ES2273412T3 - Dispositivos osteogenicos y sus metodos de uso para reparar huesos. - Google Patents
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Abstract
Se describen dispositivos osteogénicos mejorados y procedimiento de utilización para reparación de defectos en hueso y cartílago. Los dispositivos y procedimientos promueven la formación acelerada de tejido de reparación con estabilidad potenciada utilizando menos proteína osteogénica que dispositivos anteriores en la técnica. Defectos susceptibles de ser reparados por la presente invención incluyen, aunque no se limitan sólo a ellos, defectos de tamaño crítico, defectos de tamaño no crítico, fracturas no consolidadas, fracturas, defectos osteocóndricos, defectos subcóndricos y defectos como resultado de enfermedades degenerativas como la osteocondritis disecante.
Description
Dispositivos osteogénicos y sus métodos de uso
para reparar huesos.
La invención dada a conocer en la presente
memoria se refiere a materiales y usos para reparar defectos óseos y
cartilaginosos utilizando proteínas osteogénicas.
Se ha identificado ahora una clase de proteínas
que es competente para actuar como verdaderos morfógenos tisulares
condrogénicos. Es decir, estas proteínas son capaces, por sí mismas,
de inducir la proliferación y diferenciación de células progenitoras
en tejido óseo, cartilaginoso, tendinoso y/o ligamentoso funcional.
Esta clase de proteínas, designadas en la presente memoria como
"proteínas osteogénicas" o "proteínas morfogénicas" o
"morfógenos", incluye miembros de la familia de proteínas
morfogenéticas óseas (BMP) que se identificaron inicialmente por su
capacidad de inducir morfogénesis ósea ectópica endocondral. Las
proteínas osteogénicas se clasifican generalmente en la técnica como
un subgrupo de la superfamilia de TGF-\beta de
factores de crecimiento (Hogan (1996) Genes & Development
10: 1580-1594). Los miembros de la familia
morfogénica de proteínas incluyen la proteína osteogénica 1 de
mamífero (OP-1, también conocida como
BMP-7, y el homólogo de Drosophila 60A), la
proteína osteogénica 2 (OP-2, también conocida como
BMP-8), la proteína osteogénica 3
(OP-3), BMP-2 (también conocida como
BMP-2A o CBMP-2A y el homólogo de
Drosophila DPP), BMP-3, BMP-4
(también conocida como BMP-2B o
CBMP-2B), BMP-5,
BMP-6 y su homólogo de múrido Vgr-1,
BMP-9, BMP-10,
BMP-11, BMP-12, GDF3 (también
conocida como Vgr2), GDF8, GDF9, GDF10, GDF11, GDF12,
BMP-13, BMP-14,
BMP-15, GDF-5 (también conocida como
CDMP-1 o MP52), GDF-6 (también
conocida como CDMP-2), GDF-7
(también conocida como CDMP-3), el homólogo de
Xenopus Vgl y NODAL, UNIVIN, SCREW, ADMP y NEURAL. Los
miembros de esta familia codifican cadenas polipeptídicas secretadas
que comparten rasgos estructurales comunes, incluyendo el
procesamiento a partir de un precursor "de forma pro",
proporcionando una cadena polipeptídica madura competente para
dimerizar y que contiene un dominio activo
carboxi-terminal de aproximadamente
97-106 aminoácidos. Todos los miembros comparten un
patrón conservado de cisteínas en este dominio, y la forma activa de
estas proteínas puede ser un homodímero unido por disulfuro de un
solo miembro de la familia o un heterodímero de dos miembros
diferentes (véanse, por ejemplo, Massague (1990) Annu. Rev. Cell
Biol., 6: 597; Sampath et al., (1990), J. Biol.
Chem. 265: 13198). Véanse también los documentos U.S. 5.011.691,
U.S. 5.266.683, Ozkaynak et al. (1990), EMBO J. 9:
2085-2093, Wharton et al., (1991) PNAS
88, 9214-9218), (Ozkaynak (1992) J. Biol.
Chem. 267: 25220-25227 y U.S. 5.266.683);
(Celeste et al., (1991) PNAS 87:
9843-9847); (Lyons et al. (1989), PNAS
86: 4554-4558). Estas descripciones describen las
secuencias aminoacídicas y de ADN, así como las características
químicas y físicas, de estas proteínas osteogénicas. Véanse también
Wozney et al., (1988) Science 242:
1528-1534); BMP-9 (documento WO
93/00432, publicado el 7 de enero de 1993); DPP (Padgett et
al., (1987) Nature 325: 81-84; y
Vg-1 (Weeks (1987) Cell 51:
861-867).
Por tanto, ahora se han identificado, aislado y
clonado proteínas osteogénicas verdaderas capaces de inducir la
cascada anteriormente descrita de eventos morfogénicos resultante en
la formación de hueso endocondral. Tanto de origen natural como
preparados sintéticamente, estos factores osteogénicos, cuando se
implantan en un mamífero asociados con una matriz o sustrato que
permita la unión, proliferación y diferenciación de células
progenitoras migratorias, pueden inducir el reclutamiento de células
progenitoras accesibles y estimular su proliferación, induciendo así
la diferenciación en condrocitos y osteoblastos, e induciendo
adicionalmente la diferenciación de cartílago intermedio, la
vascularización, la formación de hueso, la remodelación y,
finalmente, la diferenciación medular. Además, numerosos
profesionales han demostrado la capacidad de estas proteínas
osteogénicas, cuando se mezclan con materiales de matriz de fuente
natural tales como colágeno o materiales de matriz poliméricos
preparados sintéticamente, de inducir la formación de hueso,
incluyendo la formación de hueso endocondral, en condiciones en las
que de otro modo no ocurriría un verdadero reemplazo óseo. Por
ejemplo, cuando se combinan con un material de matriz, estas
proteínas osteogénicas inducen la formación de hueso nuevo en
defectos óseos segmentarios grandes, fusiones vertebrales y
fracturas.
Las matrices de fuente natural, tales como
colágeno, pueden reemplazarse por materiales inertes tales como
plástico, pero el plástico no es un sustituto adecuado ya que no se
reabsorbe y está limitado a aplicaciones que requieran
configuraciones geométricas simples. Hasta la fecha, se han
utilizado también polímeros y copolímeros biodegradables como
matrices mezclados con proteínas osteogénicas para reparar defectos
sin unión. Aunque dichas matrices pueden superar algunas de las
insuficiencias anteriormente descritas, el uso de estas matrices
exige la determinación y el control de rasgos tales como química
polimérica, tamaño de partícula, biocompatibilidad y otros
particulares críticos para la operabilidad. Por ejemplo, deben
formarse poros en el polímero de una manera que asegure la adsorción
de la proteína en la matriz y la biodegraduación de la matriz. Por
lo tanto, antes del uso de la matriz polimérica, es necesario llevar
a cabo la etapa adicional de tratar el polímero para inducir la
formación de poros del tamaño apropiado.
Los dispositivos osteogénicos estándar, que
incluyen colágeno o matrices poliméricas mezclados con proteína
osteogénica, se prestan menos fácilmente a manipulación durante la
cirugía. Los dispositivos osteogénicos estándar tienen a menudo una
consistencia seca arenosa y pueden retirarse por lavado siempre que
el sitio de defecto se irriga durante cirugía, y/o por sangre y/u
otros fluidos que infiltran el sitio después de la cirugía. La
adición de ciertos materiales a estas composiciones puede ayudar a
proporcionar una composición más manejable para tratar durante la
cirugía. Las patentes de EE.UU. nº 5.385.887, 5.520.923, 5.597.897 y
la publicación internacional WO 95/24210 describen composiciones que
contienen una matriz polimérica sintética, proteína osteogénica y
un vehículo con dicho fin. Dichas composiciones se han limitado, sin
embargo, a matrices poliméricas sintéticas debido al deseo de
superar ciertas supuestas reacciones inmunológicas adversas que se
contempla que están asociadas a otros tipos de matrices,
especialmente matrices derivadas biológicamente, incluyendo algunas
formas de colágeno. Por lo tanto, estas composiciones sufren los
mismos problemas de practicabilidad para optimizar la química de
polímeros, el tamaño de partícula, la biocompatibilidad, etc.,
descritos anteriormente. El documento WO 94/13653 describe
formulaciones para inducir el crecimiento óseo que comprenden
TGF-\beta, TCP y un vehículo tal como colágeno,
CMC y derivados de celulosa. El documento WO 94/20133 describe
sellantes de tejido que comprenden cola de fibrina, hueso
desmineralizado y BMP. Sigue existiendo la necesidad de
composiciones y métodos para reparar defectos óseos y cartilaginosos
que proporcionen una mayor facilidad de tratamiento durante la
cirugía y que no se basen en matrices poliméricas sintéticas. Sigue
existiendo también la necesidad de métodos y composiciones que
puedan potenciar la velocidad y calidad de formación de hueso y
cartílago nuevos.
En consecuencia, es un objeto de la presente
invención proporcionar dispositivos osteogénicos mejorados y métodos
de uso de los mismos para reparar defectos óseos, defectos
cartilaginosos y/o defectos osteocondrales que: sean más fáciles de
manipular durante la cirugía, eviten los problemas de la química de
polímeros, el tamaño de partícula y la biocompatibilidad asociados
al uso de matrices poliméricas sintéticas; y que permitan la
formación acelerada de hueso y una reparación cartilaginosa más
estable utilizando menores dosis de proteína osteogénica que las que
pueden conseguirse utilizando dispositivos y métodos de la técnica.
Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar
dispositivos osteogénicos y métodos de uso de los mismos para
reparar defectos sin curación y sin unión y para promover la
reparación cartilaginosa articular en defectos condrales u
osteocondrales. Es aún otro objeto de la presente invención
proporcionar dispositivos y usos de dispositivos para la reparación
de defectos óseos y cartilaginosos sin intervención quirúrgica.
Estos y otros objetos, junto con las ventajas y rasgos de la
invención dados a conocer en la presente memoria, resultarán
manifiestos a partir de la descripción, dibujos y reivindicaciones
siguientes.
La presente invención está basada en el
descubrimiento de que mezclar proteína osteogénica y una matriz no
sintética no polimérica tal como colágeno o
\beta-fosfato de tricalcio
(\beta-TCP) con un agente aglutinante seleccionado
del grupo consistente en carboximetilcelulosa y una sal de sodio de
la misma, en el que el agente aglutinante tiene una viscosidad de
aproximadamente 0,01-0,2 Pa.s y un grado de
sustitución de 0,65-0,90, proporciona un dispositivo
osteogénico mejorado con capacidades de reparación de hueso y
cartílago mejoradas. No sólo dichos dispositivos mejorados pueden
acelerar la velocidad de reparación, sino que estos dispositivos
pueden promover también la formación de tejido de reparación estable
de alta calidad, particularmente tejido cartilaginoso.
Adicionalmente, los beneficios anteriores pueden conseguirse
utilizando significativamente menos proteína que la necesaria para
dispositivos osteogénicos estándar. Aunque sin desear quedar ligado
a teoría alguna, las propiedades inesperadas anteriormente citadas
pueden atribuirse probablemente a una interacción complementaria o
sinérgica entre la matriz no polimérica y dicho agente aglutinante.
En vista de las tecnologías ortopédica y reconstructiva existentes,
estos descubrimientos son inesperados y no se habían apreciado hasta
el momento.
La invención proporciona, en un aspecto, un
nuevo dispositivo para inducir la formación de hueso y cartílago
local que comprende proteína osteogénica, matriz derivada de
material no sintético no polimérico y agente aglutinante
seleccionado del grupo consistente en carboximetilcelulosa y una sal
de sodio de la misma, en el que el agente aglutinante tiene una
viscosidad de aproximadamente 0,01-0,2 Pa.s y un
grado de sustitución de 0,65-0,90. Como se contempla
en la presente memoria, el dispositivo comprende preferiblemente
proteínas osteogénicas tales como, pero sin limitación,
OP-1, OP-2, BMP-2,
BMP-4, BMP-5 y
BMP-6. Una proteína osteogénica actualmente
preferida es OP-1. Como se utiliza en la presente
memoria, los términos "morfógeno", "morfógeno óseo",
"proteína morfogénica ósea", "BMP", "proteína
osteogénica" y "factor osteogénico" abarcan la clase de
proteínas tipificada por la proteína osteogénica 1 humana
(hOP-1). Las secuencias nucleotídica y aminoacídica
de hOP-1 se proporcionan en las SEC ID Nº 1 y 2,
respectivamente. Para facilitar la descripción,
hOP-1 se denomina a continuación en la presente
memoria como una proteína osteogénica representativa. Sin embargo,
se apreciará por el experto en la técnica que la
OP-1 es simplemente una representante de la subclase
TGF-\beta de morfógenos tisulares verdaderos
competentes para actuar como proteínas osteogénicas, y no se
pretende que limite la descripción. Otras proteínas conocidas, y
útiles, incluyen BMP-2, BMP-3,
BMP-3b, BMP-4,
BMP-5, BMP-6, BMP-8,
BMP-9, BMP-10,
BMP-11, BMP-12,
BMP-13, BMP-15,
GDF-1, GDF-2, GDF-3,
GDF-5, GDF-6, GDF-7,
GDF-8, GDF-9,
GDF-10, GDF-11,
GDF-12, NODAL, UNIVIN, SCREW, ADMP, NEURAL y
variantes aminoacídicas osteogénicamente activas de las mismas. En
una realización preferida, las proteínas útiles en la invención
incluyen variantes de especie biológicamente activas de cualquiera
de estas proteínas, incluyendo variantes de secuencia aminoacídica
conservativa, proteínas codificadas por variantes de secuencia
nucleotídica degenerada y proteínas osteogénicamente activas que
comparten el esqueleto de siete cisteínas conservado como se define
en la presente memoria y codificado por una secuencia de ADN
competente para hibridar con una secuencia de ADN que codifica una
proteína osteogénica dada a conocer en la presente memoria
incluyendo, sin limitación, OP-1,
BMP-5, BMP-6, BMP-2,
BMP-4 o GDF-5, GDF-6
o GDF-7. En otra realización, las proteínas
osteogénicas útiles incluyen aquellas que comparten el dominio de
siete cisteínas conservado y que comparten al menos un 70% de
homología de secuencia aminoacídica (similitud) en el dominio activo
C-terminal, como se define en la presente memoria.
En aún otra realización, las proteínas osteogénicas de la invención
pueden definirse como proteínas osteogénicamente activas que tienen
una cualquiera de las secuencias genéricas definidas en la presente
memoria, incluyendo OPX (SEC ID Nº 3) y las secuencias genéricas 7 y
8, o las secuencias genéricas 9 y 10.
La OPX da cabida a las homologías entre las
diversas especies de proteínas OP-1 y
OP-2 osteogénicas, y se describe por la secuencia
aminoacídica presentada en la presente memoria a continuación y en
la SEC ID Nº 3. La secuencia genérica 9 es una secuencia de 96
aminoácidos que contiene el esqueleto de 6 cisteínas definido por
hOP-1 (residuos 335-431 de la SEC ID
Nº 2) y en la que los residuos restantes dan cabida a las homologías
de OP-1, OP-2, OP-3,
BMP-2, BMP-3, BMP-4,
BMP-5, BMP-6, BMP-8,
BMP-9, BMP-10,
BMP-11, BMP-15,
GDF-1, GDF-3, GDF-5,
GDF-6, GDF-7, GDF-8,
GDF-9, GDF-10,
GDF-11, UNIVIN, NODAL, DORSALIN, NURAL, SCREW y
ADMP. Es decir, cada uno de los residuos no de cisteína se
selecciona independientemente del correspondiente residuo de este
grupo enumerado de proteínas. La secuencia genérica 9 es una
secuencia de 102 aminoácidos que incluye una secuencia de 5
aminoácidos añadida a la terminación N de la secuencia genérica 9 y
define el esqueleto de siete cisteínas de hOP-1
(330-431, SEC ID Nº 2). Las secuencias genéricas 7 y
8 son secuencias de 96 y 102 aminoácidos, respectivamente, que
contienen el esqueleto de 6 cisteínas (secuencia genérica 7) o el
esqueleto de 7 cisteínas (secuencia genérica 8) definidos por
hOP-1, y en las que los residuos no de cisteína
restantes dan cabida a las homologías de OP-1,
OP-2, OP-3, BMP2, BMP3, BMP4, 60A,
DPP, Vg1, BMPS, BMP6, Vgr-I y
GDF-1.
Como se enseña a continuación, las matrices
preferidas son materiales no sintéticos no poliméricos y pueden ser
de fuente natural o derivados de materiales biológicos. Los ejemplos
de matrices preferidas incluyen, pero sin limitación, colágeno,
hueso desmineralizado y \beta-TCP. Una matriz
actualmente preferida es el colágeno. Otra matriz actualmente
preferida es el \beta-TCP. Por tanto, los
dispositivos de la presente invención no comprenden como componente
primario matrices poliméricas sintéticas tales como homopolímeros o
copolímeros de ácido \alpha-hidroxiacético y/o
ácido \alpha-hidroxipropiónico, incluyendo mezclas
racémicas de los mismos.
Con respecto a los agentes aglutinantes, los
presentes dispositivos comprenden agentes útiles como agentes
formadores de gel, aumentadores de la viscosidad, de suspensión y/o
de emulsión, en los que dicho agente se selecciona del grupo
consistente en carboximetilcelulosa y una sal de sodio de la misma,
en los que el agente aglutinante tiene una viscosidad de
aproximadamente 0,01-0,2 Pa.s y un grado de
sustitución de 0,65-0,90. Dicho agente aglutinante
es alquilcelulosa, especialmente metilcelulosas tales como
carboximetilcelulosa. Otros agentes aglutinantes que se describen en
la presente memoria pueden ser otras gomas de celulosa, alginato de
sodio, dextranos y gelatina en polvo. Otro agente aglutinante
descrito en la presente memoria puede ser cola de fibrina.
Como se utiliza en la presente memoria, el
término "cola de fibrina" significa una composición que
comprende fibrinógeno y trombina de mamífero. En ciertas
realizaciones, los dispositivos mejorados de la presente invención
comprenden adicionalmente un agente humectante tal como, pero sin
limitación, solución salina u otras soluciones fisiológicas
acuosas.
Los dispositivos mejorados de la presente
invención pueden asumir una variedad de configuraciones. La
configuración dependerá en parte del tipo de agente aglutinante y
agente humectante empleados. Como se da a conocer en la presente
memoria, una realización actualmente preferida puede tener una
consistencia de masilla. Esta configuración particular es
especialmente adecuada para tratar defectos abiertos según los
métodos de la presente invención. Otra realización actualmente
preferida del dispositivo osteogénico mejorado puede tener una
consistencia fluida viscosa. Esta configuración particular es
especialmente adecuada para tratar defectos cerrados según los
métodos dados a conocer en la presente memoria. Dependiendo de la
configuración del dispositivo mejorado, la provisión a un sitio de
defecto puede conseguirse mediante una variedad de modos de
suministro. Por ejemplo, puede compactarse una masilla en y/o
alrededor del defecto o extruirse en forma de una perla a partir de
un aparato de gran calibre. Como alternativa, puede inyectarse un
líquido viscoso en y/o alrededor del defecto, o como alternativa
cepillarse y/o pintarse sobre
la(s) superficie(s) del defecto. Se ejemplifica en la presente memoria la explotación de la variedad de estas posibles realizaciones para reparar defectos óseos y cartilaginosos.
la(s) superficie(s) del defecto. Se ejemplifica en la presente memoria la explotación de la variedad de estas posibles realizaciones para reparar defectos óseos y cartilaginosos.
Entre las características del agente aglutinante
seleccionado del grupo consistente en carboximetilcelulosa y una sal
de sodio de la misma, en el que el agente aglutinante tiene una
viscosidad de aproximadamente 0,01-0,2 Pa.s y un
grado de sustitución de 0,65-0,90, está la capacidad
de hacer al dispositivo:
plegable, conformable y/o maleable; inyectable;
adherente a hueso, cartílago, músculo y otros tejidos; resistente a
disgregración tras lavado y/o irrigación durante cirugía; y
resistente al desalojo durante cirugía, sutura y después de la
operación, por nombrar sólo unas pocas. Adicionalmente, en ciertas
realizaciones preferidas, dicho agente aglutinante puede conseguir
los rasgos y beneficios anteriormente citados cuando está presente
en bajas proporciones.
Por ejemplo, un dispositivo mejorado actualmente preferido comprende aproximadamente 1 parte de agente aglutinante y aproximadamente 5 partes de matriz. Ciertas otras realizaciones preferidas comprenden aproximadamente 1 parte de agente aglutinante y aproximadamente 10 partes de matriz, mientras que aún otras comprenden aproximadamente 1 parte de agente aglutinante y aproximadamente 25 partes de matriz. Otro dispositivo actualmente preferido comprende aproximadamente 3 partes de agente aglutinante por 5 partes de matriz. Ciertos agentes aglutinantes pueden utilizarse en proporciones iguales o mayores respecto a la matriz. Otro dispositivo actualmente preferido comprende 1 parte de agente aglutinante y 3 partes de matriz. Como se ejemplifica en la presente memoria, dispositivos mejorados de proporciones ampliamente divergentes pueden inducir la formación de hueso y cartílago. Se ejemplifican en la presente memoria dispositivos mejorados que tienen partes de agente aglutinante a partes de matriz en el intervalo de aproximadamente 1:1 a 4:1, así como de aproximadamente 1:2 a 1:5 y 1:10 a 1:25, así como 1:25 a 1:50. Puede utilizarse cualquier proporción de agente aglutinante a matriz para practicar la presente inven-
ción.
Por ejemplo, un dispositivo mejorado actualmente preferido comprende aproximadamente 1 parte de agente aglutinante y aproximadamente 5 partes de matriz. Ciertas otras realizaciones preferidas comprenden aproximadamente 1 parte de agente aglutinante y aproximadamente 10 partes de matriz, mientras que aún otras comprenden aproximadamente 1 parte de agente aglutinante y aproximadamente 25 partes de matriz. Otro dispositivo actualmente preferido comprende aproximadamente 3 partes de agente aglutinante por 5 partes de matriz. Ciertos agentes aglutinantes pueden utilizarse en proporciones iguales o mayores respecto a la matriz. Otro dispositivo actualmente preferido comprende 1 parte de agente aglutinante y 3 partes de matriz. Como se ejemplifica en la presente memoria, dispositivos mejorados de proporciones ampliamente divergentes pueden inducir la formación de hueso y cartílago. Se ejemplifican en la presente memoria dispositivos mejorados que tienen partes de agente aglutinante a partes de matriz en el intervalo de aproximadamente 1:1 a 4:1, así como de aproximadamente 1:2 a 1:5 y 1:10 a 1:25, así como 1:25 a 1:50. Puede utilizarse cualquier proporción de agente aglutinante a matriz para practicar la presente inven-
ción.
Además, la presente invención contempla que un
dispositivo osteogénico mejorado puede comprender más de un material
de matriz en combinación; las proporciones relativas pueden variarse
para conseguir el resultado clínico deseado, y pueden determinarse
rutinariamente utilizando la experiencia normal. Es una matriz
actualmente preferida el colágeno, especialmente colágeno bovino. Es
otra matriz adecuada el hueso desmineralizado. Son aún otras
matrices adecuadas hidroxiapatitos (HAp) de relaciones molares de
calcio:fosfato (Ca/P), porosidad y cristalinidad variables;
cerámicas bioactivas; y cerámicas de fosfato de calcio, por nombrar
sólo unas pocas. Adicionalmente, están también contempladas en la
presente memoria las mezclas de los anteriores en las que se
manipulan las relaciones de HAp/fosfato de tricalcio. En una
realización particularmente preferida, la matriz es
\beta-fosfato de tricalcio
(\beta-TCP).
En otro aspecto, la presente invención
proporciona usos del dispositivo descrito en la presente memoria
para inducir la formación de hueso o cartílago local para reparación
de defectos óseos, cartilaginosos u osteocondrales. Los presentes
usos se contemplan como útiles para inducir la formación de al menos
hueso endocondral, hueso intramembranoso y cartílago articular. Como
se da a conocer en la presente memoria, los usos para reparación
incluyen el tratamiento de defectos tanto cerrados como abiertos con
los dispositivos osteogénicos mejorados anteriormente descritos.
Como se enseña en la presente memoria, los usos de la presente
invención pueden practicarse utilizando dispositivos mejorados que
son de volumen suficiente para rellenar el sitio de defecto, así
como utilizando dispositivos mejorados que no lo son. Además, como
resultado de este descubrimiento, están ahora disponibles
realizaciones para promover la reparación de defecto de hueso y/o
cartílago sin requerir intervención quirúrgica. La disponibilidad de
dichos usos tiene implicaciones para individuos comprometidos tales
como individuos diabéticos, fumadores, obesos y otros cuya salud
global y flujo sanguíneo deficiente a sus extremidades suponen un
riesgo cuando se requiere intervención quirúrgica. Los ejemplos de
defectos incluyen, pero sin limitación, defectos de tamaño crítico,
defectos de tamaño no crítico, fracturas sin unión, fracturas,
defectos osteocondrales, defectos condrales y defectos
periodontales.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un kit para la práctica de los usos anteriormente
descritos. Como se contempla en la presente memoria, una realización
de un kit para inducir la formación de hueso o la formación de
cartílago local comprende un dispositivo mejorado en el que la
proteína osteogénica y la matriz se envasan en el mismo recipiente.
En otras realizaciones, proteína osteogénica, matriz y agente
aglutinante están en el mismo recipiente. En aún otras
realizaciones, se proporciona también agente humectante y se envasa
separadamente de los otros componentes del kit.
Debido a que la presente invención proporciona a
los profesionales materiales y usos mejorados para reparación de
hueso y cartílago, incluyendo reparación de cartílago articular
presente en articulaciones de mamífero, supera los problemas
encontrados de otro modo utilizando los métodos y dispositivos de la
técnica. Por ejemplo, la presente invención puede inducir la
formación de cartílago de hialina genuina en lugar de fibrocartílago
en un sitio de defecto. El cartílago de hialina funcional se forma
sobre la superficie articular de hueso en un sitio de defecto y no
degenera con el tiempo a fibrocartílago. En contraposición, los
métodos de la técnica anterior generalmente dan como resultado en
última instancia el desarrollo de fibrocartílago en el sitio de
defecto. Al contrario que el cartílago de hialina, el fibrocartílago
carece de la capacidad fisiológica de restaurar las articulaciones a
su entera capacidad. Por tanto, cuando se utilizan dispositivos
osteogénicos mejorados según los presentes métodos, el profesional
puede restaurar sustancialmente un defecto osteocondral o condral a
una articulación funcional y evitar la formación indeseable de
fibrocartílago típica de los métodos de la técnica anterior. Como se
contempla en la presente memoria, la invención incorpora
adicionalmente materiales de reemplazo alogénicos para reparar
tejido avascular en una articulación esquelética que dan como
resultado la formación de tejidos de reemplazo mecánica y
funcionalmente viables en una articulación.
En resumen, los usos, dispositivos y kits de la
presente invención pueden utilizarse para inducir la formación de
hueso endocondral o intramembranoso para reparar defectos óseos que
no se curan espontáneamente, así como para promover y potenciar la
velocidad y/o calidad de formación de hueso nuevo, particularmente
en la reparación de fracturas y fusiones, incluyendo fusiones
vertebrales. Los usos, dispositivos y kits pueden inducir también la
reparación de defectos osteocondrales y/o subcondrales,
concretamente, pueden inducir la formación de hueso nuevo y/o el
cartílago de superficie superpuesto. La presente invención es
particularmente adecuada para uso en la reparación de defectos
resultantes de enfermedades deteriorantes o degenerativas tales
como, pero sin limitación, osteocondritis disecante. Es también
particularmente adecuada para uso en pacientes que requieren
cirugías reconstructivas repetitivas, así como pacientes de cáncer.
Otras aplicaciones incluyen, pero sin limitación, reparación
protésica, fusión vertebral, escoliosis, reparación craneal/facial y
reparación por aloinjerto masivo.
Los anteriores y otros objetos y rasgos de la
invención, así como la invención misma, pueden entenderse más
completamente a partir de la siguiente descripción cuando se lee
junto con los dibujos adjuntos, en los que:
la Figura 1 es una gráfica que representa las
propiedades de cohesividad de partes variables (p/p) de agente
aglutinante a partes (p/p) de dispositivo de OP estándar.
La Figura 2 es una gráfica que representa el
efecto de volúmenes variables de agente humectante sobre la
integridad de un dispositivo osteogénico mejorado.
Para describir más clara y concisamente la
materia en cuestión de la invención reivindicada, se pretende que
las siguientes definiciones proporcionen directrices del significado
de términos específicos utilizados en la siguiente descripción
escrita y reivindicaciones adjuntas.
"Formación de hueso" significa formación de
hueso endocondral o formación de hueso intramembranoso. En seres
humanos, la formación de hueso empieza durante las primeras
6-8 semanas de desarrollo fetal. Las células madre
progenitoras de origen mesenquimático migran a sitios
predeterminados donde (a) se condensan, proliferan y se diferencian
en células formadoras de hueso (osteoblastos), un proceso observado
en el cráneo y designado como "formación de hueso
intramembranoso"; o (b) se condensan, proliferan y se diferencian
en células formadoras de cartílago (condroblastos) como
intermedios, que se reemplazan posteriormente por células formadoras
de hueso. Más específicamente, las células madre mesenquimáticas se
diferencian en condrocitos. Los condrocitos se calcifican después,
experimentan hipertrofia y se reemplazan por hueso recién formado
preparado por osteoblastos diferenciados, que están ahora presentes
en el sitio. Posteriormente, se remodela extensamente el hueso
mineralizado, ocupándose después de ello por un osículo rellenado
con elementos de médula ósea funcionales. Este proceso se observa en
huesos largos y se designa como "formación de hueso
endocondral". En la vida postfetal, el hueso tiene la capacidad
de repararse a sí mismo tras lesión imitando el proceso celular de
desarrollo de hueso endocondral embriónico. Es decir, las células
madre progenitoras mesenquimáticas de médula ósea, periostio y
músculo pueden inducirse a migrar al sitio de defecto y empezar la
cascada de eventos descrita anteriormente. Allí se acumulan,
proliferan y se diferencian en cartílago, que se reemplaza
posteriormente por hueso recién formado.
"Hueso" designa un tejido conectivo
calcificado (mineralizado) que comprende principalmente una
combinación de calcio y fosfato depositada en forma de
hidroxiapatito, colágeno (principalmente colágeno de tipo I) y
células óseas tales como osteoblastos, osteocitos y osteoclastos,
así como tejido de médula ósea que se forma en el interior de hueso
endocondral verdadero. El tejido óseo difiere significativamente de
otros tejidos, incluyendo tejido de cartílago. Específicamente, el
tejido óseo es tejido vascularizado compuesto por células y un medio
bifásico que comprende un componente mineralizado inorgánico
(principalmente cristales de hidroxiapatito) y un componente
orgánico (principalmente colágeno de tipo I). Los
glicosaminoglicanos constituyen menos de un 2% de este componente
orgánico y menos de un 1% del medio bifásico mismo, o del tejido
óseo per se. Además, respecto al tejido cartilaginoso, el
colágeno presente en el tejido óseo existe en una disposición
paralela altamente organizada. Los defectos óseos, tanto de
etiologías degenerativa, traumática, como cancerosa, plantean un
enorme reto al cirujano plástico. Es particularmente difícil la
reconstrucción o reparación de partes esqueléticas que comprenden
parte de un complejo multitejido, tal como ocurre en las
articulaciones de mamífero.
"Formación de cartílago" significa
formación de tejido conectivo que contiene condrocitos embebidos en
una red extracelular que comprende fibrillas de colágeno
(predominantemente colágeno de tipo II junto con otros tipos
minoritarios tales como tipos IX y XI), diversos proteoglicanos,
otras proteínas y agua. "Cartílago articular" designa
específicamente hialina o cartílago articular, un tejido no
mineralizado avascular que cubre las superficies de articulación de
las porciones de los huesos en articulaciones y permite el
movimiento en articulaciones sin contacto directo
hueso-hueso, evitando así el desgaste y el daño de
las superficies óseas opuestas. El cartílago articular sano normal
se designa como "hialina", concretamente, tiene una apariencia
cristalina deslustrada característica. En condiciones fisiológicas,
el tejido de cartílago articular permanece sobre la superficie ósea
mineralizada subyacente llamada hueso subcondral, que contiene
osículos altamente vascularizados. El cartílago articular, o de
hialina, encontrado en el extremo de los huesos de articulación es
un tejido especializado histológicamente distinto, y es responsable
de la distribución de la resistencia a la carga ante fuerzas
compresivas, y del deslizamiento suave que es parte de la función de
la articulación. El cartílago articular tiene pocas o ninguna
propiedad autorregenerativa. Por tanto, si el cartílago articular se
desgarra o se desgasta su grosor o se daña de otro modo en función
del tiempo, enfermedad o traumatismo, se compromete su capacidad de
proteger la superficie ósea subyacente. En cartílago articular
normal, existe un equilibrio entre síntesis y destrucción de la red
extracelular anteriormente descrita. Sin embargo, en tejido sometido
a traumatismo repetido, por ejemplo, debido a la fricción entre
huesos mal alineados en contacto entre sí, o en enfermedades
articulares caracterizadas por
la pérdida neta de cartílago articular, por ejemplo osteoartritis, aparece un desequilibrio entre síntesis y degraduación.
la pérdida neta de cartílago articular, por ejemplo osteoartritis, aparece un desequilibrio entre síntesis y degraduación.
Otros tipos de cartílago en articulaciones
esqueléticas incluyen fibrocartílago y cartílago elástico. Las
articulaciones cartilaginosas secundarias están formadas por discos
de fibrocartílago que unen vértebras en la columna vertebral. En el
fibrocartílago, la red de mucopolisacárido está entrelazada con
haces de colágeno prominentes y los condrocitos están más
ampliamente dispersados que en cartílago de hialina. El cartílago
elástico contiene fibras de colágeno que son histológicamente
similares a las fibras de elastina. El tejido cartilaginoso,
incluyendo cartílago articular, al contrario que otros tejidos
conectivos, carece de vasos sanguíneos, nervios, vasos linfáticos y
membrana basal. El cartílago está compuesto por condrocitos, que
sintetizan un medio extracelular abundante compuesto por agua,
colágenos, proteoglicanos y proteínas no colagenosas y lípidos. El
colágeno sirve para atrapar los proteglicanos y para proporcionar
resistencia a la tracción al tejido. El colágeno de tipo II es el
colágeno predominante en el tejido de cartílago. Los proteoglicanos
están compuestos por un número variable de cadenas de
glicosaminoglicano, sulfato de queratina, sulfato de condroitina y/o
sulfato de dermatano, y oligosacáridos ligados por N y ligados por O
unidos covalentemente a un núcleo proteico.
El cartílago articular, o de hialina, puede
distinguirse de otras formas de cartílago tanto por su morfología
como por su bioquímica. Ciertos colágenos tales como los tejidos
cartilaginosos fibróticos, que se encuentran en tejido de cicatriz,
por ejemplo, son queloides y típicos de tejido de tipo cicatriz,
concretamente, compuestos por capilares y haces abundantes
irregulares y desorganizados de colágeno de tipo I y tipo II. En
contraposición, el cartílago articular se caracteriza
morfológicamente por zonas superficiales frente a medias frente a
profundas que muestran una graduación característica de rasgos desde
la superficie del tejido hasta la base del tejido adyacente al
hueso. En la zona superficial, por ejemplo, los condrocitos están
aplanados y yacen paralelos a la superficie embebidos en una red
extracelular que contiene colágeno dispuesto tangencialmente y unos
pocos proteoglicanos. En la zona media, los condrocitos son
esféricos y están rodeados por una red extracelular rica en
proteoglicanos y fibras de colágeno organizadas oblicuamente. En la
zona profunda, cerca del hueso, las fibras de colágeno están
orientadas verticalmente. Los proteoglicanos ricos en sulfato de
queratina aumentan en concentración al aumentar la distancia desde
la superficie del cartílago. Para una descripción detallada de la
microestructura de cartílago articular, véanse, por ejemplo,
(Aydelotte y Kuettner, (1988), Conn. Tiss. Res. 18: 205;
Zanetti et al. (1985), J. Cell. Biol. 101: 53 y Poole
et al., (1984), J. Anat. 138: 13. Bioquímicamente, el
colágeno articular puede identificarse por la presencia de colágeno
de tipo II y tipo IX, así como por la presencia de proteoglicanos
bien caracterizados y por la ausencia de colágeno de tipo X, que
está asociado a la formación de hueso endocondral.
