1: Formulação 2: Formulação 3: Controlo 1: Controlo 2: Controlo 3: 0,350 mg de rhOP-1 em 100 μΐ CMC gel (7%) a/o matriz de colagénio 0,350 mg de rhOP-1 em 100 μΐ de tampão acetato/ lactose 0,350 mg de rhOP-1 em 170 mg de matriz colagénio-CMC com solução salina 0 mg de rhOP-1 em 100 μΐ de gel

0 mg de rhOP-1 em 100 μΐ de tampão acetato/ lactose 0 mg de rhOP-1 em 17 0 mg de matriz de colagénio-CMC 112 molhada com solução salina

Desenho Experimental

Foram criados em todos os animais defeitos segmentais no cúbito de 3 mm em ambos os lados. Nove animais receberam uma das três formulações teste experimentais no defeito do lado direito, de tal modo que foram estudados três locais de cada tipo. 0 defeito no lado esquerdo foi implantado com o dispositivo de branco. Estes animais foram sacrificados às quatro semanas após a operação. Os restantes animais receberam em ambos os lados defeitos sem implantes e foram sacrificados em períodos de quatro, oito, e doze semanas ( três em cada período de tempo). Como discutido acima, foram tiradas radiografias para estudar a progressão da cura. A determinação final das datas de sacrifício dos nove animais que recebiam formulações de rhOP-1 foi baseada em radiografias semanais. No sacrifício, todos os cúbitos foram recuperados en bloc e testados mecanicamente, quanto à torsão. Os segmentos foram avaliados por histologia como acima descrito no que diz respeito à resposta dos tecidos e qualidade e quantidade de formação de novo osso, e extensão da cura. Utilizando técnicas cirúrgicas padrão foi feita uma incisão de aproximadamente dois centímetros de comprimento, e exposição do cúbito foi obtida utilizando uma dissecção brusca e precisa. O defeito de 3 mm foi criado no cúbito direito médio utilizando uma serra oscilante. 0 rádio foi mantido por questões de estabilidade mecânica, mas não foi utilizada nenhuma fixação interna ou externa. Os tecidos moles foram fechados meticulosamente em camadas à volta do defeito. A amostra de rhOP-1 ou dispositivo de branco foi então injectado no local de acordo com a calendarização do tratamento. 0 procedimento foi então repetido do lado oposto com a amostra adequada. 113

Radiografias dos membros anteriores foram tiradas semanalmente até às seis semanas após a operação e depois duas vezes por semana até às doze semanas nos animais sobreviventes. Foi obtido um raios-X adicional a partir dos animais restantes no sacrifício às doze semanas após operação. As radiografias foram avaliadas pelo investigador numa escala de 0-6 e comparadas com radiografias anteriores para avaliar a qualidade e velocidade da cura.

Procedimentos de Teste

Como discutido acima, os animais foram sacrificados nos tempos designados, e o cúbito e o rádio foram imediatamente recuperados en bloc. Ambos os cúbitos foram macrofotografados e foram tiradas radiografias de contacto. Os tecidos moles foram meticulosamente dissecados para fora do local do defeito. Uma serra arrefecida com água foi utilizada para cortar o cúbito até a um comprimento uniforme de 9 cm com o local do defeito centrado no meio do espécimen de teste. Imediatamente após seccionamento o espécimen foi testado por torção até à quebra numa máquina de teste hidráulica MTS de loop fechado (Minneapolis, MN) , como descrito acima.

Ambos os especímenes testados e não testados foram preparados para avaliação histológica, como já descrito acima. A seguir à microradiografia, as secções foram novamente trituradas até aproximadamente 50 μπι e coradas com fuxina básica e azul de toluidina para avaliação histológica dos parâmetros seguintes de reparação incluindo: qualidade da união, aparência e qualidade do osso cortical e esponjoso, e resposta inflamatória.

Estatísticas descritivas do teste mecânico, avaliação radiográfica e histologia foram avaliadas para caracterizar a cura. 114

Resultados

As observações seguintes e os dados representativos foram recolhidos até à data (quatro semanas após a operação):

Os resumos dos testes mecânicos aparecem nas Tabelas 9, 10 e 11. A tabela 11 é um resumo de sujeitos de controlo em experiências prévias não relacionadas. Geralmente e acima de tudo os resultados deste estudo indicam que os animais tratados com OP-1 exibem uma cura acelerada. Os defeitos tratados com OP-1 curaram-se em um terço a metade do tempo de controlos não tratados. Adicionalmente, e inesperadamente, a formação de CMC/OP-l/colagénio resultou num melhor confinamento do osso do que o observado na ausência de CMC. Estas observações foram confirmadas mecanicamente, radiograficamente e histologicamente.

Conclusão

Dispositivos osteogénicos contendo CMC (configuração injectável) podem ser utilizados para reparar defeitos segmentais do cúbito de 3 mm de tamanho não critico num local de defeito fechado.

Tabela 9

Avaliação de Formulações em Dispositivos Melhorados de rhOP-1 para a Reparação de Defeitos de Tamanho Não Critico

Resultados dos Testes Mecânicos N° do Animal Lado Perl o -do de tempo Tipo de Implante Carga dt6 â quebra Momen to (Nin) o. Contro -los intact os Angu- lação (graus j Energia absor vida 3.1ΙΘ à quebra (Nm graus) 1875 0 DtO 4 sema nas Formulação 1 49,37 2, 96 75, 65 35, 72 63,57 1864 3 Dto 4 sema nas Formulação 1 16, 56 0, 99 25, 37 14,04 6,78 115 1804 3 Dto 4 sema Π3 S Formulação 1 33,32 2,00 51,05 43, 62 54,56 Média 33,08 1,99 50,69 31, 13 41,64 Des vio pa drão 16,41 0,98 25,14 15,32 30,52 Tama nho da amos tra 3 3 3 3 3 1788 4 · Dto 4 sema nas Formulação 2 32,47 1,95 49,75 50,11 55, 91 1847 3 Dto 4 sema nas Formulação 2 43,83 2,63 67,15 37,53 51,77 Dto 4 sema nas Formulação 2 10,79 0,65 16 20,78 5, 94 Média 20,03 1,74 44,48 36, 14 37,87 Des vio pa drão 16,79 1,01 25,72 14,71 27,73 Tama nho da amos tra 3 3 3 3 3 1877 2 Dto 4 sema nas Formulação 3 42,64 2,56 65,33 55, 06 55,74 1864 0 Dto 4 sema nas Formulação 3 20,95 1,26 32,10 24,77 14,62 1850 8 Dto 4 sema nas Formulação 3 7,24 0,43 11,09 17,08 3,04 Média 23, 61 1,42 36, 17 32,30 24,47 Des vio pa drão 17,85 1,07 27,35 20,08 27,70 Tama nho da amos tra 3 3 3 116 *Cálculos baseados nos dados primários dos testes mecânicos

Tabela 10

Resultados dos Testes Mecânicos N° do Animal Lado Perl o -do de tempo Tipo de Implante Carga até à quebra Momen to (Nm) "o Contro -los intact os Angu-lação (graus) Energia absorvida até à quebra (Nm graus) 1875 0 Esq 4 sema nas Con trolo 1 12,81 0,77 19, 63 33,26 14,06 1864 3 Esq 4 sema nas Con trolo 1 11,00 8,00 16, 85 59,35 16, 83 1804 3 Esq 4 sema nas Con trolo 1 4,14 0,25 6,34 7,46 0,70 Média 9,32 3,01 14,27 33,36 10,53 Des vio pa drão 4,57 4,33 7,01 25, 95 8,62 Tama nho da amos tra 3 3 3 3 3 1788 4 * Esq 4 sema nas Con trolo 2 4,82 0,29 7,38 11,12 0,73 1847 3 Esq 4 sema nas Con trolo 2 4,53 0,27 6, 94 30, 63 2,50 Esq 4 sema nas Con trolo 2 7,52 0,45 11,52 33,29 8,59 Média 5, 62 0,34 8, 62 24,91 3, 94 Des vio pa drão 1,65 0,10 2,53 12,03 4, 12

Tama nho da amos tra 3 3 3 —1 J 3 1877 2 Esq 4 sema nas Con trolo 3 15,41 0, 92 23, 61 49, 91 15,40 1864 0 Esq 4 sema nas Con trolo 3 10,28 0, 62 15,75 40,50 11,23 1850 8 Esq 4 sema nas Con trolo 3 4,32 0,26 6,62 4,89 0,41 Média 10, 00 0, 60 15,33 31,77 9,01 Des vio pa drão 5,55 0,33 8,50 23,75 7,74 Tama nho da amos tra 3 3 3 3 3

Tabela 11

Avaliação de Formulações em Dispositivos melhorados de rhOP-1 para a Reparação de Defeitos de Tamanho não Critico -Controlos Não Relacionados

Resultados dos Testes Mecânicos N° do Animal Lado Perl o -do de tempo Tipo de Implante Carga até à quebra Momen to (Nm) o o Contro -los intact os Angu- lação (graus) Energia absorvida até a quebra {Nm graus) 1793 2 Dto 8 sema nas Con trolo não rela ciona do 35,40 2,12 54,24 61,58 34,63 18 92 6 Dto 8 sema nas Con trolo não rela- 6,20 0, 37 9,50 59, 65 6, 96 118 ciona do 1875 4 Dto 8 sema nas Con trolo não rela ciona do 25, 68 1,54 39, 34 33,53 27,87 1793 2 Esq 8 sema nas Con trolo não rela ciona do 29,14 1,54 39,34 33, 53 27,87 1892 6 Esq 8 sema nas Con trolo não rela ciona do 5,67 0,34 8,69 47,20 6,20 1875 4 Esq 8 sema nas Con trolo não rela ciona do 12,23 0, 73 18,74 39, 43 15, 10 Média 19,05 1, 14 29, 19 44,64 18,43 Des vio pa drão 12,68 0,76 19,42 14,14 11,36 Tama nho da amos tra 6 6 6 6 6 2. Experiência 2: Reparação Acelerada de um Defeito de Fractura Fechada Quando Tratada com um Dispositivo Unitário (cães) O seguinte é um estudo experimental comparativo da eficácia de formulações rhOP-1 contendo CMC para acelerar a cura de fracturas em cães.

Sistema de Teste

Foram utilizados neste estudo cães sem raça definida adultos (18) criados de propósito. Foi dada especial 119 atenção na selecção de animais de tamanho uniforme para limitar a variabilidade na geometria do osso e carga. Os animais foram rastreados clinicamente e radiografados para excluir condições médicas agudas e crónicas durante um período de quarentena de duas semanas.

Utilizando técnicas assépticas padrão foi efectuada cirurgia sob anestesia com gás isofluorano e foi monitorizada por electrocardiograma e monitores de ritmo cardíaco. Foi administrada medicação pré-cirurgia aproximadamente 20-30 minutos antes da indução da anestesia. A medicação pré-cirurgica consistiu em atropina (dosagem 0,02mg/lb de peso corporal) e acepromizina (dosagem de 0,1 mg/lb de peso corporal). A anestesia foi administrada por injecção intravenosa de pentotal de sódio com a dosagem de 5,0 mg/lb de peso corporal. A seguir à indução, um tubo endotraqueal foi colocado e a anestesia foi mantida através de inalação por isofluorano. Ambos os membros anteriores foram preparados e envolvidos em panos de forma estéril. Foi feita uma incisão lateral de aproximadamente dois centímetros de comprimento e foi obtida a exposição do cúbito utilizando uma dissecção brusca e precisa. Foi criado um defeito de tamanho não crítico de 3 mm no cúbito médio utilizando uma serra oscilante. 0 rádio foi mantido por questões de estabilidade mecânica e não foi utilizada fixação interna ou externa. O local foi irrigado com solução salina e os tecidos moles foram fechados meticulosamente em camadas à volta do defeito. O dispositivo de implante adequado foi injectado no local do defeito de acordo com a calendarização do tratamento. O procedimento foi então repetido no lado oposto com o implante adequado.

Foi administrado acepromizina (0,75 cc/501b de peso corporal) e tartarato de butorfanol (0,025 mg/lb de peso corporal) como requerido após a operação. Aos animais foram 120 administrados antibióticos por via intramuscular durante quatro dias após cirurgia e radiografias anteriores-posteriores de rotina foram tiradas imediatamente após cirurgia para assegurar colocação cirúrgica adequada. Os animais foram mantidos em gaiolas de recuperação de 3x4 pés até ter sido demonstrado que podiam com o seu peso, após o que foram transferidos para corridas e permitido o movimento sem restrições.

Foram tiradas radiografias dos membros anteriores semanalmente até às quatro semanas e depois duas vezes por semana até às 16 semanas nos animais sobreviventes utilizando tempos de exposição padrão e intensidades. As radiografias foram avaliadas e comparadas com radiografias anteriores para avaliar a qualidade e velocidade da cura do defeito. Alterações na aparência radiográfica foram avaliadas com base na presença e densidade de formação de osso novo; extensão da união do defeito e incorporação nos córtices do osso hospedeiro.

Descrição do Material de Teste

Os materiais do implante consistiam em proteína osteogénica recombinante humana 1 (rhOP-1) numa formulação de tampão acetato e rhOP-1 em CMC- colagénio. As formulações de rhOP-1 foram comparadas com controlos apenas com suporte. A formulação de rhOP-1 de tampão acetato consistia em 3,5 mg/ml de OP-1 num tampão de lactose/ acetato administrado num volume de 100 μΐ. O controlo do veículo consistiu num volume de 100 μΐ de tampão de lactose/ acetato. A formulação de rhOP-l/CMC de colagénio consistiu em 0,35 mg de rhOP-1 em 170 mg de matriz de CMC-colagénio molhada aproximadamente com 0,43 ml de solução salina e possuía a consistência de uma pasta. 0 controlo de CMC colagénio consistiu em 170 mg de matriz de CMC-colagénio molhada com aproximadamente 0,43 ml de solução 121 salina e foi também administrado num volume injectável de 100 μΐ.

Desenho Experimental

Foi utilizado total de 36 cães adultos sem raça definida. Foram criados em todos os animais defeitos segmentais de 3,0 mm de comprimento no cúbito de ambos os lados. Catorze animais receberam uma injecção de 0,35 mg de formulação de 0,35 mg de rhOP-1/ tampão de acetato num defeito e de tampão acetato sem rhOP-1 no lado oposto do defeito. Nove animais receberam uma injecção de formulação de 03,5 mg de rhOP-l/CMC-colagénio num defeito e só CMC-colagénio no defeito do lado oposto. Os 23 animais foram sacrificados em períodos de 4, 8, 12 e 16 semanas após operação.

Procedimentos de Teste

No final do período de estudo os animais foram sacrificados utilizando um excesso de dose de barbiturato. O cúbito e rádio foram recuperados imediatamente en bloc e colocados em fraldas impregnadas com solução salina. Ambos os cúbitos foram macrofotografados e foram tiradas radiografias de contacto. Os tecidos moles foram dissecados cuidadosamente e retirados do local do defeito. Uma serra arrefecida com água foi utilizada para cortar o cúbito até a um comprimento uniforme de 9 cm com o local do defeito centrado no meio do espécimen de teste para avaliação em teste biomecânico.

Se a cura do defeito era suficiente baseada na manipulação manual os especímenes foram testados até à quebra em torsão numa máquina hidráulica de teste de loop fechado MTS (Minneapolis, MN) operada com controlo de batimento com um deslocamento constante de 50 mm/min. Cada extremidade do segmento do osso foi montada numa manga cilíndrica de alumínio e cementada com metilmetacrilato. 122

Uma extremidade foi fixa rigidamente e a outra foi rodada no sentido contrário aos ponteiros do relógio. Uma vez que o cúbito do cão possui uma ligeira curvatura os especímenes não foram montados excentricamente para manter a rotação do espécimen coaxial com a do dispositivo. A força de torsão foi aplicada com um braço nivelador de 6 cm. Foram geradas curvas de força - deslocamento angular a partir das quais foram obtidos o momento e deformação angular até à quebra e a absorção de energia até à quebra foi calculada como a área sob a curva carga -deslocamento:

Ambos os especímenes testados e não testados foram preparados para avaliação histológica. Os especímenes individuais foram fixos por imersão numa solução tamponizada de formalina a 10% imediatamente a seguir ao teste mecânico ou após o seccionamento em especímenes não testados. Numa serra de diamante arrefecida com água os especímenes foram divididos bisectando o espécimen ao longo do seu eixo. Este procedimento resultou em duas porções de cada espécimen para preparações histológicas incluindo o seccionamento da secção de base não descalcifiçada e seccionamento não descalcifiçado por micrótomo. As secções histológicas foram avaliadas, quanto à qualidade da união, aparência e qualidade do osso cortical e esponjoso, e remodelação do osso.

