JPH09503904A - 増殖分化因子−７ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 増殖分化因子−７（ＧＤＦ−７）がそのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列と共に開示されている。ＧＤＦ−７ポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を用いる診断及び治療方法も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】 増殖分化因子−７ 発明の背景 １．発明の分野 本発明は、一般的には増殖因子に関し、特定的にはトランスフォーミング増殖 因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーの増殖分化因子−７（ＧＤＦ−７）と いわれる新規なメンバーに関する。 ２．関連技術の説明 トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーは、胚発 育の間の分化過程の広い範囲に影響を及ぼす構造的に関連する一群のタンパク質 を包含する。このファミリーには、正常な雄性発育に必要なミューラー阻害物質 （ＭＩＳ）(Behringerら，Nature，345:167，1990)、背腹軸形成及び成虫原基の 形態形成に必要なドロソフィラ・デカペンタプレジック(Drosophila decapentap legic)（ＤＰＰ）遺伝子産物(Padgettら，Nature，325:81-84，1987)、卵の植物 極に局在しているツメガエルＶｇ−１遺伝子産物（Weeksら，Cell，51:861-867 ，1987）、ツメガエルの胚の中胚葉及び前部構造の形成を誘発することができる （Thomsonら，Cell，63:485，1990）アクチビン(Masonら，Biochem．Biophys．R es．Commun.，135:957-964，1986)、及び de novo 軟骨及び骨形成を誘発できる 骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ，オステオゲニン，ＯＰ−１）（Sampathら，J． Biol．Chem.，265:13198，1990）が含まれる。ＴＧＦ−β類 は、脂質生成、筋発生、軟骨形成、血液生成、及び上皮細胞分化を含む種々の分 化過程に影響することができる（委細については、Massague，Cell，49:437，19 87を参照のこと）。 ＴＧＦ−βファミリーのタンパク質は、最初、大きな前駆体タンパク質として 合成され、その後にＣ−末端から約１１０〜１４０アミノ酸の塩基性残基のクラ スターでタンパク質分解性開裂を受ける。これらタンパク質のＣ−末端領域又は 成熟領域は全て構造的に関連しているので、異なるファミリーメンバーをそれら の相同性の程度に基づいて個別のサブグループに分類することができる。個々の サブグループ内の相同性は７０％から９０％アミノ酸配列同一性の範囲となるが 、サブグループ間の相同性はかなり低くて一般に僅か２０％から５０％の範囲に 過ぎない。各場合において、活性種はＣ−末端断片のジスルフィド連結ダイマー のようである。ＴＧＦ−βファミリーのメンバーのプロ領域をＴＧＦ−βファミ リーの他のメンバーの成熟領域と同時発現すると、細胞内二量化と生物活性なホ モダイマーの分泌が起こることが示された（Gray，A.とMaston，A.，Science，2 47:1328，1990）。Hammondsらによる更なる研究（Molec．Endocrin．5:149，199 1)で、ＢＭＰ−２プロ領域をＢＭＰ−４成熟領域と組み合わせて用いると、成熟 ＢＭＰ−４の発現が劇的に向上することが示された。研究した殆どのファミリー メンバーについて、そのホモダイマー種が生物活性であることが分かったが、イ ンヒビン（Lingら，Nature，321:779，1986）及びＴＧＦ−β類（Cheifetzら，C ell，48:409，1987）のような他のファミリーメンバーについては、ヘテロダイ マーも検出され、そしてこれらはそれぞれのホモダイマ ーとは異なる生物特性を有するようである。 それらの発現パターンにおいて組織特異的である新規な因子の同定で、その組 織の発育及び機能の深い理解が得られるであろう。 発明の要旨 本発明は、細胞増殖及び分化因子、つまりＧＤＦ−７、該因子をコードするポ リヌクレオチド配列、及び該因子と免疫反応性である抗体を提供する。