Se reconocen dos tipos de defectos en
superficies articulares, concretamente, defectos de grosor completo
y defectos superficiales. Estos defectos difieren no sólo en la
extensión del daño físico al cartílago, sino también en la
naturaleza de la respuesta de reparación que cada tipo de lesión
puede desencadenar. Los defectos de grosor completo, designados
también en la presente memoria como "defectos osteocondrales",
de una superficie articular incluyen daño en el cartílago de
hialina, la capa de cartílago calcificada y el tejido óseo
subcondral con sus vasos sanguíneos y médula ósea. Los defectos de
grosor completo pueden causar un fuerte dolor, puesto que la placa
ósea contiene terminaciones nerviosas. Dichos defectos surgen
generalmente de traumatismo grave y/o durante las etapas tardías de
una enfermedad articular degenerativa tal como osteoartritis. Los
defectos de grosor completo pueden conducir, en ocasiones, a
hemorragia y a la inducción de una reacción de reparación del hueso
subcondral. Sin embargo, en dichos casos el tejido de reparación
formado es un tipo de cartílago fibroso vascularizado con
propiedades biomecánicas insuficientes, y no persiste a largo plazo.
En contraposición, los defectos superficiales en el tejido de
cartílago articular están limitados al tejido de cartílago mismo.
Dichos defectos, también designados en la presente memoria como
"defectos condrales" o "subcondrales", son conocidos
porque no se curan y no muestran tendencia a reacciones de
reparación. Los defectos superficiales pueden aparecer como fisuras,
huecos o hendiduras en la superficie del cartílago. No contienen
vasos sangrantes (puntos de sangre) tales como los observados en
defectos de grosor completo. Los defectos superficiales pueden no
tener una causa conocida, pero a menudo son el resultado de
alteraciones mecánicas que conducen a un desgaste del tejido
cartilaginoso. Dichas alteraciones mecánicas pueden estar causadas
por traumatismo en la articulación, por ejemplo, un desplazamiento
del tejido de menisco roto en la articulación, meniscectomía, una
relajación de la articulación por un ligamento roto, mal
alineamiento de articulaciones o fractura ósea, o por enfermedades
hereditarias. Los defectos superficiales son también característicos
de las etapas tempranas de enfermedades articulares degenerativas
tales como osteoartritis. Puesto que el tejido cartilaginoso no está
inervado ni vascularizado, los defectos superficiales no se curan y
a menudo degeneran en defectos de grosor completo.
"Defecto" o "sitio de defecto", como
se contempla en la presente memoria, puede definir una
desestabilización estructural ósea que requiere reparación. El
defecto puede definir adicionalmente un defecto osteocondral,
incluyendo la desestabilización estructural tanto del hueso como del
cartílago superpuesto. Un defecto puede asumir la configuración de
un "vacío", que se entiende que significa un defecto
tridimensional tal como, por ejemplo, un hueco, cavidad, agujero u
otra desestabilización sustancial de la integridad estructural de un
hueso o articulación. Un defecto puede ser el resultado de
accidente, enfermedad, manipulación quirúrgica y/o fallo protésico.
En ciertas realizaciones, el defecto es un vacío que tiene un
volumen incapaz de reparación endógena o espontánea. Dichos defectos
son generalmente de dos veces el diámetro del hueso en cuestión y se
denominan también defectos "de tamaño crítico". Por ejemplo, en
un modelo de defecto de cúbito canino, la técnica reconoce que
dichos defectos son un hueco de aproximadamente 3-4
cm, generalmente de al menos aproximadamente 2,5 cm, incapaz de
reparación espontánea. Véanse, por ejemplo, Schmitz et al.,
"Clinical Orthopaedics and Related Research" 205:
299-308 (1986); y Vukicevie et al., en
"Advances in Molecular and Cell Biology", vol. 6, pág.
207-224 (1993) (JAI Press, Inc.).
En modelos de defecto segmentario de conejo y
mono, el hueco es de aproximadamente 1,5 cm y 2,0 cm,
respectivamente. En otras realizaciones, el defecto es un defecto
segmentario de tamaño no crítico. Generalmente, estos son capaces de
cierta reparación espontánea, aunque biomecánicamente inferior a la
posibilitada por la práctica de la presente innovación. En ciertas
otras realizaciones, el defecto es un defecto osteocondral tal como
un tapón osteocondral. Dicho defecto atraviesa la totalidad del
cartílago superpuesto y entra, al menos en parte, en la estructura
ósea subyacente. En contraposición, un defecto condral o subcondral
atraviesa el cartílago superpuesto, parcial o totalmente,
respectivamente, pero no implica al hueso subyacente. Otros defectos
susceptibles de reparación utilizando la presente invención
incluyen, pero sin limitación, fracturas sin unión, cavidades óseas,
resección de tumor, fracturas recientes (desplazadas o no
desplazadas), anormalidades craneales/faciales, defectos e
irregularidades periodontales, fusiones vertebrales, así como
aquellos defectos resultantes de enfermedades tales como cáncer,
artritis, incluyendo osteoartritis, y otros trastornos degenerativos
óseos tales como osteocondritis disecante.
"Reparar" se pretende que signifique
formación de hueso y/o cartílago nuevo, que es suficiente para
rellenar al menos parcialmente el vacío o discontinuidad estructural
en el defecto. Sin embargo, reparar no significa, ni exige por lo
demás, un proceso de curación completa o un tratamiento que sea 100%
eficaz en la restauración de un defecto a su estado
fisiológico/estructural/mecánico previo al defecto.
"Matriz", como se contempla en la presente
memoria, significa un material no polimérico no sintético que puede
actuar como sustrato osteoconductor y tiene una estructura de
soporte sobre la que pueden unirse, proliferar y participar en el
proceso morfogénico las células infiltrantes, culminando en la
formación de hueso. Como se contempla en la presente memoria, matriz
no incluye materiales poliméricos sintéticos tales como matrices
poliméricas que comprenden homopolímeros o copolímeros de ácido
\alpha-hidroxiacético y/o ácido
\alpha-hidroxipropiónico, incluyendo mezclas
racémicas de los mismos. Específicamente, las matrices como se
contemplan en la presente memoria no incluyen homopolímeros ni
copolímeros de ácido glicólico, ácido láctico ni ácido butírico,
incluyendo derivados de los mismos. Por ejemplo, la matriz de la
presente invención puede derivar de materiales de fuente biológica o
natural o de origen natural. Una matriz adecuada debe ser
particulada y porosa, siendo la porosidad un rasgo crítico para su
efectividad en la inducción de la formación de hueso,
particularmente la formación de hueso endocondral. Se entiende que
el término "matriz" significa un componente estructural o
sustrato que tiene intrínsecamente una forma tridimensional sobre la
que ocurrirán ciertos eventos celulares implicados en la
morfogénesis de hueso endocondral; una matriz actúa como una
estructura de soporte temporal para células infiltrantes que tiene
intersticios para la unión, proliferación y diferenciación de dichas
células. La presente invención contempla que un dispositivo
osteogénico mejorado puede comprende más de un material de matriz en
combinación; las proporciones relativas pueden variar para conseguir
los resultados clínicos deseados y pueden determinarse
rutinariamente utilizando experiencia normal. Es una matriz
actualmente preferida el colágeno, especialmente colágeno bovino. Es
otra matriz adecuada el hueso desmineralizado. Son aún otras
matrices adecuadas hidroxiapatitos (HAp) de relaciones molares de
calcio:fosfato (Ca/P), porosidad y cristalinidad variables;
cerámicas bioactivas; y cerámicas de fosfato de calcio, por nombrar
sólo unas pocas. Adicionalmente, se contemplan también en la
presente memoria mezclas de los anteriores en las que se manipulan
las relaciones HAp/fosfato de tricalcio. Estas matrices pueden
obtenerse comercialmente en forma de gránulos, bloques y polvos. Por
ejemplo, Pyrost® es un bloque de HAp derivado de hueso bovino (Osteo
AG, Suiza); Collapta® es una esponja de HAp que contiene colágeno
(Osteo G, Suiza); pueden obtenerse fosfatos de tricalcio
(\beta-TCP) en Pharma GmbH (Alemania) en forma de
Cerasob®, así como en Clarkson Chromatography Products, Inc. (S.
Williamsport, PA) u Osteonics (Holanda); pueden obtenerse mezclas de
gránulos de TCP/HAp en Osteonics (Holanda); y pueden obtenerse polvo
o gránulos de HAp al 100% en CAM (una filial de Osteotech, NJ). La
preparación y caracterización de ciertas de las matrices
anteriormente citadas se han descrito extensamente en la técnica y
sólo exigen experimentación rutinaria y experiencia normal. Véanse,
por ejemplo, los documentos US 4.975.526, US 5.011.691, US
5.171.574, US 5.266.683, US 5.354.557 y US 5.468.845.
Están bien descritas en la técnica también otras
de las matrices anteriormente citadas. Véanse, por ejemplo, tratados
de biomateriales tales como LeGeros y Daculsi en "Handbook of
Bioactive Ceramics II", pág. 17-28, (1990, CRC
Press) y otras descripciones publicadas tales como Yang Cao, Jie
Weng, Biomaterials 17 (1996), pág. 419-424;
LeGeros, Adv. Dent. Res. 2, 164 (1988); Johnson et al., J.
Orthopaedic Research, 1996, vol. 14, pág.
351-369; y Piatelli et al.,
Biomaterials, 1996, vol. 17, pág.
1767-1770.
El \beta-TCP
(\beta-fosfato de tricalcio) sinterizado calentado
a alta temperatura es una matriz actualmente preferida. El
\beta-TCP sinterizado tiene una mayor velocidad de
disolución que los HAp sinterizados y fosfato de calcio bifásico
sinterizado (BCP). La capacidad del \beta-TCP de
soportar la formación de hueso parece estar basada, en parte, en el
tamaño de los gránulos de Ca/P en la matriz. Los
\beta-TCP sinterizados que tienen tamaños de
partícula de entre aproximadamente 212 \mum y aproximadamente 425
\mum son los más preferidos, y pueden obtenerse en Clarkson
Chromatography Products, Inc. (S. Williamsport, PA) u Osteonics
(Holanda). Tras la implantación, los dispositivos que contienen
partículas de tamaño dentro de este intervalo muestran altas
velocidades de resorción por análisis de imágenes y bajas respuestas
inflamatorias cuando se implantan en un sitio subcutáneo de rata,
como se describe en otro lugar en la presente memoria.
"Dispositivo osteogénico" se entiende que
significa una composición que comprende al menos una proteína
osteogénica dispersada en una matriz. Como se da a conocer en la
presente memoria, un "dispositivo osteogénico mejorado"
comprende proteína osteogénica, una matriz como se define
anteriormente y un agente aglutinante como se define anteriormente.
En contraposición, un "dispositivo osteogénico estándar"
comprende proteína osteogénica y una matriz, pero no un agente
aglutinante; los dispositivos osteogénicos estándar pueden
comprender una matriz sintética, polimérica o como se define
anteriormente. En los ejemplos y enseñanzas expuestos a
continuación, los dispositivos osteogénicos estándar se designan
adicionalmente: dispositivos estándar, dispositivo de OP,
dispositivo de OP-1 u OP. Los dispositivos
osteogénicos mejorados se designan adicionalmente: dispositivo que
contiene CMC, dispositivo estándar que contiene CMC, dispositivo de
CMC/OP-1, OP-1/CMC/colágeno,
OPCMC/colágeno y dispositivo mejorado que contiene cola de fibrina.
Como se utiliza en la presente memoria, un "dispositivo
ficticio" no contiene proteína osteogénica y se formula libre de
cualquier factor osteoinductor conocido. La presente invención
contempla también dispositivos mejorados que comprenden al menos dos
proteínas osteogénicas diferentes y/o al menos dos matrices
diferentes como se definen en la presente memoria. Otras
realizaciones de dispositivos mejorados pueden comprender
adicionalmente al menos dos agentes aglutinantes diferentes como se
definen en la presente memoria. En aún otras realizaciones,
cualquiera de los dispositivos mejorados anteriormente citados puede
comprender adicionalmente un agente humectante como se define en la
presente memoria. Cualquiera de las realizaciones anteriormente
citadas puede incluir también componentes radioopacos tales como
agentes de contraste disponibles comercialmente. Generalmente, hay
tres tipos bien conocidos de dichos agentes: hidroxiapatitos,
sulfato de bario y yodo orgánico. Los dispositivos que contienen
componentes radioopacos son particularmente útiles para la
administración de dispositivo en un sitio de defecto cerrado, como
se discute en otro lugar en la presente memoria. La identificación
de un componente radioopaco adecuado requiere sólo experiencia
normal y experimentación rutinaria. Véanse, por ejemplo, tratados
radiográficos, incluyendo Ehrlich y McCloskey, "Patient Care in
Radiography" (Mosby Publisher, 1993); "Radiographic Exposure,
Processing and Quality Control" de Carol Fuch (Charles C. Thomas
Publisher, 1993) y "Fundamentals of Special Radiographic
Procedures" de Snopek (W.B. Saunders Company, 1992).
Las realizaciones preferidas de dispositivos
mejorados son adhesivas a hueso, cartílago, músculo y/u otro tejido.
Tienen propiedades de manejo mejoradas y son resistentes al desalojo
tras irrigación durante cirugía y tras sutura. De forma similar, son
cohesivos y no se eliminan por lavado, se disgregan ni se diluyen
por irrigación y/o infiltración de fluidos corporales tales como la
sangre. Las realizaciones preferidas permanecen adheridas después de
la cirugía, incluso en una articulación. Es de particular
importancia que los dispositivos mejorados se confinan fácilmente en
el sitio de defecto. Funcionalmente, el dispositivo osteogénico
mejorado de la presente invención induce la formación acelerada de
hueso y/o cartílago, así como un tejido de reparación de mayor
calidad y más estable, y puede conseguir estos beneficios a dosis de
proteína osteogénica menores que la necesaria con un dispositivo
osteogénico estándar. Por tanto, la mezcla de proteína osteogénica
con matriz no sintética no polimérica y un agente aglutinante tiene
propiedades inesperadas que el profesional experto puede ahora
aprovechar como se ejemplifica en la presente memoria. Una
realización actualmente preferida comprende OP-1,
matriz de colágeno y el agente aglutinante carboximetilcelulosa
(CMC). Como se discute a continuación, una ventaja asociada al
agente aglutinante, CMC, es su efectividad incluso cuando está
presente en cantidades relativas bajas. Por ejemplo, en ciertas
realizaciones ejemplificadas en la presente memoria, puede
utilizarse OP-1 en cantidades en el intervalo de
aproximadamente 1,25 a 2,50 mg por aproximadamente 1.000 mg de
colágeno y por aproximadamente 180 a 200 mg de CMC.
Estas matrices y el agente aglutinante como se
describen en la presente memoria exhiben todas las características
de manejo preferidas anteriormente citadas asociadas a un
dispositivo osteogénico mejorado.
En ciertas otras realizaciones, estas cantidades
de proteína, matriz y agente aglutinante pueden aumentarse o
reducirse según las condiciones y las circunstancias relacionadas
con la reparación de defecto. Puede añadirse adicionalmente un
agente humectante tal como solución salina. Como se ejemplifica a
continuación, una configuración preferida para implantación en un
sitio de defecto abierto asume una consistencia de masilla. Puede
moldearse y conformarse por el cirujano antes de la implantación.
Esta configuración se consigue ajustando la proporción de matriz a
agente aglutinante a agente humectante de manera similar a la
enseñada en la presente memoria. Como se ejemplifica adicionalmente
a continuación, los defectos cerrados pueden tratarse con una
configuración de dispositivo más suelta y más fluida, que parece un
líquido viscoso. Dichas configuraciones pueden inyectarse sin
intervención quirúrgica en el sitio de defecto. De nuevo,
simplemente ajustando las proporciones de matriz a agente
aglutinante a agente humectante, puede conseguirse esta realización.
Actualmente, un dispositivo mejorado preferido comprende
aproximadamente 1 parte de agente aglutinante (p/p) por
aproximadamente 5 partes de matriz (p(p). Como se describe en
la presente memoria a continuación, pueden utilizarse otras
proporciones para preparar dispositivos mejorados, dependiendo de
la naturaleza del agente aglutinante y/o la matriz.
Por supuesto, un rasgo esencial de cualquier
formulación de dispositivo osteogénico mejorado es que debe ser
efectiva para proporcionar al menos una fuente local de proteína
osteogénica en el sitio de defecto, aunque transitoria. Como se
ejemplifica a continuación, el contenido de agente aglutinante de un
dispositivo osteogénico mejorado no afecta a la cinética de
liberación/retención de proteína. Esto es inesperado en vista de las
observaciones contrarias de que los dispositivos estándar que
contienen polímero no consiguieron mostrar efectos osteoinductores
clínicamente significativos en ausencia de material secuestrante
(definido por incluir materiales celulósicos) debido a que la
desorción de proteína era demasiado grande. (Véase, por ejemplo, el
documento US 5.597.897). Como se ejemplifica a continuación, incluso
cuando está presente un agente aglutinante como se define en la
presente memoria, la proteína se sigue desorbiendo del dispositivo
mejorado, aunque los efectos osteoinductivos son fácilmente
manifiestos. Aunque sin desear quedar ligado a teoría alguna, los
rasgos y beneficios inesperados asociados a la presente invención
parecen relacionarse menos con una interacción
proteína-agente aglutinante y más con una
interacción agente aglutinante-matriz.
Específicamente, el agente aglutinante como se define en la presente
memoria parece complementar y/o interaccionar sinérgicamente con la
matriz necesaria para la presente invención. Esto no ha sido
observado hasta el momento, y esta combinación se desalienta por las
enseñanzas de la técnica anterior. (Véanse, por ejemplo, los
documentos US 5.520.923, 5.597.897 y WO 95/24210).
El término dispositivo "unitario" designa
un dispositivo osteogénico mejorado proporcionado al profesional en
forma de una formulación premezclada única que comprende proteína
osteogénica, matriz y agente aglutinante. El término dispositivo
"no unitario" designa un dispositivo osteogénico mejorado
proporcionado al profesional en al menos dos envases separados para
mezclar antes del uso. Típicamente, un dispositivo no unitario
comprende al menos agente aglutinante envasado separadamente de la
proteína osteogénica y la matriz. El término "vehículo" designa
una mezcla de agente aglutinante y matriz, como se define cada uno
en la presente memoria. Por tanto, por ejemplo, un dispositivo
osteogénico mejorado como se da a conocer en la presente memoria
comprende proteína osteogénica y un vehículo.
Además de las proteínas osteogénicas, pueden
estar contenidos también en un dispositivo osteogénico mejorado
diversos factores de crecimiento, hormonas, enzimas, composiciones
terapéuticas, antibióticos u otros agentes bioactivos. Por tanto,
pueden combinarse diversos factores de crecimiento conocidos tales
como EGF, PDGF, IGF, FGF, TGF-\alpha y
TGF-\beta con un dispositivo osteogénico mejorado
y suministrarse al sitio de defecto. Puede utilizarse también un
dispositivo osteogénico mejorado para suministrar agentes
quimioterapéuticos, insulina, enzimas, inhibidores enzimáticos y/o
factores quimioatractores/quimiotácticos.
"Proteína osteogénica" o proteína
morfogénica ósea, se entiende generalmente que significa una
proteína que puede inducir la cascada completa de eventos
morfogénicos que culminan en la formación de hueso endocondral. Como
se describe en otro lugar en la presente memoria, la clase de
proteínas está tipificada por la proteína osteogénica humana
(hOP-1). Otras proteínas osteogénicas útiles en la
práctica de la invención incluyen formas osteogénicamente activas de
OP-1, OP-2, OP-3,
BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP9, DPP, Vgl, Vgr, proteína 60A,
GDF-1, GDF-3, GDF-5,
6, 7, BMP10, BMP11, BMP13, BMP15, UNIVIN, NODAL, SCREW, ADMP o
NEURAL, y variantes de secuencia aminoacídica de las mismas. En una
realización actualmente preferida, la proteína osteogénica incluye
una cualquiera de: OP-1, OP-2,
OP-3, BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP9 y variantes de
secuencia aminoacídica y homólogos de las mismas, incluyendo
homólogos de especie de las mismas. Las proteínas osteogénicas
particularmente preferidas son aquellas que comprenden una secuencia
aminoacídica que tiene al menos un 70% de homología con los
102-106 aminoácidos C-terminales que
definen el dominio de siete cisteínas conservado de
OP-1 humana, BMP2 y proteínas relacionadas. Ciertas
realizaciones preferidas de la presente invención comprenden la
proteína osteogénica OP-1. Ciertas otras
realizaciones preferidas comprenden OP-1 madura
solubilizada en una solución salina fisiológica. Como se describe
con más detalle en otro lugar en la presente memoria, las proteínas
osteogénicas adecuadas para uso con la invención de los solicitantes
pueden identificarse mediante experimentación rutinaria utilizando
el bioensayo reconocido en la técnica descrito por Reddi y Sampath.
"Homología de secuencia aminoacídica" se entiende en la
presente memoria que significa similitud de secuencia aminoacídica.
Las secuencias homólogas comparten residuos de aminoácidos
idénticos o similares, siendo residuos similares sustituciones
conservativas, o mutaciones puntuales permitidas, de los
correspondientes residuos de aminoácidos en una secuencia de
referencia alineada. Por tanto, una secuencia polipeptídica
candidata que comparte un 70% de homología aminoacídica con una
secuencia de referencia es aquella en la que un 70% cualquiera de
los residuos alineados son idénticos, o son sustituciones
conservativas, de los correspondientes residuos en una secuencia de
referencia. Los ejemplos de variaciones conservativas incluyen la
sustitución de un residuo hidrofóbico, tal como isoleucina, valina,
leucina o metionina, por otro, o la sustitución de un residuo polar
por otro tal como la sustitución de arginina por lisina, ácidos
glutámico por aspártico o glutamina por asparagina, y similares. El
término "variación conservativa" incluye también el uso de un
aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido original no
sustituido, a condición de que los anticuerpos creados por el
polipéptido sustituido inmunoreaccionen también con el polipéptido
no
sustituido.
sustituido.
Las proteínas útiles en esta invención incluyen
proteínas eucarióticas identificadas como proteínas osteogénicas
(véase la patente de EE.UU. 5.011.691) tales como proteínas
OP-1, OP-2, OP-3 y
CBMP-2, así como proteínas de secuencia aminoacídica
relacionada tales como DPP (de Drosophila), Vgl (de
Xenopus), Vgr-1 (de ratón),
GDF-1 (de seres humanos, véase Lee (1991)
PNAS, 88: 4250-4254), 60A (de
Drosophila, véase Wharton et al., (1991) PNAS
88: 9214-9218), dorsalina-1 (de
pollo, véase Basler et al. (1993) Cell 73:
687-702 y número de acceso a GenBank L12032 y
GDF-5 (de ratón, véase Storm et al. (1994)
Nature 368: 639-643). Se prefiere también la
BMP-3. Las proteínas útiles adicionales incluyen
constructos morfogénicos biosintéticos dados a conocer en la patente
de EE.UU. nº 5.011.691, por ejemplo, COP-1,
3-5, 7 y 16, así como otras proteínas conocidas en
la técnica. Aún otras proteínas incluyen formas osteogénicamente
activas de BMP-3b (véase Takao et al. (1996),
Biochem. Biophys. Comm. 219: 656-662),
BMP-9 (véase el documento WO95/33830),
BMP-15 (véase el documento WO 96/35710),
BMP-12 (véase el documento WO 95/16035),
CDMP-1 (véase el documento WO 94/12814),
CDMP-2 (véase el documento WO 94/12814),
BMP-10 (véase el documento WO 94/26893),
GDF-1 (véase el documento WO 92/00382),
GDF-10 (véase el documento WO 95/10539),
GDF-3 (véase el documento WO 94/15965) y
GDF-7 (documento WO 95/01802).
Aún otras proteínas útiles incluyen proteínas
codificadas por ADN competentes para hibridar con un ADN que
codifica una proteína osteogénica como se describe en la presente
memoria, y análogos, homólogos, muteínas (variantes biosintéticas) y
similares relacionados (véase a continuación). Ciertas realizaciones
de los dispositivos osteogénicos mejorados contempladas en la
presente memoria comprenden proteína osteogénica ligada funcional
y/o establemente a matriz.
"Agente aglutinante", como se utiliza en la
presente memoria, significa cualquier material fisiológicamente
compatible que, cuando se mezcla con proteína osteogénica y matriz
como se definen en la presente memoria, promueve la formación de
hueso y/o cartílago. El agente aglutinante preferido como se
describe en la presente memoria promueve dicha reparación utilizando
menos proteína osteogénica que los dispositivos osteogénicos
estándar. El agente aglutinante preferido puede promover la
reparación utilizando la misma cantidad de proteína osteogénica que
los dispositivos osteogénicos estándar, mientras que algunos
requieren más para promover la reparación. Como se enseña en la
presente memoria, el experto en la técnica puede determinar la
cantidad efectiva de proteína para uso con cualquier agente
aglutinante adecuado utilizando sólo experimentación rutinaria.
Entre las otras características del agente aglutinante preferido
está la capacidad de volver al dispositivo:
plegable, conformable y/o maleable; inyectable;
adherente a hueso, cartílago, músculo y otros tejidos; resistente a
la disgregración tras lavado y/o irrigación durante cirugía; y
resistente al desalojo durante cirugía, sutura y después de la
operación, por nombrar sólo unas pocas. Adicionalmente, en ciertas
realizaciones preferidas, un agente aglutinante puede conseguir los
rasgos y beneficios anteriormente citados cuando está presente a
bajas proporciones. Por ejemplo, un dispositivo mejorado actualmente
preferido comprende aproximadamente 1 parte de agente aglutinante y
aproximadamente 5 partes de matriz. Otro dispositivo actualmente
preferido comprende aproximadamente 3 partes de agente aglutinante
por 5 partes de matriz. Aún otros dispositivos preferidos comprenden
aproximadamente 1 parte de agente aglutinante y aproximadamente 10
partes de matriz, mientras que otros comprenden aproximadamente 1
parte de agente aglutinante y aproximadamente 25 ó 50 partes de
matriz. Ciertos agentes aglutinantes pueden utilizarse en
proporciones iguales o mayores respecto a la matriz, pero dichos
agentes deben ensayarse como se enseña a continuación para
identificar posibles efectos de dilución de matriz.
El agente comercial utilizado según la invención
es carboximetilcelulosa, incluyendo la sal de sodio de la misma, en
el que el agente aglutinante tiene una viscosidad de aproximadamente
0,01-0,2 Pa.s y un grado de sustitución de
0,65-0,90.
"Agente humectante", como se utiliza en la
presente memoria, significa cualquier solución acuosa
fisiológicamente compatible, a condición de que no interfiera con la
formación de hueso y/o cartílago. En ciertas realizaciones de la
presente invención, el agente humectante se mezcla con un
dispositivo mejorado para conseguir la consistencia exigida por el
modo de reparación de defecto. Como se enseña en la presente
memoria, puede utilizarse el agente humectante para conseguir una
configuración de masilla o, como alternativa, una configuración de
líquido viscoso. Es un agente humectante actualmente preferido la
solución salina fisiológica. Pueden identificarse equivalentes por
el experto utilizando sólo experimentación rutinaria y experiencia
normal.
Los medios para preparar y aplicar los usos,
implantes y dispositivos de la invención, así como otros aspectos
materiales referentes a su naturaleza y utilidad, incluyendo cómo
preparar y cómo usar la materia en cuestión reivindicada, se
entenderán adicionalmente a partir de lo siguiente, que constituye
el mejor modo contemplado actualmente para practicar la invención.
Se apreciará que la invención no está limitada a dicho trabajo
ejemplar o a los detalles específicos expuestos en estos
ejemplos.
Las proteínas de origen natural identificadas
y/o apreciadas en la presente memoria por ser proteínas osteogénicas
o morfogénicas óseas forman un subgrupo distinto dentro del
agrupamiento evolutivo amplio de proteínas de secuencia relacionada
conocido como la superfamilia o familia de supergenes de
TGF-\beta. Los morfógenos óseos de origen natural
comparten una secuencia aminoacídica sustancial en sus regiones
C-terminales (dominios). Típicamente, las proteínas
osteogénicas de origen natural anteriormente citadas se traducen en
forma de un precursor que tiene una secuencia de péptido señal
N-terminal de típicamente menos de aproximadamente
30 residuos, seguida de un dominio "pro" que se escinde,
proporcionando el dominio C-terminal maduro. El
péptido señal se escinde rápidamente tras la traducción en un sitio
de escisión que puede predecirse en una secuencia dada utilizando el
método de Von Heijne (1986) "Nucleic Acids Research" 14:
4683-4691. El dominio pro es típicamente
aproximadamente tres veces más grande que el dominio
C-terminal maduro totalmente procesado.
En realizaciones preferidas, el par de
polipéptidos morfogénicos tiene secuencias aminoacídicas que
comprenden cada una una secuencia que comparte una relación definida
con una secuencia aminoacídica de un morfógeno de referencia. En la
presente memoria, los polipéptidos osteogénicos preferidos comparten
una relación definida con una secuencia presente en
OP-1 humana osteogénicamente activa, la SEC ID Nº 2.
Sin embargo, una cualquiera o más de las secuencias de origen
natural o biosintéticas dadas a conocer en la presente memoria
podrían utilizarse de forma similar como secuencia de referencia.
Los polipéptidos osteogénicos preferidos comparten una relación
definida con al menos el dominio de seis cisteínas
C-terminal de OP-1 humana, los
residuos 336-431 de la SEC ID Nº 2. Preferiblemente,
los polipéptidos osteogénicos comparten una relación definida con al
menos el dominio de siete cisteínas C-terminal de
OP-1 humana, residuos 330-431 de la
SEC ID Nº 2. ES decir, los polipéptidos preferidos en una proteína
dimérica con actividad morfogénica ósea comprenden cada uno una
secuencia que corresponde con una secuencia de referencia o es
funcionalmente equivalente a la misma.
Las secuencias funcionalmente equivalentes
incluyen disposiciones funcionalmente equivalentes de residuos de
cisteína dispuestas en la secuencia de referencia, incluyendo
inserciones o deleciones de aminoácidos que alteran la disposición
lineal de estas cisteínas, pero que no perjudican materialmente su
relación en la estructura plegada de la proteína morfogénica
dimérica, incluyendo su capacidad de formar dichos enlaces disulfuro
intra- o intercatenarios que pueden ser necesarios para la actividad
morfogénica. Las secuencias funcionalmente equivalentes incluyen
adicionalmente aquellas en las que uno o más residuos de aminoácidos
difieren del residuo correspondiente de una secuencia de referencia,
por ejemplo, el dominio de siete cisteínas
C-terminal (también designado en la presente memoria
como el esqueleto de siete cisteínas conservado) de
OP-1 humana, a condición de que esta diferencia no
destruya la actividad morfogénica ósea. En consecuencia, se
prefieren las sustituciones conservativas de los correspondientes
aminoácidos en la secuencia de referencia. Los residuos de
aminoácidos que son sustituciones conservativas de los
correspondientes residuos en una secuencia de referencia son
aquellos que son física o funcionalmente similares a los
correspondientes residuos de referencia, por ejemplo, que tienen
similar tamaño, forma, carga eléctrica, propiedades químicas,
incluyendo la capacidad de formar enlaces covalentes o de hidrógeno,
o similares. Son sustituciones conservativas particularmente
preferidas aquellas que satisfacen los criterios definidos para una
mutación puntual aceptados en Dayhoff et al. (1978), 5,
"Atlas of Protein Sequence and Structure", supl. 3, cap. 22
(pág. 354-352), Natl. Biomed. Res. Found.,
Washington D.C., 20007.
Los ejemplos de sustituciones conservativas
incluyen: las sustituciones conservativas incluyen típicamente la
sustitución de un aminoácido por otro de características similares,
por ejemplo, sustituciones dentro de los siguientes grupos: valina,
glicina; glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido
aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina;
lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. La expresión
"variación conservativa" incluye también el uso de un
aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido original no
sustituido, a condición de que los anticuerpos creados por el
polipéptido sustituido inmunoreaccionen también con el polipéptido
no sustituido.
La proteína osteogénica de fuente natural en su
forma nativa madura es un dímero glicosilado que tiene típicamente
un peso molecular aparente de 30-36 kDa como se
determina por PAGE-SDS. Cuando se reduce, la
proteína de 30 kDa da lugar a dos subunidades peptídicas
glicosiladas que tienen pesos moleculares aparentes de
aproximadamente 16 kDa y 18 kDa. En estado reducido, la proteína no
tiene actividad osteogénica detectable. La proteína no glicosilada,
que tiene también actividad osteogénica, tiene un peso molecular
aparente de aproximadamente 27 kDa. Cuando se reduce, la proteína de
27 kDa da lugar a dos polipéptidos no glicosilados que tienen pesos
moleculares de aproximadamente 14 kDa a 16 kDa, capaces de inducir
la formación de hueso endocondral en un mamífero. Como se describe
anteriormente, las secuencias particularmente útiles incluyen
aquellas que comprenden las secuencias de 96 ó 102 aminoácidos
C-terminales de DPP (de Drosoplula), Vgl (de
Xenopus), Vgr-1 (de ratón), las proteínas
OP-1 y OP-2 (véase la patente de
EE.UU. nº 5.011.691 y Oppermann et al)., así como las
proteínas designadas como BMP2, BMP3, BMP4 (véanse los documentos WO
88/00205, patente de EE.UU. nº 5.013.649 y WO 91/18098), BMPS y BMP6
(véanse los documentos WO 90/11366, PCT/US 90/01630), BMP8 y
BMP9.
Otras proteínas morfogénicas útiles en la
práctica de la invención incluyen formas morfogénicamente activas de
OP-1, OP-2, OP-3,
BMP2, BMP3, BMP4, BNT5, BMP6, BMP9, GDF-5,
GDF-6, GDF-7, DPP, Vgl, Vgr,
proteína 60A, GDF-1, GDF-3,
GDF-5, GDF-6, GDF-7,
BMP10, BMP11, BMP13, BMP15, UNIVIN, NODAL,
SCREW, ADMP o NURAL, y variantes de secuencia aminoacídica de las mismas. En una realización actualmente preferida, la proteína osteogénica incluye una cualquiera de OP-1, OP-2, OP-3, BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP9 y variantes de secuencia aminoacídica y homólogos de las mismas, incluyendo homólogos de especie de las
mismas.
SCREW, ADMP o NURAL, y variantes de secuencia aminoacídica de las mismas. En una realización actualmente preferida, la proteína osteogénica incluye una cualquiera de OP-1, OP-2, OP-3, BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP9 y variantes de secuencia aminoacídica y homólogos de las mismas, incluyendo homólogos de especie de las
mismas.
Las publicaciones que dan a conocer estas
secuencias, así como sus propiedades químicas y físicas, incluyen:
OP-1 y OP-2: documentos US
5.011.691, US 5.266.683, Ozkaynak et al. (1990) EMBO
J. 9: 2085-2093; OP-3: documento
WO 94/10203 (PCT US 93/10520); BMP2, BMP3, BMP4: documento WO
88/00205, Wozney et al. (1988) Science 242:
1528-1534); BMP5 y BMP6: Celeste et al.
(1991) PNAS 87: 9843-9847;
Vgr-1: Lyons et al. (1989) PNAS 86:
4554-4558; DPP: Padgett et al., (1987)
Nature 325: 81-84; Vg-1:
Weeks (1987) Cell 51: 861-867;
BMP-9: documento WO 95/33830 (PCT/US 95/07084);
BMP-10: documento WO 94/26893 (PCT/US 94/05290);
BMP-11: documento WO 94/26892 (PCT/US 94/05288);
BMP-12: documento WO 95/16035 (PCT/US94/14030);
BMP-13: documento WO 95/16035 (PCT/US 94/14030);
GDF-1: documento WO 92/00382 (PCT/US 91/04096) y Lee
et al. (1991) PNAS 88: 4250-4254;
GDF-8: documento WO 94/2168 (PCT/US 94/03019);
GDF-9: documento WO 94/15966 (PCT/US 94/00685);
GDF-10: documento WO 95/10539 (PCT/US 94/11440);
GDF-11: documento WO 96/01845 (PCT/US 95/08543);
BMP-15: documento WO 96/36710 (PCT US 96/06540);
MP021: documento WO 96/01316 (PCT/EP 95/02552);
GDF-5 (CDMP-1, MP52): documentos WO
94/15949 (PCT/US 94/00657) y WO 96/1433 (PCT/US 94/12814) y WO
93/16099 (PCT/EP 93/00350); GDF-6
(CDMP-2, BMP-13): documentos WO
95/01801 (PCT/US 94/07762) y WO 96/14335 y WO 95/10635 (PCT/US
94/14030); GDF-7 (CDMP-3, BMP12):
documentos WO 95/10802 (PCT/US 94/07799) y WO 95/10635 (PCT/US
94/14030). En otra realización, las proteínas útiles incluyen
constructos biosintéticos biológicamente activos, incluyendo nuevas
proteínas morfogénicas biosintéticas y proteínas quiméricas
diseñadas utilizando secuencias de dos o más morfógenos conocidos.