Resultados

Observações Grosseiras

Todos os defeitos tratados com rhOP-1 apresentavam formação do osso tão cedo como às 4 semanas. Todos os defeitos tratados eram estáveis manualmente e encontravam-se unidos com osso novo sólido que começou a remodelar-se entre as 8 e 12 semanas após a operação. Em alguns defeitos, o osso novo prolongou-se para além das 123 extremidades do defeito e sobrepunha-se com os tecidos moles que rodeavam os defeitos. A maior parte dos defeitos de controlo não eram completamente estáveis por manipulação manual até às 4 semanas após a operação, apesar da maior parte ter sido testada mecanicamente. Tecido fibroso encontrava-se frequentemente presente e as extremidades dos defeitos permaneciam visíveis com alguns sinais de osso novo. Às 12 semanas após a operação, a maior parte dos defeitos de controlo eram estáveis apenas com um movimento ocasional ligeiro das extremidades dos defeitos.

Avaliação Radioqráfica

Nos defeitos tratados com rhOP-1, traços de osso novo foram observados às duas semanas após operação dentro e à volta dos locais do defeito. A quantidade e densidade de osso novo aumentou de 2 a 4 semanas com os córtexes do osso hospedeiro começarem a obscurecer. Entre as 4 e oito semanas após a operação os defeitos tratados com rhOP-1 possuíam quantidades significativas de osso novo denso à radiação nas extremidades do defeito e unindo o defeito lateralmente. Às 12 semanas os córtexes hospedeiros estavam obscurecidos com ligações em ponte densas à radiação. A aparência radiográfica dos defeitos de controlo tratados e não tratados era significativamente diferente da aparência dos controlos tratados com rhOP-1. Entre 2 e 3 semanas após a operação não houve mudanças significativas nas aparências radiográficas comparadas com as aparências após operação. Às quatro semanas eram visíveis alterações fracas na densidade à radiação das extremidades do osso hospedeiro. Das 8 às 12 semanas algum osso novo prolongou-se a partir das regiões endosteais e extremidades do osso hospedeiro, apesar da união não se encontrar completa. Às 16 semanas após a operação, apenas metade dos controlos não 124 tratados apresentavam sinais radiográficos da cura completa do defeito ósseo.

Testes Mecânicos

Os resultados médios dos testes mecânicos por grupo de tratamento e período de tempo encontram-se sumarizados nas Tabelas 11A e 11B. Forças de torsão de defeitos tratados com rhOP-1 foram significativamente maiores do que os controlos não tratados e controlos apenas com suporte e aproximavam-se da resistência de cúbitos intactos previamente testados. A resistência mecânica dos defeitos da formulação rhOP-1/ tampão acetato foi de 59% da resistência do cúbito intacto às 4 semanas após a operação, 77% às 8 semanas após a operação, e 98% às 12 semanas após a operação. A resistência mecânica dos defeitos rhOP-l/CMC-colagénio foi de 36%, 53% e 66% da resistência dos cúbitos intactos às 4 semanas, 8 semanas e 12 semanas, respectivamente.

Mecanicamente, os locais de defeitos de controlo possuíam pouca estabilidade mecânica nos períodos de tempos iniciais apesar da resistência dos defeitos melhorar com o decurso de tempo. A resistência mecânica dos defeitos que recebem a solução tampão acetato de controlo estava entre 23% e 30% da dos defeitos tratados com rhOP-1/ tampão acetato em períodos de tempo equivalentes. Os defeitos de controlo possuíam uma resistência mecânica equivalente a 16 % da resistência do cúbito intacto às 4 semanas após a operação, 18% às 8 semanas, e 29% às 12 semanas. Os defeitos apenas com colagénio eram semelhantes em resistência mecânica aos defeitos de controlo com tampão acetato. A resistência mecânica média às 16 semanas após operação diminuiu para 28%, o que foi semelhante à resistência às 8 semanas de 29%. 125

Tcibelâ 1 ΙΑ

Resultados dos Testes Mecânicos, média ± desvio padrão (n) Implante Semana s Ca rga máx. até a guebra (N) Momento (Nm) % Controlos Intactos Angu-laçãD (graus) Energia absorvida até à quebra (Nm-graus) RhOP- 1/tampão acetato 4 semanas 38,46+17, 3 (8) 2,31+1,0 (8) 58,92±26, 5 (8) 25,13+16, 2 (8) 35,71139, 3 (8) RhOP-1/tampão acetato 8 semanas 50,57+23, 0 (3) 3,03+1,4 (3) 77,48+35, 3 (3) 39,56+14, 6 (3) 70,51138, 0 (3) RhOP-1/tampão acetato 12 semanas 63,70±22, 1 (3) 3,82+1,3 (3) 97,60133, 8 (3) 18,7 9+2,4 (3) 38,46117, 3 (3) Apenas tampão acetato 4 semanas 10,72±6,4 (8) 0,64±0,4 (8) 16,4219,7 (8) 23,85+22, 3 (8) 5,46+7,9 (8) Apenas tampão acetato X semanas 11,4719,4 (3) 0,69+0,6 (3) 17,57114, 5 (3) 39,38132, 4 (3) 11,83+10, 2 (3) Apenas tampão acetato 12 semanas 18,91±29, 9 (3) 1, 13+1,8 (3) 28,97+45, 9 (3) 35,72111, 4 (3) 43,69+72, 7 (3) RhOP- 1/CMC- colagénio 4 semanas 23,61±17, 9 (3) 1,42±1,1 (3) 36,17+27, 4 (3) 32,30120, 1 (3) 24,47127, 7 (3) RhOP- 1/CMC- colagénio 8 semanas 34,33+22, 6 (3) 2,06±1,4 (3) 53,6=34,6 (3) 42,76+20, 2 (3; 37,08114, 4 (3) RhOP- 1/CMC- colagénio 12 semanas 43,39±22, 3 (8) 38,46+17, 3 (8) 38,46+17, 3 (8) 38,46+17, 3 (8) 38,46117, 3 (8) Apenas CMC- colagénio 4 semanas 10,00±5,5 5 (3) 0, 60±0,3 (3) 15,3318,5 (3) 31,77123, 8 (3) 9,0117,7 (3) Apenas CMC- colagénio 8 semanas 4,45+4,0 (3) C,27±0,2 (3) 6,81+6,2 (3) 31,90+25, 6 (3) 5,0916,3 (3) Apenas CMC- colagénio 12 semanas 18,82±8,6 (3) 1,13±0,5 (3) 28,84113, 2 (3) 43,87+11, 0 (3) 23,55+16, 4 (3) Mão tratado (testado 5/8) 4 semanas 6,04±1,8 (5) 0,36±0,1 (5) 9,25±2,8 (5) 43,71112, 3 (5) 6,0011,8 (5) Não tratado 8 semanas 19,05+12, 7 (6) 1,14±0,8 (6) 29,19±19, 4 (6) 4 4, 64+14 , 1 (6) 18,43+11, 4 (6) Não tratado 12 semanas 45,91±4G, 6 (6) 2,75±2,4 (6) 70,34+62, 1 (6) 38,04+17, 8 (6) 38,26121, 4 (6) Não tratado (testado 5/6) 16 semanas 18,S5±9,3 (5) 1,11+0,56 (5) 28,43+14, 2 (5) 39,15+8,3 (5) 20,19±9f 8 (5} 126

Tabela 11B

Resultados dos Testes Mecânicos em termos de percentagem de resistência do cúbito intacto, média ± desvio padrão (n)

Implante 4 semanas 8 semanas 12 semanas 16 semanas RhOP-1/tampão acetato 53126 (8) 77:35 (3) 98134 (3) Apenas tampão acetato 16110 (8) 18115 (3) 2 914 6 (3) RhOP- 1/CMC- colagénio 36127 (3) 53135 (3) 66134 (3) Apenas CMC- colagénio 1519 (3) 716 3) 2 9113 (3) Não tratado 913 (5) 29119 (6) 70162 (3) 28114 (5)

Avaliação Histológica A histologia de rhOP-1 e defeitos de controlo correlacionou-se bem com os resultados grosseiros radiográficos e dos testes mecânicos. Nos defeitos tratados com rhOP-1 foi observada uma formação de osso novo proliferativa unindo os defeitos e em alguns casos prolongando-se para o tecido subcutâneo. 0 osso novo formado a partir das regiões endosteal do cúbito e do periósteo próximo dos córtexes dos defeitos. A união com osso novo foi geralmente completada às 8 semanas após a operação, apesar de se encontrarem presentes áreas de mineralização. Os defeitos foram unidos e cheios com osso entrelaçado, denso e foi observada uma reorganização dos córtexes do osso hospedeiro às 12 semanas. Defeitos de controlo tratados e não tratados apresentaram apenas sinais de união do tecido fibroso com pequenas quantidades de osso novo formado ao longo do periósteo lateral do cúbito ou a partir da região endosteal às quatro semanas após a operação. Às 8 semanas cartilagem fibrosa enchia os 127 defeitos de controlo com áreas de cartilagem de mineralização presentes entre o crescimento de osso novo. Formaram-se quantidades significativas de osso novo nos córtexes do osso hospedeiro e prolongava-se para os defeitos. Córtexes com defeito estavam obscurecidos com formação de osso novo densa e a cura endocondral encontrava-se avançada, apesar da união não se encontrar completa. Âs 16 semanas defeitos de controlo encontravam-se unidos com osso novo com algumas falhas de cartilagem em mineralização presentes. 0 osso novo prolongava-se a partir dos córtexes hospedeiros e camadas de tecido periosteal adjacentes através do defeito.

Conclusão

Os resultados deste estudo demonstraram que proteínas osteogénicas injectadas em defeitos de tamanho não crítico podem acelerar a reparação do osso. A injecção percutânea local de rhOP-1 no local do defeito de tamanho não crítico no cúbito canino resultou num periósteo proliferativo e formação de osso novo endosteal, quando comparada com defeitos de controlo não tratados e só com veículo. Radiograficamente, a injecção de rhOP-1 resultou em calcificações difusas de osso novo e formação precoce de callus de fractura tão cedo quanto as 2 a 3 semanas após operação com união significativa do osso e incorporação dos córtexes hospedeiros às 8 a 12 semanas após a operação. A resistência mecânica de defeitos não críticos tratados com rhOP-1 aproximaram-se da resistência do cúbito intacto às 12 semanas e eram 2 a 3 vezes superiores à observada na cura dos defeitos de controlo. C. Reparação de Defeitos de Fractura Utilizando Dispositivos Osteogénicos Melhorados Contendo

Carboximetilcelulose 1.Experiência 1: Estudo da Fractura da Cabra Utilizando Doses Variadas de OP-1 (Local de Defeito Fechado)

Escolha do Animal Experimental É geralmente reconhecido no estado da técnica que as cabras possuem uma velocidade de cura do osso comparável à dos humanos. Assim, os ossos das cabras apresentam semelhanças com os dos humanos no que diz respeito ao tamanho, forma e carga mecânica. Como revelado e aqui descrito, foi desenvolvido um modelo animal para uma fractura diafisária. Este modelo promove o estudo da cura natural e acelerada da fractura, com ou sem dispositivo interno de fixação, permitindo a criação de um padrão de fractura reprodutível do membro posterior. Resumidamente, em cabras completamente anestesiadas é criada uma fractura no eixo médio da tíbia com o auxílio de um dispositivo de torsão em três pontos. Após redução fechada e desvio de 5 mm da fractura, é aplicado um molde externo. Devido a uma diminuição no inchamento do membro posterior, o molde é substituído duas vezes por semana para reter a estabilidade. Após duas semanas, os animais suportam o peso completo sobre o membro fracturado, e após 4-6 semanas a fractura é curada clinicamente e radiograficamente. 0 molde é removido após 6 semanas. Os animais foram comprados à Ruiter (Holanda), um criador de cabras especializado. Serão utilizadas cabras leiteiras fêmeas adultas criadas aleatoriamente. Para tornear a influência de um esqueleto em desenvolvimento nos resultados, serão utilizados animais adultos. Os animais não maduros do ponto de vista do esqueleto, com 1 a 2 anos de idade e pesam cerca de 50 kg.

Procedimento Experimental 129

Como pré-medicação foi administrada, cetamina 10 mg/kg i.irt. e atropina 1,5 mg i.m. (ou equivalentes dos medicamentos anteriores reconhecidos no estado da técnica) cerca de 15 minutos antes de anestesiar completamente os animais. 0 último é realizado com etomidatos (ou os seus equivalentes reconhecidos no estado da técnica) 0,3 mg/kg i.v. Após intubação, a anestesia é mantida com uma mistura de O2/N2O (1:1 vol/vol) suplementada com 1 a 2% de isoflurano (ou seus equivalentes reconhecidos no estado da técnica).

Com um dispositivo de torsão de três pontos é aplicado um trauma varus à tibia esquerda até ser obtida uma fractura fechada do eixo médio. A fractura é então reduzida manualmente, e a pele sobre a área da fractura é obtida. O membro posterior esquerdo completo é iodado com um álcool contendo uma solução de desinfectante para administração fechada de um dispositivo osteogénico através de injecção e para posterior imobilização do molde. O dispositivo osteogénico é injectado no local da fractura na vizinhança da falha da fractura para maximizar o contacto com a cavidade medular. Por exemplo, um dispositivo osteogénico é injectado por via intramedular com uma agulha espessa de aspiração da medula óssea. Após a imobilização, é aplicada a imobilização do molde.

Desenho do Estudo

Os animais encontram-se divididos em 5 grupos (I-V) de 3 animais e 1 grupo (VI) de 9 animais de acordo com o tratamento: 0,5 mg de OP-1 numa configuração injectável de dispositivo osteogénico contendo pelo menos OP-1, matriz de colagénio, e agente ligante tal como CMC, formulado como descrito acima (directamente após a criação da fractura) (Grupo I), 1,0 mg de OP-1 num dispositivo injectável contendo pelo menos OP-1, colagénio e agente ligante, tal 130 como CMC, (directamente após a criação da fractura) (Grupo I), 1,0 mg de OP-1 num dispositivo injectável contendo pelo menos OP-1, colagénio e agente ligante, tal como CMC, (directamente pós criação da fractura) (Grupo IV), 1,0 mg de OP-1 numa configuração padrão do dispositivo OP-1 (correspondendo a 0,4 g de dispositivo de OP-1) injectado directamente após a criação da fractura (Grupo V) , e sem tratamento com OP-1 (Grupo VI, controlos). Os grupos de tratamento encontram-se sumarizados como se segue:

Grupo Tempo de Dispositivo Quantidade Número injecção de OP-1 aproximado (dias) (mg) de animais I 0 Injectável 0,5 3 II 0 Injectável 1,0 3 III 3 Injectável 1,0 "3 IV 0 Injectável 1,0 3 V 0 Dispositivo 1,0 3 padrão VI Nenhum Nenhum 0 9 Os animais foram sacrificados 2, 4 e 6 semanas após a criação da fractura. Nos grupos I a V um animal é sacrificado em cada intervalo de tempo, e no grupo VI, três animais são sacrificados em cada intervalo de tempo. Comparando os grupos tratados com os controlos, o efeito de aceleração do tratamento na cura da fractura pode ser determinado. Informação sobre o efeito da dose de OP-1 e o tempo de injecção pode ser obtido por comparação do grupo I a grupo II, respectivamente, e do grupo II com o grupo III. Diferenças na eficácia entre as diferentes configurações são avaliadas avaliando os resultados dos grupos II, IV e V. 131

Noutras experiências relacionadas, as doses de proteína osteogénica tal como OP-1 vai variar entre aproximadamente 0,125 e 10,0 mg. Certas outras configurações dos dispositivos osteogénicos melhorados vai conter quantidades variadas de agente de ligação, tal como CMC, variando de abaixo de 200 mg CMC/1000 mg de matriz de colagénio e acima de 200 mg de CMC/ 1000 g de matriz de colagénio. Volumes de agente molhante vão ser variados como anteriormente descrito para obter a consistência/ configuração desejada de dispositivo osteogénico. Porém noutras experiências relacionadas podem ser utilizados outros agentes ligantes tais como cola de fibrina e/ ou outras matrizes tais como β-TCP.

Avaliando a Reparação do Defeito

Radiografia

Raios-X são realizados segundo um procedimento padronizado e representa o local da fractura em duas direcções, anteroposterior e mediolateral. As primeiras radiografias são tiradas imediatamente após a criação da fractura e depois duas vezes por semana até ao sacrifício dos animais. As radiografias na altura do sacrifício são feitas depois de se remover o material de molde; todos as outras são feitos com o material para a moldagem ín situ. Elas são avaliadas quantitativamente por dois radiologistas cegos ou cirurgiões, e se possível a seguinte escala de avaliação é aplicada para avaliar o processo de cura.

Grau 0 Nenhuma diferença comparada directamente após a criação da fractura

Grau 1 Pequena quantidade de callus

Grau 2 Grande quantidade de callus 132

Grau 3 Grande quantidade de -di. los

Grau 4 Enfraquecimento das extremidades da fractura É dada especial atenção ao tipo de fractura e alinhamento.

Tomoqrafia Computorizada

Após a remoção do membro posterior esquerdo e material de moldagem, e depois de fazer as radiografias é efectuado um varrimento TC à área da fractura. Os tecidos moles deverão permanecer in si tu para uma melhor qualidade dos varrimentos. 0 remanescente da falha da fractura e callus pode deste modo ser tornado visível. Além disso a quantidade de callus pode ser calculada. Informação mais detalhada sobre o progresso da cura pode ser obtida com varrimentos CT do que com radiografias simples.

Teste Biomecânico

Após o varrimento TC e posterior remoção de todos os tecidos moles da tíbia, são efectuadas investigações biomecânicas. Um método para testes mecânicos avançados do osso é desenvolvido como se segue: é medida a rigidez de torsão em 24 direcções com incrementos angulares de 15° e representada como um vector num sistema de coordenadas X-Y, a partir do qual é obtido uma elipse. A elipse é comparada com a da tíbia intacta lateralmente oposta. Podem ser derivados parâmetros a partir desta comparação que servem como medidas da eficiência da cura. Finalmente é efectuado um teste de torsão até à quebra e a resistência à torsão medida, rigidez à torsão, deslocamento angular e absorção de energia até à quebra é expressa como uma percentagem da tíbia do lado oposto saudável. Esta comparação com a tíbia 133 do lado oposto é efectuada para reduzir a variação inter individual.

Histologia

Após o teste biomecânico, os fragmentos do osso são mantidos juntos com anéis especiais para o exame histológico. É utilizada uma fixação padrão, técnicas de impregnação e coloração para o osso e cartilagem. É dada especial atenção a sinais de união fibrosa, osteocondral ou óssea. Um sistema de pontuação histológica é aplicado para quantificar a quantidade de tecido fibroso, cartilagem, osso recentemente formado e medula óssea na falha da fractura.

Resultados Experimentais É esperado que dados mecânicos, radiográficos, tomográficos e histológicos vão indicar que configurações injectáveis de dispositivos osteogénicos melhorados possam induzir uma reparação acelerada de defeitos de fractura em locais fechados.

Conclusão

Dispositivos osteogénicos melhorados (configuração injectável) possa ser utilizado para reparar fracturas frescas da tíbia no eixo médio (desviados até 5 mm) num local fechado do defeito. 2.Experiência 2. Estudo de Fractura de Cabra utilizando Várias Doses de OP-1 para Tempos Variados (Locai de Defeito Fechado)

Este estudo independente também utiliza cabras como modelo animal para estudar a reparação de defeitos de 134 fractura utilizando dispositivos osteogénicos melhorados. Utilizando técnicas semelhantes àquelas descritas acima, fracturas frescas diafisária (na maior parte das vezes transversa e oblíqua simples) com redução com fixação externa e desvio de 5 mm são tratadas utilizando dispositivos osteogénicos contendo CMC. 0 desenho do estudo é o seguinte:

Grupo Tratamento N° de Cabras I Sem injecção 10 II CMC+colagénio 10 sozinho via inj ecção III CMC Tcolagénio 10 +0P-1 (2,5 mg 0P- 1/1000 mg de colagénio) via inj ecção IV Dosagem de 1,25 mg 10 OP-1/1000 mg de colagénio)

Cinco cabras em cada grupo são sacrificadas às duas semanas após tratamento e cinco cabras em cada grupo são sacrificadas às 4 semanas após tratamento.

Outros estudos relacionados investigam a reparação de defeitos de fractura em pontos de tempo superiores às 4 semanas, e investigam tanto dosagens baixas e elevadas de OP-1. Adicionalmente, é estudada a reparação de defeitos de fractura utilizando quantidades totais diferentes (mg) do dispositivo contendo CMC administrado no local do defeito. Um estudo utiliza um dispositivo de 400 mg de peso total administrado no local do defeito. No entanto, outros estudos relacionados vão utilizar quaisquer dos agentes de 135 ligação anteriormente mencionados, tais como: cola de fibrina, e/ ou quaisquer das matrizes anteriormente mencionadas, tais como β-TCP. A reparação dos defeitos é avaliada utilizando uma variedade de protocolos clínicos de rotina, incluindo radiografia, varrimento de TC, testes biomecânicos, e histologia como descrito mais detalhadamente acima.

Resultados Experimentais É esperado que dados mecânicos radiográficos, histológicos tomográfícos vão indicar que configurações injectáveís de dispositivos osteogénicos melhorados podem induzir uma reparação acelerada de defeitos de fractura de locais fechados. É também antecipado que em determinadas concretizações preferidas, baixas dosagens de proteína osteogénica vai ser eficaz para induzir reparação, especialmente em dispositivos osteogénicos melhorados.

Conclusão

Dispositivos osteogénicos melhorados (configuração injectável) podem ser utilizados para reparar fracturas diafisárias fechadas frescas (com desvio de 5 mm) num local de defeito fechado. D. reparação de defeitos Osteocondrais Utilizando

Dispositivos__Osteogénicos_Melhorados_Contendo

Carboximetilcelulose 1. Experiência 1: Defeitos Osteocondrais de Espessura Completa (cães)

Um estudo utilizando o modelo de defeito de tampão osteocondral de cão foi efectuado para demonstrar a eficácia de dispositivos osteogénicos melhorados para 136 reparar defeitos osteocondricos/ condrais. Foram avaliadas quatro formulações de implantes, incluindo (1) dispositivo osteogénico padrão, incluindo rhOP-1 e matriz de colagénio, (2) dispositivo osteogénico melhorado, incluindo rhOP-1, matriz de colagénio e agente ligante carboximetilcelulose (CMC), (3) apenas matriz de colagénio, ou (4) matriz de colagénio e agente ligante CMC.

Resumidamente, foram criados defeitos de espessura completa de 5 mm de diâmetro e prolongando-se 6 mm para o osso subcondral em ambos os lados no condilo femoral médio de 4 cães adultos sem raça definida. Foram escolhidos cães sem raça definida, machos adultos devido ao seu tamanho anatómico e reparação do osso e características de remodelação. Foi dada especial atenção na selecção dos animais de tamanho uniforme e peso para limitar a variabilidade na geometria do osso e carga da articulação. Os animais foram rastreados radiograficamente antes da operação para assegurar o tamanho adequado, maturidade do esqueleto e que não existiam anormalidades óbvias do esqueleto. Os defeitos do lado esquerdo receberam um dispositivo osteogénico padrão em dois animais, e o dispositivo osteogénico melhorado nos outros dois animais. Os defeitos do lado direito receberam apenas matriz num animal, uma mistura de matriz/ agente de ligação num animal e não foi tratado nos restantes dois animais.

Descrição do Dispositivo Teste 0 dispositivo osteogénico padrão consistiu em rhOP-1 misturado com matriz de colagénio de bovino do tipo I (2,5 mg rhOP-l/g). 0 dispositivo osteogénico melhorado compreendia 100 mg de OP-1/ matriz de colagénio dispositivo osteogénico padrão combinado com 20 mg de CMC (total de 120 mg). Os controlos consistiram apenas em matriz de colagénio 137 de bovino do tipo I, e a matriz de colagénio com CMC. Ambos foram fornecidos em quantidades de 100 mg.

Desenho do Estudo O desenho do estudo encontra-se sumarizado na tabela 12 .

Tabela 12: Reparação do Defeito Osteocondral do Cão Utilizando OP-1 Número do Implante Implante Animal Esquerdo Direito H122 OP-1 Matriz H130 OP-1 Nenhum H125 OP-1/CMC Nenhum H132 OP-1/CMC Nenhum OP-1: 100 mg de dispositivo OP- 1/colagénio (dispositivo osteogénico padrão). OP-1/CMC: 120 mg de dispositivo OP- 1/CMC/colagénio (dispositivo osteogénico padrão). Matriz: 100 mg de colagénio CMC/Matriz: I 100 mg de CMC/colagénio Dispositivos e controlos foram molhados com solução salina (aprox. 0,21 a 0,26 m) para assegurar uma consistência de massa antes da implantação

Cirurgia

Utilizando técnicas padrão assépticas, foi realizada cirurgia sob anestesia com gás isofluorano. A anestesia foi administrada por injecção intravenosa de pentotal de sódio numa dosagem de 5,0 mg/lb de peso corporal. Foi efectuada uma incisão parapatelar média aproximadamente de 4 cm de comprimento. A patela foi retraída lateralmente para expor 138 o condilo femoral. Foi utilizado um freio de perfuração de 5 mm com uma manga especialmente desenhada para evitar ultrapassar por perfuração a espessura do defeito (6 mm) para criar o defeito final. Foi adicionado tampão estéril salino ao dispositivo osteogénico melhorado e misturado mesmo antes da implantação. Após irrigação do defeito com solução salina para remover os detritos de osso e células de medula derramadas, o dispositivo apropriado foi colocado no local do defeito utilizando uma sonda romba. Foi colocado dispositivo suficiente de modo a estar nivelado com a superfície de articulação. A cápsula junta e os tecidos moles foram então fechado em camadas. O processo foi repetido no lado oposto com o implante adequado.

Avaliações e Procedimentos Terminais

Foi avaliada grosseiramente a cura osteocondral e histologicamente utilizando protocolos de rotina, como descrito abaixo. Foram utilizadas radiografias para avaliarem a cura. Às doze semanas depois da operação cada animal foi sacrificado através de uma sobredosagem de barbiturato. Tanto os fémures direito e esquerdo distai foram recolhidos en bloc e mantidos em solução salina arrefecido até a avaliação grosseira e as microfotografias terem sido completadas. Os especímenes foram então colocados em fixador de 4% de paraformaldeído, rotulado com todas as identificações necessárias, e armazenados a 4°C até à expedição aproximadamente 10 dias depois do sacrifício. Mesmo antes da expedição os especímenes foram aparados em pequenos blocos, com o defeito articular no centro.

Análise Grosseira

Cada defeito recolhido foi avaliado, quanto à sua aparência grosseira. Esta análise distribui pontos baseada 139 na formação de adesões intra-articulares, restauração da superfície articular, erosão e aparência da cartilagem. É possível um total de oito pontos. A escala grosseira de avaliação é apresentada na Tabela 13.

Tabela 13: Escala de Avaliação Grosseira

Adesões intra-articulares Nenhuma= Mínima/ tecido fibroso fino solto Graus 2 1 Adesões intra-articulares 0 Tecido principal/ denso fibroso= Restauração da superfície 2 articular Completa= 1 Parcial= 0 Nenhuma= Erosão da cartilagem Nenhuma= 2 Local do defeito/ limite 1 local= Local do defeito e 0 cartilagem adjacente normal- Aparência da cartilagem Translúcida= 2 Opaca= 1 Descolorada ou irregular= 0 PONTUAÇÃO TOTAL 8 pontos possíveis

Histologia

Todos os especímenes foram preparados para avaliação histológica. Os especímenes individuais foram fixados por imersão em solução de 4% de paraformaldeído. Adicionalmente 140 utilizando procedimentos de rotina como descritos aqui noutro lugar, foi efectuada a análise de impressão de tecido para caracterizar o tipo de colagénio e composição percentual do tecido. Secções não descalcifiçadas uma para cada espécimen coradas com Safranin-0 e manchas de Verde Rápido (para indicar o teor de glicosaminoglicano na matriz) foram devolvidas para avaliação.

As secções histológicas foram baseadas na natureza da cartilagem de reparação, caracteristicas estruturais, e alterações celulares. A escala de avaliação histológica é apresentada na Tabela 14.

Tabela 14 Escala de Avaliação Histológica Natureza do Tecido Predominante Morfologia celular Cartilagem hialina articular= 4 Incompletamente diferenciado= 2 Tecido fibroso ou osso= 0 Coloração da matriz com safranin-0 Normal/ quase normal= 3 Moderada= 2 Ligeira= 1 Nenhuma= 0 CARACTERISTICAS ESTRUTURAIS Regularidade da superfície Suave/ intacta 3 Laminação horizontal superficial 2 Fissuras.25.100% de espessura= 0 Quebra grave fibrilação 0 Integridade estrutural Normal= 2 Quebra leve, incluindo cistos 1 Desintegração grave 0 141

Espessura 100% da espessura da cartilagem normaA 2 50-100%= 1 0-50%= 0 Ligaçao à cartilagem adjacente Ligada a ambos as extremidades do defeito= 2 Ligada a uma extremidade ou ligada parcialmente a ambas as extremidades= 1 Não Ligada 0 LIBERDADE DAS ALTERAÇÕES CELULARES DA DEGENERAÇÃO Hipocelularidade Nenhuma= 3 Leve= 2 Moderada= 1 Grave 0 Agrupamento de condrócitos Nenhum= 2 <25% das células 1 >25% das células 0 Liberdade de alterações degenerativas em cartilagens adj acentes Celularidade normal, sem agrupamentos, normal coloração= 3 Celularidade normal, agrupamentos moderados, coloração moderada= 2 Hipocelularidade suave ou moderada coloração leve= 1 Hipocelularidade severa, pobre ou sem coloração= 0 TOTAL 24 pontos possíveis

Resultados 142

Todas as cirurgias foram sem ocorrências sem complicações após operação. Em geral, foi observado algum inchaço médio no joelho do dia quatro depois da operação em todos os quatro animais e permaneceu até ao dia dez após a operação. Nenhum animal experimentou nenhuma reacção adversa relacionada com os materiais implantados ou procedimentos experimentais.

Avaliação Grosseira

Um resumo da avaliação grosseira média aparece na Tabela 15.

Tabela 15: Avaliação Grosseira Média Grau ± desvio padrão (n)

Disposi tivo osteogé nico Padrão Disposi tivo Osteogé nico Melhorado Apenas matriz de Colagéni o Matriz de Colagénio /CMC Sem trata mento Intra- articu- lar 2,0±0,0 2,0±0,0 2, 0±0,0 2,0+0,0 2,010,0 Restauração da superfície 1,5±0,6 1,5±0,6 0,0±0,0 0,510,6 2,010,0 Erosão 18±0,5 1,23+0,5 1,5±0,7 1,011,4 1,810,5 Aparên cia 0,8±0,5 1,0±0,8 0,0+0,0 1,010,0 1,510,6 Total (de oito pontos possíveis) 6,4±1,4 (2) 5,8±1,7 (2) _ 3,510,7 (D 4,5+0,7 (D 7,310,5 (2)

Avaliação Histológica

Os defeitos não tratados e defeitos tratados com o dispositivo osteogénico melhorado de OP-1, matriz de colagénio e CMC receberam a avaliação média histológica 143 máxima, 15 e 16,5 de 24 pontos possíveis, respectivamente. Contudo, em cada um destes grupos um espécimen apresentava marcadamente um melhor aspecto do que o outro. Contudo os locais tratados só com matriz de colagénio, matriz de colagénio com CMC, e os locais tratados com dispositivo padrão contudo pontuaram de forma mais consistente e inferior aos locais tratados com dispositivo osteogénico melhorado (n<2). Um resumo da avaliação histológica média aparece na Tabela 16.

Tabela 16: Avaliação Histológica Média Grau ± desvio padrão (n)

Disposi tivo osteogé nico padrão Disposi tivo osteogé nico melhora do Apenas Matriz de Colagé nio Matriz de Colagé- nio/CMC Não Implan tado Natureza do tecido predomi nante 3,5±0,7 (2) 4,5+2,1 (2) 1,0 (1) 2,0 (1) 4,0+2,8 (2) Caracte- rísticas estrutu rais 1,5±0,1 (2) 5,5+0,6 (2) 7,0 (1) 6,0 (1) 5,0+2,8 (2) Liberdade de alterações celulares de degeneração 4,5+0,7 (2) 6,5+2,1 (2) 3,0 (1) 4,0 (1) 6,0+1,4 (2) Total (de 24 pontos possíveis ) 12,5+0,7 (2) 16,5+7,8 (2) 11,0(1) 12,0 (1) 1,5+7,1 (2) 144

Inesperadamente, locais tratados com o dispositivo osteogénico melhorado obtiveram as pontuações médias mais elevadas para a natureza do novo tecido de reparação, para as caracteristicas estruturais da reparação, e para minimizar a degeneração da cartilagem de reparação ou da cartilagem Intacta circundante. Os locais do dispositivo osteogénico melhorado também receberam a pontuação global mais elevada. Estes resultados foram ponderados pela pontuação de um animal em que a morfologia celular e do tecido era consistente com a cartilagem articular. A cartilagem de reparação era continua com a cartilagem intacta e a espessura da reparação foi a mesma que a da cartilagem intacta. A camada de osso subcondral foi também completamente restaurada. A cura não estava também tão avançada nos outros locais tratados com OP-1/ matriz de colagénio ou sem CMC. Pontuações mais baixas foram o resultado de diferenciação incompleta de tecido de reparação, restauração incompleta do osso subcondral, e espessura não homogénea da reparação de tecido. Não foi observado em qualquer secção implante residual ou material do veículo.