Véanse también los constructos biosintéticos dados a conocer en la
patente de EE.UU. 5.011.691 (por ejemplo, COP-1,
COP-3, COP-4, COP-5,
COP-7 y COP-16).
En ciertas realizaciones preferidas, las
proteínas morfogénicas óseas útiles en la presente memoria incluyen
aquellas en las que las secuencias aminoacídicas comprenden una
secuencia que comparte al menos un 70% de homología de secuencia
aminoacídica o "similitud" y, preferiblemente, un 80% de
homología o similitud, con una proteína morfogénica de referencia
seleccionada de las proteínas de origen natural anteriores.
Preferiblemente, la proteína de referencia es OP-1
humana, y la secuencia de referencia de la misma es el dominio de
siete cisteínas C-terminal presente en formas
osteogénicamente activas de OP-1 humana, residuos
330-431 de la SEC ID Nº 2. En ciertas realizaciones,
se alinea con la misma un polipéptido sospechoso de ser equivalente
funcional de un polipéptido morfogénico de referencia utilizando el
método de Needleman et al. (1970), J. Mol. Biol. 48:
443-453, implementado convenientemente mediante
programas informáticos tales como el programa Align (DNAstar, Inc.).
Como se observa anteriormente, los huecos internos e inserciones
aminoacídicas en la secuencia candidata se ignoran con el fin de
calcular la relación definida, expresada convencionalmente como el
nivel de homología o identidad de secuencia aminoacídica entre las
secuencias candidata y de referencia. "Homología de secuencia
aminoacídica" se entiende en la presente memoria que incluye
tanto identidad como similitud de secuencia aminoacídica. Las
secuencias homólogas comparten residuos de aminoácidos idénticos y/o
similares, siendo los residuos similares sustituciones
conservativas, o "mutaciones puntuales permitidas", de los
correspondientes residuos de aminoácidos en una secuencia de
referencia alineada. Por tanto, una secuencia polipeptídica
candidata que comparte un 70% de homología aminoacídica con una
secuencia de referencia es aquella en la que cualquier 70% de los
residuos alineados son idénticos, o son sustituciones conservativas,
de los correspondientes residuos en una secuencia de referencia. En
una realización actualmente preferida, la secuencia de referencia es
OP-1. Las proteínas morfogénicas óseas útiles en la
presente memoria incluyen en consecuencia contrapartidas alélicas,
filogenéticas y otras variantes de la secuencia de referencia
preferida, tanto de origen natural como producidas biosintéticamente
(por ejemplo, incluyendo "muteínas" o "proteínas
mutantes"), así como nuevos miembros de la familia morfogénica
general de proteínas, incluyendo aquellas expuestas e identificadas
anteriormente. Ciertos polipéptidos morfogenéticos particularmente
preferidos comparten al menos un 60% de identidad aminoacídica con
la secuencia de referencia preferida de OP-1 humana,
aún más preferiblemente al menos un 65% de identidad aminoacídica
con la misma.
En otras realizaciones preferidas, la familia de
polipéptidos morfogénicos óseos útiles en la presente invención, y
los miembros de la misma, se definen por una secuencia aminoacídica
genérica. Por ejemplo, la secuencia genérica 7 (SEC ID Nº 4) Y la
secuencia genérica 8 (SEC ID Nº 5), dadas a conocer a continuación,
proporcionan las homologías compartidas entre los miembros de la
familia de proteínas preferidos identificados hasta la fecha,
incluyendo al menos OP-1, OP-2,
OP-3, CBMP-2A,
CBMP-2B, BMP-3, 60A, DPP, Vgl,
BMP-5, BMP-6, Vgr-1
y GDF-1. Las secuencias aminoacídicas para estas
proteínas se describen en la presente memoria y/o en la técnica,
como se resume anteriormente. Las secuencias genéricas incluyen
tanto la identidad aminoacídica compartida por estas secuencias en
el dominio C-terminal, definida por los esqueletos
de seis y siete cisteínas (secuencias genéricas 7 y 8,
respectivamente), así como residuos alternativos para las posiciones
variables dentro de la secuencia. Las secuencias genéricas
proporcionan un esqueleto de cisteína apropiado en el que pueden
formarse enlaces disulfuro inter- o intramoleculares, y contienen
ciertos aminoácidos críticos que es probable que influyan en la
estructura terciaria de las proteínas plegadas. Además, las
secuencias genéricas permiten una cisteína adicional en posición 36
(secuencia genérica 7) o posición 41 (secuencia genérica 8),
abarcando así las secuencias morfogénicamente activas de
OP-2 y OP-3.
en la que cada Xaa se selecciona
independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos
especificados definidos del modo siguiente: "res" significa
"residuo" y Xaa en res.2= (Tyr o Lys); Xaa en Res.3= (Val o
Ile); Xaa en res.4= (Ser, Asp o Glu); Xaa en res.6= (Arg, Gln, Ser,
Lys o Ala); Xaa en res.7= (Asp o Glu); Xaa en res.8= (Leu, Val o
Ile); Xaa en res.11= (Gln, Leu, Asp, His, Asn o Ser); Xaa en res.12=
(Asp, Arg, Asn o Glu); Xaa en res.13= (Trp o Ser); Xaa en res.14=
(Ile o Val); Xaa en res.15= (Ile o Val); Xaa en res.16= (Ala o Ser);
Xaa en res.18= (Glu, Gln, Leu, Lys, Pro o Arg); Xaa en res.19= (Gly
o Ser); Xaa en res.20= (Tyr o Phe); Xaa en res.21= (Ala, Ser, Asp,
Met, His, Gln, Leu o Gly); Xaa en res.23= (Tyr, Asn o Phe); Xaa en
res.26= (Glu, His, Tys, Asp, Gln, Ala o Ser); Xaa en res.28= (Glu,
Lys, Asp, Gln o Ala); Xaa en res.30= (Ala, Ser, Pro, Gln, Ile o
Asn); Xaa en res.31= (Phe, Leu o Tyr); Xaa en res.33= (Leu, Val o
Met); Xaa en res.34= (Asn, Asp, Ala, Thr o Pro); Xaa en res.35=
(Ser, Asp, Glu, Leu, Ala o Lys); Xaa en res.36= (Tyr, Cys, His, Ser
o Ile); Xaa en res.37= (Met, Phe, Gly o Leu); Xaa en res.38= (Asn,
Ser o Lys); Xaa en res.39= (Ala, Ser, Gly o Pro); Xaa en res.40=
(Thr, Leu o Ser); Xaa en res.44= (Ile, Val o Thr); Xaa en res.45=
(Val, Leu, Met o Ile); Xaa en res.46= (Gln o Arg); Xaa en res.47=
(Thr, Ala o Ser); Xaa en res.48= (Leu o Ile); Xaa en res.49= (Val o
Met); Xaa en res.50= (His, Asn o Arg); Xaa en res.51= (Phe, Leu,
Asn, Ser, Ala o Val); Xaa en res.52= (Ile, Met, Asn, Ala, Val, Gly
o Leu); Xaa en res.53= (Asn, Lys, Ala, Glu, Gly o Phe); Xaa en
res.54= (Pro, Ser o Val); Xaa en res.55= (Glu, Asp, Asn, Gly, Val,
Pro o Lys); Xaa en res.56= (Thr, Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, Ser, Gly,
Ile o His); Xaa en res.57= (Val, Ala o Ile); Xaa en res.58= (Pro o
Asp); Xaa en res.59= (Lys, Leu o Glu); Xaa en res.60= (Pro, Val o
Ala); Xaa en res.63= (Ala o Val); Xaa en res.65= (Thr, Ala o Glu);
Xaa en res.66= (Gln, Lys, Arg o Glu); Xaa en res.67= (Leu, Met o
Val); Xaa en res.68= (Asn, Ser, Asp o Gly); Xaa en res.69= (Ala, Pro
o Ser); Xaa en res.70= (Ile, Thr, Val o Leu); Xaa en res.71= (Ser,
Ala o Pro); Xaa en res.72= (Val, Leu, Met o Ile); Xaa en res.74=
(Tyr o Phe); Xaa en res.75= (Phe, Tyr, Leu o His); Xaa en res.76=
(Asp, Asn o Leu); Xaa en res.77= (Asp, Glu, Asn, Arg o Ser); Xaa en
res.78= (Ser, Gln, Asn, Tyr o Asp); Xaa en res.79= (Ser, Asn, Asp,
Glu o Lys); Xaa en res.80= (Asn, Thr o Lys); Xaa en res.82= (Ile,
Val o Asn); Xaa en res.84= (Lys o Arg); Xaa en res.85= (Lys, Asn,
Gln, His, Arg o Val); Xaa en res.86= (Tyr, Glu o His); Xaa en
res.87= (Arg, Gln, Glu o Pro); Xaa en res.88= (Asn, Glu, Trp o Asp);
Xaa en res.90= (Val, Thr, Ala o Ile); Xaa en res.92= (Arg, Lys, Val,
Asp, Gln o Glu); Xaa en res.93= (Ala, Gly, Glu o Ser); Xaa en
res.95= (Gly o Ala) y Xaa en res.97= (His o
Arg).
La secuencia genérica 8 (SEC ID Nº 5) incluye
toda la secuencia genérica 7 e incluye además la siguiente secuencia
(SEC ID Nº 8) en su terminación N:
En consecuencia, empezando por el residuo 7,
cada "Xaa" en la secuencia genérica 8 es un aminoácido
especificado definido como para la secuencia genérica 7, con la
diferencia que cada número de residuo descrito para la secuencia
genérica 7 se desplaza en cinco en la secuencia genérica 8. Por
tanto, "Xaa en res.2= (Tyr o Lys)" en la secuencia genérica 7
designa Xaa en el res.7 en la secuencia genérica 8. En la secuencia
genérica 8, Xaa en res.2= (Lys, Arg, Ala o Gln); Xaa en res.3= (Lys,
Arg o Met), Xaa en res.4= (His, Arg o Gln) y Xaa en res.5= (Glu,
Ser, His, Gly, Arg, Pro, Thr o Tyr).
En otra realización, las proteínas osteogénicas
útiles incluyen aquellas definidas por las secuencias genéricas 9 y
10, definidas a continuación.
Específicamente, las secuencias genéricas 9 y 10
son secuencias aminoacídicas combinadas de las siguientes proteínas:
OP-1 humana, OP-2 humana,
OP-3 humana, BMP-2 humana,
BMP-3 humana, BMP-4 humana,
BMP-5 humana, BMP-6 humana,
BMP-8 humana, BMP-9 humana,
BMP-10 humana, BMP-11 humana, 60A de
Drosophila, Vg-1 de Xenopus, UNIVIN de
erizo de mar, CDMP-1 humana (GDF-5
de ratón), CDMP-2 humana (GDF-6 de
ratón, BMP-13 humana), CDMP-3 humana
(GDF-7 de ratón, BMP-12 humana),
GDF-3 de ratón, GDF-1 humana,
GDF-1 de ratón, DORSALIN de pollo, dpp, SCREW de
Drosophila, NODAL de ratón, GDF-8 de ratón,
GDF-8 humana, GDF-9 de ratón,
GDF-10 de ratón, GDF-11 humana,
GDF-11 de ratón, BMP-15 humana y
BMP-3b de rata. Como la secuencia genérica 7, la
secuencia genérica 9 proporciona el esqueleto de seis cisteínas
C-terminal y, como la secuencia genérica 8, la
secuencia genérica 10 proporciona el esqueleto de siete
cisteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que cada Xaa se selecciona
independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos
especificados definidos como a continuación: "Res" significa
"residuo" y Xaa en el res.1= (Phe, Leu o Glu); Xaa en res.2=
(Tyr, Phe, His, Arg, Thr, Lys, Gln, Val o Glu); Xaa en res.3= (Val,
Ile, Leu o Asp); Xaa en res.4= (Ser, Asp, Glu, Asn o Phe); Xaa en
res.5= (Phe o Glu); Xaa en res.6= (Arg, Gln, Lys, Ser, Glu, Ala o
Asn); Xaa en res.7= (Asp, Glu, Leu, Ala o Gln); Xaa en res.8= (Leu,
Val, Met, Ile o Phe); Xaa en res.9= (Gly, His o Lys); Xaa en res.10=
(Trp o Met); Xaa en res.11= (Gln, Leu, His, Glu, Asn, Asp, Ser o
Gly); Xaa en res.12= (Asp, Asn, Ser, Lys, Arg, Glu o His); Xaa en
res.13= (Trp o Ser); Xaa en res.14= (Ile o Val); Xaa en res.15= (Ile
o Val); Xaa en res.16= (Ala, Ser, Tyr o Trp); Xaa en res.18= (Glu,
Lys, Gln, Met, Pro, Leu, Arg, His o Lys); Xaa en res.19= (Gly, Glu,
Asp, Lys, Ser, Gln, Arg o Phe); Xaa en res.20= (Tyr o Phe); Xaa en
res.21= (Ala, Ser, Gly, Met, Gln, His, Glu, Asp, Leu, Asn, Lys o
Thr); Xaa en res.22= (Ala o Pro); Xaa en res.23= (Tyr, Phe, Asn, Ala
o Arg); Xaa en res.24= (Tyr, His, Glu, Phe o Arg); Xaa en res.26=
(Glu, Asp, Ala, Ser, Tyr, His, Lys, Arg, Gln o Gly); Xaa en res.28=
(Glu, Asp, Leu, Val, Lys, Gly, Thr, Ala o Gln); Xaa en res.30= (Ala,
Ser, Ile, Asn, Pro, Glu, Asp, Phe, Gln o Leu); Xaa en res.31= (Phe,
Tyr, Leu, Asn, Gly o Arg); Xaa en res.32= (Pro, Ser, Ala o Val); Xaa
en res.33= (Leu, Met, Glu, Phe o Val); Xaa en res.34= (Asn, Asp,
Thr, Gly, Ala, Arg, Leu o Pro); Xaa en res.35= (Ser, Ala, Glu, Asp,
Thr, Leu, Lys, Gln o His); Xaa en res.36= (Tyr, His, Cys, Ile, Arg,
Asp, Asn, Lys, Ser, Glu o Gly); Xaa en res.37= (Met, Leu, Phe, Val,
Gly o Tyr); Xaa en res.38= (Asn, Glu, Thr, Pro, Lys, His, Gly, Met,
Val o Arg); Xaa en res.39= (Ala, Ser, Gly, Pro o Phe); Xaa en
res.40= (Thr, Ser, Leu, Pro, His o Met); Xaa en res.41= (Asn, Lys,
Val, Thr o Gln); Xaa en res.42= (His, Tyr o Lys); Xaa en res.43=
(Ala, Thr, Leu o Tyr); Xaa en res.44= (Ile, Thr, Val, Phe, Tyr, Met
o Pro); Xaa en res.45= (Val, Leu, Met, Ile o His); Xaa en res.46=
(Gln, Arg o Thr); Xaa en res.47= (Thr, Ser, Ala, Asn o His); Xaa en
res.48= (Leu, Asn o Ile); Xaa en res.49= (Val, Met, Leu, Pro o Ile);
Xaa en res.50= (His, Asn, Arg, Lys, Tyr o Gln); Xaa en res.51= (Phe,
Leu, Ser, Asn, Met, Ala, Arg, Glu, Gly o Gln); Xaa en res.52= (Ile,
Met, Leu, Val, Lys, Gln, Ala o Tyr); Xaa en res.53= (Asn, Phe, Lys,
Glu, Asp, Ala, Gln, Gly, Leu o Val); Xaa en res.54= (Pro, Asn, Ser,
Val o Asp); Xaa en res.55= (Glu, Asp, Asn, Lys, Arg, Ser, Gly, Thr,
Gln, Pro o His); Xaa en res.56= (Thr, His, Tyr, Ala, Ile, Lys, Asp,
Ser, Gly o Arg); Xaa en res.57= (Val, Ile, Thr, Ala, Leu o Ser); Xaa
en res.58= (Pro, Gly, Ser, Asp o Ala); Xaa en res.59= (Lys, Leu,
Pro, Ala, Ser, Glu, Arg o Gly); Xaa en res.60= (Pro, Ala, Val, Thr o
Ser); Xaa en res.61= (Cys, Val o Ser); Xaa en res.63= (Ala, Val o
Thr); Xaa en res.65= (Thr, Ala, Glu, Val, Gly, Asp o Tyr); Xaa en
res.66= (Gln, Lys, Glu, Arg o Val); Xaa en res.67= (Leu, Met, Thr o
Tyr); Xaa en res.68= (Asn, Ser, Gly, Thr, Asp, Glu, Lys o Val); Xaa
en res.69= (Ala, Pro, Gly o Ser); Xaa en res.70= (Ile, Thr, Leu o
Val); Xaa en res.71= (Ser, Pro, Ala, Thr, Asn o Gly); Xaa en res.72=
(Val, Ile, Leu o Met); Xaa en res.74= (Tyr, Phe, Arg, Thr, Tyr o
Met); Xaa en res.75= (Phe, Tyr, His, Leu, Ile, Lys, Gln o Val); Xaa
en res.76= (Asp, Leu, Asn o Glu); Xaa en res.77= (Asp, Ser, Arg,
Asn, Glu, Ala, Lys, Gly o Pro); Xaa en res.78= (Ser, Asn, Asp, Tyr,
Ala, Gly, Gln, Met, Glu, Asn o Lys); Xaa en res.79= (Ser, Asn, Glu,
Asp, Val, Lys, Gly, Gln o Arg); Xaa en res.80= (Asn, Lys, Thr, Pro,
Val, He, Arg, Ser o Gln); Xaa en res.81= (Val, Ile, Thr o Ala); Xaa
en res.82= (Ile, Asn, Val, Leu, Tyr, Asp o Ala); Xaa en res.83=
(Leu, Tyr, Lys o Ile); Xaa en res.84= (Lys, Arg, Asn, Tyr, Phe, Thr,
Glu o Gly); Xaa en res.85= (Lys, Arg, His, Gln, Asn, Glu o Val); Xaa
en res.86= (Tyr, His, Glu o Ile); Xaa en res.87= (Arg, Glu, Gln, Pro
o Lys); Xaa en res.88= (Asn, Asp, Ala, Glu, Gly o Lys); Xaa en
res.89= (Met o Ala); Xaa en res.90= (Val, Ile, Ala, Thr, Ser o Lys);
Xaa en res.91= (Val o Ala); Xaa en res.92= (Arg, Lys, Gln, Asp, Glu,
Val, Ala, Ser o Thr); Xaa en res.93= (Ala, Ser, Glu, Gly, Arg o
Thr); Xaa en res.95= (Gly, Ala o Thr); Xaa en res.97= (His, Arg,
Gly, Leu o Ser). Adicionalmente, después del res.53 en rBMP3b y
mGDF-10, hay una Ile; después del res.54 en
GDF-1 hay una T; después del res. 54 en BMP3 hay una
V; después del res.78 en BMP-8 y dorsalina hay una
G; después del res.37 en hGDF-1 hay Pro, Gly, Gly,
Pro.
La secuencia genérica 10 (SEC ID Nº 7) incluye
toda la secuencia genérica 9 (SEC ID Nº 6) y además incluye la
siguiente secuencia (SEC ID Nº 9) en su terminación N:
En consecuencia, empezando por el residuo 6,
cada "Xaa" en la secuencia genética 10 es un aminoácido
especificado definido como para la secuencia genérica 9, con la
diferencia de que cada número de residuo descrito para la secuencia
genérica 9 está desplazado en cinco en la secuencia genérica 10. Por
tanto, "Xaa en res.1= (Tyr, Phe, His, Arg, Thr, Lys, Gln, Val o
Glu)" en la secuencia genérica 9 designa Xaa en el res.6 en la
secuencia genérica 10. En la secuencia genérica 10, Xaa en res.2=
(Lys, Arg, Gln, Ser, His, Glu, Ala o Cys; Xaa en res.3= (Lys, Arg,
Met, Lys, Thr, Leu, Tyr o Ala); Xaa en res.4= (His, Gln, Arg, Lys,
Thr, Leu, Val, Pro o Tyr); y Xaa en res.5= (Gln, Thr, His, Arg, Pro,
Ser, Ala, Gln, Asn, Tyr, Lys, Asp o Leu).
Como se observa anteriormente, ciertas
secuencias polipeptídicas morfogénicas óseas actualmente preferidas
en esta invención tienen más de un 60% de identidad, preferiblemente
más de un 65% de identidad, con la secuencia aminoacídica que define
la secuencia de referencia preferida de hOP-1. Estas
secuencias particularmente preferidas incluyen contrapartidas
alélicas y filogenéticas variantes de las proteínas
OP-1 y OP-2, incluyendo la proteína
60A de Drosophila. En consecuencia, en ciertas realizaciones
particularmente preferidas, las proteínas morfogénicas útiles
incluyen proteínas activas que comprenden pares de cadenas
polipeptídicas dentro de la secuencia aminoacídica genérica
designada en la presente memoria como "OPX" (SEC ID Nº 3), que
define el esqueleto de siete cisteínas y da cabida a las homologías
entre varias variantes identificadas de OP-1 y
OP-2. Como se describe en la misma, cada Xaa en una
posición dada se selecciona independientemente de los residuos que
aparecen en la correspondiente posición en la secuencia
C-terminal de OP-1 u
OP-2 de ratón o humana.
en la que Xaa en res.2= (Lys o
Arg); Xaa en res.3= (Lys o Arg); Xaa en res.11= (Arg o Gln); Xaa en
res.16= (Gln o Leu); Xaa en res.19= (Ile o Val); Xaa en res.23= (Glu
o Gln); Xaa en res.26= (Ala o Ser); Xaa en res.35= (Ala o Ser); Xaa
en res.39= (Asn o Asp); Xaa en res.41= (Tyr o Cys); Xaa en res.50=
(Val o Leu); Xaa en res.52= (Ser o Thr); Xaa en res.56= (Phe o Leu);
Xaa en res.57= (Ile o Met); Xaa en res.58= (Asn o Lys); Xaa en
res.60= (Glu, Asp o Asn); Xaa en res.61= (Thr, Ala o Val); Xaa en
res.65= (Pro o Ala); Xaa en res.71= (Gln o Lys); Xaa en res.73= (Asn
o Ser); Xaa en res.75= (Ile o Thr); Xaa en res.80= (Phe o Tyr); Xaa
en res.82= (Asp o Ser); Xaa en res.84= (Ser o Asn); Xaa en res.89=
(Lys o Arg); Xaa en res.91= (Tyr o His); y Xaa en res.97= (Arg o
Lys).
En aún otra realización preferida, las proteínas
activas osteogénicamente útiles tienen cadenas polipeptídicas con
secuencias aminoacídicas que comprenden una secuencia codificada por
un ácido nucleico que hibrida, en condiciones de bajo, medio o alto
rigor, con ADN o ARN que codifica secuencias morfogénicas de
referencia, por ejemplo, secuencias C-terminales que
definen los dominios de siete cisteínas conservados de
OP-1, OP-2, BMP2, 4, 5, 6, 60A,
GDF3, GDF6, GDF7 y similares. Como se utiliza en la presente
memoria, las condiciones de hibridación de alto rigor se definen
como hibridación según técnicas conocidas en formamida al 40%, 5 x
SSPE, 5 x solución de Denhardt y SDS al 0,1% a 37ºC durante una
noche, y lavado en 0,1 x SSPE, SDS al 0,1% a 50ºC. Las condiciones
de rigor estándar están bien caracterizadas en textos de clonación
molecular estándar disponibles comercialmente. Véanse, por ejemplo,
"Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2ª ed., ed. por
Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989); "DNA Cloning", volúmenes I y II (D.N. Glover ed., 1985);
"Oligonucleotide Synthesis" (M.J Gait ed., 1984); "Nucleic
Acid Hybridization", (B.D. Hames & S.J. Higgins ed., 1984); y
B. Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning",
(1984).
Como se observa anteriormente, las proteínas
útiles en la presente invención son generalmente proteínas diméricas
que comprenden un par plegado de los polipéptidos anteriores. Dichas
proteínas morfogénicas son inactivas en forma reducida, pero son
activas en forma de homodímeros oxidados, y cuando se oxidan en
combinación con otras de esta invención produciendo heterodímeros.
Por tanto, los miembros de un par plegado de polipéptidos
morfogenéticos en una proteína morfogénicamente activa pueden
seleccionarse independientemente de cualquiera de los polipéptidos
específicos citados anteriormente.
Las proteínas morfogénicas óseas útiles en los
materiales y métodos de esta invención incluyen proteínas que
comprenden cualquiera de las cadenas polipeptídicas descritas
anteriormente, tanto aisladas de fuentes de origen natural, como
producidas mediante ADN recombinante u otras técnicas sintéticas, e
incluyen contrapartidas alélicas y filogenéticas variantes de estas
proteínas, así como muteínas de las mismas, y diversos constructos
truncados y de fusión. Los mutantes de deleción o adición se prevé
también que sean activos, incluyendo aquellos que pueden alterar el
dominio de seis o siete cisteínas C-terminal
conservado, a condición de que la alteración no desestabilice
funcionalmente la relación de estas cisteínas en la estructura
plegada. En consecuencia, dichas formas activas se consideran el
equivalente de los constructos descritos específicamente dados a
conocer en la presente memoria. Las proteínas pueden incluir formas
que tienen patrones de glicosilación variables, terminaciones N
variables, una familia de proteínas relacionadas que tienen regiones
de homología de secuencia aminoacídica, y formas truncadas o mutadas
activas de proteínas nativas o biosintéticas, producidas mediante la
expresión de ADN recombinante en células hospedadoras.
Las proteínas morfogénicas óseas contempladas en
la presente memoria pueden expresarse a partir de ADNc intacto o
truncado o de ADN sintéticos en células hospedadoras procarióticas o
eucarióticas, y purificarse, escindirse, replegarse y dimerizarse,
formando composiciones morfogénicamente activas. Las células
hospedadoras actualmente preferidas incluyen, sin limitación,
procariotas incluyendo E. coli o eucariotas incluyendo
levadura, o células de mamífero tales como células CHO, COS o BSC.
Un experto en la técnica apreciará que pueden utilizarse
ventajosamente otras células hospedadoras. Las descripciones
detalladas de las proteínas morfogénicas óseas útiles en la práctica
de esta invención, incluyendo cómo prepararlas, utilizarlas y
ensayar la actividad osteogénica, se dan a conocer en numerosas
publicaciones, incluyendo las patentes de EE.UU. nº 5.266.683 y
5.011.691.
Por tanto, en vista de esta descripción y el
conocimiento disponible en la técnica, los expertos en ingeniería
genérica pueden aislar genes a partir de ADNc o bibliotecas
genómicas de diversas especies biológicas diferentes que codifican
secuencias aminoacídicas apropiadas, u oligonucleótidos, y
expresarlos después en diversos tipos de células hospedadoras,
incluyendo tanto procariotas como eucariotas, produciendo grandes
cantidades de proteínas activas capaces de estimular la morfogénesis
de hueso endocondral en un mamífero.
Como ya se ha explicado, "agente
aglutinante", como se utiliza en la presente memoria, significa
cualquier material fisiológicamente compatible del grupo consistente
en carboximetilcelulosa y una sal de sodio de la misma, en el que el
agente aglutinante tiene una viscosidad de aproximadamente
0,01-0,2 Pa.s y un grado de sustitución de
0,65-0,90 que, cuando se mezcla con proteína
osteogénica y matriz como se definen en la presente memoria,
promueve la formación de hueso y/o cartílago. En ciertas
realizaciones actualmente preferidas, dicho agente aglutinante
promueve dicha reparación utilizando menos proteína osteogénica que
los dispositivos osteogénicos estándar. Entre las otras
características del agente aglutinante preferido como se describe en
la presente memoria están la capacidad de volver al dispositivo:
plegable, conformable y/o maleable; inyectable;
adherente a hueso, cartílago, músculo y otros tejidos; resistente a
disgregación tras lavado y/o irrigación durante cirugía; y
resistente al desalojo durante cirugía, sutura y después de la
operación, por nombrar sólo unas pocas. Adicionalmente, en una
realización actualmente preferida, el agente aglutinante puede
conseguir los rasgos y beneficios anteriormente citados cuando está
presente en proporciones relativamente bajas. Por ejemplo, un
dispositivo mejorado actualmente preferido comprende aproximadamente
1 parte de agente aglutinante y aproximadamente 5 partes de matriz.
Otro dispositivo actualmente preferido comprende 1 parte de agente
aglutinante y 3 partes de matriz. Como se ejemplifica en la presente
memoria, dispositivos mejorados de proporciones ampliamente
divergentes pueden inducir la formación de hueso y cartílago. Se
ejemplifican en la presente memoria dispositivos mejorados que
tienen partes de agente aglutinante por partes de matriz en el
intervalo de aproximadamente 1:1 a 4:1 hasta, e incluyendo, al menos
10:1, así como de aproximadamente 1:2 a 1:5 hasta, e incluyendo, al
menos 1:10, e incluyendo adicionalmente 1:25 a 1:50. Puede
utilizarse cualquier proporción de agente aglutinante a matriz para
practicar la presente invención. Todo lo necesario es mezclar agente
aglutinante con matriz y proteína osteogénica para conseguir la
formación de hueso y cartílago. Como se discute a continuación, los
agentes aglutinantes pueden utilizarse en proporciones iguales o
mayores respecto a la matriz, pero dichos agentes deben ensayarse
como se enseña en la presente memoria para medir cualquier efecto de
dilución de matriz.
Aquellos agentes aglutinantes contemplados como
útiles en la presente memoria se seleccionan del grupo consistente
en carboximetilcelulosa y una sal de sodio de la misma, en los que
el agente aglutinante tiene una viscosidad de aproximadamente
0,01-0,2 Pa.s y un grado de sustitución de
0,65-0,90, como se ejemplifica y describe a
continuación. Otros agentes aglutinantes incluyen, pero sin
limitación, dextrano, manitol, vaselina blanca, aceite de sésamo y
mezclas de los mismos. Como se ejemplifica y se describe a
continuación, otros agentes aglutinantes incluyen, pero sin
limitación, dextrano, manitol, vaselina blanca, aceite de sésamo y
mezclas de los mismos.
Finalmente, otro agente aglutinante descrito en
la presente memoria es la cola de fibrina, que comprende una mezcla
de fibrinógeno y trombina de mamífero. Como se ejemplifica en la
presente memoria, la cola de fibrina puede comprender amplios
intervalos de fibrinógeno y trombina, por ejemplo, 1 parte de cola
de fibrina y 25 partes de matriz de \beta-TCP; el
contenido de trombina puede estar en el intervalo de aproximadamente
2,0 U a 25 U, 5 U a 10 U y aproximadamente 2,5 U a 5 U.
El contenido de fibrinógeno puede estar en el
intervalo de aproximadamente 40 mg por 1.000 mg de
\beta-TCP, por ejemplo. En un dispositivo mejorado
que contiene colágeno, el contenido de fibrinógeno puede estar en el
intervalo de aproximadamente 20 mg por 1.000 mg de colágeno a
aproximadamente 180 mg por 1.000 mg de colágeno, por ejemplo.
En vista de las enseñanzas expuestas en la
presente memoria, el experto puede identificar los equivalentes
adecuados de los agentes aglutinantes identificados anteriormente
utilizando simplemente experimentación rutinaria y experiencia
normal. Los candidatos a agente aglutinante adecuados pueden
identificarse, caracterizarse, ensayarse y después utilizarse en
dispositivos osteogénicos como se expone a continuación.
Por tanto, el experto en la técnica puede
identificar en consecuencia candidatos a agente aglutinante y puede
reconocer de modo similar equivalentes de los agentes aglutinantes
preferidos identificados específicamente en la presente memoria
utilizando sólo experiencia normal y experimentación rutinaria.
Habiendo identificado un(os) candidato(s)
adecuado(s), el experto en la técnica puede seguir después
las directrices indicadas a continuación para la selección final de
un agente aglutinante preferido.
Basándose en estudios similares a los descritos
en la presente memoria, son ejemplos de agentes aglutinantes
adecuados, sin limitación: combinación de manitol/dextrano; dextrano
solo; combinación de manitol/vaselina blanca; y aceite de sésamo. Se
formuló del modo siguiente un dispositivo mejorado que contiene
manitol/dextrano: Una parte de dextrano 40, 3 partes de manitol, 1
parte de dispositivo OP. Se formularon dichos dispositivos mejorados
con 2,5 mg de proteína osteogénica por g de colágeno o por 0,5 g de
colágeno, variando así la dosis de proteína osteogénica. Para uso en
el presente método, se humedeció la formulación con aproximadamente
0,8 ml de solución salina por 2,5 g de dispositivo que contiene
manitol/dextrano. A continuación, se formuló un dispositivo que
contiene dextrano solo a partir de 4 partes de dextrano o 1 parte de
dextrano por 1 parte de dispositivo de OP, y se humedeció con
aproximadamente 0,8 ml de solución salina por 2,0 g de dispositivo.
El dextrano puede estar en el intervalo de 3.000 a 40.000 de PM. A
continuación, se formuló un dispositivo de manitol/vaselina blanca a
partir de 1,5 partes de manitol, 1,5 partes de vaselina y 1 parte de
dispositivo de OP. Esta formulación no requiere humectación.
Finalmente, se formuló un dispositivo mejorado que contiene aceite
de sésamo a partir de 1 parte de aceite y 1 parte de dispositivo de
OP. Esta formulación no requiere humectación. Los dispositivos
mejorados anteriormente descritos ilustran el intervalo de agentes
aglutinantes específicos, proporciones en dispositivos mejorados y
volúmenes de agente humectante que pueden utilizarse en los
dispositivos mejorados de la presente invención. Las químicas,
proporciones y requisitos de humectación son variados, pero todos
están dentro de la experiencia en la técnica. Cada uno de los
dispositivos mejorados anteriormente citados indujo la formación de
hueso (medido por el contenido de calcio y % de hueso) cuando se
ensayó en el bioensayo subcutáneo de rata descrito en la presente
memoria.
Como se enseña en la presente memoria, la
carboximetilcelulosa (CMC) es el agente aglutinante preferido. La
CMC está comercialmente disponible en suministradores tales como,
pero sin limitación: Hercules Inc., Aqualon® Division, Delaware; FMC
Corporation, Pensilvania; British Celanese, Ltd., Reino Unido; y
Henkel KGaA, Reino Unido. La carboximetilcelulosa de sodio es la sal
de sodio de un éter policarboximetílico de celulosa con un peso
molecular típico en el intervalo de 90.000-700.000.
La CMC se identificó como un agente aglutinante candidato basándose,
en parte, en lo siguiente: la CMC se utiliza ampliamente en
formulaciones farmacéuticas orales y tópicas como agente aumentador
de la viscosidad. La CMC se utiliza también en cosméticos, artículos
de limpieza y alimentos como agente emulsionante
(0,25-1,0%), agente formador de gel
(4,0-6,0%), inyectable (0,05-0,75%)
y aglutinante de comprimido (1,0-6,0%).
Aunque las características anteriores sugieren
la adecuabilidad como agente aglutinante, los experimentos
detallados a continuación confirmaron que la CMC era adecuada para
uso en los dispositivos osteogénicos mejorados dados a conocer en la
presente memoria. Dichos experimentos confirmatorios fueron
necesarios porque ninguna de las aplicaciones anteriormente citadas
es similar a la reparación de hueso o cartílago para la que son
útiles los dispositivos osteogénicos mejorados dados a conocer en la
presente memoria. Por ejemplo, ninguna de las aplicaciones
anteriormente citada requiere CMC por encima de un 6%, pero un
dispositivo mejorado implantable actualmente preferido de la
presente invención comprende más de aproximadamente un 6% (p/p) de
CMC y, preferiblemente, al menos aproximadamente un 10%, más
preferiblemente aproximadamente un 12-20%, estando
aproximadamente un 16% (p/p) o 1 parte de CMC por 5 partes de
dispositivo osteogénico estándar entre lo más actualmente preferido
para un dispositivo implantable. Estos porcentajes aproximados están
basados en cálculos del peso total de matriz mezclada con agente
aglutinante, excluyendo proteína osteogénica y agente
humectante.
Resulta significativo en la práctica de la
presente invención el hecho de que estén comercialmente disponibles
diversas graduaciones de carboximetilcelulosa de sodio que tienen
viscosidades diferentes. Las viscosidades de diversas graduaciones
de carboximetilcelulosa de sodio se reseñan y muestran en la Tabla 1
a continuación (véase "Handbook of Pharmaceutical Excipients"
(2ª edición), American Pharmaceutical Association & Royal
Pharmaceutical Society of Great Britain).