Comparações dos animais demonstraram que em três animais os defeitos que receberam o dispositivo contendo OP-1, com ou sem CMC (todos os defeitos esquerdos) obtiveram graus histológicos iguais ou superiores do que o defeito do lado oposto que recebe a matriz de controlo, ou nenhum tratamento.

Inesperadamente o dispositivo OP-1 sem CMC induziu a formação de osso e de cartilagem, mas de uma maneira mais organizada com tecido fibroso considerável presente.

Amostras não tratadas apenas com suporte foram cheias com cartilagem fibrosa e tecidos conjuntivos densos.

Estes dados sugerem que a reparação superior com inesperada conseguida com o dispositivo osteogénico 145 melhorado encontra-se associado com as diferenças na sua consistência relativa à do dispositivo osteogénico padrão sem agente ligante que afecta por sua vez o confinamento do dispositivo per se no local do defeito. É esperado que a adesão da formulação e propriedades de desintegração sejam críticas em defeitos em cartilagem articular dada a natureza dinâmica da junta.

Imunocoloração do Colagénio do Tipo I e Tipo II e Microscopia de Luz Polarizada

Este estudo também realizou a coloração de secções para comparar a reparação do colagénio nos locais de defeito tratados com: sem dispositivo, apenas dois tipos de composição de matriz (matriz e matriz/ agente ligante) ou ambas as composições de matriz com OP-1.

Em geral utilizando o anticorpo do colagénio do tipo I foi observada a coloração do osso subcondral subjacente existente, assim como do osso recentemente regenerado. 0 osso recentemente regenerado diferenciava-se ligeiramente do osso existente pela presença de regiões de matriz mais desorganizada, quando vista sob microscopia de contraste de fase. Utilizando o anticorpo de colagénio do tipo II, a cartilagem articular existente corou qualitativamente, assim como o tecido de reparação nos defeitos, apesar da coloração do tecido novo ser menos intensa. Em pelo menos um defeito tratado com dispositivo osteogénico melhorado, foi observada a regeneração completa do osso subcondral com a cartilagem semelhante à articular regenerada ao longo do topo. Δ matriz celular desta cartilagem regenerada não era idêntica à cartilagem articular existente, mas uma matriz celular visível de grandes feixes soltos podia ser vista sob o contraste de fase.

Defeitos Tratados com Dispositivo Osteogénico. Em defeitos tratados com dispositivo osteogénico melhorado pelo menos 146 um animal evidenciou a reparação de cartilagem articular a um nível macroscópico. 0 osso subcondral foi regenerado e uma nova camada de cartilagem de espessura quase normal foi observada através de coloração histológica com azul de toluidina e safranina 0. Estas camadas e tecidos coraram adequadamente com anticorpo do tipo I localizado no osso subcondral e colagénio do Tipo II localizado na nova camada semelhante a cartilagem. Houve também alguma evidência da regeneração de uma zona de cartilagem calcificada e marca distinta da cartilagem regenerada. Contudo algumas diferenças foram observadas entre a nova e a camada existente de cartilagem. A nova cartilagem possuía uma densidade mais elevada de condrócitos e continha feixes soltos, desorganizados de fibras visíveis por microscopia de contraste de fase ou com luz polarizada. Deveria ser salientado que apenas um ponto no tempo é aqui representado durante o processo de reparação e que os resultados de períodos mais longos ou mais curtos são desconhecidos. Defeitos Tratados com Dispositivo Osteogénico Padrão. Defeitos tratados com dispositivos osteogénicos padrão mostraram que aproximadamente 50% do osso foi regenerado no local de defeito com crescimento para o interior de cartilagem articular a partir das fronteiras do defeito. Ali parecia haver algumas áreas adicionais de formação de cartilagem articular próxima do osso recentemente formado, com o remanescente do defeito cheio com tecido de reparação. 0 tecido de reparação corou levemente com colagénio do Tipo II, e não com anticorpos do colagénio do Tipo I. Mais condrócitos encontravam-se presentes com grandes feixes soltos de matriz circundando as células. 0 tratamento com dispositivo osteogénico padrão diferiu do tratamento com o dispositivo osteogénico melhorado pelo facto do osso subcondral diferir de regenerar até ao seu nível normal, e tecido fibroso denso desorganizado aparecer 147 sobre a nova cartilagem, o que provocou que o topo do defeito fizesse uma saliência com uma superfície irregular. Este tecido fibroso parecia ter células mais semelhantes a fibroblastos com feixes fibrosos disposto paralelamente com a superfície articular.

Defeitos Tratados com Matriz/ Agente Lígante. Um defeito apenas com matriz/ agente de ligação sem OP-1 apresentou regeneração de cerca de um terço do osso subcondral removido com o restante cheio com um tecido de reparação. Este tecido regenerado corava ligeíramente com anticorpos de colagénio do tipo I, especialmente perto do fundo do defeito, e apresentava uma coloração mais forte com o anticorpo do colagénio do tipo II com a coloração mais forte perto da superfície. É visível uma matriz densa desorganizada na metade superior do tecido de reparação, e um padrão horizontal mais organizado de fibras aparece na metade inferior. 0 azul de toluidina não corou o tecido reparativo, enquanto que Safranina 0 corou a metade superior e inferior diferenciadamente. A metade perto da superfície articular corou levemente com Safranina 0, e a inferior corou com Verde Rápido. Foi observada uma distinção semelhante entre as duas metades do tecido de reparação quando corado com Masson Trichrom. Apesar de o tecido reparativo não se parecer com cartilagem articular, a região perto da superfície articular parecia conter colagénio do tipo II, uma matriz acídica com talvez alguns mucopolissacarídeos. A metade inferior possuía mais colagénio do tipo I com menos hidrato de carbono e pode ser em natureza mais semelhante a um tecido conjuntivo. O único defeito tratado apenas com matriz de colagénio sozinha não apresentou qualquer regeneração do osso subcondral. 0 tecido reparador que encheu o local do defeito corou ligeiramente tanto com anticorpos de colagénio do tipo I e II. Este tecido possuía uma matriz 148 fibrosa aumentada com células semelhantes a fibroblastos e parecia em certas áreas ser semelhante a cartilagem fibrosa. Esta amostra era semelhante ao tratamento apenas com CMC/ matriz de colagénio com ligeira localização no tecido de reparação de ambos os tipos I e II de colagénio. Adicionalmente, o local do defeito apresentou a mesma coloração diferencial com Safranina 0/ Verde Rápido, com coloração na metade superior do tecido de reparação com Safranina 0 e o fundo com Verde Rápido.

Sumário e Conclusão

Defeitos osteocondrais tratados com os dispositivos osteogénicos melhorado demonstraram inesperadamente mais regeneração de cartilagem avançada, condrócitos e fenotipo de cartilagem, quando comparados com defeitos tratados com o dispositivo osteogénico padrão, apenas matriz de colagénio, ou matriz de colagénio misturada com CMC, todas demonstraram cartilagem de reparação menos organizada e formação de osso subcondral. Uma reparação pobre com o tratamento com a matriz de colagénio ou matriz de colagénio com CMC indica que apenas a presença de um suporte de colagénio não é suficiente para induzir a cura e pode na realidade dissuadir a progressão da cura e organização da reparação do tecido.

Defeitos de espessura complete osteocondrais podem ser reparados utilizando dispositivos osteogénicos contendo CMC de acordo com os métodos da presente invenção. É esperado que defeitos osteocondrais de espessura completa podem também ser reparados utilizando dispositivos osteogénicos melhorados contendo qualquer dos agentes de ligação preferidos anteriormente referidos tais como cola de fibrina e/ ou qualquer uma das matrizes preferidas anteriormente mencionadas. 149 2. Experiência 2: Avaliação a Longo Termo da Reparação de Defeitos Osteocondrais de Espessura Completa (cães)

Este estudo foi conduzido para avaliar melhor a reparação de defeitos osteocondrais/ condrais por dispositivos osteogénicos melhorados. Até à data, o estudo examinou os defeitos do dispositivo osteogénico melhorado às 6 e 12 semanas e vai continuar a examinar os efeitos às 26 e 52 semanas. Isto disponibiliza dados de estabilidade da reparação a longo termo. A organização da cartilagem ao longo do tempo foi seguida para determinar se se aproxima de tecido normal no que diz respeito à sua estrutura e função. Duas formulações dos dispositivos foram avaliadas em defeitos osteocondrais/ condrais incluindo: 1) dispositivo osteogénico melhorado, ou dispositivo de branco contendo CMC e apenas matriz de colagénio.

Resumidamente, defeitos de espessura completa de 5 mm de diâmetro prolongando-se 6 mm para o osso subcondral foram criados lateralmente no condilo médio femoral de 16 cães adultos sem raça definida. Cães adultos sem raça definida foram utilizados neste estudo devido ai seu tamanho anatómico e conhecida reparação do osso e características de remodelação. Todos os animais tinham entre 1 e 4 anos e pesavam aproximadamente 20 a 30 kg. Foi dada atenção específica à selecção de animais de tamanho uniforme e peso para limitar a variabilidade na carga da articulação. Os animais foram rastreados radiograficamente para assegurar um tamanho adequado, maturidade do esqueleto, e que não existiam anormalidades obvias ósseas. Em cada grupo de quatro cães, os defeitos do lado esquerdo receberam dispositivo osteogénico melhorado. Os defeitos do lado direito receberam matriz/ agente de ligação em dois animais, e os restantes dois animais não foram tratados. No sacrifício, os fémures distais foram recuperados en bloc , 150 e os locais dos defeitos avaliados histologicamente e baseados grosseiramente no esquema acima descrito. O dispositivo osteogénico melhorado compreende um dispositivo padrão (2,5 mg rhOP-1/ 1 g de matriz) misturada com CMC. Para formular o dispositivo melhorado, 100 mg de rhOP-1/ mistura de colagénio foi misturado com 20 mg de CMC imediatamente antes da implantação (total 120 mg). O dispositivo apenas com colagénio consiste em colagénio de bovino do Tipo I (100 mg). 0 desenho do estudo é sumarizado na Tabela 17.

Tabela 17: Reparação do Defeito Osteocondral do Cão

Grupo Cães (2 defeitos/ animal Implante esquerdo Implante direito Duração I 4 OP-l/CMC Nenhum/ veículo 6 semanas II 4 OP-l/CMC Nenhum/ veículo 12 semanas III 4 OP-l/CMC Nenhum/ veículo 26 semanas IV 4 OP-l/CMC Nenhum/ veículo 52 semanas Dispositivo OP-l/CMC 120 mg 0P-1 CMC/ colagénio (dispositivo osteogénico melhorado) veículo: 100 mg de CMC/ colagénio

Cirurgia

Utilizando técnicas assépticas padrão foi realizada a cirurgia sob anestesia de gás isofluorano. Foi feita uma incisão média paratelar de aproximadamente quatro centímetros. A patela foi retractada lateralmente para expor o condilo femoral. Foi utilizado um freio de perfuração de 1/8 de polegada, foi feito um orifício piloto na região que suporta o peso do condilo do fémur médio. Foi utilizado um freio de perfuração de 5 mm com uma manga especiaimente desenhada para evitar perfurar em excesso a profundidade do defeito (6 mm) para criar o defeito final. Após irrigação copiosa com solução salina para remover os 151 detritos de osso e células da medula derramadas, o dispositivo experimental adequado foi colocado dentro do local do defeito utilizando uma sonda romba. A cápsula da articulação e os tecidos moles foram então meticulosamente fechados em camadas. 0 procedimento foi repetido do lado oposto com o implante adequado.

Avaliação

Quatro animais foram sacrificados às 6 e 12 semanas e quatro animais às 26 e 53 semanas depois da operação, utilizando uma dose intravenosa em excesso de barbiturato. Os fémures foram imediatamente recolhidos en bloc e armazenados numa fralda impregnada com solução salina. Foram tiradas fotografias de elevado poder aos defeitos. Os tecidos moles foram dissectados meticulosamente para for a do defeito. A extremidade proximal do fémur foi removida. A aparência grosseira dos locais de defeito e tecido de reparação foram avaliados com base nos parâmetros acima descritos por dois observadores desconhecendo a prescrição do tratamento. Os pontos foram distribuídos de acordo com a de adesão intra-articular, restauração da superfície articular, erosão da cartilagem e aparência. Todos os especímenes foram preparados para avaliação histológica imediatamente após avaliação grosseira e fotografia. Os fémures individuais distais foram fixados por imersão em solução a 10% de formalina, ou numa solução a 4% em paraformaldeído. Cada defeito foi isolado com uma serra de diamante arrefecida com água. Foram cortadas três secções de três níveis de cada bloco. Os níveis 1 e 3 foram os mais próximos do perímetro do defeito. O nível 2 encontrava-se localizado no centro do defeito. Três secções de cada nível foram coradas ou com hematoxilina e eosina, ou com o tricromo de Goldner, Safranina O, ou Verde Rápido. As secções foram então avaliadas baseadas no esquema acima 152 descrito. Esta análise distribuiu pontos baseada na natureza do tecido de reparação, características estruturais e alterações estruturais. É possível um total de 24 pontos.

Resultado e Conclusão

Após seis semanas, certos animais dos sacrificados acima foram sacrificados e avaliações imunohistoquimicas foram efectuadas como aqui descrito noutro lugar. Os resultados foram os seguintes: em todos os casos, os defeitos foram tratados com dispositivo de OP-1 CMC/ colagénio apresentavam uma reparação superior. 0 dispositivo OP-1 CMC/ colagénio apresentava uma reparação superior. Com o dispositivo OP-1 CMC/ colagénio existia união completa ou quase completa do defeito com o tecido de cartilagem. Foi observada coloração com colagénio do tipo II na cartilagem de reparação com pouca ou sem coloração do tipo colagénio. A coloração de proteoglicano seguiu a localização do colagénio do tipo II com áreas de coloração mais escuras que pareciam estar mais próximas de cartilagem hialina. Baseada na coloração o Safranina 0, a regeneração da superfície da camada de cartilagem ainda não estava completa às seis semanas após o tratamento.

Após as 12 semanas a cura tinha progredido significativamente em defeitos tratados com dispositivos melhorados. Não foi observada uma cura apreciável nos controlos. A pontuação média da avaliação grosseira observada com dispositivos melhorado às 12 semanas foi de 6,50 ± 0,89 (n=8); a média do controlo foi de 3,69 ±0,70 (n=8). Em todos os pontos restantes de tempo, é antecipado que os defeitos tratados com os dispositivos osteogénicos melhorados vai demonstrar regeneração de cartilagem mais avançada, condrócitos e fenótipo de cartilagem, de uma forma acelerada relativamente aos tecidos tratados apenas 153 com colagénio/CMC ou não tratados. É antecipado que defeitos tratados com dispositivos osteogénico melhorado apresentem cartilagem e tecido ósseo subcondral, enquanto que é esperado que os defeitos tratados com colagénio/ CMC ou não tratados induzam formação desorganizada de osso e de cartilagem com uma quantidade considerável de tecido fibroso presente.

Os defeitos osteocondrais de espessura completa podem ser reparados de forma estável utilizando dispositivos osteogénicos contendo CMC de acordo com os métodos da presente invenção. É esperado que experiências semelhantes àquelas descritas acima, em que outros agentes de ligação preferidos tais como cola de fibrina são avaliados vão demonstrar que dispositivos osteogénicos melhorados podem reparar de forma estável defeitos osteocondrais de espessura completa. E. Reparação de Defeitos Condrais Utilizando Dispositivos Osteocondrais Melhorados Contendo Carbóximetilcelulose 1. Experiência 1: Avaliação a Longo Termo da Reparação de Defeitos Condrais Comparativamente a Defeitos Osteocondrais (ovelha)

Este estudo avalia a reparação tanto de defeitos condrais e osteocondrais por dispositivos osteogénicos melhorados utilizando um modelo de animal grande. A espessura aumentada da cartilagem articular e semelhanças com os seres humanos em tamanho e características de suporte do peso fazem com que um modelo de ovelha a partir do qual podem ser extrapoladas aplicações clinicas humanas, especialmente para aplicação clinica de dispositivos osteogénicos melhorados para a reparação de defeitos condrais. Os grupos de estudo são os seguintes: 154

Defeitos Osteocondrais A (de diâmetro)

Grupo A I:

Grupo A II:

Grupo A III:

Grupo A IV:

Grupo A V: espessura completa) (5 mm de

Sem tratamento

Carboximetilcelulose/ colagénio

Carboximetilcelulose/OP-1/ colagénio

Aloenxerto liofilizado Aloenxerto liofilizado + 0P-1 (de espessura parcial) (5 mm de

Defeitos Osteocondrais B diâmetro)

Grupo B I:

Grupo B II:

Grupo B III:

Grupo B IV:

Grupo B V:

Sem tratamento

Carboximetilcelulose/ colagénio

Carboximetilcelulose/OP-1/ colagénio Ácido hialurónico + pasta de sulfato de condroitina Ácido hialurónico + pasta de sulfato de condroitina + 0P-1

Ambas as articulações dos joelhos anteriores de cada ovelhas foram operadas e foram criados dois defeitos por articulação ( um no condilo médio e o outro no lateral). Uma das articulações possui dois defeitos condrais de espessura parcial padronizados (5 mm de diâmetro) criados em cada condilo, enquanto que a outra articulação possui dois defeitos osteocondrais mais profundos de espessura completa (cerca de 1-2 mm para dentro do osso subcondral). Cada grupo possui um subgrupo sacrificado mais cedo às 8 155 semanas e outro mantido durante 6-7 meses para avaliação a longo termo.

Existe um total de 20 grupos e 12 defeitos por grupo. Por isso, o número total de defeitos é 240 e o número total de ovelhas é 60. Existem cinco grupos de tratamento diferentes: três de controlo (sem tratamento e dois dispositivos de branco diferentes) e duas formulações de OP-1 diferentes para cada tipo de defeito. Dispositivos osteogénicos melhorados compreendendo OP-1 em CMC/ colagénio vão ser utilizados para a reparação do defeito osteocondral e reparação de defeito condral. Os dispositivos são formulados de modo que 2,5 mg de OP-1/ g de colagénio são adicionados a cada local de defeito que recebem este dispositivo osteogénico melhorado. A reparação é avaliada às 8 semanas e aos 6-7 meses. O protocolo do tratamento é apresentado na Tabela 18.

Tabela 18: Reparação de Defeito Condral e Osteocondral utilizando OP-1 na Ovelha

Grupo Ovelha (4 defeitos/ ovelha) Osteocondrais (2 defeitos/ ovelha) Defeitos Condrais (2 defeitos/ ovelha) Duração 1 12 Controlo não tratado Controlo não tratado 8 semanas (6) > 26 semanas (6) 12 Controlo CMC/ colagénio Controlo CMC/ colagénio 8 semanas (6) > 26 semanas (6) III 12 OP-1 + CMC/ colagénio OP-1 + CMC/ colagénio 8 semanas (6) > 26 semanas (6)

As duas cirurgias em ambos os joelhos foram desfasadas de duas semanas para permitir a cura do primeiro joelho 156 antes da cirurgia no segundo joelho. A primeira cirurgia é utilizada para gerar efeitos condricos, a segunda é para os defeitos osteocondrais. A cirurgia é efectuada numa sala completamente equipada utilizando técnicas padrão e equipamento utilizado na cirurgia humana. A ovelha é deixada deambular livremente no seu território de pastagem após a operação. Cirurgias desfasadas resultam em tempos de cura de 8 semanas para defeitos condrais e seis semanas de tempos de cura para defeitos osteocondrais. No sacrifício, é efectuada a perfusão das articulações, são fixadas e processadas de acordo com protocolos citológicos padrão.

No final dos períodos de estudo, os animais foram sacrificados e as articulações foram recolhidas en bloc. A aparência grosseira dos locais de defeito e tecidos de reparação é avaliada utilizando métodos de rotina, tais como os descritos acima. A pontuação é distribuída de acordo com a presença de adesões intra-articulares, restauração da superfície articular, erosão da cartilagem e aparência.

Utilizando os métodos semelhantes àqueles descritos acima são preparados os especímenes para avaliação histológica imediatamente após avaliação grosseira e fotografia. É esperado que os defeitos tratados com dispositivos 0P-1/CMC/ colagénio vão exibir uma reparação superior semelhante à da Experiência D.2 acima. É ainda esperado que dispositivos osteogénicos melhorados contendo qualquer um dos agentes ligantes preferidos, tal como cola de fibrila, também vão exibir a reparação de defeitos condrais e osteocondrais. 2. Experiência 2: Avaliação a Longo termo da Reparação Utilizando Doses Variáveis de OP-1 de Defeitos Subcondrais (cabras) 157 É efectuado um estudo utilizando cabras leiteiras com maturidade de esqueleto para demonstrar a eficácia do dispositivo osteogénico melhorado para a reparação de defeitos osteocondrais/ condrais. São utilizadas formulações de dispositivo osteogénico melhorado com concentrações variáveis de rhOP-1 conjuntamente com dispositivo de branco ou controlos sem dispositivo. 0 dispositivo de branco consiste em colagénio misturado com carboximetilcelulose (CMC). Além disso, os grupos animais são sacrificados aos 4, 12 e 24 meses depois da cirurgia para comparar a velocidade e a estabilidade da reparação do defeito. O seguinte resume os parâmetros experimentais.

Grupos

Tempo depois da operação 4 meses 12 meses 2 anos 1 rhOP-1 800 A B C μρ/ιηΐ 2 rhOP-1 1600 A μρ/ιηΐ 3 rhOP-1 3200 A μς/παΐ 4 Dispositivo A B de branco 5 Sem A B dispositivo

Resumidamente, defeitos subcondrais são feitos nos joelhos esquerdo de 56 cabras leiteiras com maturidade do esqueleto: os defeitos possuem 8 mm de diâmetro e 3 mm de profundidade. Esta configuração de defeito evita tensões de stress muito elevadas no defeito conduzindo à formação de colagénio do Tipo I. Cabras leiteira holandesas com cerca de 2 anos e pesando aproximadamente 50 kg são úteis nesta experiência. São fornecidos dispositivos correspondentes a 2,5 mg de rhOP-l/grama de colagénio. Em cada caso são adiciona-se 0,2 gramas de CMC a um dispositivo osteogénico padrão, depois adiciona-se aproximadamente 2,6 ml de 158 solução salina e mistura-se. Isto dá origem a aproximadamente 3-4 ml de dispositivo osteogénico melhorado. Este material é então utilizado para encher o volume do defeito. Técnica Cirúrgica É induzida anestesia e o joelho esquerdo é aberto através de um procedimento parapatelar médio. A patela é deslocada lateralmente e o condilo médio é exposto. Com um topo aguçado e oco é desenhado o defeito na parte anterior que suporta o peso do condilo médio. Com um triturador manual de ponta quadrada que é colocado dentro do tubo, é criado um defeito um osso subcondral. A tíbia próximas é então exposta e uma aba periósteal do mesmo diâmetro que o defeito no condilo médio é retirada. A aba periósteal é parcíalmente fixada ao restante com a sua camada de cambio na direcção do defeito. 0 defeito é cheio com material de teste adequado e coberto com a aba periósteal utilizando uma sutura reabsorvível. 0 dispositivo CMC é adicionado através de uma seringa até o defeito ser cheio e a aba é então completamente saturada. Em animais de controlo é utilizado um dispositivo de branco incluindo apenas colagénio e CMC. Um segundo grupo de controlo não recebeu nenhum implante, mas recebeu apenas uma aba periósteal.

Tratamento Pós-operatório

Actividade suportadora de peso ilimitada é permitida tanto, quanto pode ser tolerada após a operação.

Desempenho Clinico 0 padrão de suporte do peso é avaliado às 2, 4, 6 e 8 semanas e depois cada 4 semanas.

Avaliação Grosseira 159

Avaliações grosseiras são realizadas baseadas no esquema apresentado acima. Depois de sacrificar o animal a presença ou ausência das contracções do joelho é registada e tanto a patela e condilos do fémur são examinados, quanto às adesões, contorno da superfície articular, aparência da cartilagem restaurada e a presença e a ausência das erosões da cartilagem. A cada uma destas características é dada uma pontuação. São retiradas lâminas de cor utilizando uma macro lente.

Análise Histológica

Para ajudar à avaliação do osso regenerado subcondral e para localizar os limites do defeito durante a avaliação histológica, as cabras receberam uma tetraciclina duplamente marcada antes do sacrifício. Isto permite a hístomorfometria do enchimento ósseo da parte mais profunda do defeito. As amostras histológicas são também observadas incorporando microscopia polarizada para fornecer informação sobre características estruturais regulares.

Para análise histológica dos especímenes incluindo o osso subcondral são fixados em formalina tamponizada com fosfato a 10% e são impregnadas em metil metacrilato não descalcifiçado (MMA). Com um micrótomo de elevada eficiência são retiradas secções de 5 pm de espessura. As secções são coradas com azul de toluidina para identificar a cartilagem e com trícromo de Goldner para identificar o osso. É efectuada a avaliação da hialinidade do tecido, afinidade para a matriz para o azul de toluidina (metacromasia), irregularidade da superfície, agrupamento de condrócitos em osso subcondral regenerado, ligação à cartilagem articular adjacente, célula inflamatória, infiltração de células à volta do implante, e liberdade de alterações regenerativas na cartilagem adjacente. 160 A cada uma destas caracteristicas é dada uma pontuação.

Análise Bioquímica

Extracção de proteoglicanos: para a análise bioquímica é recolhida cartilagem de controlo e de tecido do defeito em tampão fosfato salino arrefecido (PBS). São extraídos proteoglicanos das secções liofilizadas através de tratamento com 4 M guanidina HC1, 0,15 M de acetato de potássio a pH 5,8 na presença de inibidores de proteinase (5 iM de benzamidina, 0,1 M de ácido 6-amino-n-hexanoico, 10 ml de EDTA, 5 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, e 5 mM de N-etilmaleiamida) a 4°C durante 60 horas: o extracto e o resíduo são separados. 0 resíduo é exaustivamente lavado com tampão de extracção que é adicionado ao extracto. Os extractos são analisados, quanto ao teor em sulfato de condroitina e utilizado para filtração em gel.

Filtração em gel: alíquotas de extractos são aplicadas a colunas de Sepharose C 12 B (0,66 xl45 cm) (Pharmacia AB, Uppsala, Suécia) e eluídos com um tampão de dissociação a pH 6,1, contendo 4 M de guanidina HC1, 0,1 de sulfato de sódio, 0,05 M de acetato de sódio, e 0,1% de triton X-100. O fluxo é de 1,2 ml/h. As fracções são analisadas, quanto ao teor de sulfato de condroitina. Pode ser calculado o número de grandes moléculas específicas de cartilagem, provavelmente agrecanos.

IRM

Imagiologia de Ressonância Magnética (MRI) é efectuada com duas finalidades. Primeiro, para monitorizar 1 mês após a operação que a aba mais o implante permaneceu no lugar. Segundo, o grupo 1C ( 2 anos ou mais pós-op.) é seguido longitudinalmente com IRM aos 4 meses, 12 meses e no sacrifício. 161

Sumário É antecipado que os defeitos tratados com dispositivo osteogénico melhorado vai demonstrar regeneração avançada de cartilagem, condrócito e fenótipo de cartilagem, quando comparada com os controlos com dispositivo de branco e sem dispositivo. É também antecipado que baixas dosagens de 0P-1 vão pelo menos conseguir uma reparação quantitativamente e qualitativamente semelhante à das doses mais elevadas. F. Reparação de defeitos Condrais Utilizando Proteína Osteogénica

Este estudo investiga formação de cartilagem de mamífero em lesões subcondrais tratadas com proteína -1 osteogénica recombinante humana (rhOP-1) (sozinha, ou em combinação com uma matriz de colagénio) e/ ou pericondrio autólogo.

Materiais e Métodos

No condílo médio femoral da articulação do joelho esquerdo de 15 cabras foi criado um defeito subcondral de 9 mm de diâmetro. 0 defeito foi cheio com um implante que consiste em sangue fresco coagulado misturado com: (a) pequenas partículas de pericondrio da orelha autóloga; ou (b) dispositivo rhOP-1; ou (c) rhOP-1 mais pericondrio da orelha. RhOP-1 ou foi adicionado em combinação com uma matriz de colagénio (dispositivo OP-1) ou sem uma matriz de colagénio (OP-1 sozinho). 0 defeito foi fechado com uma aba periósteal, que foi pregada à cartilagem. Após os tempos de implantação de 1, 2 e 4 meses a extensão de reparação de cada defeito foi investigada por técnicas histológicas padrão (metacromasia e hialinidade) e métodos bioquímicos bem conhecidos (cromatografia de gel de proteoglicanos). 162

Resultados

Após 1 e 2 meses neste estudo particular, não houve diferenças aparentes entre o controlo (implante (a) acima) e os vários defeitos tratados com OP-1. Contudo, após 4 meses, apenas um dos três defeitos de controlo apresentaram uma formação de cartilagem detectável, enquanto que todos os defeitos tratados com OP-1 encontravam-se cheios completamente ou cheios parcialmente com cartilagem, como indicado pela análise histológica e bioquímica apresentada na Tabela 19.

Tabela 19

Implante % de defeito 1 A Pontuação Bioquímica B Pontuação Histológica Pontuação da cartilagem2 Parei al Total Controlo 86% 0,7 0, 0 0,60 14% 3,0 4,0 0, 98 1,58 Disposit ivo OP-1 62% 2,0 4,0 3,72 38% 3,3 6, 0 3,53 7,25 Disposit ivo OP-1 + pericon. 79% 1,2 2,0 2,53 21% 5,7 6, 0 2,46 7, 99 OP-1 sozinho 79% 2,0 5,0 5, 53 21% 2,1 6, 0 1,70 4,23 OP-1 + perocon. 78% 1,0 2,0 2,34 22% 4,2 5,0 2,02 4,36 1. 0 defeito foi dividido em partes homogéneas, a % é indicada. 2. Calculado como se segue: %x(A+B), por ex. 0,86x(0,7+0,0)=0,60 A tabela 19 apresenta a pontuação da cartilagem de defeitos condilares, tratados durante 4 meses sem OP-1 (controlo) ou com OP-1 mais ou menos pericondrio na presença ou ausência de matriz de colagénio. À pontuação bioquímica (A) foi atribuída um valor de 0-5 baseada na cromatografia de gel. A pontuação 163 histológica (B) encontra-se baseada nas secções plásticas não descalcifiçadas numa escala de graduação de 0 a 6.

Conclusão

Os resultados deste estudo confirmam que OP-1 possui uma utilidade promotora da cartilagem em grandes defeitos subcondrais em cabras. Isto indica que OP-1 é de relevância para tratar grandes lesões da cartilagem articular e é particularmente útil para a reparação condral de defeitos de esqueleto suportador de peso causados por trauma ou doença em mamíferos.

Em estudos relacionados é antecipado que outros dispositivos osteogénicos melhorados tais como dispositivos contendo cola de fibrina vão resultar na reparação de grandes defeitos subcondrais. Além disso, tal reparação vai ser acompanhada por regeneração de cartilagem articular, primitiva, mais estável. É ainda antecipado, que a reparação de defeito subcondral vai ocorrer a uma velocidade acelerada com quantidades reduzidas de OP-1, quando misturada com matriz de colagénio e um agente de ligação, tal como CMC, relativamente a OP-1 misturado apenas com colagénio. Além disso, tal reparação vai ser acompanhada por regeneração de cartilagem articular primitiva, mais estável. G. Reparação de Defeito Segmentai (Tamanho Crítico e Não-crítico) Utilizando Dispositivos Osteogénicos Melhorados Compreendendo Apatites e/ ou Fosfatos Tricálcicos (TCP) e/ ou Matrizes de Colagénio

Dispositivos melhorados compreendendo uma variedade de matrizes ou suas misturas vão ser utilizados para reparar defeitos segmentais do cúbito (de tamanho crítico e não crítico) com doses variáveis de OP-1 em coelhos e cães. Dispositivos melhorados vão compreender: matriz de 164

Pyrost®(Osteo AG. Suiça), um bloco Hap derivado de osso de bovino; 1005 de grânulos Hap (aproximadamente 300-400 ou 350-450 μ) ; 100% de TCP (aproximadamente 400 μ) ; e 50% Hap/50% TCP (aproximadamente 400 μ). Outras concretizações vão compreender uma ou mais das matrizes anteriormente descritas de porosidade adequada. Uma concretização particularmente de dispositivo osteogénico vai compreender matriz de Collapat® (Osteo Ag, Suiça), uma esponja de Hap e colagénio. Outra concretização particularmente preferida compreende aproximadamente 0,6 g de CMC por g de Hap grânulos, ou por g de grânulos de 75% Hap/25% TCP, especialmente quando um dispositivo com uma consistência de massa é desejado. Outra concretização preferida descrita acima contém β-TCP e cola de fibrina. É esperado que dispositivos melhorados tal como os descritos acima vão induzir a reparação de defeitos segmentais, e certas concretizações preferidas vão fazer isso para baixas doses de OP-1. H. Formação de Osso Utilizando Cola de Fibrina como Agente Ligante

Foram completados estudos subcutâneos de 4 ratos para avaliação do efeito da formulação OP-1 cola de fibrina na formação do osso. A quantidade de formação de osso a 10 μρ de OP-1 utilizando as três fontes diferentes de cola de fibrina eram semelhantes, variando de 25% a 40% (ver tabelas 19A-19F). Não existia uma correlação clara entre inflamação e formação de osso nestes estudos. Resultados indicam que o rato reage diferentemente à cola de fibrina de diferentes espécies; Por exemplo, cola de fibrina humana de Tissucol® provocou uma resposta inflamatória de 2 a 2,7 (ver tabela 19A), cola de fibrina de bovino provocou uma resposta inflamatória de 2 a 3,5 (ver Tabelas 19B e 19C) e a cola de fibrina de rato teve a resposta inflamatória mais 165 baixa de 1 a 1,3 (ver Tabela 19D) numa escala de 0-4. Tipicamente, uma resposta de 3-4 é definida como grave e 1-2 é definida como moderada a média.