Están comercialmente disponibles una serie de
graduaciones de carboximetilcelulosa, teniendo la graduación más
frecuentemente usada un grado de sustitución (GS) de 0,7. El GS se
define como el número medio de grupos hidroxilo sustituidos por
unidad de anhidroglucosa. Es este GS el que determina la solubilidad
acuosa del polímero. El grado de sustitución y la viscosidad
estándar de una solución acuosa de concentración indicada se indican
en cualquier etiquetado de carboximetilcelulosa de sodio. Se
prefiere actualmente la CMC de viscosidad baja (Aqualon® Division,
Hercules Inc., Wilmington, DE). Los grados actualmente preferidos de
sustitución están en el intervalo de 0,65-0,90 (GS=
0,7, Aqualon® tipo 7L).
Como se describe anteriormente, la CMC está
disponible en varias graduaciones, viscosidad baja, media y alta. A
este respecto, se determinó que la viscosidad de la
carboximetilcelulosa (CMC) utilizada para formular un dispositivo
osteogénico mejorado era crítica para la formación de hueso.
Contrariamente a las enseñanzas en la técnica, se ha descubierto
ahora que la CMC de viscosidad alta afecta adversamente la formación
de hueso cuando se utiliza en un dispositivo osteogénico mejorado
que comprende una matriz como se define en la presente memoria. La
patente de EE.UU. nº 5.587.897 ("la patente 897") enseña el uso
de CMC de viscosidad alta (2,480 Pa.s) (véase la Tabla 1 anterior)
para inducir la formación de hueso. Sin embargo, los dispositivos en
la patente 897 requieren una matriz polimérica sintética, en lugar
de una matriz biológica tal como colágeno. Inesperadamente, cuando
se utiliza un material biológico tal como colágeno como matriz, el
dispositivo mejorado puede formularse con CMC de viscosidad baja
(aproximadamente 0,01-0,05 cP, o
0,05-0,20) para inducir la formación de hueso y/o
cartílago, como se enseña en la presente memoria.
Se realizó un estudio de toxicidad comparando un
dispositivo mejorado que contiene CMC con un dispositivo estándar.
Se preparó el dispositivo estándar con 2,5 mg de
OP-1/g de matriz de colágeno. Se preparó el
dispositivo mejorado que contiene CMC añadiendo CMC de viscosidad
baja (Aqualon®) a un dispositivo estándar a una relación de 1:5,
seguido de irradiación. Se implantaron alícuotas de 25 mg de un
dispositivo estándar o dispositivo ficticio (concretamente, sin
proteína osteogénica) y alícuotas de 30 mg de dispositivo mejorado
que contiene CMC o dispositivo de CMC ficticio en un sitio
subcutáneo de rata como se describe en otro lugar en la presente
memoria (un implante por animal). Se retiraron tres implantes de
cada formulación a los 7 días, 14 días, 21 días y 28 días después de
la implantación, y se evaluó histológicamente la formación de hueso
y cartílago y la reacción de tejido local. No se observó reacción
celular adversa, y no había evidencias que indicaran ningún efecto
adverso de la CMC, determinado evaluando la inflamación y la
formación fibrosa. El perfil histológico del dispositivo mejorado
que contiene CMC era generalmente similar al dispositivo de OP
estándar. Los niveles séricos de calcio y fosfatasa alcalina,
medidos utilizando enseñanzas estándar, siguieron también los del
dispositivo osteogénico estándar. Finalmente, utilizando análisis de
toxicidad estándar en ratas inmaduras y maduras, no se detectaron
lesiones significativas.
Basándose en una serie de estudios rutinarios
descritos a continuación, la bioactividad de un dispositivo
osteogénico estándar no se afectó adversamente por mezclado con CMC.
En lugar de ello, la bioactividad es al menos comparable para ambas
configuraciones de dispositivo, pero la capacidad de manipular el
dispositivo intraoperatoriamente y de retener el dispositivo en el
sitio de defecto durante cirugía y cierre de herida está potenciada
por la CMC. Para estos estudios, se añadió CMC irradiada al
dispositivo estándar antes de la implantación.
Brevemente, se realizaron dos estudios que
medían la liberación in vivo de OP-1 a partir
de un dispositivo estándar \pm CMC. En un experimento, se
implantaron 75 mg de dispositivo irradiado \pm 15 mg de CMC
irradiada en un sitio subcutáneo en ratas como se describe en la
presente memoria. Se retiraron los dispositivos implantados 1 hora,
1 día, 3 días y 6 días después de la implantación, seguido de
extracción con tampón urea 8 M; se analizó el contenido de
OP-1 mediante análisis de ELISA y transferencia
Western rutinarios. Se extrajo el dispositivo de
OP-1 (no implantado en los animales) con tampón urea
8 M y se utilizó como patrón interno. En general, la cinética de la
liberación in vivo de OP-1 a partir del
dispositivo de OP estándar y del dispositivo mejorado que contiene
CMC eran similares. La observación de que no hay diferencia en la
captación o retención de OP-1 por un dispositivo
estándar frente a un dispositivo mejorado que contiene una
combinación de matriz de colágeno y CMC es un resultado inesperado.
Se ha reseñado que, cuando se combina con matrices poliméricas no
biológicas, la CMC actúa captando proteína osteogénica. (Véase, por
ejemplo, el documento US 5.597.897).
Se realizaron también estudios in vitro.
En estos estudios, se midió la OP-1 liberada en
contraposición con los estudios in vivo anteriormente
descritos, en los que se midió la OP-1 restante en
el dispositivo. En un estudio, se humedecieron 25 mg de dispositivo
de OP o dispositivo de CMC con solución salina. Se añadió después 1
ml de suero bovino a cada dispositivo, y se incubaron los
dispositivos a 37ºC. Se retiró el sobrenadante y se reemplazó por
suero reciente a las 1 y 3 horas. A las 6 horas, se añadió urea 8 M
para extraer cualquier OP-1 aún asociada al
dispositivo. Se analizaron las concentraciones de
OP-1 en los sobrenadantes mediante técnicas de ELISA
y transferencia Western rutinarias. Tanto el dispositivo de OP
estándar como el dispositivo mejorado que contiene CMC tenían una
cinética de liberación de proteína similar durante las seis horas
estudiadas. De nuevo, estos resultados eran inesperados a la vista
de los informes anteriores de que la CMC actúa captando la proteína
osteogénica, y retardando y/o previniendo así su liberación a partir
de mezclas con matrices poliméricas sintéticas. (Véase, por ejemplo,
el documento US 5.597.897).
En conclusión, la CMC no inhibe sustancialmente
la retención o liberación de OP-1 a partir de un
dispositivo osteogénico que contiene una matriz de colágeno in
vivo o in vitro.
Se realizó un estudio (véase la Tabla 2)
comparando la estabilidad del dispositivo de OP estándar con un
dispositivo estándar que contiene CMC. Basándose tanto en análisis
in vitro como en un bioensayo de formación de hueso (descrito
en otro lugar en la presente memoria), se observó que el dispositivo
mejorado que contiene CMC era al menos tan estable como el
dispositivo estándar cuando se almacenaba a 30ºC durante 1 año. Los
datos sugieren también que la CMC puede premezclarse con el
dispositivo de OP estándar y esterilizarse terminalmente para una
configuración de producto unitario. Dicho producto unitario es útil
para reparar defectos de hueso y cartílago locales como se
ejemplifica a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Durante la formulación de un dispositivo
estándar que contiene CMC, la CMC y las proteínas osteogénicas
pueden esterilizarse separadamente, por ejemplo, mediante exposición
a irradiación gamma, y después combinarse los componentes
esterilizados para producir el dispositivo estándar que contiene
CMC. Además, la CMC puede premezclarse con el dispositivo de OP
estándar y esterilizarse la formulación resultante, por ejemplo,
mediante exposición a irradiación gamma. Este último proceso se
designa en la técnica como esterilización terminal, y se ha
utilizado para esterilizar otros dispositivos osteogénicos. Véanse,
por ejemplo, los documentos PCT/US 96/10377, publicado como WO
96/40297 el 19 de diciembre de 1996, y US 5.674.292, expedido el 7
de octubre de 1997. Como se utiliza en la presente memoria, los
términos "esterilización" y "esterilizado" designan un
proceso que utiliza medios físicos o químicos para eliminar
sustancialmente todos los organismos viables, especialmente
microorganismos, virus y otros patógenos, asociados al dispositivo
de la invención. Los dispositivos esterilizados de la invención
tienen preferiblemente un nivel de aseguramiento de la esterilidad
de 10^{-6}, determinado por los patrones de la Federal Drug
Administration (FDA). En el caso de dispositivos irradiados con
radiación gamma, por ejemplo, las dosificaciones de irradiación
apropiadas necesarias para esterilizar un dispositivo particular
pueden determinarse fácilmente consultando el texto de referencia
"Associate for the Advancement of Medical Instrumentation
Guidelines", publicado en 1992. Se proporcionan directrices en el
mismo para determinar la dosis de radiación necesaria para
conseguir un nivel de aseguramiento de la esterilidad dado para una
carga biológica particular del dispositivo. Las dosificaciones para
esterilizar dispositivos de la invención están preferiblemente en el
intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 4,0 megarad, y lo
más preferiblemente, están dentro del intervalo de aproximadamente
2,0 a aproximadamente
3,5 megarad.
3,5 megarad.
Adicionalmente, se realizó un estudio para
evaluar la estabilidad a corto plazo de un dispositivo osteogenico
al que se habían añadido CMC y solución salina. El estudio utilizó
un dispositivo estándar al que se añadieron 200 mg de CMC irradiada
envasada separadamente. Se retiraron muestras de dispositivo
mejorado que contiene CMC y se humedecieron con solución salina. Se
extrajo a las 0, 1, 3, 6 y 22 horas la OP-1 con
tampón urea 8 M y se analizó mediante HPLC en fase inversa en
condiciones reductoras. Se analizó también en los extractos la
actividad biológica de OP-1 con un ensayo basado en
célula estándar para medir la fosfatasa alcalina. Los datos
indicaron que la OP-1 retiene la actividad biológica
en estas condiciones. Estos datos sugirieron también que la
configuración del dispositivo mejorado que contiene CMC resultante
del mezclado de estas partes componentes (dispositivo osteogénico
estándar/CMC/solución salina) es utilizable durante varias horas
después de haber sido preparado, proporcionando al profesional un
tiempo intraoperativo significativo durante el cual el producto
permanece eficaz.
Se utilizaron métodos USP reconocidos en la
técnica para la identificación y caracterización de agentes
aglutinantes en bruto tales como CMC. Los ensayos incluían ensayos
de identidad química, viscosidad, pH, pérdida por secado y metales
pesados. Se ensayó también en el material la carga biológica antes
de esterilización, así como endotoxinas, pH, apariencia y
esterilidad después de irradiación. Se realizó un estudio de
estabilidad para monitorizar la viscosidad, la apariencia y el pH
del material irradiado. Todos los niveles y características eran
aceptables, determinados utilizando métodos y técnicas estándar.
Por ejemplo, se evaluó en CMC (Aqualon® de
viscosidad baja) la carga biológica y el contenido de endotoxina. Se
evaluó en CMC Aqualon®, lote FP10 12342, la presencia de
ofendotoxinas (LAL) utilizando el ensayo cromogénico cinético LAL de
BioWhittaker (Walkersville, MD, 21793).
La "carga biológica" puede medirse del modo
siguiente. Por ejemplo, se solubilizaron muestras de 200 mg de CMC
en 100 ml de agua tamponada con fosfato y se filtraron a través de
filtros de 0,45 \mum. Se dispusieron los filtros en una placa TSA
y se incubaron durante 48 horas. Se inocularon dos muestras de CMC
solubilizada con 10-100 UFC de Bacillus
subtilis para utilizar como controles de crecimiento. Los datos
sugieren que la carga biológica de la CMC es baja, y que la CMC no
interfiere en el análisis matando bacterias o inhibiendo el
crecimiento celular.
Se realizó un estudio comparando la viscosidad
de CMC antes y después de irradiación (irradiación gamma,
2,5-3,0 megarad). Los datos indicaron que, como se
reseña en la técnica, la viscosidad se reduce después de la
irradiación. Aunque esto no afecta a la biodisponibilidad o a su
utilidad global como agente aglutinante (véanse los estudios
expuestos en la presente memoria), el profesional experto deberá
tener en consideración este rasgo cuando evalúe las propiedades de
viscosidad o fluidez de un dispositivo osteogénico mejorado. Se
realizó también un estudio para evaluar la estabilidad de la CMC
irradiada. Los resultados indicaron que la CMC irradiada era estable
durante al menos 6 meses tanto a 4 como a 30ºC. Se midió la
viscosidad como el parámetro de estabilidad. Pueden llevarse a cabo
análisis y evaluaciones similares para otros agentes aglutinantes o
materiales de dispositivo utilizados en una formulación deseada.
Como se describe en la presente memoria, la
"cola de fibrina" es otro agente aglutinante. La cola de
fibrina comprende una mezcla de fibrinógeno y trombina de mamífero.
El fibrinógeno humano está comercialmente disponible en productos
tales como, pero sin limitación: Tissucol® (ImmunoAG, Viena,
Austria), Beriplase® (Behringswerke, Marburg, Alemania), Biocoll®
(Centre de Transfusion Sanguine de Lille (Tours, Francia) y
Transglutine® (CNTS Fractionation Centre, Estrasburgo, Francia). La
trombina humana está comercialmente disponible en ImmunogAG, Viena,
Austria. La cola de fibrina puede prepararse también con fibrinógeno
y trombina de otras fuentes de mamífero tales como, por ejemplo,
fuentes bovina y múrida.
Se identificó la cola de fibrina como un agente
aglutinante candidato basándose en sus propiedades similares a gel y
sus características de manejo mejoradas cuando se mezcla con un
material de matriz tal como, por ejemplo, colágeno o
\beta-TCP. Se mostró también que la cola de
fibrina desencadena una baja respuesta inflamatoria (véase a
continuación) y promueve la formación de hueso.
Se realizó un estudio de toxicidad comparando un
dispositivo mejorado que contiene cola de fibrina con un dispositivo
estándar. Se preparó el dispositivo estándar mezclando 10 \mug de
OP-1 en etanol al 47,5%/TFA al 0,01% y 25 mg de
colágeno, y liofilizando la mezcla durante una noche. Se humedeció
el dispositivo estándar con 100 \mul de solución salina tamponada
con fosfato (PBS) antes de la implantación. Se preparó el
dispositivo mejorado que contiene cola de fibrina añadiendo 50
\mul de fibrinógeno bovino (Sigma F8630, 10 mg/ml) y 50 \mul de
trombina bovina (50 U/ml) al dispositivo estándar, preparado como se
describe anteriormente, inmediatamente antes de la implantación. Se
implantaron después el dispositivo estándar y el dispositivo
mejorado que contiene cola de fibrina en un sitio subcutáneo de rata
como se describe en otro lugar en la presente memoria. Se evaluó
histológicamente en los implantes la formación de hueso y cartílago,
y la reacción de tejido local. El dispositivo mejorado que contiene
cola de fibrina desencadenó una baja respuesta inflamatoria y una
baja formación fibrosa. El perfil histológico del dispositivo
mejorado que contiene cola de fibrina era generalmente similar al
del dispositivo estándar. No apareció ninguna correlación entre la
respuesta inflamatoria y la capacidad del dispositivo mejorado que
contiene cola de fibrina de promover la formación
ósea.
ósea.
Se realizó un estudio para evaluar la cinética
de liberación de OP-1 a partir de un dispositivo
mejorado que contiene cola de fibrina a diferentes concentraciones
de trombina in vitro. Se mejoró la cinética de liberación
mediante la adición de mayores cantidades de trombina. Para este
estudio, se mezclaron 12,5 \mul de OP-1 en una
solución de lactosa al 5% con 50 mg de \beta-TCP,
25 \mul de fibrinógeno humano y 25 U/ml de trombina humana o 50
U/ml de trombina humana. Se transfirieron las mezclas a un vial de
vidrio y se añadió 1 ml de suero de ternero a cada uno. Se dejaron
después incubar las muestras a 37ºC/60 rpm. Se tomaron muestras de
suero y se analizaron mediante ELISA rutinaria a las
0-1 horas, 1-3 horas,
3-5 horas y 5-24 horas. Se resumen
los resultados en la tabla siguiente.
Los dispositivos de la invención pueden
formularse utilizando métodos rutinarios. Todo lo que se necesita es
la determinación de la concentración final deseada de proteína
osteogénica por dispositivo, teniendo presente que el volumen de
dispositivo suministrado puede ser, pero no debe ser necesariamente,
menor que el volumen del sitio de defecto. La concentración final
deseada de proteína dependerá de la actividad específica de la
proteína, así como del tipo, volumen y/o localización anatómica del
defecto. Adicionalmente, la concentración final deseada de proteína
puede depender de la edad, el sexo y/o la salud global del receptor.
Típicamente, para un defecto segmentario de tamaño crítico de
aproximadamente al menos 2,5 cm de longitud, se ha observado que
0,5-1,75 mg de proteína osteogénica, utilizando el
dispositivo estándar, inducen la formación de hueso necesaria para
reparar el hueco. En el caso de un defecto de tamaño no crítico o
una fractura reciente, se ha observado que aproximadamente
0,1-0,5 mg de proteína, utilizando el dispositivo
osteogénico estándar, reparan el defecto. En general, las
concentraciones de proteína para uso con matrices preferidas
descritas en la presente memoria pueden estar en el intervalo de
aproximadamente 0,4 mg a aproximadamente 3,0 mg por dispositivo. La
optimización de las dosificaciones sólo requiere experimentación
rutinaria y está dentro del nivel de experiencia de un experto en la
técnica.
Como se ejemplifica en la presente memoria,
pueden mezclarse una proteína osteogénica y un agente aglutinante
tal como carboximetilcelulosa (viscosidad baja, Aqualon®) o cola de
fibrina formando una masilla. En algunas realizaciones, se añade
solución salina al agente aglutinante para formar una pasta o
masilla en la que está dispersada una proteína osteogénica tal como
OP-1. Puede utilizarse una configuración de pasta
para pintar las superficies de un defecto tal como una cavidad.
Pueden utilizarse pastas para pintar defectos de fractura, defectos
condrales u osteocondrales, así como defectos óseos en un sitio de
implante protésico. Puede inyectarse o extruirse una configuración
más fluida en o a lo largo de las superficies de un defecto, de
manera similar a extruir pasta de dientes o estopa a partir de un
tubo, de tal modo que se libere una perla de dispositivo a lo largo
de la longitud del sitio de defecto. Típicamente, el diámetro de la
perla extruida se determina por el tipo de defecto, así como el
volumen de vacío en el sitio de
defecto.
defecto.
Como se cita anteriormente, pueden utilizarse
otros agentes aglutinantes como se definen en la presente memoria
para formular un dispositivo con una configuración similar a
masilla. Como resultará obvio para el experto en la técnica, dicha
configuración es el resultado de ajustar la proporción de vehículo a
agente humectante, produciendo menos agente humectante un
dispositivo más seco y produciendo más un dispositivo más húmedo. La
configuración adecuada de dispositivo precisa para reparar un
defecto dependerá al menos del tipo de defecto y del tamaño del
defecto. El experto en la técnica apreciará las variables.
Basándose en el siguiente tipo de estudios, se
estableció que aproximadamente 0,2 g de CMC a aproximadamente 1,0 g
de dispositivo osteogénico estándar proporcionan un dispositivo
mejorado con las propiedades de manejo actualmente preferidas. Se
combinaron relaciones variables de CMC y colágeno y después se
humedecieron con solución salina. Se suspendió cada mezcla
resultante de CMC y matriz en un tubo centrífugo cónico de 15 ml de
agua y se dispuso en un agitador rotativo (100 rpm). Se registró el
tiempo de asentamiento, cuando las partículas de matriz de colágeno
sueltas o liberadas se asentaron hasta una marca predeterminada en
el tubo. Los datos resumidos en la Tabla 1 y la Figura 3 sugieren
que un intervalo de aproximadamente 0,15 a 0,25 g CMC/g de colágeno
puede maximizar la cohesividad, integridad y propiedades de
manejo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudió también la cantidad preferida de
solución salina para humedecer el dispositivo de CMC. En este
estudio, se mezclaron aproximadamente 0,2 g de CMC con
aproximadamente 1 g de dispositivo osteogénico estándar. Se
añadieron cantidades variables de solución salina, y se anotó la
consistencia del dispositivo resultante. Se resumen los resultados
cualitativos y cuantitativos de este estudio en la Tabla 4 y la
Figura 2, respectivamente. Generalmente, estos datos ilustran que
hay un intervalo de volúmenes de agente humectante a los que puede
dar cabida el profesional que posibilitan que el dispositivo retenga
su integridad y cohesividad. Para un agente aglutinante tal como
CMC, los datos sugieren que más de aproximadamente 1,5 ml,
aproximadamente 1,8 a 2,5 ml de solución salina, es el volumen de
humectación actualmente preferido (para aproximadamente 1 g de
dispositivo mezclado con aproximadamente 200 mg de un agente
aglutinante tal como CMC) para conseguir un dispositivo implantable
con la consistencia de masilla actualmente preferida. Cantidades de
solución salina en exceso de ésta consiguen un dispositivo
inyectable con la consistencia fluida actualmente preferida. Como se
ejemplifica en otro lugar en la presente memoria, una configuración
de dispositivo implantable es adecuada para uso en un sitio de
defecto abierto, mientras que una configuración de dispositivo
inyectable es adecuada para uso en un sitio de defecto cerrado. En
términos de equivalentes gramo, se ha determinado que
aproximadamente 0,5 g a aproximadamente 3,0 g de solución salina
proporcionan dispositivos mejorados con consistencias deseables;
cuanto mayor es el peso, más inyectable es la configuración.
En ciertas realizaciones de la presente
invención, la preparación del dispositivo osteogénico mejorado
actual puede ocurrir inmediatamente antes de su suministro al sitio
de defecto. Como se ejemplifica en la presente memoria, los
dispositivos mejorados que contienen CMC pueden prepararse en el
sitio, adecuadamente para mezclado inmediatamente antes de la
cirugía. En una realización, se envasó y se irradió CMC de
viscosidad baja (Aqualon®) separadamente de la proteína osteogénica
OP-1 y la matriz de colágeno. Se mezcló después la
proteína OP-1 en matriz de colágeno con el agente
aglutinante. Se observó que los dispositivos preparados de esta
manera eran al menos tan activos biológicamente como el dispositivo
estándar sin CMC.
Basándose en el siguiente tipo de estudios, se
estableció que aproximadamente 500 \mul de fibrinógeno (80 mg/ml
en PBS a pH 7,4) y 500 \mul de trombina (50 U/ml o 25 U/ml en NaCl
al 0,9%) añadidos aproximadamente a 1 g de
\beta-TCP proporcionan un dispositivo mejorado con
las propiedades de manejo actualmente preferidas. Los temas
referidos a propiedades de manejo incluyen el tiempo de coagulación
de la cola de fibrina y la consistencia del dispositivo mejorado que
contiene cola de fibrina. Se prefiere un dispositivo que tiene la
consistencia de una masilla moldeable. Una vez coagula la cola, se
vuelve más difícil cambiar la forma de la masilla. Por lo tanto, un
tiempo de coagulación más largo es también un rasgo preferido del
dispositivo.
Se determinó el tiempo de coagulación de cola de
fibrina bovina mezclando continuamente 20 \mul de solución de
fibrinógeno bovino (80 mg/ml en PBS a pH 7,4) con 20 \mul de
solución de trombina bovina (500 U/ml o 25 U/ml en solución salina)
en una navecilla de pesada utilizando una barra de vidrio capilar.
Se evaluaron también los tiempos de coagulación con o sin la adición
de solución de CaCl_{2} al 0,6%. Los resultados se muestran en la
siguiente tabla:
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Se evaluó la consistencia del dispositivo que
contiene cola de fibrina utilizando un dispositivo que contiene
\beta-TCP como matriz ejemplar. Se añadieron
cantidades diferentes de cola de fibrina a 100 mg o 1.000 mg de
gránulos de \beta-TCP y se determinó la
consistencia. Se resumen los resultados en la tabla siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Como puede observarse por estos dos estudios, un
dispositivo que contiene cola de fibrina de aproximadamente 500
\mul de fibrinógeno (80 mg/ml en PBS a pH 7,4) y 500 \mul de
trombina (50 U/ml o 25 U/ml en NaCl al 0,9%) añadidos a
aproximadamente 1 g de \beta-TCP, tiene un tiempo
de coagulación y una consistencia adecuados para el dispositivo
osteogénico mejorado.
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\vskip1.000000\baselineskip
Basándose en los estudios anteriormente
descritos, se estableció que aproximadamente 40 mg de cola de
fibrina por aproximadamente 1.000 mg de \beta-TCP
proporcionan un dispositivo mejorado como se contempla en la
presente memoria. Basándose en los mismos estudios, se estableció
que aproximadamente 20 mg de cola de fibrina por aproximadamente
1.000 mg de colágeno proporcionan un dispositivo con las propiedades
preferidas expuestas en la presente memoria. Generalmente, los datos
sugieren que un intervalo de aproximadamente 20-220
mg de cola de fibrina/1.000 mg de matriz puede maximizar la
cohesividad, integridad y propiedades de manejo, dependiendo de las
circunstancias precisas y del uso pretendido.
En ciertas realizaciones de la invención, el
material de matriz preferido es \beta-TCP. Las
características preferidas de un material no sintético no polimérico
para uso como matriz en la invención reivindicada incluyen, pero sin
limitación: una alta velocidad de resorción de la matriz por el
tejido circundante y una baja respuesta inflamatoria. Como se
discute anteriormente, se prefiere actualmente
\beta-TCP sinterizado calentado a alta temperatura
que tenga tamaños de partícula en el intervalo de aproximadamente
212 \mum a aproximadamente 425 \mum, pero pueden utilizarse
también otros tamaños de partícula para practicar la presente
invención.
\newpage
Se determinó la velocidad de resorción de la
matriz de \beta-TCP utilizando un método de
análisis de imágenes estándar. El análisis de imágenes es un método
de evaluación de la distribución del tamaño de partícula de los
gránulos de Ca/P. Se compara el tamaño de partícula de los gránulos
de Ca/P antes y después de implantación en ratas. Se disuelven los
tejidos blandos de los tejidos extirpados mediante hipoclorito de
sodio, y se lavan los gránulos de Ca/P restantes varias veces con
agua y se secan a temperatura ambiente. Se mezclan las partículas
con glicerol y se montan sobre portaobjetos de vidrio. Se determina
el tamaño de partícula mediante microscopía utilizando un sistema de
análisis de imágenes estándar tal como Bioquant OS/2 ligado mediante
cámara de vídeo al miscroscopio. Se seleccionan las series que
denotan el área y diámetro más largo para expresar las dimensiones
de partícula individuales. Se eligieron las imágenes de partícula
que muestran escalas de gris de 0 a 88 en un ajuste de nivel de 256,
y se midieron. Se utilizaron los datos brutos de partículas
individuales para calcular la media y la desviación típica. Se miden
al menos 50 partículas en cada conjunto de datos.
En el estudio expuesto a continuación, se
formula \beta-TCP (Clarkson, nº 211096, BD= 0,86,
212-425 \mum, 9/6/97) en una pasta de CMC/sangre
con o sin 10 \mug de OP-1 y se implanta en sitios
subcutáneos de rata. Se retiran los implantes después de 6 y 12
semanas in vivo y se analizan utilizando el método de
análisis de imágenes descrito anteriormente. Los resultados a las 6
semanas se resumen en la tabla 4D a continuación. Los resultados
indican que después de 6 semanas el tamaño de
\beta-TCP se reduce de 334 \mum a 184 \mum
(sin OP-1) y a 1,66 \mum (con
OP-1). La diferencia de tamaño entre muestras
tratadas con OP-1 y no tratadas no es significativa.
Sin embargo, hay aproximadamente un 50% de reducción en el diámetro
de la \beta-TCP después de 6 semanas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En general, puede suponerse que las partículas
pequeñas se resorberán más rápido que las partículas grandes. Los
resultados indicaron que, sin OP-1, el
\beta-TCP (212-415 \mum)
desencadenaba una respuesta inflamatoria ligeramente elevada. Sin
embargo, la reacción inflamatoria se redujo a medida que aumentó la
dosis de OP-1 de 10 \mug a 20 \mug. Los estudios
animales previos han mostrado que las partículas pequeñas menores de
10 \mum desencadenan una alta respuesta inflamatoria. Por lo
tanto, el uso de partículas de \beta-TCP (al 100%)
sinterizadas del tamaño de 212 a 425 \mum es un equilibrio entre
la velocidad de resorción, la baja inflamación y la capacidad de
soportar la formación de hueso en el modelo subcutáneo de rata.
A continuación se exponen protocolos ejemplares
para identificar y caracterizar proteínas osteogénicas o
morfogénicas óseas genuinas, así como dispositivos osteogénicos
dentro del alcance de la invención de los solicitantes.
Se utiliza el bioensayo reconocido en la técnica
para inducción ósea como se describe por Sampath y Reddi (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 6591-6595) y la
patente de EE.UU. nº 4.968.590, para establecer la eficacia de los
protocolos de purificación. Brevemente, este ensayo consiste en
depositar las muestras de ensayo en sitios subcutáneos en ratas
receptoras alogénicas bajo anestesia con éter. Se hace una incisión
vertical (1 cm) en condiciones estériles en la piel sobre la región
torácica, y se prepara una bolsa mediante disección roma. En ciertas
circunstancias, se implantan aproximadamente 25 mg de la muestra de
ensayo profundamente en la bolsa y se cierra la incisión con un clip
cutáneo metálico. El sitio heterotrópico permite el estudio de la
inducción ósea sin las posibles ambigüedades resultantes del uso de
sitios ortotópicos.
Las reacciones celulares secuenciales que
ocurren en el sitio heterotrópico son complejas. La cascada
multietapa de formación de hueso endocondral incluye: unión de
fibrina y fibronectina a la matriz implantada, quimiotactismo de
células, proliferación de fibroblastos, diferenciación en
condroblastos, formación de cartílago, invasión vascular, formación
de hueso, remodelación y diferenciación de médula ósea.
En ratas, el modelo de bioensayo exhibe una
progresión controlada a través de las etapas de desarrollo de hueso
endocondral inducido por matriz que incluye: (1) infiltración
transitoria por leucocitos polimorfonucleares el dia 1; (2)
migración y proliferación de células mesenquimáticas los días 2 y 3;
(3) aparición de condrocitos los días 5 y 6; (4) formación de matriz
de cartílago el día 7; (5) calcificación de cartílago el día 8; (6)
invasión vascular, aparición de osteoblastos y formación de hueso
nuevo los días 9 y 10; (7) aparición de remodelación osteoblástica y
ósea los días 12 a 18; y (8) diferenciación de médula ósea
hematopoyética en el osículo el día 21.
Se prefiere el seccionamiento histológico y
tinción para determinar la extensión de la osteogénesis en los
implantes. La tinción con azul de toluidina o hematoxilina/eosina
demuestra claramente el desarrollo último de hueso endocondral. Son
suficientes bioensayos de 12 días para determinar si la actividad
inductora de hueso está asociada a la muestra de ensayo.
Adicionalmente, puede utilizarse la actividad
fosfatasa alcalina como marcador para la osteogénesis. La actividad
enzimática puede determinarse espectrofotométricamente después de la
homogeneización del material de ensayo extirpado. La actividad
alcanza un pico en los días 9-10 in vivo, y
después de ello se reduce lentamente. Las muestras que no muestran
desarrollo óseo por histología no deberían tener actividad fosfatasa
alcalina en estas condiciones de ensayo. El ensayo es útil para la
cuantificación y obtención de una estimación de la formación ósea
muy rápidamente después de retirar las muestras de ensayo de la
rata. Por ejemplo, se han ensayado muestras que contienen proteína
osteogénica a diversos niveles de pureza para determinar el nivel de
dosis/pureza más efectivo para buscar una formulación que pueda
producirse a escala industrial. Los resultados medidos por el nivel
de actividad fosfatasa alcalina y evaluación histológica pueden
representarse como "unidades de formación de hueso". Una unidad
de formación de hueso representa la cantidad de proteína que es
necesaria para una actividad de formación de hueso semimáxima el día
12. Adicionalmente, pueden construirse curvas de dosis para la
actividad inductora de hueso in vivo en cada etapa de un
esquema de purificación ensayando diversas concentraciones de
proteína. En consecuencia, el experto en la técnica puede construir
curvas de dosis representativas utilizando sólo experimentación
rutinaria.
Brevemente, es bien conocido en la técnica que
la identificación de cartílago articular genuino puede conseguirse
utilizando parámetros ultraestructurales y/o bioquímicos. Por
ejemplo, el cartílago articular forma una capa continua de tejido
cartilaginoso que posee zonas identificables. La zona superficial se
caracteriza por condrocitos que tienen una morfología aplanada y una
red extracelular que no se tiñe, o se tiñe poco, con azul de
toluidina, indicando la ausencia relativa de proteoglicanos
sulfatados. El azul de toluidina se utiliza habitualmente para la
tinción de hueso y cartílago. Es un tinte metacromático que
proporciona diferentes colores basándose en la presencia de cargas
negativas espaciadas densamente en los tejidos, que conducen a la
agregación y polimerización del tinte, que desplaza el color de azul
a púrpura. El hueso se tiñe de azul, mientras que el cartílago, con
sus mucopolisacáridos ácidos, se tiñe de púrpura oscuro. Los
condrocitos en las zonas media y profunda tienen una apariencia
esférica, y la matriz contiene abundantes proteoglicanos sulfatados,
como se evidencia por la tinción con azul de toluidina. Las fibras
de colágeno están presentes difundidamente a lo largo de la matriz.
Los condrocitos poseen abundante retículo endoplasmático rugoso y
están rodeados por una red extracelular. La red pericelular contiene
numerosas fibras de colágeno finas sin bandas. El colágeno en la red
interterritorial está menos compactado y embebido en material amorfo
translúcido a electrones, similar a cartílago articular. Las fibras
de colágeno en la región interterritorial de la red exhiben la
característica de bandas periódicas de fibras de colágeno en la zona
interterritorial de tejido de cartílago.
La tinción de Von Kossa muestra una densa
tinción negra del tejido mineralizado. Esta tinción representa
claramente el hueso existente y recién regenerado mediante la
deposición de plata sobre las sales de calcio. Típicamente, la
contratinción es safranina O, que tiñe el cartílago rojo anaranjado.
Habitualmente, el hueso nuevo y existente pueden distinguirse
fácilmente morfológicamente en secciones teñidas en consecuencia. La
safranina O/Fast Green es capaz de distinguir más rasgos que el azul
de toluidina. La safranina O es un tinte básico que tiñe los
mucopolisacáridos ácidos en el cartílago articular rojo anaranjados,
y el hueso subcondral subyacente sólo ligeramente. Fast Green es un
tinte ácido que tiñe el citoplasma gris verdoso. Esta tinción no es
sólo capaz de identificar claramente el cartílago existente y
regenerado, sino que puede distinguir también diferencias entre dos
regiones en el tejido reparativo indicando las diferencias en el
contenido de proteoglicanos.
Pueden utilizarse también tinciones con
hematoxilina/eosina, que representan hueso con un rojo más oscuro y
el cartílago rico en carbohidrato sólo muy ligeramente. El tricromo
de Masson es capaz de distinguir diferencias en el tejido
reparativo. El cartílago y el tejido reparativo rico en polisacárido
ácido, músculo y eritrocitos se tiñen de rojo, con el colágeno del
hueso teñido de azul.
Las evaluaciones histológicas pueden implicar
también la valoración de: contenido de glicosaminoglicano en el
cartílago de reparación; morfología de cartílago y condrocito; e
integridad estructural y morfología en la interfase de defecto. La
morfología del cartílago de reparación puede identificarse por el
tipo de cartílago formado: articular frente a fibrótico, evaluando
el contenido de glicosaminoglicano, el grado de deposición de
cartílago, y similares.
Las evaluaciones histológicas que utilizan
metodologías estándar bien caracterizadas en la técnica permiten
también la valoración de la formación de hueso y médula ósea nuevos.
Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.266.683.
Adicionalmente, es bien conocido en la técnica
que, bioquímicamente, la presencia de colágeno de tipo B y tipo IX
en el tejido cartilaginoso es indicativa de fenotipo diferenciado de
condrocitos. La presencia de colágeno de tipo II y/o tipo IX puede
determinarse mediante electroforesis en gel estándar, análisis de
transferencia Western y/o tinción inmunohistoquímica utilizando, por
ejemplo, anticuerpo comercialmente disponible como se describe a
continuación. Otros marcadores bioquímicos incluyen hematoxilina,
eosina, tricromo de Goldner y safranina O.
Pueden utilizarse métodos inmunohistoquímicos
tales como los siguientes para identificar la formación de tejido
cartilaginoso, incluyendo cartílago articular. Se preparan secciones
de tejido utilizando técnicas de imbibición y seccionamiento
rutinarias conocidas en la técnica. En primer lugar, se exponen los
epítopos de colágeno de tipo II a pretratamiento con proteasa. Por
ejemplo, se pretratan muestras de tejido con pronasa de tipo XIV 1
mg/ml de Sigma (St. Louis, MO; número de catálogo P5147) en solución
salina tamponada con Tris (TBS) durante aproximadamente 10 min a
temperatura ambiente. Se lavan después las muestras con TBS con 0,2%
de glicina. Se bloquean las muestras durante 30 min en una solución
salina tamponada con Tris que contiene 1% de Tween 20 (TBST) y
albúmina de suero bovino (BSA), y se lavan con TBST. Se incuban
después las muestras con anticuerpos policlonales purificados por
afinidad de cabra anti-colágeno humano de tipos I y
II durante aproximadamente 1 hora, o durante una noche, a
temperatura ambiente. En ciertos de los ejemplos expuestos a
continuación, el anticuerpo de cabra anti-colágeno
humano de tipo I se obtuvo en Southern Biotechnology Associates
(Birmingham, Alabama), número de catálogo 310-01,
por ejemplo, número de lote L055-X916; el anticuerpo
de cabra anti-colágeno humano de tipo II se obtuvo
también en Southern Biotechnology Associates, número de catálogo
1320-01, por ejemplo, número de lote
C153-T826. Pueden utilizarse también anticuerpos
anti-colágeno humano de tipos I y II generados en
ratón o conejo. El experto en la técnica apreciará las
circunstancias en las cuales es apropiado el uso de una especie
frente a otra. Para ciertos de los ejemplos expuestos a
continuación, las concentraciones de anticuerpos de cabra
anti-colágeno humano de tipos I y II utilizadas para
incubación son, por ejemplo, 20 \mug/ml para cada anticuerpo
diluido en 1% de BSA en TBST. Después de incubación con anticuerpos,
se aclaran las muestras con TBST y se mantienen en un baño. Se
añade después un anticuerpo de enlace comercialmente disponible. Por
ejemplo, las muestras tratadas con anticuerpos de cabra
anti-colágeno humano de tipos I y II pueden
incubarse con anticuerpo de enlace de cabra de BioGenex Laboratories
(San Ramón, CA); número de catálogo HK209-5G)
durante al menos 10 min a temperatura ambiente. Para aquellas
muestras incubadas con anticuerpos de ratón o conejo, puede
utilizarse el kit Dako LSAB2 número K0610 de Dako Corporation
(Carpintería, CA) como anticuerpo de enlace. Se aclaran de nuevo
las muestras con TBST y se mantienen en un baño. A continuación, se
dejan incubar las muestras con estreptavidina/fosfatasa alcalina
comercialmente disponible en cualquiera de las fuentes anteriormente
identificadas durante al menos aproximadamente 10 min a temperatura
ambiente. Se aclaran de nuevo las muestras con TBST. Se desarrollan
después las muestras mediante tratamiento con una solución de
sustrato apropiado durante aproximadamente 10 min o menos. Por
ejemplo, para detección de fosfatasa alcalina, se utilizan
aproximadamente 100 \mul de lavamasol 50 x. Para el desarrollo de
color, se utiliza Fast Red de Dako Corporation. Después del
desarrollo, se contratiñen las muestras lavando durante 2 min con
hematoxilina de Harris y carbonato de litio al 1%. Se montan después
las muestras en un medio acuoso de montaje, y se evalúa
posteriormente la formación de cartílago.
La tinción para colágeno de tipos I y II es útil
para determinar el límite entre el hueso subcondral regenerado y el
tejido reparativo. Generalmente, el tejido reparativo que es fibroso
se tiñe menos intensamente. Adicionalmente, el hueso subcondral
recién formado puede identificarse mediante la localización del
colágeno de tipo II en pequeñas espículas del cartílago restante. El
azul de toluidina y la safranina O son también útiles para teñir
proteoglicanos ácidos en una capa de cartílago, así como tejidos
reparativos.
La microscopía de luz polarizada puede
utilizarse para valorar la interdigitación fibrilar en la unión
entre los márgenes del tejido de reparación y el cartílago articular
residual adyacente al defecto. Dicha microscopía puede realizarse
utilizando secciones teñidas con safranina O de un defecto. En
ciertos casos, la microscopía de luz polarizada ofrece al experto en
la técnica una visión más exacta del proceso de reparación. Por
ejemplo, utilizando microscopía de luz, el tejido de reparación en
la periferia de un defecto puede aparecer bien yuxtapuesto con el
cartílago residual. Sin embargo, utilizando microscopía de luz
polarizada, puede observarse que las fibrillas de colágeno del
tejido de reparación no están bien integradas con las del cartílago
residual. La falta de continuidad de fibrilla entre el cartílago de
reparación y el persistente es indicativa de una reparación
subóptima. Por tanto, cuando se evalúa cualitativamente la interfase
entre cartílago de reparación y cartílago viable residual, la
continuidad fibrilar se valora preferiblemente utilizando
microscopía de luz polarizada como se ejemplifica en la presente
memoria a continuación. (Véase, también, Shapiro et al.,
Journal of Bone and Joint Surgery 75:
532-553, (1993)).
La práctica de la invención se entenderá más
completamente a partir de los siguientes ejemplos, que se presentan
en la presente memoria sólo para ilustración, y no debe considerarse
que limiten la invención en modo alguno.
Este estudio ilustra la eficacia de la
OP-1 combinada con matriz de colágeno y
carboximetilcelulosa para reparar defectos segmentarios de cúbito de
tamaño crítico en el modelo canino reconocido en la técnica.
Brevemente, los datos expuestos a continuación
indican una curación radiográfica al menos comparable en sitios que
recibieron un dispositivo de CMC/OP-1 respecto a
defectos segmentarios tratados con el dispositivo de OP estándar. La
graduación radiográfica final (máximo= 6,0) para defectos tratados
con CMC/OP-1 era de 5,33 \pm 0,58, comparada con
4,67 \pm 0,58 para defectos que recibieron el dispositivo de
OP-1 estándar. En general, la formación de hueso
nuevo era evidente tan tempranamente como dos semanas después de la
operación en todos los defectos. El hueso nuevo siguió densificando,
consolidándose y remodelándose hasta el sacrificio a las 12 semanas
después de la operación. La carga de rotura media de los defectos
tratados con el dispositivo de CMC/OP-1 era de 59,33
N \pm 26,77. Esto era un 70% de la carga de rotura media en los
lados contralaterales que recibieron los implantes de
OP-1 estándar. Histológicamente, el volumen final,
la calidad y el grado de remodelación eran al menos equivalentes en
defectos tratados con el dispositivo de CMC/OP-1 y
de OP-1 estándar, aunque se observó una variación de
la formación de hueso nuevo final y del grado de remodelación en
comparaciones de animal a animal. La graduación histológica media
para defectos tratados con el dispositivo de CM/OP-1
era de 12,67 \pm 1,04 de 16 puntos totales posibles. La graduación
histológica media para defectos tratados con el dispositivo de
OP-1 estándar era de 11,41 \pm 0,95 de 16 puntos
totales posibles.
Como ya se ha descrito, los dispositivos
estándar consistían en proteína osteogénica 1 humana recombinante
(rhOP-1) mezclada con matriz de colágeno de tipo I
óseo bovino a una relación de 2,5 mg de rhOP-1 por g
de matriz de colágeno. El dispositivo mejorado consistía en
rhOP-1 mezclada con matriz de colágeno de tipo I
óseo bovino y carboximetilcelulosa (CMC). Los dispositivos unitarios
se suministraron en viales estériles.
Como se describe anteriormente, el dispositivo
que contiene CMC actualmente preferido para defectos abiertos tiene
una consistencia de masilla. Se dispuso el dispositivo de
CMC/OP-1 unitario seco en un recipiente pequeño y se
mezcló con solución salina. Utilizando los dedos, el profesional
mezcló y conformó el dispositivo a la forma general del defecto y
después dispuso el dispositivo en el sitio de defecto. Se reseñó que
el dispositivo mejorado se manejaba y conformaba más fácilmente, y
no se pegaba a los guantes quirúrgicos. El dispositivo mantuvo su
integridad cuando se dispuso en el defecto durante irrigación y
durante/después de sutura.
Se utilizaron perros mestizos macho adultos
debido a sus características de reparación y remodelación óseas bien
conocidas. Todos los animales eran de al menos 2 años de edad y
pesaban de 18,14 a 22,68 kg. Todos los animales se suministraron por
Martin Creek Kennels, número USDA
71-B-108, Willowford, AK. Se prestó
una atención especial a seleccionar animales de tamaño y peso
uniforme para limitar la variabilidad de la geometría y carga óseas.
Se examinaron radiográficamente los animales antes de la operación
para asegurar un tamaño apropiado, madurez esquelética y que no
existieran anormalidades óseas obvias.
Se utilizaron un total de 3 perros macho
adultos. Se crearon defectos segmentarios bilaterales de cúbito de
2,5 cm. Todos los defectos del lado derecho recibieron el
dispositivo mejorado (dispositivo de CMC/OP-1).
Todos los defectos del lado izquierdo recibieron el dispositivo de
OP-1 estándar. Se tomaron radiografías cada dos
semanas para estudiar la progresión de la curación y se graduaron en
una escala de 0-6. En el sacrificio, se recuperaron
todos los cúbitos en bloque y, en aquellos que se habían curado
suficientemente tras manipulación manual, se ensayó mecánicamente la
torsión. Se evaluaron en los segmentos mediante histología la
respuesta de tejido, la arquitectura y remodelación óseas, y la
calidad y cantidad de formación y curación de hueso nuevo; la
graduación estaba en una escala de 0-16.
Utilizando técnicas asépticas estándar, se
realizó cirugía bajo anestesia con gas halotano. Se hizo una
incisión lateral de aproximadamente 4,0 cm de longitud y se obtuvo
la exposición del cúbito utilizando disección roma y aguda. Se creó
un defecto osteoperiostial segmentario de 2,5 cm en el cúbito medio
utilizando una sierra oscilante. Este defecto era de aproximadamente
2-2,5 veces el diámetro de eje medio, y representa
un defecto de tamaño crítico, concretamente, el defecto no se
curaría espontáneamente. Se hicieron medidas intraoperativas del
segmento de hueso retirado. Se mantuvo el radio para estabilidad
mecánica, pero no se utilizó fijación interna ni externa. Se irrigó
el sitio con solución salina para retirar los restos de hueso y
células de médula vertidas. Después de secar el sitio y conseguir la
homeostasis, se dispusieron cuidadosamente los implantes en los
defectos. Se cerraron meticulosamente los tejidos blandos en capas
para contener el implante. Se repitió después el procedimiento en el
lado contralateral.
Se obtuvieron radiografías de los miembros
anteriores cada dos semanas hasta 8 semanas después de la operación,
y después de nuevo en el sacrificio a las 12 semanas después de la
operación. Se utilizaron tiempos de exposición e intensidades
estandarizadas, y se utilizaron bolsas de arena para posicionar las
extremidades de manera consistente. Se evaluaron las radiografías y
se compararon con radiografías anteriores para apreciar la calidad y
velocidad de curación deo defecto. La graduación de las radiografías
era según la siguiente escala:
Al final del periodo de estudio, se sacrificaron
los animales utilizando una sobredosis de barbiturato intravenoso.
Se recogieron inmediatamente el cúbito y el radio en bloque y se
dispusieron en gasas empapadas con solución salina. Se
macrofotografiaron ambos cúbitos y se tomaron radiografías de
contacto con marcadores. Se separaron cuidadosamente por disección
los tejidos blandos del sitio de defecto. Se utilizó una sierra
enfriada con agua para cortar el cúbito a una longitud uniforme de 9
cm con el sitio de defecto centrado en la mitad de la muestra de
ensayo.
Inmediatamente después del seccionamiento, si la
curación se consideró suficiente por manipulación manual, se ensayó
en las muestras la rotura por torsión utilizando procedimientos
rutinarios en una máquina de ensayo hidráulica de bucle cerrado MTS
(Minneapolis, MN) operada por control de impactos a una velocidad de
desplazamiento constante de 50 mm/min. Brevemente, se montó cada
extremo del segmento óseo en un manguito de aluminio cilíndrico y se
cementó con metacrilato de metilo. Se fijó rígidamente un extremo y
se giró el otro en sentido contrario a las agujas del reloj. Puesto
que el cúbito de perro tiene una ligera curvatura, se montaron las
muestras para mantener la rotación de la muestra coaxial con la del
dispositivo de ensayo. Se aplicó la fuerza de torsión con un brazo
de palanca de 6 cm, mediante un sistema de ensayo de materiales
servohidráulico. Se hicieron registros simultáneamente del
desplazamiento del implante, medidos mediante el controlador de
impactos de la máquina, mientras que se registraba la carga en la
celda de carga. Se generaron curvas de
fuerza-desplazamiento angular, a partir de las
cuales se obtuvieron el momento y la deformación angular de rotura,
y se calculó la absorción de energía hasta rotura como el área bajo
la curva de carga-desplazamiento.
Se fijaron las muestras individuales mediante
inmersión en solución de formalina tamponada al 10% inmediatamente
después del ensayo mecánico o después del seccionamiento en muestras
no ensayadas. Se dividieron las muestras con una sierra de diamante
enfriada con agua, biseccionando la muestra a lo largo de su eje
largo. Este procedimiento daba como resultado dos porciones de cada
muestra para diferentes preparaciones histológicas, incluyendo
secciones rectificadas no descalcificadas y secciones de microtomo
no descalcificadas.
Después de la fijación, se deshidrataron las
muestras designadas para secciones no descalcificadas en soluciones
graduadas de alcohol etílico de 70 a 100%. Se dispusieron después
las muestras en metacrilato de metilo monomérico y se dejó
polimerizar. Se obtuvieron las secciones rectificadas cortando las
muestras con una sierra de seccionamiento de alta velocidad enfriada
con agua Mark V CS600-A (Grandby, CT) en secciones
de aproximadamente 700 a 1.000 \mum de grosor. Se montaron las
secciones en portaobjetos acrílicos y se rectificaron hasta 100
\mum de grosor utilizando una muela abrasiva metalúrgica, y se
hicieron microrradiografías utilizando técnicas estandarizadas.
Después de la microrradiografía, se rectificaron adicionalmente las
secciones hasta aproximadamente 50 \mum y se tiñeron con fuchsina
básica y azul de toluidina para graduación histológica que evaluara
los siguientes parámetros de reparación: calidad de la unión,
apariencia y calidad del hueso cortical y reticular, presencia de
elementos de médula ósea, remodelación ósea y respuesta
inflamatoria. La graduación de los parámetros histológicos era según
la siguiente escala:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
En este estudio, no había diferencias
significativas en las características de curación ósea radiográfica
de sitios que recibieron un dispositivo de CMC/OP-1
comparados con defectos segmentarios tratados con el dispositivo de
OP estándar. En general, era evidente la formación de hueso nuevo
tan tempranamente como dos semanas después de la operación en todos
los defectos. El hueso nuevo siguió densificando, consolidándose y
remodelándose hasta el sacrificio a las 12 semanas después de la
operación. Ocurrió el desarrollo de corteza nueva con formación de
cavidad medular temprana entre las evaluaciones de la semanas 6 y 8.
La graduación radiográfica final para defectos tratados con el
dispositivo de CMC/OP-1 era de 5,33 \pm 0,58. La
graduación radiográfica final para defectos que recibieron el
dispositivo de OP-1 estándar era de 4,67 \pm
0,58.
Como ejemplo, se exponen a continuación las
observaciones representativas específicas de uno de los animales de
ensayo:
A las 2 semanas después de la operación, estaban
presentes trazas de material radiodenso en el defecto derecho, pero
el defecto no tenía un puente completo ni estaba rellenado con hueso
nuevo. A las 4 semanas después de la operación, aumentó
significativamente la cantidad de radiodensidad de hueso nuevo. El
defecto estaba cubierto, pero el hueso nuevo no estaba bien
contenido. Había cierta consolidación de hueso nuevo a lo largo de
los bordes periostiales. Se había formado una cantidad equivalente
de hueso nuevo comparada con el defecto izquierdo de este animal. A
las 6 semanas después de la operación, aumentó la radiodensidad del
hueso nuevo y el defecto estaba completamente cubierto y
extensamente rellenado con hueso nuevo. Era evidente una
remodelación temprana, con los extremos del hueso del hospedador
empezando a incorporarse al hueso nuevo. A las 8 semanas después de
la operación, el hueso nuevo siguió remodelándose y el volumen de
hueso nuevo se aproximó mejor a los bordes del defecto. Se
incorporaron los extremos del hueso del hospedador al hueso nuevo
con densificación del hueso nuevo a lo largo de los bordes,
sugiriendo la formación de corteza nueva. No había evidencias
radiográficas de ningún material vehículo residual. En el
sacrificio, estaba presente una región radioluscente en el centro
del defecto del lado derecho, pero la densificación de los bordes de
hueso nuevo sugería la formación de corteza nueva. La graduación
radiográfica final era de 5 de 6 puntos posibles.
A las 2 semanas después de la operación, estaban
presentes trazas de material radiodenso en los defectos, pero el
defecto no tenía puente ni estaba rellenado con hueso nuevo. A las 4
semanas después de la operación, aumentó significativamente la
cantidad y radiodensidad del hueso nuevo, y el defecto estaba
cubierto y rellenado con hueso nuevo. A las 6 semanas después de la
operación, aumentó la radiodensidad del hueso nuevo y el defecto
estaba completamente cubierto y extensamente rellenado con hueso
nuevo. Era evidente remodelación temprana, y el volumen de hueso
nuevo se aproximaba mejor a los bordes del defecto. El hueso nuevo
era uniformemente denso, y los extremos del hueso del hospedador
estaban empezando a incorporarse. A las 8 semanas después de la
operación, siguió remodelándose hueso nuevo, se incorporaron los
extremos de hueso del hospedador y había empezado la densificación
del hueso nuevo a lo largo de los bordes del defecto. En el
sacrificio, la densificación de hueso nuevo a lo largo de los bordes
del defecto sugería una reformación temprana de cortezas nuevas. La
densidad del hueso nuevo en el centro del defecto era mayor que el
hueso nuevo que se había formado en el defecto del lado derecho,
aunque no había diferencias significativas en las apariencias
radiográficas de los lados derecho e izquierdo en este animal. La
graduación radiográfica final era de 5 de 6 puntos posibles.
Ambas muestras derecha e izquierda de todos los
animales tenían apariencias macroscópicas similares. En dos
animales, los defectos derecho e izquierdo estaban firmemente unidos
y tenían aproximadamente el mismo volumen de hueso nuevo. En un
tercer animal, el lado derecho e izquierdo tenían un volumen de
hueso nuevo similar, pero el lado izquierdo no estaba completamente
unido.
La carga de rotura media para defectos tratados
con el dispositivo de CMC/OP-1 era de 59,33 N \pm
26,77 (n= 3). La carga de rotura media era un 79% de la carga de
rotura media de los lados contralaterales, que recibieron los
dispositivos de OP-1 estándar. Esto representaba un
91% de la resistencia de los controles intactos ensayados
anteriormente. La deformación angular media era de 38,22 \pm 0,69
grados. La energía absorbida hasta rotura media era de 97,47 \pm
47,21 N.m/grado.
La carga de rotura media de los defectos
tratados con el dispositivo de OP-1 estándar era de
75,39 N \pm 1,88 (n= 2). Esto representaba un 115% de la
resistencia de los controles intactos ensayados anteriormente. La
deformación angular media era de 59,06 \pm 27,80 grados. La
energía absorbida hasta rotura media era de 93,40 \pm 17,49
N.m/grado. Como se observa, un defecto tratado con el dispositivo de
OP-1 estándar no se ensayó debido a inestabilidad
macroscópica.
En general, se observó la formación de hueso
nuevo consistente con los defectos tratados con el dispositivo de
rhOP-1 estándar con una matriz de colágeno. Tanto el
volumen final como la calidad y el grado de remodelación eran
equivalentes en la comparación de dispositivos de
CMC/OP-1 y OP-1 estándar. Se observó
una variación de la formación de hueso nuevo final y del grado de
remodelación en comparaciones de animal a animal. La graduación
histológica media para defectos tratados con el dispositivo de
CMC/OP-1 era de 12,67 \pm 1,04 de 16 puntos
posibles totales. La graduación histológica media para defectos
tratados con el dispositivo de OP-1 estándar era de
11,41 \pm 0,95 de un total de 16 puntos posibles.
Generalmente, ambos defectos izquierdo y derecho
estaban cubiertos por un gran volumen de hueso nuevo. El hueso nuevo
estaba empezando a reorganizarse y tenía características lamelares.
A lo largo de los bordes del defecto, el hueso nuevo se volvió más
denso, sugiriendo cortezas nuevas. En ciertos casos, la remodelación
no estaba tan uniformemente avanzada en el lado izquierdo como en el
derecho. El volumen de hueso nuevo en el lado izquierdo era
ligeramente menor que en el derecho en ciertos casos. En el centro
de todos los defectos, era evidente la vuelta de componentes
medulares.
En conclusión, se utilizaron dispositivos
osteogénicos mejorados (configuración unitaria) para reparar
defectos segmentarios de tamaño crítico. Las velocidades de
reparación ósea endocrondral, evidencias de resistencia mecánica,
evidencias radiográficas y evidencias histológicas sugerían que los
dispositivos mejorados dan como resultado una reparación de defecto
al menos comparable con los dispositivos osteogénicos estándar.
Este estudio ilustra adicionalmente la eficacia
de un dispositivo osteogénico estándar mezclado con
carboximetilcelulosa (CMC) utilizando tanto las formulaciones de
dosis estándar como baja de OP-1 para curar defectos
segmentarios grandes de tamaño crítico en el modelo de defecto
segmentario de cúbito canino.
Como se describe con detalle a continuación, se
emplearon diversas dosificaciones de OP-1 en este
estudio. Brevemente, las formulaciones de dosis baja del dispositivo
de OP-1 sin CMC se encontraron efectivas en la
inducción de la formación de hueso nuevo, pero menos que el
dispositivo de OP-1 de dosis estándar. Sin embargo,
e inesperadamente, los defectos tratados con el dispositivo que
contiene CMC de dosis baja demostraron volúmenes más tempranos y
mayores de formación de hueso nuevo comparados con el dispositivo de
OP-1 sin CMC de dosis baja. El dispositivo de
OP-1 de dosis estándar o baja se preparó combinando
1 g de dispositivo de OP-1 con 3,2 ml de solución
salina estéril. El dispositivo de OP-1 de dosis
estándar o baja que contiene CMC se preparó combinando 1 g de
dispositivo de OP-1 con 0,2 g de CMC y
aproximadamente 2 ml de solución salina estéril. Se prepararon los
dispositivos intraoperativamente. Los sitios tratados con
OP-1 de dosis estándar con y sin CMC tenían
radiográficamente apariencias radiográficas similares. Los sitios de
OP-1 de dosis estándar tenían volúmenes más
tempranos y mayores de formación de hueso nuevo comparados con los
sitios de dosis baja. Los resultados histológicos demostraron una
curación de defecto segmentario de hueso más avanzada en sitios
tratados con el dispositivo que contiene CMC comparados con el
dispositivo de OP-1 estándar. Los sitios tratados
con dispositivo de OP-1 de dosis baja que contiene
CMC consiguieron un grado equivalente de remodelación e
incorporación al hueso del hospedador respecto a sitios tratados con
el dispositivo de OP-1 de dosis estándar, pero el
volumen de hueso nuevo inducido fue menor. Los sitios de defecto
tratados con el dispositivo de dosis estándar que contiene CMC
obtuvieron la mayor carga torsional de rotura media a las 12 semanas
después de la operación, comparados con todos los demás grupos de
tratamiento (61,91 \pm 35,37 N, un 95% de la resistencia a la
torsión de controles intactos). La resistencia a la torsión de los
sitios de dispositivo de dosis baja que contiene CMC era similar a
la del dispositivo de OP-1 estándar, que tiene un
78% de la resistencia de cúbitos intactos y un 99% de la resistencia
de los sitios ensayados anteriormente tratados con el dispositivo
estándar. En contraposición, la resistencia a la torsión de los
sitios de OP-1 de dosis baja sin CMC era sólo un 44%
de la resistencia a la torsión de cúbitos intactos y un 56% de los
defectos segmentarios ensayados anteriormente tratados con el
dispositivo de OP-1 estándar.
El dispositivo de OP-1 estándar
(designado OP en la Tabla 11) consistía en proteína osteogénica 1
humana recombinante (rhOP-1) mezclada con matriz de
colágeno de tipo I óseo bovino a una relación de 2,5 mg de
rhOP-1/g de matriz de colágeno. Un dispositivo de
CMC (dosis estándar, designado OP-1/CMC, OPCMC en la
Tabla 11) consistía en un dispositivo de OP-1
combinado con carboximetilcelulosa. El dispositivo de
OP-1 de dosis baja consistía en 1,25 mg de
rhOP-1/g de matriz de colágeno (designado LOP en la
Tabla 10). Cada dispositivo de OP-1 a dosis tanto
estándar como baja consistía en 1 g de dispositivo envasado
separadamente de la CMC. La CMC se envasó a 200 mg por vial. Esto
está en contraposición con el dispositivo unitario descrito
anteriormente, en el que la CMC se coenvasaba con los demás
componentes de matriz de colágeno y proteína osteogénica.
Se utilizaron un total de 12 perros mestizos
adultos. Se crearon defectos segmentarios bilaterales de cúbito de
tamaño crítico de 2,5 cm. Los defectos del lado derecho de seis
animales recibieron el dispositivo de OP-1 estándar.
Los defectos del lado izquierdo de este grupo recibieron los
dispositivos de OP-1/CMC de dosis estándar. El
segundo grupo de seis animales recibió los dispositivos de
OP-1 de dosis baja en el defecto del lado derecho, y
recibió los dispositivos de OP-1/CMC de dosis baja
en los defectos del lado izquierdo. Se tomaron radiografías cada dos
semanas para estudiar la progresión de la curación. En el
sacrificio, se recuperó todo en bloque y se ensayó mecánicamente la
torsión. Se evaluaron en los segmentos de cúbito mediante histología
la respuesta de tejido, el implante residual y la calidad y cantidad
de formación y curación de hueso nuevo.
Como se describe anteriormente, se utilizaron
perros mestizos macho adultos debido a su tamaño anatómico y
características de reparación y remodelación óseas conocidas. Todos
los animales eran esqueléticamente maduros y pesaban de 18,14 a
22,68 kg.
Utilizando técnicas quirúrgicas estándar
similares a las descritas anteriormente, se hizo una incisión
lateral de aproximadamente 4 cm de longitud y se obtuvo la
exposición del cúbito utilizando disección roma y aguda. Se creó un
defecto osteoperiostial segmentario de 2,5 cm en el cúbito medio
utilizando una sierra oscilante. El defecto era de aproximadamente
2-2,5 veces el diámetro del eje medio, y
representaba un defecto de tamaño crítico, concretamente, el defecto
no se curaría espontáneamente. Se hicieron medidas intraoperativas
del segmento de hueso retirado. Se registraron la longitud del
segmento, los dos diámetros externos del segmento y el diámetro
central del segmento en milímetros en los registros quirúrgicos. Se
mantuvo el radio para estabilidad mecánica. Se irrigó el sitio con
solución salina para retirar los desechos óseos y células de médula
vertidas. Después de secar el sitio y conseguir la homeostasis, se
dispusieron los implantes en el defecto. Se cerraron los tejidos
blandos en capas para contener el implante. Se repitió después el
procedimiento en el sitio contralateral.
Como se describe anteriormente, se obtuvieron
radiografías de los miembros anteriores cada dos semanas hasta las 8
semanas después de la operación, y después de nuevo en el sacrificio
a las 12 semanas después de la operación.
Los procedimientos fueron similares a los
descritos anteriormente. Al final del periodo de estudio, se
sacrificaron los animales, se recogieron inmediatamente cúbito y
radio en bloque y se dispusieron en gasas empapadas de solución
salina. Se separaron cuidadosamente por disección los tejidos
blandos del sitio de defecto. Se utilizó una sierra de cinta para
cortar el cúbito a una longitud uniforme de 9 cm con el sitio de
defecto centrado en la mitad de la muestra de ensayo
Los protocolos fueron similares a los descritos
anteriormente. Brevemente, se ensayó en muestras la torsión de
rotura en una máquina de ensayo hidráulica de bucle cerrado MTS
(Minneapolis. MN) operada por control de impactos a una velocidad de
desplazamiento constante de 50 ml/min. Se aplicó fuerza de torsión
con un brazo de palanca de 6 cm mediante un sistema de ensayo de
materiales servohidráulico. Se hicieron registros simultáneos del
desplazamiento de implante, medidos por el controlador de impactos
de la máquina, mientras se registraba la carga en la celda de carga.
Se generaron curvas de fuerza-desplazamiento
angular, a partir de las cuales se obtuvieron el momento y la
deformación angular de rotura, y se calculó la energía de absorción
hasta rotura como el área bajo la curva de
carga-desplazamiento.
Como se describe anteriormente, se deshidrataron
muestras fijadas designadas para secciones no descalcificadas en
soluciones de alcohol etílico graduadas de 70% a 100%. Se
dispusieron después las muestras en metacrilato de metilo monomérico
y se dejaron polimerizar. Se obtuvieron las secciones rectificadas
cortando las muestras con una sierra de seccionamiento de alta
velocidad enfriada con agua en secciones de aproximadamente 700 a
1.000 \mum de grosor. Se montaron estas secciones en portaobjetos
acrílicos y se rectificaron hasta 100 \mum de grosor. Después de
la microrradiografía rutinaria, se rectificaron adicionalmente las
secciones hasta aproximadamente 50 \mum y se tiñeron con fuchsina
básica y azul de toluidina para graduación histológica que evaluara
los siguientes parámetros de reparación: calidad de la unión,
apariencia y calidad del hueso cortical y reticular, presencia de
elementos de médula ósea, remodelación ósea y respuesta
inflamatoria.
A las 12 semanas después de la operación
(sacrificio), los sitios de OP-1/CMC de dosis
estándar conseguían la mayor graduación radiográfica media, 5,17/6,0
puntos. La graduación radiográfica final para los dispositivos de
OP-1 estándar era de 5,00/6,00. Los sitios de
OP-1 de dosis baja tenían una graduación
radiográfica final media de 3,83/6,00. Los sitios de
OP-1/CMC de dosis baja tenían una graduación media
de 4,67/6,0. En todos los periodos de tiempo, los sitios de
OP-1/CMC de dosis estándar tenían graduaciones
radiográficas medias mayores que la OP-1 estándar
sin CMC. A todos los periodos de tiempo, los sitios de
OP-1/CMC de dosis baja tenían mayores graduaciones
radiográficas medias que los sitios de OP-1 de dosis
baja sin CMC.
El análisis estadístico demostró un efecto
significativo del tipo de implante cuando se combinaban todas las
graduaciones (análisis de varianza de un factor de
Kruskal-Wallis, p= 0,0049). Múltiples comparaciones
demostraron que las graduaciones radiográficas medias de los
dispositivos de OP-1 estándar y
OP-1/CMC de dosis estándar para todos los periodos
de tiempo eran significativamente mayores que en los sitios de
OP-1 de dosis baja sin CMC (a \alpha= 0,10 y
\alpha= 0,05, respectivamente). Múltiples comparaciones
demostraron también que la graduación radiográfica media de los
sitios de OP-1/CMC de dosis estándar era
significativamente mayor que en los sitios de
OP-1/CMC de dosis baja (a= 0,10). Sin embargo, e
inesperadamente, las graduaciones radiográficas medias de los
dispositivos de OP-1 de dosis estándar no eran
significativamente mayores que las graduaciones radiográficas medias
de los sitios de OP-1/CMC de dosis baja.
A las 2 semanas después de la operación, era
evidente la formación de hueso nuevo en uno de los seis defectos
tratados con OP-1 de dosis baja. Estaban presentes
trazas de material radiodenso alrededor del defecto, pero el hueso
nuevo no formaba puente ni cubría el defecto. La graduación
radiográfica media a las 2 semanas después de la operación era de
0,17/60 puntos. A las 4 semanas después de la operación, el mismo
sitio que demostró formación de hueso nuevo a las 2 semanas,
demostró un aumento del volumen de hueso nuevo. Estaban cubiertos
cuatro defectos y un defecto estaba rellenado con hueso nuevo a las
4 semanas. Dos sitios demostraron poca actividad a las 4 semanas
después de la operación. La graduación radiográfica media a las 4
semanas era de 1,83/6,0. A las 6 semanas después de la operación,
dos sitios tratados con OP-1 de dosis baja estaban
cubiertos y rellenados con hueso nuevo. Dos sitios estaban
cubiertos, pero incompletamente rellenados con hueso nuevo. Un
animal demostró cierta formación temprana de hueso nuevo. Un animal
no demostró ninguna formación de hueso nuevo. La graduación
radiográfica media a las 6 semanas era de 2,83/6,00. De 6 a 8
semanas, no era evidente la formación de hueso nuevo adicional, pero
se manifestaba cierta densificación de hueso nuevo y había ocurrido
cierta remodelación temprana. La graduación radiográfica media a las
8 semanas era de 3,17/6,0. En el sacrificio, 12 semanas después de
la operación, todos los defectos demostraron algo de hueso nuevo
bien contenido, pero la densidad era significativamente menor que el
hueso del hospedador circundante. Estaban presentes radioluscencias
ocasionales en la unión de hueso de hospedador/hueso nuevo. La
graduación radiográfica media a las 12 semanas era de 3,83/6,0.
A las 2 semanas después de la operación, era
evidente la formación temprana de hueso nuevo en tres de seis
defectos tratados con OP-1/CMC de dosis baja. El
hueso nuevo no cubría ni rellenaba los defectos, pero estaba bien
contenido en los sitios quirúrgicos. La graduación radiográfica
media a las 2 semanas era de 0,83/6,0. A las 4 semanas después de la
operación, estaba presente la formación de hueso nuevo en cinco de
seis defectos, cubriendo y casi rellenando los defectos. La
graduación radiográfica media a las 4 semanas era de 2,33/6,0. A las
6 semanas, aumentó la densidad de hueso nuevo presente en los
defectos. Era evidente la incorporación temprana del hueso del
hospedador en tres de seis defectos. Un animal no demostró ninguna
formación de hueso nuevo bilateralmente a las 6 semanas. La
graduación radiográfica media en este momento era de 3,00/6,0. De 6
a 8 semanas, no ocurrió formación adicional de hueso nuevo. Se
manifestaron remodelación temprana e incorporación al hueso del
hospedador. Un animal no demostró ningún cambio en la apariencia
radiográfica. La graduación radiográfica media a las 8 semanas era
de 3,33/6,0. Inesperadamente, los sitios de OP-1/CMC
a dosis baja demostraron una formación de hueso nuevo y remodelación
más extensas que los sitios de OP-1 a dosis baja sin
CMC. En sitios en que el defecto estaba completamente rellenado con
hueso nuevo, la densidad del hueso nuevo era menor que el hueso del
hospedador circundante. La graduación radiográfica media a las 12
semanas (sacrificio) era de 4,67/6,0.
Los resultados de este estudio eran consistentes
con todos los estudios previos del dispositivo de
OP-1 estándar. A las 2 semanas después de la
operación, cuatro de seis defectos tratados con el dispositivo de
OP-1 demostraron formación temprana de hueso nuevo.
En dos defectos, el hueso nuevo cubría extensamente los defectos,
pero el hueso nuevo no rellenaba los defectos. Globalmente, el hueso
nuevo no estaba bien contenido. La graduación radiográfica media a
las 2 semanas era de 1,50/6,0. A las 4 semanas después de la
operación, ocurrió un aumento de la cantidad y densidad de hueso
nuevo en los seis defectos. El hueso nuevo cubría todos los
defectos. En cuatro de seis sitios, el defecto aparecía
completamente rellenado con hueso nuevo. La graduación radiográfica
media a las 4 semanas era de 3,00/6,0. A las 6 semanas después de la
operación, aumentó la densidad de hueso nuevo. El hueso nuevo no
estaba bien contenido en los defectos restantes. Generalmente, se
observó incorporación temprana en los extremos de hueso del
hospedador en tres de seis sitios. La graduación radiográfica media
a las 6 semanas era de 3,67/6,0. De 6 a 8 semanas, era evidente una
incorporación casi completa al hueso del hospedador en tres de seis
sitios, aunque la remodelación hacia los contornos del cúbito había
ocurrido en todos los defectos. La graduación radiográfica media a
las 8 semanas era de 4,50/6,0. A las 12 semanas después de la
operación (sacrificio), había ocurrido una remodelación extensa,
aunque el volumen de hueso nuevo no se aproximaba todavía a los
contornos del cúbito. A menudo, se extendía hueso nuevo en los
tejidos blandos circundantes, aunque se manifestaba cierta
reformación de cortezas en todos los defectos tratados con el
dispositivo de OP-1 estándar. La graduación
radiográfica media a las 12 semanas era de 5,00/6,00.