Tabela 19A: Dados in vivo de Tissucol®/OP-l

Estudo OP-1, μg Metade do p. de explante mg Ca2+, μρ/mg % de osso/ histolo gia Fibrose (0-4) Infla mação (0-4) n=4 Tissucol ® 0 n. d. <1 0 2,3±0,6 2,7±1,2 Tissucol 10 16+6 15+2 3 2 5+25 3,3+1,0 2,5+0,6 Tissucol ® 20 58+42 3 9+9 66+32 1,8±0,5 2+0,8 OP-1 10 2 9±21 4 9±8 95±6 0,8±0,5 0,5+0,6

Vinte μΐ de OP-1 (10 μς ou 20 μς em 5% de lactose) foi misturada com 50 μΐ, de fibrinogénio (70-110 mg/mL) e 50 μΤ de solução de trombina (500 U/mL) antes da implantação subcutânea.

Tabela 19B: Dados In Vivo de Cola de Fibrina de Bovino (Implante) OP- 1, μσ Metade do p. de explant e mg Ca2+, μg/mq % de osso/ histolo gia Fibrose (0-4) Infla mação (0-4) n=4 6% de cola de fibrina 0 n.d. 6% de cola de fibrina 10 18+8 25+12 4 0+43 2,3+0,6 2+1 OP-1 10 58+8 65+10 100+0 0,75+0, 5 0+0 166

Vinte pL de OP-1 (10 pg em 5% de lactose) foi misturada com 50 μΕ de fibrinogénio de bovino (60 mg/mL) e 50 μΐ, de solução de trombina (300 U/mL) antes da implantação subcutânea.

Tabela 19C: Dados In Vivo de Cola de Fibrina de Bovino (Formulação) OP- 1, μο Metade do p. de explante mg Ca2+, μρ/ιηρ % de osso/ histologia Fibrose (0-4) Infla mação (0-4) n=4 4% de cola de fibrina 0 n. d. <3 0 2,25±1 3±1,4 4% de cola de fibrina 10 15+7 10±8 2 4±2 5 2,5±0,6 3, 5±1 OP-1 10 8±5 42+7 88±10 1+0 0+0

Vinte pL de OP-1 (10 μς em 5% de lactose) foi misturada com 50 μ]1 de fibrinogénio de bovino (40 mg/mL) e 50 μL de solução de trombina (200 U/mL) antes da implantação subcutânea.

Tabela 19D: Dados In Vivo de Cola de Fibrina de Bovino OP-1, μο Metade do p. de explante mg Ca2+, pg/mg % de osso/ histologia Fibro se (0-4) In- f1ama ç ão (0-4) ~6 Cist n=4 Fibrina a 32+13 2+0, 6 i 3+19 1,3+0,5 1,0+0, 9+12 de rato 8 Dil. 2 10 38+23 2+0,8 23+21 1,8+0,5 1,3+0, 5 26+18 167

Vinte μΕ de OP-1 (10 μς em 5% de lactose) foi misturada com 50 μΐι de fibrinogénio de bovino (40 mg/mL) e 50 μΐ, de solução de trombina (200 U/mL) antes da implantação subcutânea.

Dois outros estudos in vivo no rato foram completados para avaliar o efeito dos dispositivos contendo cola de fibrina e OP-1 na formação do osso. No primeiro estudo fibrinogénio de bovino (50 μΕ, Sigma F8630, 10 mg/ml) e trombina de bovino (50 μΐ^ 50 U/mL) foram misturados com dispositivos OP-1 mesmo antes da implantação subcutânea. Os controlos positivos são dispositivos OP-1 molhados com 100 μΕ de tampão fosfato salino. Os dispositivos OP-1 foram preparados misturando 100 μυ de OP-1 em 47,5% de etanol/ 0,01% de TFA com 25 mg de colagénio e liofilizado de um dia para o outro. Os resultados são apresentados na Tabela 19E. Não houve diferenças significativas na formação do osso entre dispositivos OP-1 padrão e dispositivos de OP-1 combinados com cola de fibrina. Também foi observada uma resposta inflamatória mais baixa com a formulação dos dispositivos OP-1/ cola de fibrina de bovino, quando comparadas com a combinação de OP-1 cola de fibrina de bovino líquido (ver Tabelas 19B e 19C).

Tabela 19E: Dados In Vivo de Cola de Fibrina de Bovino com Dispositivo de Bovino OP- 1, μυ Metade de explante mg Ca2+, μg/mg % de osso/ histologia Fibrose (0-4) Infla mação (0-4) n=4 Fibrinat dispositivo de OP-1 o 62±15 2 0±7 0±0 2,0±0,0 1,0±0,0 Fibrina+ 10 123±21 43±11 66±13 1,5±0,6 1,3±0,5 168 dispositivo de OP-1 Dispositivo OP-1 10 144±33 54±5 7 8±13 1,0±0,8 0,5±0,6

Num segundo estudo, foram combinadas diferentes concentrações de Tissucol® com o dispositivo OP-1 padrão.

Isto é, um dispositivo OP-1 liofilizado (25 mg de peso total, 10 μ9 OP-1) foi combinado com solução de fibrinogénio humano (50 pL, fibrinogénio 70-110 mg7ml ou diluído 2 ou 4 ou 8 vezes em tampão fosfato salino) e solução de trombina (50 pL, 500 U/mL ou diluído 2 ou 4 ou 8 vezes em tampão fosfato salino) imediatamente antes da implantação. Os controlos positivos são dispositivos OP-1 molhados com 100 pL de tampão de fosfato salino. Os resultados são apresentados na Tabela 19F. Não existe diferença significativa na formação do osso entre dispositivos OP-1 padrão e dispositivos combinados com diferentes concentrações de Tissucol®. Também a concentração de fibrinogénio não tinha nenhum efeito significativo na formação de osso.

Tabela 19F: Dados in vivo de Tissucol® com dispositivos de OP-1

Estudo OP-1, pg Metade de explante mg Ca2+, pg/mg % de osso/ histolo -gia Fibrose (0-4) Infla mação (0-4) n=4 OP-1 + Tissucol ® 10 163±50 37±7 55±30 2,0±0,8 1, 8 ± f 0 OP-1+ 2 vezes de Tissucol ® diluído 10 162+32 34+8 54±13 1,8±1,0 1,8±1,0 169 0P-1+ 4 vezes de Tissucol © diluído 10 17 0±19 4116,6 69126 1,511,0 1,511,0 0P-1+ 8 vezes de Tissucol ® diluído 10 177±23 4018 55125 1,811,0 1,811,0 Dispositivo 0P-1 10 137143 58110 84110 1,010,0 1,010,0

Em resumo, a propriedade de manipulação dos dispositivos padrão OP-1 é melhorada utilizando cola de fibrina, por ex. e as partículas de colagénio permanecem integradas com a cola. Os dados in vivo indicavam que os dispositivos OP-1 com cola de fibrina promovem a formação de osso. I. Reparação do Defeito Utilizando Dispositivos Melhorados Contendo Cola de Fibrina Como Agente Ligante

Dispositivos melhorados contendo cola de fibrina compreendendo uma variedade de matrizes ou suas misturas vão ser utilizados para reparar o osso, defeitos osteocondrais ou condrais em doses variada de OP-1 em modelos animais reconhecidos no estado da técnica. Certas concretizações de dispositivos preferidos vão compreender: cola de fibrina, colagénio e OP-1. Outras concretizações de dispositivos preferidos vão compreender: cola de fibrina, β-TCP e OP-1. Finalmente, a continuação dos testes vai incluir quaisquer dos materiais de matriz anteriormente mencionados para utilizar com a presente invenção. É esperado que dispositivos melhorados contendo cola de fibrina, tais como aqueles descritos acima vão promover e acelerar a formação óssea em defeitos críticos e não 170 críticos, fracturas em locais que não são de união, e fracturas, assim como promover e acelerar a reparação de defeitos osteocondrais e condrais. J. Reparação de Defeitos Segmentais (de tamanho crítico e não crítico) Utilizando Dispositivo Melhorado contendo Cola de Fibrina O seguinte é um estudo comparativo experimental da eficácia dos dispositivos melhorados contendo cola de fibrina para a cura de defeitos segmentais (de tamanho crítico e não crítico).

Sistema de Teste

Como descrito acima, foram utilizados neste estudo cães machos adultos sem raça definida criados para o fim em vista. É dada especial atenção na selecção de animais de tamanho uniforme e peso para limitar a variabilidade na geometria do osso e carga.

Como também descrito acima é efectuada cirurgia utilizando técnicas assépticas padrão, sob anestesia de gás isofluorano. Ambos os membros anteriores foram preparados e envolvidos em panos de forma estéril. É efectuada uma incisão lateral de aproximadamente dois centímetros de comprimento e é obtida a exposição do cúbito utilizando um dissecação brusca e precisa. É criado um defeito de tamanho crítico ou não crítico no cúbito médio utilizando uma serra oscilante. O rádio é mantido por questões de estabilidade mecânica e não é utilizada nenhuma fixação interna ou externa. 0 local é irrigado com solução salina e os tecidos moles são fechados meticulosamente em camadas à volta do defeito. O dispositivo de implante adequado é implantado ou 171 injectado no local do defeito. O procedimento é então repetido do lado lateral oposto com o implante adequado. São administrados aos animais antibióticos intramusculares durante quatro dias após a cirurgia e são tiradas radiografias anterior- posterior de rotina imediatamente após a cirurgia para assegurar localização cirúrgica adequada. Os animais são mantidos em gaiolas de recuperação de 2 x 4 pés até ser demonstrada capacidade de suportar o peso, depois do que são transferidos para corridas e é permitido o movimento sem limitações. São obtidas semanalmente radiografias dos membros anteriores até às 4 semanas, e depois semanalmente até às 16 semanas nos animais sobreviventes utilizando tempos de exposição e intensidades padronizados. Foram avaliadas as radiografias e comparadas com as radiografias anteriores para avaliar a qualidade e velocidade da cura dos defeitos. Alterações na aparência radiográfica são avaliadas baseadas na presença e densidade da formação de osso novo, extensão da união e incorporação dos córtexes do osso hospedeiro.

Descrição do Material de Teste

Os materiais do implante contêm proteína osteogénica recombinante humana 1 (rhOP-1) numa formulação de tampão de acetato e rhOP-1 em cola de fibrina mais colagénio ou cola de fibrina mais β-TCP. As formulações rhOP-1 são comparadas com controlos apenas com veículo. A formulação de tampão acetato rhOP-1 consiste em 3,5 mg/ml de OP-1 num tampão de lactose/ acetato, administrada num volume de 100 μΐ. A formulação de rhOP-1 de tampão acetato consiste em 3,5 mg/ml de OP-1 num tampão de lactose/ acetato. As formulações teste contêm rhOP-1/ cola de fibrina- colagénio ou rhOP-1/ cola de fibrina β-TCP.

Desenho Experimental 172

Defeitos segmentais em ambos os lados do cúbito, de tamanho crítico, ou nao crítico foram criados em todos os animais. Um grupo de animais recebeu uma injecção de formulação de 0,35 mg de rhOP-1/ tampão acetato num defeito e o tampão acetato sem rhOP-1 no defeito do lado oposto. Outro grupo de animais recebeu uma injecção de formulação de rhOP-1/ cola de fibrina- colagénio ou rhOP-1/ cola de fibrina- β-TCP num defeito e cola de fibrina- β-TCP, ou apenas colagénio no defeito do lado oposto. Os animais são sacrificados nos períodos de 00 «tf e 12 semanas após a operação. Alguns dos cães recebem defeitos em ambos os lados sem implante (apenas defeito) e são avaliados nos períodos de 4, 8, 12 e 16 semanas após a operação. Procedimentos de Teste

No final do período de estudo os animais são sacrificados utilizando uma sobredosagem intravenosa de barbiturato. 0 cúbito e o rádio foram imediatamente recolhidos en bloc e colocadas em fraldas impregnadas com solução salina. Ambos os cúbitos foram macro fotografados e foram tiradas radiografias de contacto antes dos tecidos moles serem cuidadosamente dissecados para fora do local do defeito. É utilizada uma serra arrefecida com água para cortar o cúbito até a um comprimento uniforme de 9 cm com o defeito centrado no meio do espécimen de teste para avaliação biomecânica.

Se a cura do defeito é suficiente baseada na manipulação manual os especímenes foram testados quanto à quebra por torsão utilizando procedimentos de rotina numa máquina de teste hidráulica MTS de loop fechado (Minneapolis, MN) operada com um controlo de batimento com uma velocidade deslocamento constante de 50 mm/min. Cada extremidade do segmento do osso é montada numa manga cilíndrica de alumínio e cementada com metilmetacrilato. 173 (Jma extremidade é fixa rigidamente e a outra é rodada no sentido contrário aos ponteiros do relógio. Uma vez que o cúbito do cão possui uma ligeira curvatura, os especímenes foram montados de maneira a manter a rotação do espécimen coaxial com a do dispositivo teste. A força de torção foi aplicada com um braço nivelador de 6 cm. Foram geradas curvas força, deslocamento angular a partir das quais o momento e deformação angular até à quebra foram obtidos, e a absorção de energia até à quebra foi calculada como a área sob a curva carga - deslocamento.

Tanto os especímenes testados e não testados foram preparados para avaliação histológica. Os especímenes individuais foram fixos por imersão em solução tamponizada com 10% de formalina imediatamente a seguir ao teste mecânico, ou após o seccionamento em especímenes não testados. Os especímenes foram divididos com uma serra de diamante arrefecida com água bisectando o especímenes ao longo do seu eixo mais longo. Este procedimento resultou em duas porções de cada especímenes para diferentes preparações histológicas, incluindo secções de base não descalcifiçadas e secções de micrótomo não descalcifiçadas. As secções histológicas são avaliadas, quanto à qualidade da união, à aparência e qualidade do osso cortical e esponjoso, e remodelação óssea.

Resultados É esperado que os dispositivos melhorados contendo cola de fibrina com qualquer uma das matrizes preferidas anteriormente referidas, tal como colagénio ou β-TCP, vai promover a reparação de defeitos segmentais tanto de tamanho crítico como de tamanho não crítico. VII· Estudos Clínicos Humanos: Métodos de Uso dos

Dispositivos Osteogénicos Melhorados 174 A Reparação dos Defeitos do Osso 1.Ensaio 1: Fractura da tibia exposta fresca

Este estudo é um estudo multi-cêntrico, prospectivo, aleatório com fracturas frescas da tíbia necessitando intervenção cirúrgica no local da fractura.

Introdução

Actualmente existem 26 milhões de fracturas anualmente no mundo. A maior parte das fracturas curam-se sem complicações e não são consideradas um "problema". Contudo, existe "um impacto na qualidade de vida" com os doentes sem ir ao trabalho, ou impedidos de exercer actividade normal, não sendo capazes de voltar à actividade, ou quando o fazem sofrem de dores de longa duração. Os doentes particularmente no mundo ocidental começam a esperar por soluções para estes problemas. 0 custo do tratamento das fracturas é impressionante. Em 1998, o custo das fracturas é estimado em $ 20 biliões nos Estados Unidos. O maior segmento, aproximadamente 44% ou $ 7,2 biliões encontrava-se relacionado com o internamento. Nesse ano, quase 900,000 pessoas foram hospitalizadas devido a fracturas, com uma duração média de estadia de 8,8 dias para um total de 7,9 milhões de dias. Os custos de tratamento em casa estavam em segundo lugar com $ 2,8 biliões e os cuidados hospitalares em ambulatório estava em terceiro lugar com $1,8 biliões.

Quando as ramificações económicas das fracturas são consideradas em conjunto com o impacto na qualidade de vida existe de facto uma necessidade para melhoria nas metodologias de tratamento, especialmente de fracturas que são consideradas potencialmente problemáticas. Estas são fracturas que devido à natureza do ferimento ou questões mitigantes do hospedeiro podem necessitar intervenções 175 cirúrgicas adicionais, levam um periodo de tempo extenso para se curarem e/ ou podem evitar recuperação funcional completa.

Assim, o estudo descrito abaixo tem como finalidade investigar dispositivos osteogénicos melhorados como um acelerador da cura de fracturas frescas em seres humanos como um meio de diminuir o potencial problemas após ferimento, necessidades de intervenção na cura para aumentar o processo de cura. Adicionalmente, determinados doentes neste estudo vão ser tratados com dispositivos osteogénicos melhorados como substituto de enxertos de osso em doentes que necessitam de enxertos de osso após o ferimento, ou em casos de cura prolongada. Como contemplado aqui e descrito acima concretizações actualmente preferidas de dispositivos osteogénicos melhorados possuem uma consistência que pode ser injectada através de uma agulha de grande abertura, ou pode ser colocado através de uma incisão aberta, de modo que permanecerá geralmente no lugar num ambiente sanguíneo. Adicionalmente a uma embalagem mais convencional, os dispositivos osteogénicos melhorados podem ser embalados em aplicador/ seringa prontos a usar. Uma variedade de orifícios e agulhas podem ser juntos para facilitar a aplicação. Outras aplicações vão também ser tornadas rádio opacas adicionando componentes rádio opacos, tais como os descritos anteriormente. É esperado que os dispositivos osteogénicos melhorados da presente invenção (injectáveis e implantáveis) vão diminuir a incidência de intervenções adicionais, taxa da velocidade da cura, vão melhorar a qualidade de vida e velocidade de retorno à actividade normal. Além disso, é esperado que os dispositivos osteogénicos aqui revelados vão ser utilizados em fracturas de todos os ossos longos, clavícula e escápula para promover a cura conduzindo a uma incidência diminuída de intervenção (incluindo reoperação), 176 velocidade aumentada de cura, velocidade acrescida de retorno à actividade normal, e morbidez diminuída. Em contraste com as modalidades de reparação de fracturas actualmente disponíveis, não existem requisitos biomecânicos com os dispositivos melhorados e métodos aqui revelados.

Desenho do Estudo

Doentes vão necessitar de tratamento cirúrgico de fracturas expostas da tíbia adquiridas secundariamente a um trauma. A fractura tem de ter o potencial de ser adequadamente estabilizada no local da fractura para permitir a cura. Os doentes vão demonstrar evidência radiográfica de maturidade do esqueleto.

Tipo de Tratamento

Tipo #1: Ferimento inicial < 7 dias no fecho definitivo

Tipo #2: Até 6 semanas após ferimento inicial em doentes que necessitam de enxerto de osso.

As fracturas do Tipo #1 são aquelas que não necessitam de enxerto de osso. Os doentes são atribuídos aleatoriamente numa razão de 1:1 de tratamento padrão (remoção de detritos no local da fractura, redução e estabilização) que será o grupo de controlo em função do tratamento mais dispositivo OP-1 com e sem um agente ligante, tal como carboximetilcelulose (CMC). Em determinados doentes as dosagens de proteína osteogénica vão variar. Como descrito acima, uma formulação actualmente preferida do dispositivo osteogénico melhorado contém 2,5 mg de OP-l/lOOO g de colagénio / 200 mg de CMC. As dosagens de OP-1 vão variar de 1-2 da máxima e 4x; o teor em CMC vai variar de 100-300 mg. Tal como descrito acima, variações dos volumes do agente molhante serão investigadas pelo 177 cirurgião/ médico assistente para obter a consistência/ configuração desejada do dispositivo. Os doentes do primeiro grupo que não estão curados aos 6 meses de pós-tratamento são novamente distribuídos aleatoriamente numa proporção de 1:1 de enxerto de osso (controlo) em função de OP-1. Doentes do primeiro grupo que não estão curados aos 6 meses após o tratamento serão transferidos do enxerto do osso para OP-1 e de OP-1 para o enxerto do osso.

Plano de estudo

Os doentes serão seguidos durante um mínimo de 1 anos de pós-tratamento para avaliar a cura, com um acompanhamento de 24 meses para avaliar o estado.

As avaliações de acompanhamento serão efectuadas às 2 semanas, 4 semanas e cada 4 semanas até aos 6 meses e aos 8, 10 e 12 meses de pós-tratamento. Todos os doentes vão ter uma avaliação de acompanhamento aos 24 meses para determinar o estado geral de saúde e o estado do local da fractura. As seguintes avaliações serão efectuadas: alterações do exame físico; radiografias, avaliações de dor clínica; avaliações clínicas de suporte de peso; avaliações clínicas da função; avaliações da qualidade de vida (pré-alta, 6 e 12 meses); e documentação de quaisquer intervenções para aumentar/ promover a cura (cirúrgica e não cirúrgica) e hardware quebras/ substituições. É esperado que as fracturas tratadas com osteogénicos melhorados irão evidenciar uma taxa acelerada de cura.

Adicionalmente é esperado que os doentes tratados com dispositivos osteogénicos melhorados vão experimentar pelo menos os seguintes benefícios adicionais: 1) Potencial para tempo de cura diminuído com uma mais rápida restauração da função, suporte de peso e ambulação; 2) Potencial para a prevenção de atrasos de não união; 178 3) Retorno às actívidades normais mais cedo/ menos tempo perdido nos empregos/ escola, 4) Poupança potencial de outras intervenções/ procedimentos cirúrgicos para promover a cura; 5) Menos complicações de hardware; e 6) Naqueles doentes que necessitam de enxerto de osso, o benefício de não haver cirurgia num segundo local para a recolha de osso com a morbidez associada. 2, Ensaio 2: Fracturas frescas diafisiárias fechadas. A reparação de fracturas frescas diafiseárias em sujeitos humanos irá ser avaliada utilizando dispositivos osteogénicos melhorados. Especificamente os doentes serão tratados com dispositivos ínjectáveis osteogénicos melhorados, injectando o dispositivo no local fechado do defeito. É antecipado que a reparação acelerada do defeito será observada relativamente aos doentes não tratados com dispositivos osteogénicos melhorados. 3. Outros Ensaios com Seres Humanos É antecipado que os ensaios 1 e 2 apresentados acima serão repetidos utilizando várias configurações de dispositivos osteogénicos melhorados contendo cola de fibrina. É ainda antecipado que tais dispositivos vão promover a formação de osso e em certas concretizações aceleram a reparação do defeito relativamente a sujeitos não tratados. B. Reparação de defeitos Osteocondrais. 1. Experiência 1: Qsteocondrite Dessicans

Modelos de defeitos osteocondrais suportam o uso clínico de rhOP-1 para tratar a Osteocondrite Dissecans (OD) e defeitos de trauma. A OD é uma doença que resulta em áreas localizadas de defeitos osteocondrais. A causa da doença pode ser o dano isquémico da área localizada, mas a sua 179 etiologia exacta não é conhecida. Nos doentes com OD a área afectada tor'na-se avascular, com alterações posteriores na cartilagem articular sob jacente. Os doentes que sofrem de OD do joelho experienciam sintomas incluindo a prisão da articulação, dor localizada, inchaço e crepitus retropatelar. Uma experiência envolvendo doentes com OD do joelho é efectuada de modo a comparar a capacidade de dispositivo osteogénico melhorado com a do dispositivo osteogénico padrão, para reparar defeitos OD. Métodos actuais conhecidos no estado da técnica para o tratamento da OD envolvem o uso de técnicas cirúrgicas altamente invasivas. Na maior parte dos doentes com maturidade de esqueleto com OD é necessária cirurgia. As técnicas cirúrgicas necessitam de perfuração artroscópica da lesão Intacta. Como consequência os doentes têm que se submeter a anestesia geral durante a cirurgia. No pós operatório os doentes têm que ter o movimento dos seus joelhos restringidos por uma ligadura imobilizadora e não podem andar sem a utilização de muletas até a cura ser evidenciada.

Neste estudo, são realizadas técnicas menos invasivas para o tratamento da OD. As técnicas envolvem o uso de um dispositivo osteogénico melhorado que é administrado ao local do defeito através de injecção. A actividade do dispositivo osteogénico melhorado na reparação de OD é comparada com a do dispositivo osteogénico padrão. É antecipado que doentes tratados com dispositivo osteogénico melhorado contendo qualquer uma das matrizes anteriormente mencionadas e agentes de ligação vão mostrar um maior alívio nos sintomas da OD do que aqueles tratados com dispositivo osteogénico padrão. Os doentes tratados com o dispositivo osteogénico melhorado vão experimentar pelo mesmo uma maior diminuição na dor, inchaço e prisão do joelho do que aqueles tratados com. dispositivo osteogénico 180 padrão, sendo isto indícios de melhoria e/ ou reparação do defeito.

Equivalentes A invenção pode ser concretizada noutras formas específicas sem se afastar das suas caracteristícas essenciais. As concretizações anteriores são por isso em todos os aspectos para serem consideradas ilustrativas e não limitativas da invenção aqui descrita. 0 âmbito da invenção é assim indicado pelas reivindicações em anexo e não pela descrição anterior, e todas as alterações que podem advir do significado das reivindicações estão por isso abrangidas por elas. 181

LISTAGEM DA SEQUÊNCIA

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: RUEGER, David C. TUCKER, Marjorie M.

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: DISPOSITIVOS OSTEOGÉNICOS

MELHORADOS E MÉTODOS PARA O SEU USO PARA REPARAÇÃO DO OSSO ENDOCONDRAL E DEFEITOS OSTEOCONDRAIS (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 9 (iv) MORADA PARA CORRESPONDÊNCIA:

(A) DESTINATÁRIO: CREATIVE BIOMOLECULES, INC

(B) RUA: 45 SOUTH STREET

(C) CIDADE: HOPKINTON

(D) ESTADO: MA

(E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL : 01748 (v) FORMA A SER LIDA POR COMPUTADOR:

(A) TIPO DE MEIO: DISKETTE

(B) COMPUTADOR: IBM PC compatível (C )SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.30 (vi) DADOS DO PEDIDO INICIAL: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE DEPÓSITO: (C )CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE ADVOGADO/AGENTE DE PROPRIEDADE INDUSTRIAL: (A)NOME: VITO, CHRISTINE C: (B)NÚMERO DE REGISTO: 39,061 (C }REFERÊNCIA/NÚMERO DE ENDOSSE:CRP-137 (ix) INFORMAÇÃO SOBRE TELECOMUNICAÇÕES: (A) Telefone: (617)/248-7000 (B) Telefax: (617)/248-7100 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1822 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (vi) ORIGINAL INICIAL:

(A) ORGANISMO: HOMOSAPIENS (F) TIPO DE TECIDO HIPPOCAMPUS (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) Localização: 49..1341 (C) MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO: experimental (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/FUNÇÃO=,/PROTEÍNA OSTEOGÉNICA" /produto="OPl" /evidência = EXPERIMENTAL /nome_padrão="OPl" xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: GGTGCGGGCC CGGAGCCCGG AGCCCGGGT. GCGCGTAGAG CCGGCGCG ATG CAC GTG Met His Vai i CGC TCA CTG CGA GCT GCG GCG CCG Arg Ser Leu Arg Ala Ala Ala Pro 5 10 CCC CTG TTC CTG CTG CGC TCC GCC Pro Leu Phe Leu Leu Arg Ser Ala 20 25 GAG GTG CAC TCG AGC Τ'Τ’ξ-, ATC CAC Giu Vai His Ser Ser Phe 11 e His CAC AGC TTC GTG GCG CTC TGG GCA His Ser Phe Vai 15 Ala Leu Trp Ala CTG GCC GAC TTC AGC CTG GAC AAC Leu Ala As D 30 Phe Ser Leu Asp Asn 35 CG vir CGC CTC CGC AGC CAG GAG CGG Arg Arg Leu Arg Ser Gin Glu Arg 184

40 45 SD CGG GAG ATG CAG CGC GAG ATC CTC TCC ATT TTG GGC TTG CCC CAC CGC Arg Glu Met Gin Arg Glu Xie Leu Ser Ile Leu Giy Leu Pro His Arg 55 SO 65 CCG CGC CCG CAC CTC CAG GGC AAG CAC AAC TCG GCA CCC ATG TTC ATG Pro Arg Pro His Leu Gin Gly Lvs His Asn Sex Ala Pro Met Phe Met 70 75 80 CTS GAC CTG TAC AAC GCC ATG GCG GTG GAG GAG GGC GGC GGG CCC GGC Leu Asp leu Tyr Asn Ala Met Ala Vai Glu Glu Gly Gly Gly Pro Giy 85 90 95 GGC CAG GGC TTC TCC TAC CCC TAC AA-G GCC GTC TTC AGT ACC CAG GGC Gly Gin Gly Phe Ser Tvr Pro Tyr Lys Ala Vai Phe Ser Thr Gin Gly 100 1ÔS 110 115

CCC CCT CTG GCC AGC CTG CAA GAT AGC CAT TTC CTC ACC GAC GCC GAC

Pro Pro Leu Ala Ser Leu Gin Asp Scr His Phe Leu Thr Aso Ala Asp 120 12S ' 130 ATG GTC ATG AGC TTC GTC AAC CTC GTG GAA CAT GAC AAG GAA TTC TTC Met Vai Met Ser Phe Vai Asn Leu Vai Glu His Asd Lys Glu Phe Phe 135 140 ' 145 CAC CCA CGC TAC CAC CAT CGA GAG TTC CGC ITT GAT CTT TCC AAG ATC His Pro Arg Tyr Kxs His Arg Glu Phe Arg Phe Aso Leu Ser Lvs Ile 150 155 ' 160 CCA GAA GGG GAA GCT GTC ACG GCA GCC GAA TTC CGG ATC TAC AAG GAC Pro Glu Gly Glu Ala Vai Thr Ala Ala Glu Phe Arg lie Tyr Lys Asp 165 170 17l TAC ATC CGG GAA CGC TTC GAC AAT GA.G ACG TTC CGG ATC AGC GTT TAT Tyr ile Arg Glu Arg Phe Ast> Asn Glu Thr Phe Arg lie Ser Vai Tyr 180 185 ‘ ISO 195 CAC- GTG CTC CAG GAG CAC TTG GCC AGG GAA TCG GAT CTC TTC CTG CTC Gin Vai Leu Gin Glu His Leu Gly Arg Glu Ser Asd Leu Phe Leu Leu 200 205 210 C-AC AGC CGT ACC CTC TGG GCC TCG GAG GAG GC-C TGG CTG GTG TTT GAC Asp Ser Arg Thr Leu Trp Ala Ser Glu Glu Gly Trp Leu Vai Phe Asp 215 220 225 ATC ACA GCC ACC AGC AAC CAC TGG GTG GTC AAT CCG CGG CAC AAC CTG Ile Thr Ala Thr Ser Asn His Trp Vai Vai Asn Pro Arg His Asn Leu 230 235 240

GGC CTG CAG CTC TCG GTG GAG ACG CTG GAT GGG CAG AGC ATC AAC CCC

Gly Leu Gin Leu Ser Vai Glu Thr Leu Asp Gly Gin Ser Ile Asn Pro 245 250 255 AAG TTG GCG GGC CTG ATT GGG CGG CAC GGG CCC CAG AAC AAG CAG CCC Lys Leu Ala Gly Leu Ile Gly Arg His Gly Pro Gin Asn Lys Gin Ρ’Ό 260 265 270 275 TTC ATG GTG GCT TTC TTC AAG GCC ACG GAG GTC CAC TTC CGC AGC ATC Phe Met Vai Ala Phe Phe Lys Ala Thr Glu Vai His Phe Arg Ser Ile 280 285 290 CGG TCC ACG GGG AGC AAA CAG CGC AGC CAG AAC CGC TCC AAG ACG CCC Arg Ser Thr Gly Ser Lys Gin Arg Ser Gin Asn Arg Ser Lvs Thr Pro 295 300 305 AAG AAC CAG GAA GCC CTG CGG ATG GCC AAC GTG GCA GAG AAC AGC AGC Lys Asn Gin Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Vai Ala Glu Asn Ser Ser 310 315 320 AGC GAC CAG AGG CAG GCC TGT AAG AAG CAC GAG CTG TAT GTC AGC TTC Ser Asp Gin Arg Gin Ala Cvs Lys Lys His Glu Leu Tvr Vai Ser Phe 32S 330 335 ' CGA GAC CTG GGC TGG CAG GAC TGG ATC ATC GCG CCT GAA GGC TAC GCC Axg Asp Leu Gly Trp Gin Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala 340 34S 350 355 GCC TAC TAC TGT GAG GGG GAG TGT GCC TTC CCT CTG AAC TCC TAC ATG Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met 360 365 370

AAC GCC ACC AAC CAC GCC ATC GTG CAG ACG CTG GTC CAC TTC ATC AAC 185

Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Vai Gin Thr Leu Vai His phe lie Asn 375 380 385

CCG GAA ACG GTG CCC AAG CCC TGC TGT GCG CCC ACG CAG CTC AAT GCC

Pro Giu Thr Vai Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gin Leu Asn Ala 390 395 400

ATC TCC GTC CTC TAC TTC GAT GAC AGC TCC AAC GTC ATC CTG AAG AAA

Ile Ser Vai Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Vai Ile Leu Lys Lvs 405 410 415 TAC AGA AAC ATG GTG GTC CGG GCC TGT GGC TGC CAC TAGCTCCTCC Tvr Arçr Asn Ket Vai Vai Arg Ala Cys Gly Cys His 420 425 430