A las 2 semanas después de la operación, era
evidente la formación temprana de hueso nuevo en cuatro de seis
defectos tratados con el dispositivo de OP-1/CMC. El
hueso nuevo estaba bien contenido en sólo uno de los cuatro
defectos. Parecía que el hueso nuevo cubría y rellenaba dos de los
seis defectos. La graduación radiográfica media a las 2 semanas era
de 1,67/6,0. A las 4 semanas después de la operación, había ocurrido
la formación de hueso nuevo extenso en todos los seis defectos. El
hueso nuevo no estaba bien contenido, pero se observó la
incorporación temprana al hueso del hospedador en dos sitios. La
graduación radiográfica media a las 4 semanas era de 1,67/6,0. De 4
a 6 semanas, ocurrió una remodelación extensa e incorporación del
hueso del hospedador en todos los defectos. El hueso nuevo no
estaba bien contenido, pero había empezado a resorberse hueso nuevo
en el tejido blando. La graduación radiográfica media a las 6
semanas era de 4,33/6,0. A las 8 semanas, se apreciaba la
incorporación completa al hueso del hospedador en dos sitios, y era
evidente la formación temprana de corteza nueva en al menos un
sitio. La graduación radiográfica media a las 8 semanas era de
4,67/6,0. A las 12 semanas después de la operación (sacrificio),
tres de seis defectos tenían incorporación extensa a los extremos
del hueso del hospedador. Estaba todavía presente hueso nuevo fuera
de los defectos, aunque había ocurrido una extensa remodelación. La
graduación radiográfica media a las 12 semanas era de 5,17/6,0.
Los sitios tratados con implantes de dosis baja
con y sin CMC demostraron menos volumen de hueso nuevo comparados
con los sitios de OP-1 de dosis alta con y sin CMC.
Todos los sitios de dosis alta estaban firmemente unidos
macroscópicamente, pero tres de los doce sitios tratados con
OP-1 de dosis baja no estaban todavía firmemente
unidos en el sacrificio.
En todos las casos, la cantidad de hueso nuevo
formado no superaba el volumen de defecto original. La formación de
hueso nuevo estaba bien contenida, aunque en dos de seis segmentos
el hueso no estaba completamente uni-
do.
do.
De forma similar a los defectos tratados con
OP-1 de dosis baja, la formación de hueso nuevo
estaba bien contenida. Uno de seis sitios tratados con
OP-1/CMC de dosis baja no estaba completamente
unido. Típicamente, el volumen de hueso nuevo era menor que el
volumen de defecto original.
De forma similar a estudios previos, el volumen
de hueso nuevo en sitios tratados con el dispositivo de
OP-1 estándar era 2 a 3 veces mayor que el volumen
de defecto original. Todos los defectos estaban firmemente unidos.
En cinco de seis defectos, se extendía hueso nuevo extensivamente en
los tejidos blandos y se fusionaba con el radio. En un defecto, el
volumen de hueso nuevo formado era menor que en los otros
sitios.
El volumen de hueso nuevo en cinco de seis
defectos tratados con OP-1/CMC superaba el volumen
de hueso del hospedador original y se extendía en los tejidos
blandos. El volumen de hueso nuevo era 2 a 3 veces el volumen del
defecto original. Como se observa anteriormente en un animal, el
volumen de hueso reducido se observó bilateralmente.
Los resúmenes de ensayo mecánico aparecen en las
Tablas 7 y 8.
Inesperadamente, los sitios de defecto tratados
con el dispositivo de OP-1/CMC de dosis estándar
obtuvieron la carga media de rotura por torsión mayor a las 12
semanas después de la operación, comparados con todos los demás
grupos de tratamiento, incluyendo el grupo de dispositivo estándar.
La carga de rotura media era de 61,91 \pm 35,37 N (n= 6). Esto
representaba un 95% de la resistencia a la torsión de los cúbitos
intactos anteriormente ensayados y un 121% de la resistencia de
defectos segmentarios anteriormente ensayados tratados con el
dispositivo de OP-1 estándar. Los sitios tratados
con el dispositivo de OP-1 estándar tenían una
resistencia a la torsión media de 55,84 \pm 37,26 N (n= 6), un
86% de los cúbitos de control intactos anteriormente ensayados y un
110% de los defectos segmentarios anteriormente ensayados tratados
con el dispositivo de OP-1. La carga de rotura media
para los sitios OP-1/CMC de dosis baja era de 50,66
\pm 31,68 N (n= 5) o un 78% de la resistencia de los cúbitos de
control intactos y un 99% de los defectos segmentarios anteriormente
ensayados tratados con el dispositivo de OP-1
estándar. La carga de rotura media para los sitios de
OP-1 de dosis baja era de 28,72 \pm 14,71 N (n=
4). Esto representaba un 44% de la resistencia a la torsión de
cúbitos de control intactos anteriormente ensayados y un 56% de
defectos segmentarios anteriormente ensayados tratados con el
dispositivo de OP-1 estándar.
Inesperadamente, los test t apareados de la
carga de rotura en animales demostraron un efecto significativo para
el tipo de implante cuando se compararon dispositivos estándar de
OP-1 de dosis baja con dispositivos de
OP-1/CMC de dosis baja (p= 0,0597). La carga media
apareada para sitios OP-1 de dosis baja era de 28,72
\pm 14,71 (4). La carga de rotura media apareada para los sitios
de OP-1/CMC de dosis baja era de 62,89 \pm 18,47
(4). No se encontró una diferencia significativa en los test t
apareados de carga de rotura media de dispositivos de
OP-1 estándar comparada con la carga de rotura media
de dispositivo de OP-1/CMC de dosis estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Inesperadamente, los sitios tratados con el
dispositivo de OP-1/CMC de dosis estándar
consiguieron la mejor puntuación histológica media, 12,08/16,0
puntos. Los sitios de OP-1/CMC de dosis bajas
consiguieron una puntuación de 11,07/16,0, ligeramente mayor que la
puntuación histológica media para los sitios de dispositivos de
OP-1 estándar, 10,88/16,0. La graduación histológica
media para los sitios de OP-1 de dosis baja era de
9,58/16,0 puntos.
El análisis estadístico de las graduaciones
histológicas medias por grupo de tratamiento demostró un efecto
significativo para el tipo de implante (análisis de varianza de un
factor de Kruskal-Watlis, p= 0,0282). Comparaciones
múltiples de medias de grupo demostraron que la graduación total
media para los sitios de OP-1/CMC de dosis estándar
era significativamente mayor que en los sitios de
OP-1 de dosis baja sin CMC (a \alpha= 0,05).
El análisis estadístico de la graduación de la
calidad de unión demostró también un efecto significativo para el
tipo de implante. Inesperadamente, la calidad media de graduación de
unión para los sitios de OP-1/CMC de dosis estándar
(3,5/4,0) era de nuevo significativamente mayor que en los sitios de
OP-1 de dosis baja (2,6/4,0 a \alpha= 0,05). No se
encontraron diferencias significativas para el tipo de implante
cuando se compararon graduaciones medias para desarrollo de corteza,
implante residual y respuesta inflamatoria.
Era manifiesta la formación de hueso nuevo en
todos los defectos tratados con OP-1 de dosis baja,
pero la cantidad de hueso nuevo en el defecto a menudo no rellenaba
el defecto y no era continua con los extremos del hueso del
hospedador. En un sitio, el defecto se unía histológicamente de
forma completa. El hueso nuevo estaba en las etapas tempranas de
organización y remodelación. Eran también evidentes algunas zonas de
hueso recién mineralizado.
Los sitios de OP-1/CMC de dosis
baja tenían una apariencia histológica similar comparados con los
sitios de OP-1 de dosis baja. Sin embargo, e
inesperadamente, el hueso nuevo era continuo con el hueso del
hospedador más frecuentemente en los sitios de
OP-1/CMC de dosis baja comparados con los sitios de
OP-1 de dosis baja. En casos en que el hueso era
continuo con el hueso del hospedador, eran manifiestas remodelación
temprana y densificación de los bordes del hueso nuevo. En casos en
que la curación de hueso nuevo no era completa, eran manifiestas
zonas de hueso recién mineralizado, así como zonas de tejidos
fibrosos en el defecto. En general, el hueso nuevo no estaba bien
contenido. Se observaron algunas zonas de remodelación avanzada a lo
largo de los bordes del defecto.
La formación extensa de hueso nuevo formaba
puente en todos los defectos. Había ocurrido la densificación
temprana de los bordes de hueso nuevo. En algunos casos, las zonas
de hueso recién mineralizado se unían a zonas de hueso maduro. En el
centro de los defectos, estaban presentes ocasionales zonas pequeñas
de material vehículo residual. No se observó respuesta inflamatoria.
El hueso nuevo se extendía en los tejidos blandos. La remodelación
estaba más avanzada en los bordes de defecto/hueso nuevo. El hueso
se había remodelado a una estructura lamelar en estas zonas.
No había diferencias marcadas en la apariencia
histológica entre los sitios de OP-1 estándar y los
sitios de OP-1/CMC de dosis estándar. El hueso nuevo
extenso cubría y rellenaba los defectos. La remodelación más extensa
ocurría en los bordes de hueso nuevo/hueso del hospedador. El hueso
remodelado tenía una estructura lamelar en estas zonas. Era evidente
la densificación de nuevas cortezas, pero aún incompleta. Se
observaron ocasionales cantidades pequeñas de material vehículo
residual atrapado circundadas por la formación de hueso nuevo. No
había respuesta inflamatoria asociada.
Los dispositivos osteogénicos mejorados
indujeron inesperadamente volúmenes más tempranos y más grandes de
formación de hueso nuevo a dosis bajas de OP-1 que
los inducidos por dispositivos estándar a dosis bajas de
OP-1. Además, e inesperadamente, los sitios de
defecto tratados con dispositivos osteogénicos mejorados
consiguieron la carga de rotura por torsión media mayor a las 12
semanas después de la operación. Histológicamente, los dispositivos
mejorados consiguieron inesperadamente la mayor puntuación media y
demostraron más frecuentemente hueso nuevo continuo con hueso de
hospedador.
Se realizó este estudio de hueco de tamaño no
crítico para evaluar las configuraciones inyectables de dispositivos
osteogénicos mejorados. El diseño de estudio utilizó un hueco de 3
mm en el modelo de 4 semanas. El estudio evaluó la curación del
defecto después de la inyección de la configuración de
OP-1/CMC/matriz de colágeno. La pata contralateral
de cada animal era un control. Además, se evaluó un curso
cronológico de curación para un defecto no tratado a las 4, 8 y 12
semanas.
Los detalles del protocolo utilizado se resumen
a continuación.
Se utilizaron perros mestizos macho (18) criados
a propósito en este estudio debido a su tamaño anatómico y
características de reparación y remodelación óseas conocidas. Los
animales eran de aproximadamente 2 a 4 años de edad al inicio del
estudio y pesaban 20 a 30 kg (aproximadamente). Se examinaron
radiográficamente los animales para asegurar un tamaño apropiado,
madurez esquelética y que no existiera ninguna anormalidad ósea
obvia.
Se ensayaron formulaciones osteogénicas
mejoradas que comprenden proteína osteogénica 1 humana recombinante
(rhOP-1) en una matriz de colágeno mezclada con CMC.
Los controles consistían en dispositivo ficticio solo.
Formulación 1: 0,350 mg de
rhOP-1 en 100 \mul de gel fr CMC (al 7%) sin
matriz de colágeno
Formulación 2: 0,350 mg de
rhOP-1 en 100 \mul de tampón acetato/lactosa
Formulación 3: 0,350 mg de
rhOP-1 en 170 \mul de matriz de
colágeno-CMC humedecida con solución salina
Control 1: 0 mg de rhOP-1 en 100
\mul de gel
Control 2: 0 mg de rhOP-1 en 100
\mul de tampón acetato/lactosa
Control 3: 0 mg de rhOP-1 en 170
mg de matriz de colágeno-CMC humedecida con solución
salina.
Se crearon defectos segmentarios bilaterales de
cúbito de 3 mm en todos los animales. Nueve animales recibieron una
de las tres formulaciones de ensayo experimentales en el defecto del
lado derecho, de tal modo que se estudiaron tres sitios de cada
tipo. El defecto derecho se implantó con dispositivo ficticio. Se
sacrificaron estos animales a las 4 semanas después de la operación.
Los restantes nueve animales recibieron defectos no implantados
bilateralmente y se sacrificaron a periodos de 4, 8 y 12 semanas
(tres en cada periodo de tiempo). Como se discute anteriormente, se
tomaron radiografías para estudiar la progresión de la curación. La
determinación final de las fechas de sacrificio de los nueve
animales que reciben formulaciones de rhOP-1 se basó
en las radiografías semanales. En el sacrificio, se recuperaron
todos los cúbitos en bloque y se ensayó mecánicamente la torsión. Se
evaluaron en los segmentos mediante histología, como se describe
anteriormente, la respuesta de tejido, y la calidad y cantidad de la
formación de hueso nuevo, y la extensión de la curación.
Utilizando técnicas quirúrgicas estándar, se
hizo una incisión lateral de aproximadamente 2 cm de longitud y se
obtuvo la exposición del cúbito utilizando disección roma y aguda.
Se creó el defecto de 3 mm en el cúbito medio derecho utilizando una
sierra oscilante. Se mantuvo el radio para estabilidad mecánica,
pero no se utilizó fijación interna ni externa. Se cerraron
meticulosamente los tejidos blandos en capas alrededor del defecto.
Se inyectó después la muestra de rhOP-1 o
dispositivo ficticio en el sitio como según el esquema de
tratamiento. Se repitió después el procedimiento en el lado
contralateral con la muestra apropiada.
Se obtuvieron semanalmente radiografías de los
miembros anteriores hasta 6 semanas después de la operación y
después cada 2 semanas hasta las 12 semanas en los animales
supervivientes. Se obtuvo una radiografía de rayos X adicional en
los animales restantes en el sacrificio a las 12 semanas después de
la operación. Se graduaron las radiografías por el investigador en
una escala de graduación de 0 a 6, y se compararon con radiografías
anteriores para apreciar la calidad y velocidad de la curación de
defecto.
Como se discute anteriormente, se sacrificaron
los animales en los momentos designados, y se recogieron
inmediatamente el cúbito y el radio en bloque. Se macrofotografiaron
ambos cúbitos y se tomaron radiografías de contacto. Se separaron
meticulosamente por disección los tejidos blandos del sitio de
defecto. Se utilizó una sierra enfriada con agua para cortar el
cúbito a una longitud uniforme de 9 cm con el sitio de defecto
centrado en la mitad de la muestra de ensayo. Inmediatamente después
del seccionamiento, se ensayó en la muestra la torsión de rotura en
una máquina de ensayo hidráulica de bucle cerrado MTS (Minneapolis,
MN) como se describe anteriormente.
Se prepararon tanto las muestras ensayadas como
no ensayadas para evaluación histológica como ya se ha descrito
anteriormente. Después de la microrradiografía, se rectificaron
adicionalmente las secciones hasta aproximadamente 50 \mum y se
tiñeron con fuchsina básica y azul de toluidina para la evaluación
histológica de los parámetros de reparación, incluyendo: la calidad
de la unión, la apariencia y calidad del hueso cortical y reticular,
y la respuesta inflamatoria.
Se evaluaron las estadísticas descriptivas de
ensayo mecánico, graduación radiográfica e histología para
caracterizar la curación.
Se recogieron las siguientes observaciones y
datos representativos hasta la fecha (4 semanas después de la
operación):
Los resúmenes de ensayo mecánico aparecen en las
Tablas 9, 10 y 11. La Tabla 11 es un resumen de los sujetos de
control en experimentos previos no relacionados. Generalmente, y en
conjunto, los resultados de este estudio indican que los animales
tratados con OP-1 exhiben una curación acelerada.
Los defectos tratados con OP-1 curaron en un tercio
a la mitad del tiempo que los controles no tratados. Adicional, e
inesperadamente, la formación de CMC/OP-1/colágeno
daba como resultado una mejor contención de hueso que la observada
en ausencia de CMC. Estas observaciones se confirmaron mecánica,
radiográfica e histológicamente.
Los dispositivos osteogénicos que contienen CMC
(configuración inyectable) pueden utilizarse para reparar defectos
segmentarios de cúbito de 3 mm de tamaño no crítico en un sitio de
defecto cerrado.
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Resultados de ensayo
mecánico
Resultados de ensayo
mecánico
El siguiente es un estudio experimental
comparativo de la eficacia de formulaciones de
rhOP-1 que contienen CMC inyectables para acelerar
la curación de fractura en perros.
Se utilizaron perros mestizos macho adultos
criados a propósito en este estudio. Se prestó especial atención a
seleccionar animales de tamaño y peso uniformes para limitar la
variabilidad de la geometría y carga óseas. Se examinaron clínica y
radiográficamente los animales para excluir afecciones médicas
agudas y crónicas durante un periodo de cuarentena de dos
semanas.
Utilizando técnicas asépticas estándar, se
realizó cirugía bajo anestesia con gas isofluorano y se monitorizó
mediante electrocardiograma y monitores de ritmo cardiaco. Se
administró la medicación prequirúrgica aproximadamente
20-30 minutos antes de la inducción de anestesia. La
medicación prequirúrgica consistía en atropina (dosificación 0,044
mg/kg de peso corporal) y acepromizina (dosificación de 0,22 mg/kg
de peso corporal). Se administró la anestesia mediante inyección
intravenosa de pentotal de sodio a la dosificación de 11,04 mg/kg de
peso corporal. Después de la inducción, se dispuso un tubo
endotraqueal y se mantuvo la anestesia mediante inhalación de
isofluorano. Se prepararon ambos miembros anteriores y cubrieron de
modo estéril. Se hizo una incisión lateral de aproximadamente 2 cm
de longitud y se obtuvo la exposición del cúbito utilizando
disección roma y aguda. Se creó el defecto de tamaño no crítico de
3,0 mm en el cúbito medio utilizando una sierra oscilante. Se
mantuvo el radio para estabilidad mecánica, y no se utilizó fijación
interna ni externa. Se irrigó el sitio con solución salina y se
cerraron meticulosamente los tejidos blandos en capas alrededor del
defecto. Se inyectó el dispositivo de implante apropiado en el sitio
de defecto como según
el esquema de tratamiento. Se repitió después el procedimiento en el lado contralateral con el implante apropiado.
el esquema de tratamiento. Se repitió después el procedimiento en el lado contralateral con el implante apropiado.
Se administraron acepromizina (0,75
cm^{3}/22,65 kg de peso corporal) y tartrato de butorfanol (0,055
mg/kg de peso corporal) según fuera necesario después de la
operación. Se administraron antibióticos por vía intramuscular a los
animales durante cuatro días después de la cirugía, y se tomaron
radiografías anteroposteriores rutinarias inmediatamente después de
la cirugía para asegurar una colocación quirúrgica apropiada. Se
mantuvieron los animales en jaulas de recuperación de 91,44 x 121,92
cm hasta que se demostró que soportaban su peso, después de lo cual
se transfirieron a carreras y movimiento no restringido
permitidos.
Se obtuvieron semanalmente radiografías de los
miembros anteriores hasta las 4 semanas, y después cada dos semanas
hasta las 16 semanas en los animales supervivientes utilizando
tiempos e intensidades de exposición estandarizados. Se evaluaron
las radiografías y se compararon con radiografías anteriores para
apreciar la calidad y velocidad de curación del defecto. Se
evaluaron los cambios en la apariencia radiográfica basándose en la
presencia y densidad de formación de hueso nuevo; la extensión de la
formación de puente en el defecto y la incorporación de las cortezas
de hueso del hospedador.
Los materiales de implante consistían en
proteína osteogénica 1 humana recombinante (rhOP-1)
en una formulación de tampón acetato y rhOP-1 en
CMC-colágeno. Se compararon las formulaciones de
rhOP-1 con controles de sólo vehículo. La
formulación de rhOP-1 en tampón acetato consistía en
OP-1 3,5 mg/ml en un tampón lactosa/acetato
suministrado en un volumen de 100 \mul. El control de vehículo
consistía en un volumen de 100 \mul de tampón lactosa/acetato. La
formulación de rhOP-1/CMC-colágeno
consistía en 0,35 mg de rhOP-1 en 170 mg de matriz
de CMC-colágeno humedecida con aproximadamente 0,43
ml de solución salina, y tenía la consistencia de una pasta. La
CMC-colágeno de control consistía en 170 mg de
matriz de CMC-colágeno humedecida con
aproximadamente 0,43 ml de solución salina, y se suministró también
en un volumen inyectable de 100 \mul.
Se utilizaron un total de 36 perros mestizos
adultos. Se crearon defectos segmentarios bilaterales de cúbito de
3,0 mm de longitud en todos los animales. Catorce animales
recibieron una inyección de formulación de 0,35 mg de
rhOP-1/tampón acetato en un defecto y el tampón
acetato sin rhOP-1 en el defecto contralateral.
Nueve animales recibieron una inyección de 3,5 mg de formulación de
rhOP-1/CMC-colágeno en un defecto y
CMC-colágeno solo en el defecto contralateral. Se
sacrificaron los 23 animales a periodos de 4, 8 y 12 semanas después
de la operación. Trece perros recibieron defectos bilaterales sin
implante (sólo defecto) y se evaluaron en periodos de 4, 8, 12 y 16
semanas después de la operación.
Al final del periodo de ensayo, se sacrificaron
los animales utilizando una sobredosis de barbiturato intravenoso.
Se recogieron inmediatamente el cúbito y el radio en bloque y se
dispusieron en gasas empapadas de solución salina. Se
macrofotografiaron ambos cúbitos y se tomaron radiografías de
contacto antes de separar cuidadosamente por disección los tejidos
blandos del sitio de defecto. Se utilizó después una sierra enfriada
con agua para cortar el cúbito a una longitud uniforme de 9 cm con
el defecto centrado en la mitad de la muestra de ensayo para
evaluación de ensayo biomecánico.
Si la curación del defecto era suficiente
basándose en manipulación manual, se ensayó en las muestras la
torsión de rotura en una máquina de ensayo hidráulica de bucle
cerrado MTS (Minneapolis, MN) operada por control de impactos a una
velocidad de desplazamiento constante de 50 mm/min. Se montó cada
extremo del segmento óseo en un manguito de aluminio cilíndrico y se
cementó con metacrilato de metilo. Se fijó rígidamente un extremo y
se giró el otro en sentido contrario a las agujas del reloj. Puesto
que el cúbito de perro tiene una ligera curvatura, se montaron las
muestras excéntricamente para mantener la rotación de la muestra
coaxial con la del dispositivo de ensayo. Se aplicó la fuerza de
torsión con un brazo de palanca de 6 cm. Se generaron curvas de
fuerza-desplazamiento angular, a partir de las
cuales se obtuvieron el momento y la deformación angular de rotura,
y se calculó la absorción de energía hasta rotura como el área bajo
la curva de carga-desplazamiento.
Se prepararon tanto las muestras ensayadas como
no ensayadas para evaluación histológica. Se fijaron las muestras
individuales mediante inmersión en solución de formalina tamponada
al 10% inmediatamente después del ensayo mecénico o después de
seccionar en las muestras no ensayadas. Con una sierra de diamante
enfriada con agua, se dividieron las muestras biseccionando la
muestra a lo largo de su eje largo. Este procedimiento daba como
resultado dos porciones de cada muestra para preparaciones
histológicas, incluyendo seccionamiento rectificado no
descalcificado y seccionamiento de microtomo no descalcificado. Se
evaluaron en las secciones histológicas la calidad de unión, la
apariencia y la calidad del hueso cortical y reticular, y la
remodelación ósea.
Todos los defectos tratados con
rhOP-1 tenían formación de hueso nuevo tan
tempranamente como 4 semanas después de la operación. Todos los
defectos tratados eran manualmente estables y con puente formado con
hueso nuevo sólido, que empezaba a remodelarse entre las semanas 8 y
12 después de la operación. En algunos defectos, el hueso
nue-
vo se extendía más allá de los extremos del defecto y en los tejidos blandos superpuestos circundantes de los defectos.
vo se extendía más allá de los extremos del defecto y en los tejidos blandos superpuestos circundantes de los defectos.
La mayoría de los defectos de control no eran
completamente estables tras manipulación manual a las 4 semanas
después de la operación, aunque la mayoría se ensayaron
mecánicamente. A menudo, estaba presente tejido fibroso y los
extremos del defecto permanecían visibles con algunos signos de
hueso nuevo. A las 12 semanas después de la operación, la mayoría de
los defectos de control eran estables, con sólo un ligero movimiento
ocasional de los extremos del defecto.
En los defectos tratados con
rhOP-1, se observaron trazas de hueso nuevo a las 2
semanas después de la operación dentro y alrededor de los sitios de
defecto. La cantidad y densidad de hueso nuevo aumentaron de 2 a 4
semanas, con las cortezas de hueso del hospedador empezando a
oscurecerse. Entre las 4 y 8 semanas después de la operación, los
defectos tratados con rhOP-1 tenían cantidades
significativas de hueso nuevo radiodenso y formación de puente
lateral del defecto. A las 12 semanas, las cortezas del hospedador
estaban oscurecidas con enlaces de puente radiodensos.
La apariencia radiográfica de los defectos de
control tratados y no tratados era significativamente diferente de
la apariencia de los defectos tratados con rhOP-1.
Entre las 2 y 3 semanas después de la operación, no había cambios
significativos en las apariencias radiográficas comparadas con las
apariencias después de la operación. A las 4 semanas, eran visibles
débiles cambios en la radiodensidad de los extremos del defecto de
hueso del hospedador. De 8 a 12 semanas, se extendía algo de hueso
desde las regiones periostiales y los extremos de hueso del
hospedador, aunque la formación de puente no era completa. A las 16
semanas después de la operación, sólo la mitad de los controles no
tratados mostraban signos radiográficos de curación completa del
defecto de hueso.
Se resumen los resultados de ensayo mecánico
medio por grupo de tratamiento y periodo de tiempo en las Tablas 11A
y 11B. Las resistencias a la torsión de los defectos tratados con
rhOP-1 eran significativamente mayores que en los
controles no tratados y controles de sólo vehículo, y se aproximaban
a la resistencia de los cúbitos intactos anteriormente ensayados. La
resistencia mecánica de los defectos de formulación de
rhOP-1/tampón acetato era un 59% de la resistencia
del cúbito intacto a las 4 semanas después de la operación, un 77% a
las 8 semanas después de la operación, y un 98% a las 12 semanas
después de la operación. La resistencia mecánica de los defectos de
rhOP-1/CMC-
colágeno era un 36%, 53% y 66% de la resistencia intacta a las 4 semanas, 8 semanas y 12 semanas, respectivamente.
colágeno era un 36%, 53% y 66% de la resistencia intacta a las 4 semanas, 8 semanas y 12 semanas, respectivamente.
Mecánicamente, los sitios de defecto de control
tenían poca estabilidad mecánica en los periodos de tiempo
tempranos, aunque la resistencia del defecto mejoraba con el tiempo.
La resistencia mecánica de defectos que reciben la solución de
tampón acetato control estaba entre un 23% y un 30% de los defectos
tratados con rhOP-1/tampón acetato a periodos de
tiempo equivalentes. Los defectos de control tenían una resistencia
mecánica equivalente a un 16% de la resistencia de cúbitos intactos
a las 4 semanas después de la operación, un 18% a las 8 semanas, y
un 29% a las 12 semanas. Los defectos de sólo
CMC-colágeno eran similares en resistencia mecánica
a los defectos de tampón acetato de control. La resistencia
mecánica de defectos no tratados aumentó de un 9% a las 4 semanas a
un 70% a las 12 semanas después de la operación. La resistencia
mecánica media a las 16 semanas después de la operación se redujo a
un 28%, que era similar a la resistencia a las 8 semanas de un
29%.
La histología de los defectos de
rhOP-1 y de control se correlacionaba bien con los
resultados de ensayo macroscópico, radiográfico y mecánico. En los
defectos tratados con rhOP-1, se observó formación
de hueso nuevo proliferativo que cubría los defectos y, en algunos
casos, se extendía en el tejido subcutáneo. Se formó hueso nuevo a
partir de las regiones de cúbito endostriales y a partir del
periostio cercano a las cortezas del defecto. La formación de puente
con hueso nuevo se completó generalmente a las 8 semanas después de
la operación, aunque estaban presentes zonas de cartílago de
mineralización. Los defectos tenían puente y estaban rellenados con
hueso tejido denso, y se observó la reorganización de las cortezas
de hueso del hospedador a las 12 semanas.
Los defectos de control tratados y no tratados
mostraban sólo signos de unión de tejido fibroso con pequeñas
cantidades de hueso nuevo formado a lo largo del periostio de cúbito
lateral o a partir de la región endostial a las 4 semanas después de
la operación. A las 8 semanas, el fibrocartílago rellenaba los
defectos de control con zonas de cartílago de mineralización
presentes entre el crecimiento de hueso nuevo. Se formaron
cantidades significativas de hueso nuevo en las cortezas de hueso
del hospedador y se extendían a los defectos. Se oscurecieron las
cortezas del defecto con formación de hueso nuevo denso y la
curación endocondral era avanzada, aunque la unión no era completa.
A las 16 semanas, se formaba puente en los nuevos defectos con
algunos huecos de cartílago de mineralización presentes. Se extendía
hueso nuevo a partir de las cortezas del hospedador y capas de
tejido periostial adyacente a través del defecto.
Los resultados de este estudio demuestran que
las proteínas osteogénicas inyectadas en defectos de tamaño no
crítico pueden acelerar la reparación ósea. La inyección percutánea
local de rhOP-1 en el defecto de tamaño no crítico
en cúbito canino daba como resultado una formación de hueso nuevo
periostial y endostial proliferativa, comparada con los defectos de
control no tratados y tratados sólo con vehículo. Radiográficamente,
la inyección de rhOP-1 daba como resultado
calcificaciones difusas de hueso nuevo y la formación de callo de
fractura temprana tan tempranamente como 2 a 3 semanas después de la
operación, con formación significativa de puente e incorporación de
las cortezas del hospedador a las 8 a 12 semanas después de la
operación. La resistencia mecánica de los defectos de tamaño no
crítico tratados con rhOP-1 se aproximaba a la
resistencia de cúbito intacto a las 12 semanas y era de 2 a 3 veces
la observada en la curación de defecto de control.
El siguiente es un estudio experimental
aleatorizado comparativo de defectos de fractura de eje medio
tibiales cerrados recientes (desplazados 5 mm) en cabras.
Está reconocido generalmente en la técnica que
las cabras tienen una velocidad de curación ósea comparable a la de
los seres humanos. Por tanto, los resultados de este estudio pueden
extrapolarse a una situación clínica. Además, se aprecia por el
experto en la técnica que los huesos de las cabras muestran
similitud con los de los seres humanos respecto a tamaño, forma y
carga mecánica.
Como se da a conocer y se describe en la
presente memoria, se ha desarrollado un modelo animal para una
fractura diafisaria cerrada. Este modelo promueve el estudio de la
curación de fractura natural y acelerada, con o sin dispositivo de
fijación de fractura interno, al permitir la creación de una
fractura estándar reproducible del miembro posterior. Brevemente, en
cabras totalmente anestesiadas se crea una fractura cerrada del eje
medio de la tibia con la ayuda de un dispositivo de flexión de tres
puntos. Después de reducción cerrada y desplazamiento de 5 mm de la
fractura, se aplica una escayola externa. Debido a una reducción del
hinchamiento del miembro posterior, se reemplaza la escayola cada
dos semanas para mantener la estabilidad. Después de 2 semanas, los
animales soportan su peso completo sobre el miembro fracturado, y
después de 4-6 semanas, la fractura ha curado
clínica y radiográficamente. Se retira la escayola después de 6
semanas.
Se adquieren los animales en Ruiter (Holanda),
un especialista en la cría de cabras. Se utilizarán cabras lecheras
hembra adultas criadas aleatorias. Para evitar la influencia de un
esqueleto en desarrollo sobre los resultados, se utilizarán animales
adultos. Los animales son esqueléticamente maduros, de 1 a 2 años de
edad, y pesan aproximadamente 50 kg.
Como premedicación, se administran ketamina 10
mg/kg i.m. y atropina 1,5 mg i.m. (o equivalentes reconocidos en la
técnica de las medicaciones anteriores) aproximadamente 15 minutos
antes de anestesiar totalmente los animales. Se consigue esto último
con etomidatos (o equivalentes de los mismos reconocidos en la
técnica) 0,3 mg/kg i.v. Después de la intubación, se mantiene la
anestesia con una mezcla de O_{2}/N_{2} (1:1, vol/vol)
suplementada con 1 a 2% de isoflurano (o equivalente del mismo
reconocido en la técnica).
Con un dispositivo de flexión de 3 puntos, se
aplica un traumatismo en varo a la tibia izquierda hasta que se
obtiene una fractura de eje medio cerrada. Se reduce después
manualmente la fractura, y se afeita la piel sobre la zona de
fractura. Se yoda el miembro posterior izquierdo entero con una
solución desinfectante que contiene alcohol para la administración
del dispositivo osteogénico cerrado mediante inyección y para secar
la piel para la posterior inmovilización con escayola. Se inyecta el
dispositivo osteogénico en el sitio de fractura en la cercanía del
hueco de fractura, para maximizar el contacto con la cavidad
medular. Por ejemplo, se inyecta por vía intramedular un dispositivo
osteogénico con una aguja gruesa de aspiración de médula ósea.
Después de la inyección, se aplica la inmovilización con
escayola.
Se dividen los animales en 5 grupos
(I-V) de 3 animales y 1 grupo (VI) de 9 animales
según el tratamiento: 0,5 mg de OP-1 en una
configuración inyectable de dispositivo osteogénico que contiene al
menos OP-1, matriz de colágeno y agente aglutinante
tal como CMC, formulado como se describe anteriormente (directamente
después de la creación de la fractura) (grupo I), 1,0 mg de
OP-1 en un dispositivo inyectable que contiene al
menos OP-1, colágeno y agente aglutinante tal como
CMC (directamente después de la creación de la fractura) (grupo
IV), 1,0 mg de OP-1 en una configuración estándar de
dispositivo de OP-1 (correspondiente a 0,4 g de
dispositivo de OP-1) inyectado directamente después
de la creación de la fractura (grupo V) y sin tratamiento con
OP-1 (grupo VI, controles). Los grupos de
tratamiento se resumen del modo siguiente:
Se sacrifican los animales 2, 4 y 6 semanas
después de la creación de la fractura. En los grupos I a V, se
sacrifica un animal en cada intervalo de tiempo y, en el grupo VI,
se sacrifican tres animales en cada intervalo de tiempo. Al comparar
los grupos tratados con los controles, puede determinarse el efecto
acelerante del tratamiento sobre la curación de fractura. La
información sobre el efecto de la dosis de OP-1 y el
tiempo de inyección puede obtenerse mediante comparación del grupo I
con el grupo II, respectivamente, y del grupo II con el grupo III.
Las diferencias en eficacia entre las diferentes configuraciones se
valoran evaluando los resultados de los grupos II, IV y V.
En otros experimentos relacionados, las dosis de
proteína osteogénica tal como OP-1 estarán en el
intervalo de aproximadamente 0,125 a 10,0 mg. Ciertas otras
configuraciones de dispositivos osteogénicos mejorados contendrán
cantidades variables de agente aglutinante tal como CMC en el
intervalo de menos de 200 mg de CMC/1.000 mg de matriz de colágeno a
más de 200 mg de CMC/1.000 mg de matriz de colágeno. Los volúmenes
de agente humectante variarán como se describe anteriormente para
conseguir la consistencia/configuración deseada del dispositivo
osteogénico. En aún otros experimentos relacionados, se utilizarán
otros agentes aglutinantes tales como cola de fibrina y/u otras
matrices tales como \beta-TCP.
Se realizan las radiografías con rayos X
siguiendo un procedimiento estandarizado que representa el sitio de
fractura en dos direcciones, anteroposterior y mediolateral. Las
primeras radiografías se toman inmediatamente después de la creación
de la fractura y, después de ello, cada dos semanas hasta el
sacrificio de los animales. Las radiografías en el momento del
sacrificio se realizan después de retirar el material de escayolado;
todas las demás se realizan con el material de escayolado in
situ. Se juzgan cualitativamente por dos radiólogos o cirujanos
a ciegas y, si es posible, se aplica la siguiente escala de
graduación para evaluar el proceso de curación:
Graduación 0: sin diferencia comparado con
directamente después de la creación de la fractura.
Graduación 1: cantidad pequeña de callo.