GAGAA?TCAG ACCCTT7GGG GCCAAGTTTT TCTGGATCCT CCATTGCTCG CCTTGGCCAG GAACCAGCAG ACCAACTGCC TTTTGTGAGA CCTTCCCCTC CCTATCCCCA ACTTTAAAGG TGTGAGAGTA TTAGGAAACA TGAGCAGCAT ATGGCTTTTG ATCA.GTTTTT CAGTGGCAGC ATCCAATGAA CAAGATCCTA CAAGCTGTGC A.GGCAAAACC TAGCAGGAAA AAAAAACAAC GCATAAAGAA AAATGGCCGG GCCAGGTCAT TGGCTGGGAA GTCTCAGCCA TGCACGGACT CGTTTCCAGA GGTAATTATG AGCGCCTACC AGCCAGGCCA CCCAGCCGTG GGA.GGAAGGG GGCGTGGCAA GGGGTGGGCA CATTGGTGTC TGTGCGAAAG GAAAATTGAC CCGGAAGTTC CTGTAATAAA TGTCACAATA aaacgaatga atgaaaaaaa aaaaaaaaaa a (iii) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2 (ív) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 431 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2 186

Met i His Val Arg Ser 5 Leu Arg Ala Ala Ala 10 Pro His Ser phe Val 15 Ala Leu Trp Ala Pro 20 Leu Phe Leu Leu Arc 25 Ser Al a Leu Ala ASP 30 Phe Ser Leu Asp Asn 35 Glu Val His Ser Ser 40 Phe Ile His Arg Arg 45 Leu A_rg Ser Gin Glu 50 Arg Arg Glu Met Gin 55 Arg Glu Ile Leu Ser 60 Ile Leu Gly Leu Peo 65 His Arc Pro Arg Pro 70 His Leu Gin Gly Lys 7 5 His Asn ser Ala Pro B0 Met Phe Met Leu Asp 85 Leu Tyr Asn Ala Mec 90 Al a Val Glu Glu Gly 95 Gly Gly Pro Gly Ciy 100 Gin Gly Phe Ser T vr 1Ò5 Pro Tyr Lys Al a Val 1X0 Phe Ser Thr Gin Gly 115 Pro Pro Leu Ala Ser 120 Leu Gin Asp Sar His 12S Phe Leu Thr Asp Ala 130 Asp Met Val Met Ser 135 Phe Val Asn Leu Val 140 Glu His Asp Lys Glu 145 Phe Phe His Pro Ara 15C Tyr His His Arg Glu 155 Phe Arg Phe Asp Leu 160 Ser Lys Ile Pro Glu 165 Gly Glu Ala Val Thr 170 Ala Ala Glu Phe Arg 175 Ile Tyr Lys Asp Tyr 180 Ile Ara Glu Arg Phe 185 Asp Asn Glu Thr phe 190 Arg Ile Ser Val Tyr 195 Gin Val Leu Gin Glu 200 His Leu Gly Arg Glu 205 ser Asp Leu Phe Leu Leu Asp Ser Arg Thr Leu Trp Ala Ser Glu Glu Gly Trp Leu 210 215 220 Vai 225 Phe Asp Ile Thr Ala 230 Thr Ser Asn His Tro 23‘S Val Val Asn Pro Arg 240 His Asn Leu G1 y Leu 245 Gin Leu Ser Val Glu 250. Thr Leu Asp Gly Gin 255 Ser Xle Asn Pro Lys 2S0 Leu Ala Gly Leu Ile 265 Gl y Arg His Gl y Pro 270 Gin Asn Lys Gin Pro 275 Phe Met Val Ala Phe 280 Phe Lys Ala Thr Glu 2 8 5 Val His Phe Arg Ser 290 Ile Arg Ser Thr Gly 295 Ser Lys Gin Arg Ser 300 Gin Asn Arg Ser Lys 305 Thr Pro Lys Asn Gin 310 Glu Al a Leu Arg Met 315 Ala Asn Val Ala Glu 320 Asn Ser Ser' Ser Aso 325 Gin Arg Gin Al a Cys 330 Lys Lys His Glu Leu 335 Tyr Vai Ser Phe Arg 340 Asp Leu Gly Trp Gin 345 Asp Trp Ile Ile Ala 350 Pro Glu Gly Tyr Ala 355 «1 a Tyr Tyr Cys Glu 360 Gly Glu Cys Al a Phe 3 65 Pro Leu Asn ser Tyr 370 Me t Asn Ala Thr Asn 375 His Ala Ile Val Gin 380 Thr Leu Val His Phe 385 Ile. Asn Pro Glu Thr 390 Val Pro Lys Pro Cys 395 Cys Al a Pro Thr C-ln 40C Leu Asn Ala Ile Ser 405 Val Leu Tyr Phe Asp 410 Asp Ser Ser Asn Val 415 Ile Leu Lys Lys T vr 420 Arg Asn Met Vai Val 425 Arg Ala Cys Gly Cys 430 His 187 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (D) COMPRIMENTO: 102 aminoácidos (E) TIPO: aminoácido (F) TIPO DE CADEIA: (G) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Proteína (B) Localização: 1..102 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/designação="OPX" /nota="em que cada Xaa é seleccionado independentemente a partir de um grupo de um ou mais aminoácidos especificados como definido na especificação" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

Cys Xaa Xaa His GIu Leu Tyr Vai Xaa Phe Xaa Asd Leu Gly Trp Xaa 1 S 10 ‘ 15

Asp Trp Xaa Ile Ala Pro Xaa Gly Tyr Xaa Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly 20 25 30

Glu Cys Xaa Phe Pro Leu Xaa Ser Xaa Met Asn Ala Thr Asn His Ala 35 40 45

Ile Xaa Gin Xaa Leu Vai His Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Vai Pro Lys 50 55 só

Xaa Cys Cys Ala Pro Thr Xaa Leu Xaa Ala Xaa Ser Vai Leu Tvr Xaa 65 70 7s * BO

Asp Xaa Ser Xaa Asn Vai Xaa Leu Xaa Lys Xaa Axq Asn Met Vai Vai 8S 90 ‘ 95

Xaa Ala Cys Gly Cys His 100 188 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (H) COMPRIMENTO: 97 aminoácidos (I) TIPO: aminoácido (J) TIPO DE CADEIA: (K) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Proteína (B) Localização: 1..97 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/designação="Sequência genérica-7" /nota="em que cada Xaa é seleccionado independentemente a partir de um grupo de um ou mais aminoácidos especificados como definido na especificação" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4:

Leu 1 Xaa Xaa Xaa Phe 5 Xaa Xaa Xaa Gly Trp 10' Xaa Xaa X-S A Xaa Xaa 15 Xaa Pro Xaa Xaa Xaa 20 Xaa Ala Xaa Tyr Cvs 25 Xaa Gly Xaa cys Xaa 30 Xaa Pro Xaa Xaa Xaa 3 S Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 40 Asn His Ala Xaa Xaa 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 55 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 60 Cys Cys Xaa Pro Xaa 65 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 70 Xaa Xaa Leu Xaa Xaa 75 Xaa X SLêL Xaa Xaa Xaa 80 Vai Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa MeC Xaa Vai Xaa Xaa Cys Xaa Cys 85 90 ' 95

Xaa (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (L) COMPRIMENTO: 102 aminoácidos 189 (M) TIPO: arainoácido (N) TIPO DE CADEIA: (O) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Proteína (B) Localização: 1..102 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/designação="Sequência genérica-8" /nota="em que cada Xaa é seleccionado independentemente a partir de um grupo de um ou mais aminoácidos especificados como definido na especificação" (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5:

Cys 1 Xaa Xaa Xaa Xaa 5 Leu Xaa Xaa Xaa Phe 10 Xaa Xaa Xaa Giy Tra 15' Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 Xaa Pro KâH Xaa Xaa 25 Xaa Ala Xaa T yr cys 30 Xaa Gly Xaa Cys Xaa 35 Xaa Pro Xaa Xaa Xaa 40 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 45 Asn His Ala Xaa Xaa so- Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 5 5 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 6 5 Cys Cys Xaa Pro Xaa 70 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 75 Xaa Xaa Leu Xaa Xaa 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Vai Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ket Xaa Vai 90

Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa 100 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 190 (P) COMPRIMENTO: 97 aminoácidos (Q) TIPO: aminoácido (R) TIPO DE CADEIA: simples (S) TOPOLOGIA: linear (ii> TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Proteína (B) Localização: 1..97 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/designação="Sequência genérica-9" /nota="em que cada Xaa é seleccionado independentemente a partir de um grupo de um ou mais aminoácidos especificados como definido na especificação" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

Xaa 1 Xaa Xaa Xaa Xaa 5 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 10 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 Xaa Pro Xaa Xaa Xaa 20 Xaa Xaa Xaa Xaa C vs 25 Xaa Glv Xaa Cys Xaa 30 Xaa Xfla Xaa Xaa Xaa 35 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 40 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 Xaa Xaa Xaa Xa a Xaa 55 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 60 Xaa Cys Xaa Pro Xaa 65 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 70 Xaa Xaa Leu Xaa Xaa 75 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 90 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa 95 Cys (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (T) COMPRIMENTO: 102 aminoácidos (U) TIPO: aminoácido (V) TIPO DE CADEIA: simples (W) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Proteína (B) Localização: 1..102 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/designação="Sequência genérica-10" /nota="em que cada Xaa é seleccionado independentemente a partir de um grupo de um ou mais aminoácidos especificados como definido na especificação" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7:

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 5 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 Xaa Pro Xaa Xaa XcLâ Cy3 Xaa 35 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 40 Xaa Xaa 50 Xaa Xa a Xaa Xaa Xââ 55 Xaa Xaa 65 Xaa Cys Xaa P ro Xaa 70 Xaa Xaa Xãé3 Xaa Xaa Xaa Xaa 85 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa 100 Cys Xaa

Xaa Xaa 10 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 Xaa Xaa 25 Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 30 Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 75 Xaa Xaa Leu Xaa Xaa 80 Xaa Xaa 90 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 95 Xaa (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (X) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (Y) TIPO: aminoácido (Z) TIPO DE CADEIA: (AA) TOPOLOGIA: linear 192 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Proteína (B) Localização: 1..5 (D) OUTRA INFORMAÇÃO:/nota="em que cada Xaa é seleccionado independentemente a partir de um grupo de um ou mais aminoácidos especificados como definido na especificação" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8:

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (BB) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (CC) TIPO: aminoácido (DD) TIPO DE CADEIA: (EE) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Proteína (B) Localização: 1..5 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota="em que cada Xaa é seleccionado independentemente a partir de um grupo de um ou mais aminoácidos especificados como definido na especificação" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5

Lisboa, 30 de Novembro de 2006

Claims

1 Reivindicações 1. Dispositivo para induzir a formação local de osso ou cartilagem compreendendo: (a) proteína osteogénica; (b) matriz derivada de um material que não é um polímero sintético; e (c) um agente ligante seleccionado a partir do grupo que consiste em carboximetilcelulose e seu sal de sódio, em que o agente de ligação possui uma viscosidade de cerca de 10-200 cP e um grau de substituição de 0,65-0,90.

2. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita proteína osteogénica ser seleccionada a partir do grupo que consiste em: OP-1, OP-2, OP-3, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP9, BMP10, BMP11, BMP12, BMP15, BMP16, DPP, Vgl, Vgr, proteína 60 A, GDF1, GDF3, GDF5, GDF6, GDF7, GDF8, GDF9, GDF10, GDF11, e variantes de aminoácidos de cada um dos anteriores.

3. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita proteína osteogénica ser seleccionada a partir do grupo que consiste em: OP-1, OP-2, BMP2, BMP4, BMP5, BMP6 e variantes de sequências de aminoácidos de cada um dos anteriores.

4. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita proteína osteogénica compreender uma sequência de aminoácidos. 2

5. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita proteína osteogénica ser OP-1.

6. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito dispositivo compreender pelo menos duas proteínas osteogénicas diferentes.

7. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita matriz ser seleccionada a partir do grupo que consiste em colagénio, osso desmineralizado, apatites, hídróxiapatites, fosfatos tricálcicos e suas misturas.

8. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita matriz ser de colagénio.

9. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita matriz ser fosfato β-tricálcico.

10. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito dispositivo compreender pelo menos dois diferentes materiais de matriz.

11. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda um agente molhante.

12. Dispositivo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o dito agente molhante ser uma solução salina.

13. Dispositivo para induzir a formação local de osso ou cartilagem compreendendo: aproximadamente 1,25 mg de OP-1 e pelo menos aproximadamente 180 mg de carboximetilcelulose por 1000 mg de matriz de colagénio, em que a dita 3 carboximetilcelulose possui um viscosidade de cerca de 10-200 cP e um grau de substituição de 0,65-0,90.

14. Di spositivo de acordo com a reivindicação 13, compreendendo pelo menos 2,5 mg de OP-1 por 1000 mg de matriz de colagénio.

15. Dispositivo de acordo com a reivindicação 13 ou 14, compreendendo aproximadamente pelo menos 200 mg de carboximetilcelulose por 1000 mg de matriz de colagénio.

16. Dispositivo para induzir formação local de cartilagem ou de osso, compreendendo uma proteína osteogénica e um suporte, caracterizado por o dito suporte compreender (a) uma parte (p/p) de agente ligante seleccionado a partir do grupo que consiste em carboximetilcelulose e o seu sal de sódio, caracterizado por o agente ligante possuir uma viscosidade de cerca de 10-200 cP e um grau de substituição de 0,65-0,90; e (b) 50 ou menos partes (p/p) de matriz seleccionada a partir do grupo que consiste em colagénio, osso desmineralizado, apatites, hidróxiapatites, fosfatos tricálcicos e suas misturas. a reivindicação 16, compreender uma parte (p/p) de matriz.

17. Dispositivo de acordo com caracterizado por o dito suporte (p/p) de agente ligante e 25 partes

18. Dispositivo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o dito suporte compreender uma parte (p/p) de agente ligante e 10 partes (p/p) de matriz. 4

19. Dispositivo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o dito suporte compreender uma parte (p/p) de agente ligante e cinco partes (p/p) de matriz.

20. Dispositivo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o dito suporte compreender menos do que 5 partes (p/p) de matriz.

21. Dispositivo para induzir formação local de cartilagem ou de osso, compreendendo uma proteína osteogénica e um suporte, caracterizado por o dito suporte compreender (a) 10 ou menos partes (p/p) de agente ligante seleccionado a partir do grupo que consiste em carboximetilcelulose e o seu sal de sódio, caracterizado por o agente ligante possuir uma viscosidade de cerca de 10-200 cP e um grau de substituição de 0,65-0,90; e (b) uma parte (p/p) de matriz seleccionada a partir do grupo que consiste em colagénio, osso desmineralizado, apatites, hidróxiapatites, fosfatos tricálcicos e suas misturas.

22. Dispositivo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o dito suporte compreender menos do que 10 partes (p/p) de agente ligante.

23. Dispositivo de acordo com a reivindicação 14, 17 ou 22 compreendendo ainda uma solução salina.

24. Uso de uma proteína osteogénica, matriz derivada de um material que não é um polímero sintético e de um agente ligante seleccionado a partir de um grupo que consiste em carboximetilcelulose e o seu sal de sódio, caracterizado por o agente ligante possuir uma viscosidade de cerca de 5 10-200 cP e um grau de substituição de 0,65-0, 90, para a preparação de um dispositivo farmacêutico para induzir a formação local de osso e cartilagem para reparar o osso, cartilagem ou local de defeito osteocondral.

25. Uso de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por a formação local de osso ser formação de osso endocondral.

26. Uso de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por a formação local de cartilagem ser formação de cartilagem articular.

27. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, caracterizado por o dito local de defeito ser seleccionado a partir do grupo que consiste em: defeito de tamanho critico, defeito de tamanho não crítico, defeito segmentai em locais que não são de união, fractura em locais que não são de união, fractura, defeito osteocondral, e defeito subcondral.

28. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27, caracterizado por o volume da formulação farmacêutica fornecida ao local do defeito ser suficiente para encher o defeito.

29. Dispositivo para induzir a formação local de osso ou cartilagem, compreendendo: (a) OP-1; (b) Matriz de colagénio; e (c ) Carboxímetilcelulose possuindo uma viscosidade de cerca de 10-200 cP e um grau de substituição de 0,65-0,90. 6

30. Kit para induzir formação local de osso ou cartilagem utilizando o dispositivo da reivindicação 1, compreendendo o kit: (a) um primeiro receptáculo adaptado para albergar uma proteína osteogénica e um material de matriz; e (b) um segundo receptáculo adaptado para albergar um agente ligante, caracterizado por a proteína osteogénica e o material de matriz serem fornecidos no primeiro receptáculo, e o agente ligante ser seleccionado a partir do grupo que consiste em carboximetilcelulose e o seu sal de sódio e possuir uma viscosidade de cerca de 10-200cP e um grau de substituição de 0,65-0,90 e ser fornecido no segundo receptáculo.

31. Kit de acordo com a reivindicação 30 compreendendo ainda um terceiro receptáculo adaptado para albergar um agente molhante.

32. Kit de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por o dito primeiro receptáculo e o dito segundo receptáculo serem o mesmo. Lisboa, 30 de Novembro de 2006