Graduación 2: cantidad moderada de callo.
Graduación 3: cantidad grande de callo.
Grado 4: Desdibujamiento de los extremos de
fractura.
Se presta especial atención al tipo de fractura
y alineamiento.
Después de la retirada del miembro posterior
izquierdo del material de escayolado, y después de realizar las
radiografías, se hace un escáner por TC de la zona de fractura. Los
tejidos blandos deben permanecer in situ para una mejora
calidad de los escáneres. Pueden hacerse visibles de este modo los
restos del hueco de fractura y callo. Además, puede calcularse la
cantidad de callo. Puede obtenerse información más detallada sobre
la progresión del proceso de curación con escáneres por TC que con
simples radiografías.
Después del escáner por TC y posterior retirada
de los tejidos blandos de la tibia, se realizan las investigaciones
biomecánicas. Se desarrolla un método para ensayo mecánico avanzado
del siguiente modo: se mide la rigidez de flexión en 24 direcciones
a incrementos angulares de 15º y se representa como un vector en un
sistema de coordenadas X-Y, mediante el que se
obtiene una elipse. Se compara la elipse con la de la tibia intacta
contralateral. Pueden derivarse parámetros de esta comparación que
sirven como medidas de la eficiencia de curación. Finalmente, se
realiza un ensayo de rotura por torsión y se expresan resistencia a
la torsión, rigidez de torsión, desplazamiento angular y absorción
de energía hasta rotura medidos como un porcentaje de la tibia sana
contralateral. Esta comparación con la tibia contralateral se hace
para reducir la variación interindividual.
Después del ensayo biomecánico, se mantienen
juntos los fragmentos óseos con anillos especiales para examen
histológico, Se utilizan técnicas estándar de fijación, imbibición y
tinción para hueso y cartílago. Se presta especial atención a
señales de unión fibrosa, osteocondral u ósea. Se aplica un sistema
de puntuación histológica para cuantificar la cantidad de tejido
fibroso, cartílago, hueso recién formado y médula ósea en el hueco
de fractura.
Se espera que los datos mecánicos,
radiográficos, tomográficos e histológicos indicarán que las
configuraciones inyectables de dispositivos osteogénicos mejorados
pueden inducir una reparación acelerada de defectos de fractura de
sitios cerrados.
Los dispositivos osteogénicos mejorados
(configuración inyectable) pueden utilizarse para reparar defectos
de fractura de eje medio tibial recientes (desplazados 5 mm) en un
sitio de defecto cerrado.
Este estudio independiente utiliza también
cabras como modelo animal para estudiar la reparación de defectos de
fractura utilizando dispositivos osteogénicos mejorados. Utilizando
técnicas similares a las descritas anteriormente, se tratan
fracturas diafisarias cerradas recientes (la mayoría transversales y
oblícuas simples) con reducción con fijación externa y
desplazamiento de 5 mm utilizando dispositivos osteogénicos que
contienen CMC.
El diseño del estudio es el siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se sacrifican 5 cabras en cada grupo a las 2
semanas después del tratamiento y se sacrifican 5 cabras en cada
grupo a las 4 semanas después del tratamiento.
Otros estudios relacionados investigan la
reparación de defectos de fractura en puntos temporales mayores de 4
semanas, e investigan tanto dosificaciones menores como mayores de
OP-1. Adicionalmente, se estudia la reparación de
defectos de fractura utilizando cantidades totales diferentes (mg)
del dispositivo de OP-1 que contiene CMC
administrado al sitio de defecto. Un estudio utiliza un dispositivo
de 400 mg de peso total administrado al sitio de defecto. Sin
embargo, otros estudios relacionados utilizarán cualquiera de los
agentes aglutinantes anteriormente citados tales como: cola de
fibrina y/o cualquiera de las matrices anteriormente citadas tales
como \beta-TCP.
Se evalúa la reparación de defecto utilizando
una variedad de protocolos clínicos rutinarios, incluyendo
radiografía, escáner por TC, ensayo biomecánico e histología, como
se describe con más detalle anteriormente.
Se espera que los datos mecánicos,
radiográficos, tomográficos e histológicos indicarán que las
configuraciones inyectables de dispositivos osteogénicos mejorados
pueden inducir la reparación acelerada de defectos de fractura de
sitio cerrado. También se prevé que, en ciertas realizaciones
preferidas, dosis bajas de proteína osteogénica serán efectivas para
inducir la reparación, especialmente en dispositivos osteogénicos
mejorados.
Los dispositivos osteogénicos mejorados
(configuración inyectable) pueden utilizarse para reparar fracturas
diafisarias cerradas recientes (desplazadas 5 mm) en un sitio de
defecto cerrado.
Se realizó un estudio utilizando el modelo de
defecto de tapón osteocondral en perro para demostrar la eficacia de
los dispositivos osteogénicos mejorados para reparar defectos
osteocondrales/condrales. Se evaluaron cuatro formulaciones de
implantes, incluyendo (1) dispositivo osteogénico estándar, que
incluye rhOP-1 y matriz de colágeno, (2) dispositivo
osteogénico mejorado, que incluye rhOP-1, matriz de
colágeno y agente aglutinante carboximetilcelulosa (CMC), (3) sólo
matriz de colágeno, o (4) matriz de colágeno y agente aglutinante
CMC.
Brevemente, se crearon bilateralmente defectos
de grosor completo de 5 mm de diámetro y que se extendían 6 mm en el
hueso subcondral del cóndilo femoral medial de 4 perros mestizos
adultos. Se eligieron perros mestizos macho adultos debido a su
tamaño anatómico y características de reparación y remodelación
óseas. Se prestó especial atención a seleccionar animales de tamaño
y peso uniformes para limitar la variabilidad de la geometría y
carga de articulación óseas. Se examinaron radiográficamente los
animales antes de la operación para asegurar un tamaño apropiado, la
madurez esquelética y que no existieran anormalidades óseas obvias.
Los defectos del lado izquierdo recibieron dispositivo osteogénico
estándar en dos animales, y el dispositivo osteogénico mejorado en
los otros dos animales. Los defectos del lado derecho recibieron
matriz sola en un animal, una mezcla de matriz/agente aglutinante en
un animal, y no se trataron en los restantes dos animales.
El dispositivo osteogénico estándar consistía en
rhOP-1 mezclada con matriz de colágeno óseo de tipo
I bovino (2,5 mg de rhOP-1/g de matriz). El
dispositivo osteogénico mejorado comprendía 100 mg del dispositivo
osteogénico estándar de OP-1/matriz de colágeno
combinados con 20 mg de CMC (total de 120 mg). Los controles
consistían en matriz de colágeno óseo de tipo I bovino sola, y la
matriz de colágeno con CMC. Ambos se suministraron en cantidades de
100 mg.
Se resume el diseño del estudio en la Tabla
12.
Utilizando técnicas asépticas estándar, se
realizó cirugía bajo anestesia con gas isofluorano. Se administró
anestesia mediante inyección intravenosa de pentotal de sodio a una
dosificación de 11,04 mg/kg de peso corporal. Se hizo una incisión
pararrotuliana medial de aproximadamente 4 cm de longitud. Se
retrajo la rótula lateralmente para exponer el cóndilo femoral. Se
utilizó una broca de taladro de 5 mm con un manguito diseñado
especialmente para evitar el sobretaladrado de la profundidad de
defecto (6 mm) para crear el defecto final. Se añadió solución
salina estéril al dispositivo osteogénico mejorado y se mezcló justo
antes de la implantación. Después de la irrigación del defecto con
solución salina para retirar los restos de hueso y células de médula
vertidas, se compactó el dispositivo apropiado en el sitio de
defecto utilizando una sonda roma. Se dispuso suficiente dispositivo
en el defecto de modo que estuviera nivelado con la superficie
articular. Se cerraron después la cápsula de articulación y los
tejidos blandos en capas. Se repitió el procedimiento en el lado
contralateral con el implante apropiado.
Se evaluó la curación osteocondral macroscópica
e histológicamente utilizando protocolos rutinarios, como se
describen a continuación. Se utilizaron radiografías para evaluar la
curación.
A las 12 semanas después de la operación, se
sacrificó cada animal mediante una sobredosis de barbiturato
intravenoso. Se recogieron tanto los fémures derecho como izquierdo
distales en bloque y se mantuvieron en solución salina fría hasta
completar la graduación macroscópica y microfotografía. Se
dispusieron después las muestras en fijador de paraformaldehído al
4%, se marcaron con todas las identificaciones necesarias y se
almacenaron a 4ºC hasta envío, aproximadamente 10 días después del
sacrificio. Justo antes de enviar, se cortaron las muestras en
bloques pequeños con el defecto articular en el centro.
Se graduó cada defecto recogido según su
apariencia macroscópica. Este análisis aporta puntos basándose en la
formación de adhesiones intraarticulares, la restauración de la
superficie articular, la erosión y la apariencia del cartílago. Es
posible un total de 8 puntos. La escala de graduación macroscópica
se expone en la Tabla 13.
Se prepararon todas las muestras para evaluación
histológica. Se fijaron las muestras individuales mediante inmersión
en solución de paraformaldehído al 4%. Además, utilizando
procedimientos rutinarios como se describen en otro lugar en la
presente memoria, se realizó análisis del tipo de tejido para
caracterizar el tipo de colágeno y la composición de tejido
porcentual. Se devolvieron para evaluación secciones no
descalcificadas, una de cada muestra, teñidas con los tintes
safranina O y Fast Green (para indicar el contenido de
glicosaminoglicano en la matriz).
Se basaron las secciones histológicas en la
naturaleza del cartílago de reparación, las características
estructurales y los cambios celulares. Se expone la escala de
graduación histológica en la Tabla 14.
\newpage
Todas las cirugías fueron sin incidentes y sin
complicaciones después de la operación. En general, se observó
cierto hinchamiento bilateral de la rodilla medial el día después de
la operación en los cuatro animales, que desapareció el día 10
después de la operación. Ningún animal experimentó ninguna reacción
adversa relacionada con los materiales implantados o procedimientos
experimentales.
Aparece un resumen de las graduaciones de
evaluación macroscópica en la Tabla 15.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los defectos no tratados y defectos tratados con
el dispositivo osteogénico mejorado de OP-1, matriz
de colágeno y CMC recibieron la graduación histológica media mayor,
15 y 16,5 de 24 puntos posibles, respectivamente. Sin embargo, en
cada uno de estos grupos una muestra parecía marcadamente mejor que
la otra. Sin embargo, los sitios tratados con sólo matriz de
colágeno, matriz de colágeno con CMC y el dispositivo osteogénico
estándar, puntuaron ligeramente más consistentemente, y menos, que
los sitios tratados con dispositivo osteogénico mejorado (n
\leq2). Aparece un resumen de las graduaciones histológicas medias
en la Tabla 16.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Inesperadamente, los sitios tratados con el
dispositivo osteogénico mejorado consiguieron las puntuaciones
medias mayores para la naturaleza del nuevo tejido de reparación,
para las características estructurales de la reparación y para
minimizar la degeneración del cartílago de reparación o del
cartílago intacto circundante. Los sitios de dispositivo osteogénico
mejorado recibieron también la puntuación total global mayor. Se
ponderaron estos resultados con la puntuación de un animal en la que
la morfología celular y de tejido era consistente con cartílago
articular. El cartílago de reparación era continuo con el cartílago
intacto y el grosor de la reparación era el mismo que el del
cartílago intacto. La capa de hueso subcondral estaba también
completamente restaurada. La curación no era tan avanzada como en
los otros sitios tratados con OP-1/matriz de
colágeno o sin CMC. Las menores puntuaciones eran el resultado de
una diferenciación incompleta del tejido de reparación, restauración
ósea subcondral incompleta y grosor irregular de la reparación. No
se observó implante residual ni material de vehículo en ninguna
sección.
Las comparaciones entre animales demostraron
que, en tres animales, los defectos que recibían dispositivos que
contienen OP-1, con o sin CMC (todos los defectos
izquierdos), conseguían graduaciones histológicas iguales o mayores
que el defecto contralateral que recibe la matriz de control o sin
tratamiento.
Inesperadamente, el dispositivo de
OP-1 sin CMC indujo la formación de hueso y
cartílago, pero en un modo más desorganizado con considerable tejido
fibroso presente. Las muestras no tratadas o con vehículo sólo se
rellenaban con cartílago fibroso y tejido conectivo denso.
Estos datos sugieren que la reparación
inesperadamente superior conseguida con el dispositivo osteogénico
mejorado está asociada a las diferencias en su consistencia respecto
a la del dispositivo osteogénico estándar sin agente aglutinante,
que a su vez afectan a la contención de los dispositivos per
se en el sitio de defecto. Las propiedades de adhesión y
disgregación de la formulación se espera que sean críticas en
defectos de cartílago articular, dada la naturaleza dinámica de la
articulación.
Este estudio teñía también secciones para
comparar la reparación de colágeno en los sitios de defecto tratados
con: sin dispositivo, composiciones de sólo dos tipos de matriz
(matriz y matriz/agente aglutinante) o composiciones de ambas
matrices con OP-1.
En general, al utilizar el anticuerpo de
colágeno de tipo I, se observó tinción del hueso subcondral
subyacente existente, así como del hueso recién regenerado. El hueso
recién regenerado difería ligeramente del hueso existente por la
presencia de regiones de matriz más desorganizada cuando se
observaba bajo microscopía de contraste de fase. Utilizando el
anticuerpo de colágeno de tipo II, el cartílago articular existente
se teñía cualitativamente tan bien como el tejido reparativo en los
defectos, aunque la tinción del tejido nuevo era menos intensa. En
al menos un defecto tratado con dispositivo osteogénico mejorado, se
observó la regeneración completa del hueso subcondral con cartílago
de tipo articular regenerado a lo largo de la parte superior. La
matriz celular de este cartílago regenerado no era idéntica al
cartílago articular existente, pero pudo observarse una matriz
celular visible compuesta por grandes haces sueltos de bajo
contraste de fase.
Defectos tratados con dispositivo osteogénico
mejorado. En defectos tratados con dispositivo osteogénico
mejorado, al menos un animal evidenciaba reparación de cartílago
articular al nivel macroscópico. El hueso subcondral estaba
regenerado, y se observó una capa de cartílago nuevo de grosor casi
normal mediante tinción histológica con azul de toluidina y
safranina O. Estas capas y tejidos se teñían apropiadamente, con
anticuerpo de tipo I localizado en el hueso subcondral y colágeno de
tipo II localizado en la capa de tipo cartílago nuevo. Había también
cierta evidencia de regeneración de una zona de cartílago
calcificado y distintas señales en el cartílago regenerado. Sin
embargo, se observaron algunas diferencias entre la capa de
cartílago articular nuevo y existente. El cartílago nuevo tenía una
densidad mayor de condrocitos y contenía haces desorganizados
sueltos de fibras visibles por microscopía de contraste de fase o
con luz polarizada. Debe observarse que sólo se representa aquí un
punto temporal único durante el proceso de reparación, y que los
resultados de periodos más largos o más cortos son desconocidos.
Defectos tratados con dispositivo osteogénico
estándar. Los defectos tratados con dispositivo osteogénico
estándar mostraron que aproximadamente un 50% del hueso estaba
regenerado en el sitio de defecto con crecimiento interno de
cartílago articular desde los bordes del defecto. Parecía haber
algunas zonas adicionales de formación de cartílago articular cerca
del hueso recién regenerado, con el resto del defecto rellenado con
tejido reparativo. El tejido reparativo se teñía ligeramente con
anticuerpos de colágeno de tipo II, y no de tipo I. Estaban
presentes más condrocitos con haces sueltos grandes de matriz
circundante de las células. El tratamiento con el dispositivo
osteogénico estándar difería del tratamiento del dispositivo
osteogénico mejorado en que el hueso subcondral no conseguía
regenerarse a su nivel normal, y aparecía tejido fibroso
desorganizado denso encima del cartílago nuevo, lo que causaba que
la parte superior del defecto sobresaliera con una superficie
irregular. Este tejido fibroso parecía tener más células de tipo
fibroblasto, con haces fibrosos colocados paralelamente a la
superficie articular.
Defectos tratados con matriz/agente
aglutinante. Un defecto con sólo matriz/agente aglutinante sin
OP-1 mostró la regeneración de aproximadamente un
tercio del hueso subcondral retirado, con el resto rellenado con
tejido reparativo. Este tejido regenerado se teñía ligeramente con
anticuerpos de colágeno de tipo I, especialmente cerca de la parte
inferior del defecto, y mostraba una tinción más fuerte con el
anticuerpo de colágeno de tipo II, con la tinción más fuerte cerca
de la superficie. Es manifiesta una matriz visible desorganizada
densa en la mitad superior del tejido reparativo, y aparece un
patrón horizontal más organizado de fibras en la mitad inferior. El
azul de toluidina no teñía el tejido reparativo, mientras que la
safranina O teñía la mitad superior e inferior diferencialmente. La
mitad cerca de la superficie articular se teñía ligeramente con
safranina O, y la mitad inferior se teñía con Fast Green. Se observó
una distinción similar entre las dos mitades del tejido reparativo
cuando se teñía con tricromo de Masson. Aunque el tejido reparativo
no parecía cartílago articular, la región cerca de la superficie
articular no parecía contener colágeno de tipo II, una matriz ácida
con quizás algún mucopolisacárido. La mitad inferior tenía más
colágeno de tipo I con menos carbohidrato, y su naturaleza puede ser
más de tipo tejido conectivo.
El único defecto tratado con matriz de colágeno
sola no mostró ninguna regeneración del hueso subcondral. El tejido
reparativo que rellenó el defecto se teñía ligeramente con
anticuerpos tanto de colágeno de tipo I como II. Este tejido tenía
una matriz fibrosa aumentada con células de tipo fibroblasto, y en
ciertas zonas parecía ser similar a fibrocartílago. Esta muestra era
similar al tratamiento con CMC/matriz de colágeno solo, con una
ligera localización de colágeno tanto de tipo I como II en el tejido
reparativo. Además, el sitio de defecto mostraba la misma tinción
diferencial con safranina O/Fast Green, con tinción en la mitad
superior del tejido reparativo con safranina O y en la inferior con
Fast Green.
Los defectos osteocondrales tratados con los
dispositivos osteogénicos mejorados demostraron inesperadamente más
regeneración avanzada de cartílago, fenotipo de condrocito y
cartílago comparados con defectos tratados con el dispositivo
osteogénico estándar, matriz de colágeno sola o matriz de colágeno
mezclada con CMC, todos los cuales demostraron un cartílago de
reparación menos organizado y formación de hueso subcondral. Una
mala reparación mediante tratamiento con la matriz de colágeno o
matriz de colágeno con CMC indica que la presencia de un soporte de
colágeno solo no es suficiente para inducir la curación, y puede
incluso impedir la progresión de la curación y la organización del
tejido de reparación.
Los defectos osteocondrales de grosor completo
pueden repararse utilizando dispositivos osteogénicos que contienen
CMC según los métodos de la presente invención. Se espera que los
defectos osteocondrales de grosor completo puedan repararse también
utilizando dispositivos osteogénicos mejorados que contienen
cualquiera de los agentes aglutinantes preferidos anteriormente
citados tales como cola de fibrina y/o cualquiera de las matrices
preferidas anteriormente citadas.
Se realizó este estudio para evaluar
adicionalmente la reparación de defectos osteocondrales/condrales
mediante dispositivos osteogénicos mejorados. Hasta la fecha, el
estudio examinaba los efectos del dispositivo osteogénico mejorado a
las 6 y 12 semanas, y continuará examinando los efectos a las 26 y
52 semanas. Esto proporciona datos de estabilidad de la reparación a
largo plazo. Se siguió la organización de cartílago nuevo con el
tiempo para determinar si se aproxima al tejido normal con respecto
a su estructura y función. Se evaluaron dos formulaciones de
dispositivos en defectos osteocondrales/condrales incluyendo: 1)
dispositivo osteogénico mejorado, o 2) dispositivos ficticios que
contienen sólo CMC y matriz de colágeno.
Brevemente, se crearon bilateralmente defectos
de grosor completo de 5 mm de diámetro que se extendían 6 mm en el
hueso subcondral del cóndilo femoral medial de 16 perros mestizos
adultos. Se utilizaron mestizos adultos en este estudio debido a su
tamaño anatómico y características de reparación y remodelación
óseas conocidas. Todos los animales tenían entre 1 y 4 años de edad
y pesaban aproximadamente 20 a 30 kg. Se prestó una atención
específica a seleccionar animales de tamaño y peso uniformes para
limitar la variabilidad en la carga de articulación. Se examinaron
radiográficamente los animales para asegurar un tamaño apropiado,
madurez esquelética y que no existiera ninguna anormalidad ósea
obvia. En cada grupo de cuatro perros, los defectos del lado
izquierdo recibieron dispositivo osteogénico mejorado. Los defectos
del lado derecho recibieron matriz/agente aglutinante en dos
animales, y los restantes dos animales no se trataron. En el
sacrificio, se recuperaron los fémures distales en bloque, y se
evaluaron histológica y macroscópicamente los sitios de defecto
basándose en el esquema descrito anteriormente.
El dispositivo osteogénico mejorado comprende
dispositivo estándar (2,5 mg de rhOP-1/1 g de
matriz) mezclado con CMC. Para formular el dispositivo mejorado, se
mezclaron 100 mg de mezcla de rhOP-1/colágeno con 20
mg de CMC inmediatamente antes de la implantación (total 120 mg). El
dispositivo de sólo colágeno consiste en colágeno de tipo I bovino
(100 mg). Se resume el diseño del estudio en la Tabla 17.
Utilizando técnicas asépticas estándar, se
realizó cirugía bajo anestesia con gas isofluorano. Se hizo una
incisión pararrotuliana medial de aproximadamente 4 cm de longitud.
Se retrajo la rótula lateralmente para exponer el cóndilo femoral.
Utilizando una broca de taladro de 0,32 cm, se hizo un orificio
piloto en la región de soporte del peso del cóndilo femoral medial.
Se utilizó una broca de taladro de 5 mm con un manguito diseñado
especialmente para evitar el sobretaladrado de la profundidad de
defecto (6 mm) para crear el defecto final. Después de copiosa
irrigación del defecto con solución salina para retirar los restos
de hueso y células de médula vertidas, se compactó el dispositivo
apropiado en el sitio de defecto utilizando una sonda roma. Se
cerraron después la cápsula de articulación y los tejidos blandos en
capas. Se repitió el procedimiento en el lado contralateral con el
implante apropiado.
Se sacrificaron cuatro animales a las 6 y 12
semanas y cuatro animales a las 26 y 53 semanas después de la
operación. Se sacrificaron los animales utilizando una sobredosis de
barbiturato intravenoso. Se recogieron inmediatamente los fémures en
bloque y se almacenaron en una gasa embebida con solución salina. Se
tomaron fotografías de alta potencia de los sitios de defecto. Se
separaron meticulosamente los tejidos blandos por disección del
sitio de defecto. Se retiró el extremo proximal del fémur.
Se graduó la apariencia macroscópica de los
sitios de defecto y tejido de reparación basándose en los parámetros
anteriormente descritos por dos observadores independientes, a
ciegas de la asignación de tratamiento. Se aportaron puntos según la
presencia de adhesiones intraarticulares, la restauración de la
superficie articular, la erosión de cartílago y la apariencia.
Se prepararon todas las muestras para evaluación
histológica inmediatamente después de graduación macroscópica y
fotografía. Se fijaron los fémures distales individuales mediante
inmersión en solución de formalina tamponada al 10% o en una
solución de paraformaldehído al 4%. Se aisló cada sitio de defecto
con una sierra de diamante enfriada con agua. Se cortaron tres
secciones de tres niveles de cada bloque. Los niveles 1 y 3 eran los
más cercanos al perímetro del defecto. El nivel 2 se localizaba en
el centro del defecto. Se tiñeron tres secciones de cada nivel con
hematoxilina y eosina, tricromo de Goldner, safranina O o Fast
Green. Se graduaron después las secciones basándose en el esquema
descrito anteriormente. Este análisis aportaba puntos basándose en
la naturaleza del tejido de reparación, las características
estructurales y los cambios celulares. Son posibles un total de 24
puntos.
Después de 6 semanas, se sacrificaron ciertos de
los animales anteriormente tratados y se realizaron evaluaciones
inmunohistoquímicas como se describe en otro lugar en la presente
memoria. Los resultados fueron los siguientes: en todos los casos,
los defectos tratados con dispositivo de OP-1
CMC/colágeno exhibían una reparación superior. Con el dispositivo de
OP-1 CMC/colágeno, había una formación de puente
inesperadamente completa o casi completa del defecto con tejido
cartilaginoso. Se observó tinción de colágeno de tipo II en el
cartílago reparativo, con poca o ninguna tinción de colágeno de
tipo I. La tinción de proteoglicano siguió a la localización del
colágeno de tipo II, con una tinción más oscura en zonas que se
parecen más estrechamente a cartílago de hialina maduro. Basándose
en la tinción con safranina O, la regeneración de la capa de
superficie de cartílago no era todavía completa a las 6 semanas
después del tratamiento.
Después de 12 semanas, la curación había
progresado significativamente en los defectos tratados con
dispositivos mejorados. No se observó curación apreciable en los
controles. La puntuación de graduación macroscópica media observada
con dispositivos mejorados a las 12 semanas era de 6,50 \pm 0,89
(n= 6); la del medio de control era de 3,69 \pm 0,70 (n= 8). En
todos los puntos temporales restantes, se prevé que los defectos
tratados con los dispositivos osteogénicos mejorados demostrarán una
regeneración de cartílago más avanzada, fenotipo de condrocito y
cartílago de manera acelerada respecto a defectos tratados con sólo
colágeno/CMC o dejados sin tratar. Los defectos tratados con
dispositivo osteogénico mejorado se prevé que exhiban cartílago y
tejido óseo subcondral, mientras que los defectos tratados con
colágeno/CMC o no tratados se espera que induzcan la formación
desorganizada de hueso y cartílago con considerable tejido fibroso
presente.
Los defectos osteocondrales de grosor completo
pueden repararse establemente utilizando dispositivos osteogénicos
que contienen CMC según los métodos de la presente invención. Se
espera que experimentos similares a los descritos anteriormente, en
los que se evalúen otros agentes aglutinantes preferidos tales como
cola de fibrina, demostrarán que los dispositivos mejorados pueden
reparar establemente defectos osteocondrales de grosor completo.
Este estudio evalúa la reparación de defectos
tanto condrales como osteocondrales mediante dispositivos
osteogénicos mejorados utilizando un modelo de animal grande. El
grosor aumentado del cartílago articular y las similitudes con los
seres humanos en tamaño y características de soporte de peso hacen a
la oveja un modelo a partir del cual pueden extrapolarse
aplicaciones clínicas humanas, especialmente para la aplicación
clínica de dispositivos osteogénicos mejorados para la reparación de
defectos condrales. Los grupos de estudio son los siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Defectos osteocondrales A (grosor completo) (5
mm de diámetro)
- Grupo A I:
- Sin tratamiento
- Grupo A II:
- Carboximetilcelulosa/colágeno
- Grupo A III:
- Carboximetilcelulosa/OP-1/colágeno
- Grupo A IV:
- Aloinjerto liofilizado
- Grupo A V:
- Aloinjerto liofilizado + OP-1
\vskip1.000000\baselineskip
Defectos osteocondrales B (grosor parcial) (5 mm
de diámetro)
- Grupo B I:
- Sin tratamiento
- Grupo B II:
- Carboximetilcelulosa/colágeno
- Grupo B III:
- Carboximetilcelulosa/OP-1/colágeno
- Grupo B IV:
- Ácido hialurónico + pasta de sulfato de condroitina
- Grupo B V:
- Ácido hialurónico + pasta de sulfato de condroitina + OP-1.
Se operan ambas articulaciones de rodilla
anteriores de cada oveja, y se crean dos defectos por articulación
(uno en el cóndilo medial y otro en el lateral). En una de las
articulaciones se crean dos defectos condrales de grosor parcial
estandarizado (5 mm de diámetro) en cada cóndilo, mientras que en la
otra articulación se crean dos defectos osteocondrales de grosor
completo más profundos (aproximadamente 1-2 mm en el
hueso subcondral). Cada grupo tiene un subgrupo sacrificado
tempranamente a las 8 semanas y otro mantenido para evaluación a más
largo plazo durante 6-7 meses.
Hay un total de 20 grupos y 12 defectos por
grupo. Por lo tanto, el número total de defectos es 240 y el número
total de ovejas es 60. Hay cinco grupos de tratamiento diferentes:
tres controles (sin tratamiento y dos dispositivos ficticios
diferentes) y dos formulaciones de OP-1 diferentes
para cada tipo de defecto. Los dispositivos osteogénicos mejorados
que comprenden OP-1 en CMC/colágeno se utilizarán
para reparación de defecto osteocondral y reparación de defecto
condral. Los dispositivos se formulan de tal modo que se añaden 2,5
mg de OP-1/colágeno a cada sitio de defecto que
recibe este dispositivo osteogénico mejorado. La reparación se
evalúa a las 8 semanas y los 6-7 meses. El protocolo
de tratamiento se muestra en la Tabla 18.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se separan dos semanas las cirugías en las dos
rodillas para permitir la curación de la primera rodilla antes de la
cirugía en la segunda rodilla. Se utiliza la primera cirugía para
generar defectos condrales, la segunda es para defectos
osteocondrales. Se realiza la cirugía en una sala de operaciones
totalmente equipada utilizando técnicas estándar y equipo utilizado
en cirugía humana. Se permite a las ovejas deambular libremente en
su territorio de pasto después de la operación. Las cirugías
separadas dan como resultado tiempos de curación de 8 semanas para
defectos condrales y tiempos de curación de 6 semanas para defectos
osteocondrales. En el sacrificio, se perfunden las articulaciones,
se fijan y se procesan según protocolos citológicos estándar.
Al final de los periodos de estudio, se
sacrifican los animales y se recogen las articulaciones en bloque.
Se gradúa la apariencia macroscópica de los sitios de defecto y
tejido de reparación utilizando métodos rutinarios tales como los
descritos anteriormente. Se aportan puntos según la presencia de
adhesiones intraarticulares, la restauración de la superficie
articular, la erosión de cartílago y la apariencia.
Utilizando métodos similares a los descritos
anteriormente, se preparan muestras para evaluación histológica
inmediatamente después de graduación macroscópica y fotografía.
Se espera que los defectos tratados con
dispositivos de OP-1/CMC/colágeno exhibirán una
reparación superior similar a la del experimento D.2 anterior. Se
espera adicionalmente que los dispositivos osteogénicos mejorados
que contienen cualquiera de los agentes aglutinantes preferidos
anteriormente citados, tales como cola de fibrina, exhibirán también
reparación de defectos tanto condrales como osteocondrales.
Se realiza un estudio utilizando cabras lecheras
esqueléticamente maduras para demostrar la eficacia del dispositivo
osteogénico mejorado para reparar defectos osteocondrales/condrales.
Se utilizan formulaciones de dispositivo osteogénico mejorado con
concentraciones variables de rhOP-1, junto con
controles ficticios o sin dispositivo. El dispositivo ficticio
consiste en colágeno mezclado con carboximetilcelulosa (CMC).
Además, se sacrifican los grupos de animales a los 4, 12 y 24 meses
después de la cirugía para comparar la velocidad y estabilidad de la
reparación de defecto. A continuación, se resumen los parámetros
experimentales.
\newpage
Grupos
Brevemente, se hacen defectos subcondrales en
las rodillas izquierdas de 56 cabras lecheras esqueléticamente
maduras. Los defectos son de 8 mm de diámetro y 3 mm de profundidad.
Esta configuración de defecto evita tensiones de cizalladura muy
altas en el defecto, que conducen a la formación de colágeno de tipo
I. Se utilizan en este experimento cabras lecheras holandesas de
aproximadamente 2 años de edad y de aproximadamente 50 kg de peso.
Se proporcionan dispositivos correspondientes a 2,5 mg de
rhOP-1/g de colágeno. En cada caso, se añaden 0,2 g
de CMC al dispositivo osteogénico estándar, después se añaden
aproximadamente 2,6 ml de solución salina y se mezcla. Esto
proporciona material de aproximadamente 3-4 ml de
dispositivo osteogénico mejorado. Este material se utiliza después
para rellenar el volumen de defecto.
Se induce la anestesia y se abre la rodilla
izquierda mediante un enfoque pararrotuliano medial. Se disloca la
rótula y se expone el lado lateral y el cóndilo medial. Con un tubo
hueco afilado, se hacen los contornos de un defecto en la parte de
soporte del peso anterior del cóndilo medial. Con un trépano manual
de punta cuadrada que está colocado dentro del tubo, se crea un
defecto en el hueso subcondral. Se expone después la tibia proximal,
y se toma un colgajo periostial del mismo diámetro que el defecto en
el cóndilo medial. Se fija parcialmente el colgajo periostial, con
su capa de cámbium hacia el defecto, hacia los restos. Se rellena el
defecto con el material de ensayo apropiado y se cubre con el
colgajo periostial, utilizando una sutura reabsorbible. Se añade un
dispositivo de CMC mediante una jeringuilla hasta que el defecto
está rellenado, y se sutura después completamente el colgajo. En
los animales de control, se utiliza un dispositivo ficticio que
incluye sólo colágeno y CMC. Un segundo grupo de control no recibió
implante en absoluto, sino que recibió sólo un colgajo
periostial.
Se permite la actividad no restringida de
soporte de su peso todo lo que pueda tolerar después de la
operación.
Se evalúa el patrón de soporte de peso a las 2,
4 6 y 8 semanas, y después cada 4 semanas.
Se hacen evaluaciones macroscópicas basándose en
el esquema presentado anteriormente. Después de sacrificar el
animal, se registra la presencia o ausencia de contracturas de
rodilla, y se examinan tanto en la rótula como en los cóndilos
adhesiones, contorno de superficie articular, apariencia del
cartílago restaurado y presencia o ausencia de erosiones de
cartílago. A cada una de estas características se le da una
puntuación. Se toman diapositivas en color utilizando una
macrolente.
Para ayudar a la visualización del hueso
subcondral regenerado y a localizar los bordes del defecto durante
la evaluación histológica, las cabras reciben una tetraciclina
doblemente marcada antes del sacrificio. Esto permite la
histomorfometría del relleno óseo de la parte más profunda del
defecto. Se observan también las muestras histológicas incorporando
microscopía polarizada para proporcionar información sobre rasgos
estructurales regulares.
Para análisis histológicos, se fijan las
muestras, incluyendo el hueso subcondral, con formalina tamponada
con fosfato al 10% y se embeben no descalcificadas en metacrilato de
metilo (MMA). Se hacen secciones de 5 \mum de grosor con un
microtomo de alto rendimiento. Se tiñen las secciones con azul de
toluidina para identificar el cartílago y con tricromo de Goldner
para identificar el hueso. Se hace la valoración de hialinidad de
tejido, afinidad de la matriz por el azul de toluidina
(metacromasia), irregularidad de la superficie, hueso subcondral
regenerado por agregación de condrocitos, unión al cartílago
articular adyacente, infiltración de células inflamatorias
alrededor del implante y ausencia de cambios degenerativos en el
cartílago adyacente. A cada una de estas características se le da
una puntuación.
Extracción de proteoglicanos: Para análisis
bioquímicos, se recoge cartílago de control y tejido del defecto en
solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría. Se extraen los
proteoglicanos de las secciones liofilizadas mediante tratamiento
con HCl-guanidina 4 M, acetato de potasio 0,15 M a
pH 5,8 en presencia de inhibidores de proteinasa (benzamidina 5 mM,
acido
6-amino-n-hexanoico
0,1 M, EDTA 10 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo y
n-etilmaleimida 5 mM) a 4ºC durante 60 horas. Se
separan el extracto y el residuo. Se aclara concienzudamente el
residuo con tampón de extracción, que se añade al extracto. Se
analiza en los extractos el contenido de sulfato de condroitina y se
utilizan para cromatografía de exclusión molecular.
Cromatografía de exclusión molecular: Se aplican
alícuotas de extractos a columnas de Sepharose C 12 B (0,66 x 145
cm) (Pharmacia AB, Uppsala, Suecia) y se eluyen con un tampón
disociativo a pH 6,1 que contiene guanidina-HCl 4 M,
sulfato de sodio 0,1 M, acetato de sodio 0,05 M y Triton
X-100 al 0,1%. El caudal es de 1,2 ml/h. Se analiza
en las fracciones el contenido de sulfato de condroitina. Puede
calcularse el contenido de moléculas grandes específicas de
cartílago, probablemente agrecanos.
Se realiza la formación de imágenes por
resonancia magnética (MRI) con dos fines. En primer lugar, para
monitorizar 1 mes después de la operación que el colgajo más
implante haya permanecido en su sitio. En segundo lugar, se sigue el
grupo 1C (2 años o más después de la operación) longitudinalmente
con MRI a los 4 meses, 12 meses y en el sacrificio.
Se prevé que los defectos tratados con
dispositivo osteogénico mejorado demostrarán una regeneración de
cartílago avanzada, fenotipo de condrocitos y cartílago comparados
con controles ficticios o sin dispositivo. Se prevé también que
dosis bajas de OP-1 conseguirán reparar de modo al
menos cuantitativa y cualitativamente similar al de dosis
mayores.
Este estudio investigó la formación de cartílago
de mamífero en lesiones subcondrales tratadas con proteína
osteogénica 1 humana recombinante (rhOP-1) (sola o
en combinación con una matriz de colágeno) y/o pericondrio
autólogo.
Se hizo un defecto subcondral de 9 mm en el
cóndilo femoral medial de la articulación de rodilla izquierda de 15
cabras. Se rellenó el defecto con un implante consistente en sangre
coagulada reciente mezclada con: (a) partículas pequeñas de
pericondrio de oreja autólogo; o (b) rhOP-1; o (c)
rhOP-1 más pericondrio de oreja. La
rhOP-1 se añadió en combinación con una matriz de
colágeno (dispositivo de OP-1) o sin una matriz de
colágeno (OP-1 sola). Se cerró el defecto con un
colgajo periostial, que se cosió al cartílago. Después de tiempos de
implantación de 1, 2 y 4 meses, se investigó la extensión de la
reparación de cada defecto con técnicas histológicas estándar
(metocromasia e hialinidad) y métodos bioquímicos bien conocidos
(cromatografía en gel de proteoglicanos).
Después 1 y 2 meses en este estudio particular,
no había diferencias aparentes entre los defectos de control
(implante (a) anterior) y los tratados con diversas
OP-1. Sin embargo, después de 4 meses, sólo uno de
los tres defectos de control mostraba formación de cartílago
detectable, mientras que los cuatro defectos tratados con
OP-1 estaban completa o parcialmente rellenados con
cartílago, como indica el análisis histológico y bioquímico expuesto
en la Tabla 19.
La Tabla 19 expone la puntuación de cartílago de
defectos condilares tratados durante 4 meses sin
OP-1 (control) o con OP-1 más o
menos pericondrio en presencia o ausencia de una matriz de
colágeno.
A la puntuación bioquímica (A) se le asignó un
valor de 0-5 basado en la cromatografía en gel. La
puntuación histológica (B) está basada en secciones de plástico no
descalcificado en una escala de graduación de 0 a 6.
Los resultados de este estudio confirman que la
OP-1 tiene utilidad promotora de cartílago en
defectos subcondrales grandes en cabras. Esto indica que la
OP-1 es de relevancia clínica en el tratamiento de
lesiones grandes de cartílago articular y es particularmente útil
para la reparación condral de defectos de esqueletos de soporte de
peso causados por traumatismo o enfermedad en mamíferos.
En estudios relacionados, se prevé que otros
dispositivos osteogénicos mejorados tales como dispositivos que
contienen cola de fibrina darán como resultado la reparación de
defectos subcondrales grandes. Además, dicha reparación estará
acompañada de regeneración de cartílago articular más estable
prístino. Se prevé adicionalmente que la reparación de defecto
subcondral ocurrirá a una velocidad acelerada con cantidades
reducidas de OP-1 cuando se mezcle con matriz de
colágeno y un agente aglutinante tal como CMC, respecto a
OP-1 mezclada con colágeno solo. Además, dicha
reparación estará acompañada de regeneración de cartílago articular
más estable prístino.
Se utilizarán dispositivos mejorados que
comprenden una variedad de matrices o mezclas de las mismas para
reparar defectos de cúbito segmentarios (tamaño crítico y no
crítico) a dosis variables de OP-1 en conejos y
perros. Los dispositivos mejorados comprenderán: matriz Pyrost®
(Osteo AG, Suiza), un bloque de HAp derivado de hueso bovino;
gránulos de HAp al 100% (aproximadamente 300-400 ó
350-450 \mum); TCP al 100% (aproximadamente 400
\mum) y 50% de HAp/50% de TCP (aproximadamente 400 \mum). Otras
realizaciones comprenderán una o más de las matrices anteriormente
descritas de porosidad apropiada. Una realización particularmente
preferida de dispositivo osteogénico mejorado comprenderá matriz
Collapat® (Osteo AG, Suiza), una esponja de HAp y colágeno. Otra
realización particularmente preferida comprende aproximadamente 0,6
mg de CMC por g de gránulos de HAp o por g de gránulos de 75% de
HAp/25% de TCP, especialmente cuando se desea un dispositivo con
consistencia de masilla. Se describe anteriormente otra realización
preferida que contiene \beta-TCP y cola de
fibrina.
Se espera que los dispositivos mejorados tales
como los descritos anteriormente inducirán la reparación de defectos
segmentarios, y ciertas realizaciones preferidas harán esto a dosis
bajas de OP-1.
Se completaron cuatro estudios subcutáneos en
rata para evaluar el efecto de la formulación de
OP-1 de cola de fibrina sobre la formación de hueso.
La cantidad de formación de hueso a 10 \mug de
OP-1 utilizando las tres fuentes diferentes de cola
de fibrina era similar, en el intervalo de 25% a 40% (véanse las
tablas 19A-19F). No había una correlación clara
entre inflamación y formación de hueso en estos estudios. Los
resultados indicaron que la rata reaccionaba diferentemente a la
cola de fibrina de diferentes especies. Por ejemplo, la cola de
fibrina humana de Tissucol® desencadenaba una respuesta inflamatoria
de 2 a 2,7 (véase la Tabla 19A), la cola de fibrina bovina causaba
una respuesta inflamatoria de 2 a 3,5 (véanse las Tablas 19B y 19C)
y la cola de fibrina de rata tenía la respuesta inflamatoria más
baja de 1 a 1,3 (véase la Tabla 19D) en una escala de
0-4. Típicamente, se define una respuesta
inflamatoria de 3-4 como grave, y
1-2 se define como leve a media.
Se mezclaron 20 \mul de OP-1
(10 \mug o 20 \mug en lactosa al 5%) con 50 \mul de
fibrinógeno (70-110 mg/ml) y 50 \mul de solución
de trombina (500 U/ml) antes de implantación subcutánea.
Se mezclan 20 \mul de OP-1 (10
\mug en lactosa al 5%) con 50 \mul de fibrinógeno bovino (60
mg/ml) y 50 \mul de solución de trombina bovina (300 U/ml) antes
de implantación subcutánea.
Se mezclaron 20 \mul de OP-1
(10 \mug en lactosa al 5%) con 50 \mul de fibrinógeno bovino (40
mg/ml) y 50 \mul de solución de trombina bovina (200 U/ml) antes
de implantación subcutánea.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezclaron 20 \mul (10 \mug en lactosa al
5%) con 50 \mul de fibrinógeno bovino (40 mg/ml) y 50 \mul de
solución de trombina bovina (200 U/ml) antes de implantación
subcutánea.
Se completaron otros dos estudios in vivo
en rata para evaluar el efecto de dispositivos que contienen cola de
fibrina y OP-1 sobre la formación de hueso. En el
primer estudio, se mezclaron fibrinógeno bovino (50 \mul, Sigma
F8630, 10 mg/ml) y trombina bovina (50 \mul, 50 U/ml) con
dispositivos de OP-1 justo antes de la implantación
subcutánea. Los controles positivos son dispositivos de
OP-1 humedecidos con 100 \mul de solución salina
tamponada con fosfato. Los dispositivos de OP-1 se
prepararon mezclando 10 \mug de OP-1 en etanol al
47,5%/TFA al 0,01% con 25 mg de colágeno y se liofilizaron durante
una noche. Los resultados se muestran en la Tabla 19E. No había
diferencias significativas en la formación de hueso entre los
dispositivos de OP-1 estándar y los dispositivos de
OP-1 combinados con cola de fibrina bovina. También,
se observó una respuesta inflamatoria menor a los dispositivos de
OP-1/formulación de cola de fibrina comparados con
la combinación de OP-1 líquido-cola
de fibrina bovina (véanse las Tablas 19B y
19C).
19C).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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En un segundo estudio, se combinaron diferentes
concentraciones de Tissucol® con el dispositivo de
OP-1 estándar. Es decir, se combinó un dispositivo
de OP-1 liofilizado (25 mg de peso total, 10 \mug
de OP-1) con solución de fibrinógeno humano (50
\mul, fibrinógeno 70-110 mg/ml o diluido 2 ó 4 u 8
veces en solución salina tamponada con fosfato) y solución de
trombina (50 \mul, 500 U/ml o diluido 2 ó 4 u 8 veces en solución
salina tamponada con fosfato) inmediatamente antes de la
implantación. Los controles positivos son dispositivos de
OP-1 humedecidos con 100 \mul de solución salina
tamponada con fosfato. Los resultados se muestran en la Tabla 19F.
No hay diferencias significativas en la formación de hueso entre los
dispositivos de OP-1 estándar y los dispositivos de
OP-1 combinados con diferente concentración de
Tissucol®. También, la concentración de fibrinógeno no tenía ningún
efecto significativo sobre la formación de hueso.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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En resumen, la propiedad de manejo de
dispositivos de OP-1 estándar mejora utilizando cola
de fibrina, por ejemplo, y las partículas de colágeno permanecen
integradas en la cola. Los datos in vivo indicaban que los
dispositivos de OP-1 con cola de fibrina promueven
la formación de hueso.
Se utilizarán dispositivos mejorados que
contienen cola de fibrina que comprenden una variedad de matrices o
mezclas de las mismas para reparar defectos óseos, osteocondrales o
condrales a dosis variables de OP-1 en modelos
animales reconocidos en la técnica. Ciertas realizaciones de
dispositivos preferidos comprenderán: cola de fibrina, colágeno y
OP-1. Otras realizaciones de dispositivos preferidos
comprenderán: cola de fibrina, \beta-TCP y
OP-1. Finalmente, el ensayo adicional incluirá
cualquiera de los materiales de matriz citados anteriormente
adecuados para uso con la presente invención.
Se espera que los dispositivos mejorados que
contienen cola de fibrina tales como los descritos anteriormente
promoverán y acelerarán la formación de hueso en defectos de tamaño
crítico y no crítico, fracturas sin unión y fracturas, así como
promoverán y acelerarán la reparación de defectos osteocondrales y
condrales.
El siguiente es un estudio experimental
comparativo de la eficacia de dispositivos mejorados que contienen
cola de fibrina para curar defectos segmentarios (de tamaño crítico
y no crítico).
Como se describe anteriormente, se utilizan en
este estudio perros mestizos macho adultos criados a propósito. Se
presta especial atención a seleccionar animales de tamaño y peso
uniformes para limitar la variabilidad de la geometría y carga
óseas.
Como se describe anteriormente también, se
realiza la cirugía utilizando técnicas asépticas estándar bajo
anestesia con gas isofluorano. Se preparan ambos miembros anteriores
y se cubren de modo estéril. Se hace una incisión lateral de
aproximadamente 2 cm de longitud y se obtiene la exposición del
cúbito utilizando disección roma y aguda. Se crea un defecto de
tamaño crítico o no crítico en el cúbito medio utilizando una sierra
oscilante. Se mantiene el radio para estabilidad mecánica y no se
utiliza fijación interna ni externa. Se irriga el sitio con solución
salina y se cierran meticulosamente los tejidos blandos en capas
alrededor del defecto. Se implanta o inyecta el dispositivo de
implante apropiado en el sitio de defecto. Se repite después el
procedimiento en el lado contralateral con el implante
apropiado.
Se administran a los animales antibióticos
intramusculares durante cuatro días después de la cirugía y se toman
radiografías anteroposteriores rutinarias inmediatamente después de
la cirugía para asegurar una colocación quirúrgica apropiada. Se
mantienen los animales en jaulas de recuperación de 91,44 x 121,92
cm hasta que se demostró que soportaban su peso, después de lo cual
se transfirieron a carreras y movimiento no restringido
permitidos.
Se obtienen semanalmente radiografías de los
miembros anteriores hasta las 4 semanas, y después cada dos semanas
hasta las 16 semanas en los animales supervivientes utilizando
tiempos e intensidades de exposición estandarizados. Se evalúan las
radiografías y se comparan con radiografías anteriores para apreciar
la calidad y velocidad de curación del defecto. Se evalúan los
cambios en la apariencia radiográfica basándose en la presencia y
densidad de formación de hueso nuevo, la extensión de la formación
de puente en el defecto y la incorporación de las cortezas de hueso
del hospedador.
Los materiales de implante contienen proteína
osteogénica 1 humana recombinante (rhOP-1) en una
formulación de tampón acetato, y rhOP-1 en cola de
fibrina más colágeno o cola de fibrina más
\beta-TCP. Se comparan las formulaciones de
rhOP-1 con controles de sólo vehículo. La
formulación de rhOP-1 en tampón acetato consiste en
3,5 mg/ml de OP-1 en un tampón lactosa/acetato
suministrado en un volumen de 100 \mul. El control de vehículo
consiste en 100 \mul de volumen de tampón lactosa/acetato. Las
formulaciones de ensayo contienen rhOP-1/cola de
fibrina-colágeno o rhOP-1/cola de
fibrina-\beta-TCP.
Se crean defectos segmentarios bilaterales de
cúbito de tamaño crítico o no crítico en todos los animales. Un
grupo de animales recibe una inyección de 0,35 mg de formulación de
rhOP-1/acetato en un defecto y el tampón acetato sin
rhOP-1 en el defecto contralateral. Otro grupo de
animales recibe una inyección de rhOP-1/cola de
fibrina-colágeno o rhOP-1/cola de
fibrina-\beta-TCP en un defecto y
cola de fibrina-\beta-TCP o
colágeno solo en el defecto contralateral. Se sacrifican los
animales en periodos de 4, 8 y 12 semanas después de la operación.
Ciertos perros reciben defectos bilaterales sin implante (sólo
defecto) y se evalúan en los periodos de 4, 8, 12 y 16 semanas
después de la operación.
Al final del periodo de ensayo, se sacrifican
los animales utilizando una sobredosis de barbiturato intravenoso.
Se recogen inmediatamente el cúbito y el radio en bloque y se
disponen en gasas empapadas con solución salina. Se macrofotografían
ambos cúbitos y se toman radiografías de contacto antes de retirar
cuidadosamente por disección los tejidos blandos del sitio de
defecto. Se utiliza después una sierra enfriada con agua para cortar
el cúbito a una longitud uniforme de 9 cm con el defecto centrado en
la mitad de la muestra de ensayo para evaluación del ensayo
biomecánico.
Si la curación de defecto es suficiente
basándose en la manipulación manual, se ensaya la torsión hasta
rotura de las muestras en una máquina de ensayo hidráulica de bucle
cerrado MTS (Minneapolis, MN) operada por control de impactos a una
velocidad de desplazamiento constante de 50 mm/min. Se monta cada
extremo del segmento óseo en un manguito de aluminio cilíndrico y se
cementa con metacrilato de metilo. Se fija rígidamente un extremo y
se gira el otro en sentido contrario a las agujas del reloj. Puesto
que el cúbito de perro tiene una ligera curvatura, se montan las
muestras excéntricamente para mantener la rotación de la muestra
coaxial con la del dispositivo de ensayo. Se aplica la fuerza de
torsión con un brazo de palanca de 6 cm. Se generan curvas de
fuerza-desplazamiento angular, a partir de las
cuales se obtienen el momento y la deformación angular de rotura, y
se calcula la absorción de energía hasta rotura como el área bajo la
curva de carga-desplazamiento.
Se preparan para evaluación histológica tanto
las muestras tratadas como no tratadas. Se fijan las muestras
individuales mediante inmersión en solución de formalina tamponada
al 10% inmediatamente después del ensayo mecánico o después de
seccionar en muestras no tratadas. Con una sierra de diamante
enfriada con agua, se dividen las muestras biseccionando las
muestras a lo largo de su eje largo. Este procedimiento da como
resultado dos porciones de cada muestra para preparaciones
histológicas, incluyendo seccionamiento rectificado no
descalcificado y seccionamiento de microtomo no descalcificado. Se
evalúan en las secciones histológicas la calidad de unión, la
apariencia y calidad del hueso cortical y reticular, y la
remodelación ósea.
Se espera que los dispositivos mejorados que
contienen cola de fibrina con alguna de las matrices preferidas
anteriormente citadas, tales como colágeno o
\beta-TCP, promoverán la reparación de defectos
segmentarios tanto de tamaño crítico como no crítico.
Este estudio es un estudio multicéntrico
prospectivo aleatorizado de pacientes con fracturas recientes de
tibia que requieren intervención quirúrgica en el sitio de
fractura.
Actualmente, hay aproximadamente 26 millones de
fracturas anualmente en todo el mundo. La mayoría de las fracturas
se curan sin complicación y no se consideran "un problema".
Existe sin embargo un "impacto sobre la calidad de vida", con
pacientes que están sin trabajar o impedidos de ocuparse en una
actividad normal, que no son capaces de volver a la actividad o,
cuando lo hacen, que sufren de dolor persistente. Los pacientes,
particularmente en el mundo occidental, esperan cada vez más
soluciones a estos problemas.
El coste del tratamiento de fracturas es
sorprendente. En 1988, las fracturas costaron una estimación de
20.000 millones de dólares en los Estados Unidos. El segmento mayor,
aproximadamente un 44% o 7.200 millones de dólares, estaba
relacionado con el tratamiento hospitalario. En ese año, casi
900.000 personas fueron hospitalizadas por fracturas, con una
duración media de estancia de 8,8 días para un total de 7,9 millones
de días. Los costes de enfermería domiciliaria fueron los segundos
con 2.800 millones de dólares, y la atención hospitalaria
ambulatoria el tercero con 1.800 millones de dólares.
Cuando las ramificaciones económicas de las
fracturas se consideran en conjunto con el impacto sobre la calidad
de vida, existe verdaderamente la necesidad de mejorar las
metodologías de tratamiento, especialmente de fracturas que son
consideradas potencialmente problemáticas. Estas son fracturas que,
debido a la naturaleza de la lesión o a temas de mitigación del
hospedador, pueden requerir intervenciones quirúrgicas adicionales,
llevan un tiempo extendido para curar y/o pueden prevenir una
recuperación funcional total.
Por tanto, el estudio descrito a continuación se
diseña para investigar dispositivos osteogénicos mejorados como
aceleradores de la curación de fracturas recientes en seres humanos
y como medio para reducir el potencial de problemas de curación
después de la lesión que requieran intervención para potenciar el
proceso de curación. Adicionalmente, ciertos pacientes en este
estudio se tratarán con dispositivos osteogénicos mejorados como
sustitutos de injerto de hueso en pacientes que requieran injerto de
hueso después de lesión o en casos de curación retardada.
Como se contempla en la presente memoria y se
describe anteriormente, las realizaciones actualmente preferidas de
dispositivos osteogénicos mejorados tienen una consistencia que
puede inyectarse a través de una aguja de gran calibre, o pueden
disponerse a través de una incisión abierta de tal modo que
permanecerán generalmente en el sitio en un entorno con sangre.
Además del envasado más convencional, los dispositivos osteogénicos
mejorados inyectables pueden envasarse en un aplicador/jeringuilla
listo para uso. Pueden añadirse una variedad de boquillas y agujas
para personalizar la aplicación. Otras realizaciones se volverán
también radioopacas mediante la adición de componentes radioopacos
tales como se describen anteriormente.
Se espera que los dispositivos osteogénicos
mejorados de la presente invención (inyectables e implantables)
reducirán la incidencia de intervenciones adicionales, acelererán la
velocidad de curación, mejorarán la calidad de vida y acelererán la
vuelta a la actividad normal. Además, se espera que los dispositivos
osteogénicos mejorados dados a conocer en la presente memoria se
utilizarán en fracturas de todos los huesos largos, clavícula y
escápula, para promover la curación, conducir a una incidencia
reducida de intervención (incluyendo reoperación), una velocidad de
curación aumentada, una tasa de vuelta a la actividad normal
aumentada y una morbilidad reducida. En contraposición con las
modalidades de reparación de fractura actualmente disponibles, no
hay requisitos mecánicos con los dispositivos mejorados y métodos
dados a conocer en la presente memoria.
Los pacientes requerirán tratamiento quirúrgico
de fracturas abiertas de tibia adquiridas como consecuencia de un
traumatismo. La fractura debe tener el potencial de ser
adecuadamente estabilizada en el sitio de fractura para permitir la
curación. Los pacientes mostrarán evidencia radiográfica de madurez
esquelética.
Tipo nº 1: lesión inicial \leq7 días del
cierre definitivo.
Tipo nº 2: hasta 6 semanas después de la lesión
inicial en pacientes que requieren injerto óseo.
Las fracturas de tipo nº 1 son aquellas que no
requieren injerto óseo. Los pacientes se asignarán aleatoriamente a
una relación 1:1 de tratamiento estándar (desbridamiento del sitio
de fractura, reducción y estabilización), que será el grupo de
control, frente a tratamiento estándar más dispositivo de
OP-1 con y sin un agente aglutinante tal como
carboximetilcelulosa (CMC). En ciertos pacientes, variarán las
dosificaciones de proteína osteogénica OP-1. Como se
describe anteriormente, una formulación actualmente preferida del
dispositivo osteogénico mejorado contiene 2,5 mg de
OP-1/1.000 g de colágeno/200 mg de CMC. Las
dosificaciones de OP-1 variarán desde la mitad del
máximo a 4 veces; el contenido de CMC variará de 100 a 300 mg. Como
se describe anteriormente también, las variaciones de volúmenes de
agente humectante se investigarán por el cirujano/médico a cargo
para conseguir la consistencia/configuración deseada del
dispositivo. Los pacientes del primer grupo que no están curados 6
meses después del tratamiento se asignarán aleatoriamente de nuevo a
una relación 1:1 de injerto óseo (control) frente a
OP-1.
Las fracturas de tipo nº 2 son aquellas que
requieren injerto óseo. Los pacientes se asignarán aleatoriamente en
una relación 1:1 de injerto óseo (control) frente a
OP-1. Los pacientes del primer grupo que no están
curados a los 6 meses después del tratamiento se cruzarán de injerto
de hueso a OP-1 y de OP-1 a injerto
de hueso.
Se seguirán los pacientes durante un mínimo de 1
año después del tratamiento para valorar la curación, con un
seguimiento de 24 meses para valorar el estado.
Las valoraciones de seguimiento se realizarán a
las 2 semanas, 4 semanas y cada 4 semanas hasta los 6 meses, y a los
8, 10 y 12 meses después del tratamiento. Todos los pacientes
tendrán una valoración de seguimiento adicional a los 24 meses para
determinar el estado de salud general y del sitio de fractura. Se
realizarán las siguientes valoraciones: cambios en el examen físico;
radiografías; valoraciones de dolor clínico; valoraciones clínicas
de soporte del peso; valoraciones clínicas de funcionamiento;
valoración de la calidad de vida (antes del alta, 6 y 12 meses); y
documentación de cualquier intervención para potenciar/promover la
curación (quirúrgica y no quirúrgica) y fallos/reemplazos de
material.
Se espera que las fracturas tratadas con
dispositivos osteogénicos mejorados evidenciarán una velocidad de
curación acelerada.
Adicionalmente, se espera que los pacientes
tratados con dispositivos osteogénicos mejorados experimentarán al
menos los siguientes beneficios adicionales:
- 1)
- potencial de un tiempo de curación reducido con restauración más rápida del funcionamiento, soporte del peso y ambulación;
- 2)
- potencial de prevención de unión retardada/mala/nula;
- 3)
- vuelta a las actividades normales más pronto/menos tiempo de trabajo/escuela perdido;
- 4)
- ahorro potencial de intervenciones/procedimientos quirúrgicos adicionales para la promoción de la curación;
- 5)
- menos complicaciones de material; y
- 6)
- en aquellos pacientes que requieren injerto de hueso, el beneficio de no tener cirugía de sitio secundario para la recogida de hueso con la morbilidad asociada.
Se evaluará la reparación de fracturas
diafisarias cerradas recientes en sujetos humanos utilizando
dispositivos osteogénicos mejorados. Específicamente, los pacientes
se tratarán con dispositivos osteogénicos mejorados inyectables
mediante inyección del dispositivo en el sitio de defecto cerrado.
Se prevé que se observará una reparación acelerada del defecto
respecto a pacientes no tratados con dispositivos osteogénicos
mejorados.
Se anticipa que los ensayos 1 y 2 como se
exponen anteriormente se repetirán utilizando diversas
configuraciones de dispositivos osteogénicos mejorados que contienen
cola de fibrina. Se prevé adicionalmente que dichos dispositivos
promoverán la formación de hueso y, en ciertas realizaciones,
acelerarán la reparación de defecto respecto a sujetos no
tratados.
Los modelos de defecto osteocondral apoyan el
uso clínico de rhOP-1 para tratar osteocondritis
disecante (OD) y defectos por traumatismo. La OD es una enfermedad
que da como resultado zonas localizadas de defectos osteocondrales.
Una causa de la enfermedad puede ser daño isquémico en la zona
localizada, pero su etiología exacta es desconocida. En pacientes
con OD, la zona afectada se vuelve avasculares, con cambios
posteriores en el cartílago articular superpuesto. Los pacientes que
padecen OD en la rodilla experimentan síntomas que incluyen bloqueo
de la articulación, dolor localizado, hinchamiento y crepitus
retrorrotuliano. Se realiza un experimento que implica pacientes con
OD en la rodilla para comparar la capacidad del dispositivo
osteogénico mejorado frente a la del dispositivo osteogénico
estándar de reparar defectos de OD.
Los métodos actuales conocidos en la técnica
para el tratamiento de OD implican el uso de técnicas quirúrgicas
altamente invasivas. En la mayoría de los pacientes esqueléticamente
maduros con OD, es necesaria cirugía. Las técnicas quirúrgicas
requieren taladrado artroscópico de la lesión intacta. Como
resultado, los pacientes deben experimentar la administración de
anestesia general durante la cirugía. Los pacientes deben tener
limitado el movimiento de sus rodillas después de la operación por
una abrazadera de inmovilización, y no pueden caminar sin el uso de
muletas hasta que se evidencia la curación.
En este estudio, se realizan técnicas menos
invasivas para el tratamiento de OD. Las técnicas implican el uso de
dispositivo osteogénico mejorado, que se suministra al sitio de
defecto mediante inyección. Se compara la actividad del dispositivo
osteogénico mejorado en la reparación de OD con la del dispositivo
osteogénico estándar.
Se prevé que los pacientes tratados con el
dispositivo osteogénico mejorado que contiene cualquiera de las
matrices y agentes aglutinantes anteriormente citados mostrarán
mayor alivio de síntomas de OD que los tratados con dispositivo
osteogénico estándar. Los pacientes tratados con dispositivo
osteogénico mejorado experimentarán al menos una mayor reducción del
dolor, hinchamiento y bloqueo de la rodilla que los tratados con
dispositivo osteogénico estándar, todos los cuales son indicios de
mejora y/o reparación del defecto.
La invención puede realizarse en otras formas
específicas sin apartarse de las características esenciales de la
misma. Por lo tanto, las anteriores realizaciones han de
considerarse en todos los aspectos ilustrativas en lugar de
limitantes de la invención descrita en la presente memoria. El
alcance de la invención está por tanto indicado por las
reivindicaciones adjuntas en lugar de por la descripción anterior y,
por lo tanto, todos los cambios que entren dentro del significado de
las reivindicaciones se pretenden abarcados en las mismas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: RUEGER, David C.
\hskip3.9cmTUCKER, Marjorie, M.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: DISPOSITIVOS OSTEOGÉNICOS MEJORADOS Y MÉTODOS DE USO DE LOS MISMOS PARA LA REPARACIÓN DE DEFECTOS ÓSEOS ENDOCONDRALES Y OSTEOCONDRALES
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: CREATIVE BIOMOLECULES, INC.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 45 SOUTH STREET
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: HOPKINTON
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: MA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 01748
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: compatible con PC de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- INFORMACIÓN DE REPRESENTANTE/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: VITO, CHRISTINE C.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 39.061
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: CRP-137
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (617) 248-7000
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (617) 248-7100
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.822 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: HOMO SAPIENS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE TEJIDO: hipocampo
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 49...1341
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función= "PROTEÍNA OSTEOGÉNICA", /producto= "OP1", /evidencia= EXPERIMENTAL, /nombre_estándar= "OP1"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 431 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1...102
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /marca= OPX, /nota= "en la que cada Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos especificados como se definen en la memoria descriptiva."
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 97 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1...97
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /marca= sec.-genérica 7, /nota= "en la que cada Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos especificados como se definen en la memoria descriptiva".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1...102
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /marca= sec.-genérica-8, /nota= "en la que cada Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos especificados como se definen en la memoria descriptiva."
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 97 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1...97
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /marca= sec.-genérica-9, /nota= "en la que cada Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos especificados como se definen en la memoria descriptiva."
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1...102
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /marca= sec.-genérica-10, /nota= "en la que cada Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos especificados como se definen en la memoria descriptiva."
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1...5
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "en la que cada Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos especificados como se definen en la memoria descriptiva."
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1...5
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "en la que cada Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos especificados como se definen en la memoria descriptiva."
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa}
Claims (32)
1. Un dispositivo para inducir la formación de
hueso o cartílago local, que comprende:
(a) una proteína osteogénica;
(b) matriz derivada de un material que no es un
polímero sintético; y
(c) un agente aglutinante seleccionado del grupo
consistente en carboximetilcelulosa y la sal de sodio de la misma,
en el que el agente aglutinante tiene una viscosidad de
aproximadamente 0,01-0,2 Pa.s y un grado de
sustitución de 0,65-0,90.
2. El dispositivo de la reivindicación 1, en el
que dicha proteína osteogénica se selecciona del grupo consistente
en: OP-1, OP-2,
OP-3, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP9, BMP10, BMP11,
BMP12, BMP15, BMP16, DPP, Vgl, Vgr, proteína 60A, GDF1, GDF3, GDF5,
GDF6, GDF7, GDF8, GDF9, GDF10, GDF11 y variantes de secuencia
aminoacídica de cada una de las anteriores.
3. El dispositivo de la reivindicación 1, en el
que dicha proteína osteogénica se selecciona del grupo consistente
en: OP-1, OP-2, BMP2, BMP4, BMP5,
BMP6 y variantes de secuencia aminoacídica de cada una de las
anteriores.
4. El dispositivo de la reivindicación 1, en el
que dicha proteína osteogénica comprende una secuencia aminoacídica
que tiene al menos un 70% de homología con los
102-106 aminoácidos C-terminales,
incluyendo el dominio de siete cisteínas conservado, de
OP-1 humana.
5. El dispositivo de la reivindicación 1, en el
que dicha proteína osteogénica es OP-1.
6. El dispositivo de la reivindicación 1, en el
que dicho dispositivo comprende al menos dos proteínas osteogénicas
diferentes.
7. El dispositivo de la reivindicación 1, en el
que dicha matriz se selecciona del grupo consistente en colágeno,
hueso desmineralizado, apatitos, hidroxiapatitos, fosfatos de
tricalcio y mezclas de los mismos.
8. El dispositivo de la reivindicación 1, en el
que dicha matriz es colágeno.
9. El dispositivo de la reivindicación 1, en el
que dicha matriz es \beta-fosfato de
tricalcio.
10. El dispositivo de la reivindicación 1, en el
que dicho dispositivo comprende al menos dos materiales de matriz
diferentes.
11. El dispositivo de la reivindicación 1, que
comprende adicionalmente un agente humectante.
12. El dispositivo de la reivindicación 11, en
el que dicho agente humectante es solución salina.
13. Un dispositivo para inducir la formación de
hueso o cartílago local que comprende: aproximadamente 1,25 mg de
OP-1 y al menos aproximadamente 180 mg de
carboximetilcelulosa por 1.000 mg de matriz de colágeno, en el que
dicha carboximetilcelulosa tiene una viscosidad de aproximadamente
0,01-0,2 Pa.s y un grado de sustitución de
0,65-0,90.
14. El dispositivo de la reivindicación 13, que
comprende al menos aproximadamente 2,5 mg de OP-1
por 1.000 mg de matriz de colágeno.
15. El dispositivo de la reivindicación 13 ó 14,
que comprende al menos aproximadamente 200 mg de
carboximetilcelulosa por 1.000 mg de matriz de colágeno.
16. Un dispositivo para inducir la formación de
cartílago o hueso local, que comprende una proteína osteogénica y un
vehículo, en el que dicho vehículo comprende
(a) una parte (p/p) de agente aglutinante
seleccionado del grupo consistente en carboximetilcelulosa y la sal
de sodio de la misma, en el que el agente aglutinante tiene una
viscosidad de aproximadamente 0,01-0,2 Pa.s y un
grado de sustitución de 0,65-0,90; y
(b) 50 o menos partes (p/p) de matriz
seleccionada del grupo consistente en colágeno, hueso
desmineralizado, apatitos, hidroxiapatitos, fosfatos de tricalcio y
mezclas de los mismos.
17. El dispositivo de la reivindicación 16, en
el que dicho vehículo comprende una parte (p/p) de agente
aglutinante y 25 partes (p/p) de matriz.
18. El dispositivo de la reivindicación 16, en
el que dicho vehículo comprende una parte (p/p) de agente
aglutinante y 10 partes (p/p) de matriz.
19. El dispositivo de la reivindicación 16, en
el que dicho vehículo comprende una parte (p/p) de agente
aglutinante y 5 partes (p/p) de matriz.
20. El dispositivo de la reivindicación 16, en
el que dicho vehículo comprende menos de cinco partes (p/p) de
matriz.
21. Un dispositivo para inducir la formación de
hueso o cartílago local, que comprende una proteína osteogénica y un
vehículo, en el que dicho vehículo comprende:
(a) 10 o menos partes (p/p) de agente
aglutinante seleccionado del grupo consistente en
carboximetilcelulosa y la sal de sodio de la misma, en el que el
agente aglutinante tiene una viscosidad de aproximadamente
0,01-0,2 Pa.s y un grado de sustitución de
0,65-0,90; y
(b) una parte (p/p) de matriz seleccionada del
grupo consistente en colágeno, hueso desmineralizado, apatitos,
hidroxiapatitos, fosfatos de tricalcio y mezclas de los mismos.
22. El dispositivo de la reivindicación 21, en
el que dicho vehículo comprende menos de 10 partes (p/p) de agente
aglutinante.
23. El dispositivo de la reivindicación 14, 17 ó
22, que comprende adicionalmente solución salina.
24. Uso de una proteína osteogénica, matriz
derivada de un material que no es un polímero sintético y un agente
aglutinante seleccionado del grupo consistente en
carboximetilcelulosa y la sal de sodio de la misma, en el que el
agente aglutinante tiene una viscosidad de aproximadamente
0,01-0,2 Pa.s y un grado de sustitución de
0,65-0,90, para la preparación de un dispositivo
farmacéutico para inducir la formación de hueso o cartílago local
para reparación de sitio de defecto de hueso, cartílago u
osteocondral.
25. El uso de la reivindicación 24, en el que la
formación de hueso local es formación de hueso endocondral.
26. El uso de la reivindicación 24, en el que la
formación de hueso local es formación de cartílago articular.
27. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 26, en el que dicho sitio de defecto se
selecciona del grupo consistente en: defecto de tamaño crítico,
defecto de tamaño no crítico, defecto segmentario sin unión,
fractura sin unión, fractura, defecto osteocondral y defecto
subcondral.
28. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 27, en el que el volumen de la composición
farmacéutica proporcionada al sitio de defecto es suficiente para
rellenar el sitio de defecto.
29. Un dispositivo para inducir la formación de
hueso o cartílago local, que comprende:
(a) OP-1;
(b) matriz de colágeno; y
(c) carboximetilcelulosa que tiene una
viscosidad de aproximadamente 0,01-0,2 Pa.s y un
grado de sustitución de 0,65-0,90.
30. Un kit para inducir la formación de hueso o
cartílago local utilizando el dispositivo de la reivindicación 1,
comprendiendo el kit:
(a) un primer recipiente adaptado para albergar
una proteína osteogénica y un material de matriz; y
(b) un segundo recipiente adaptado para albergar
un agente aglutinante;
en el que la proteína osteogénica y el material
de matriz se proporcionan en el primer recipiente, y el agente
aglutinante se selecciona del grupo consistente en
carboximetilcelulosa y la sal de sodio de la misma, en el que el
agente aglutinante tiene una viscosidad de aproximadamente
0,01-0,2 Pa.s y un grado de sustitución de
0,65-0,90, y se proporciona en un segundo
recipiente.
31. El kit de la reivindicación 30, que
comprende adicionalmente un tercer recipiente adaptado para albergar
un agente humectante.
32. El kit de la reivindicación 30, en el que
dicho primer recipiente y segundo recipiente son iguales.
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