この因子 は、種々の細胞増殖性障害、特に神経組織に関連する細胞増殖性障害に関係する ようである。 かくして、１つの態様においては、本発明は、ＧＤＦ−７に関連する神経起源 の細胞増殖性障害を検出する方法を提供する。もう１つの態様においては、本発 明は、ＧＤＦ−７活性を抑制するか又は高めることによって細胞増殖性障害を治 療する方法を提供する。 図面の簡単な説明 図１は、神経組織及び細胞系内でのＧＤＦ−７ ｍＲＮＡの発現を検出してい るＲＮアーゼ保護アッセイを示す。矢印は保護種の位置を示す。 図２は、マウスＧＤＦ−７のヌクレオチド配列及び予想されるアミノ酸配列を 示す。マウス配列内の推定五塩基プロセシング部位をボックスで囲んでいる。 図３は、ＧＤＦ−７とＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーとのＣ− 末端配列のアラインメントを示す。保存システイン残基をボックスで囲んでいる 。短い横線はアラインメントを最大にするために空けた空所を表わす。 図４は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの異なるメンバー間のアミノ酸相同性 を示す。数字は、第１保存システインからＣ−末端まで計算した各ペア間のアミ ノ酸同一性のパーセントを表わす。ボックスは、特定のサブグループ内で高度に 関連するメンバー間の相同性を表わす。 発明の詳細な説明 本発明は、増殖及び分化因子ＧＤＦ−７及びＧＤＦ−７をコードするポリヌク レオチド配列を提供する。ＧＤＦ−７は、神経組織中で発現される。１つの態様 においては、本発明は、神経起源のＧＤＦ−７発現に関係する細胞増殖性障害を 検出する方法を提供する。もう１つの態様においては、本発明は、ＧＤＦ−７活 性を抑制するか又は高める物質を用いることによって細胞増殖性障害を治療する 方法を提供する。 ＴＧＦ−βスーパーファミリーは、多くの細胞型内で増殖、分化、及び他の機 能を制御する多官能性ポリペプチドからなる。これらペプチドの多くは、他のペ プチド増殖因子に正と負の両方の調節作用を有する。この発明のＧＤＦ−７タン パク質とＴＧＦ−βファミリーのメンバーとの間の構造的相同性は、ＧＤＦ−７ がこのファミリーの増殖及び分化因子の新たなメンバーであることを示している 。他の多くのメンバーの既知の活性に基づき、ＧＤＦ−７もそれを診断及び治療 用試剤として有用なものにする生物活性を有するであろうことが期待される。 特に、このスーパーファミリーの一定のメンバーは、神経系の機能に関連する 発現パターンを有するか又は活性を有する。例えば、１つのファミリーメンバー 、即ちＧＤＮＦは、ドーパミン作 動性ニューロンの生存を促進することができる強力な神経栄養因子であることが 示された(Lin ら，Science，260:1130)。他のファミリーメンバー、即ちドーサ リン（dorsalin）は、神経冠細胞の分化を促進することができる(Basterら，Cel l，73:687)。インヒビン類及びアクチビン類は、脳内で発現されることが示され (Meunier ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:247，1988；Sawchenko ら，Nat ure，334:615，1988)、そしてアクチビン類は、神経細胞生存分子として機能で きることが示された(Schubertら，Nature，344:868，1990)。他のファミリーメ ンバー、即ちＧＤＦ−１は、その発現パターンにおいて神経系特異性であり(Lee ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88:4250，1991)、そしてＶｇｒ−１（Lyons ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:4554，1989；Jones ら，Development，1 11:531，1991）、ＯＰ−１(Ozkaynakら，J．Biol．Chem.，267:25220，1992)、 及びＢＭＰ−４(Jones ら，Development，111:531，1991)の如き他の一定のファ ミリーメンバーも、神経系で発現されることが知られている。類似性により、Ｇ ＤＦ−７は、神経変性疾患（neurodegenerative diseases）の治療に又は移植前 の培養液中の細胞若しくは組織の維持に用途を有し得る。 ＴＧＦ−βスーパーファミリーの幾つかのメンバーは、癌の如き細胞増殖性障 害の治療のための用途の可能性を示唆する活性を有する。特に、ＴＧＦ−βは、 種々の細胞型に対する強力な増殖阻害物質であることが示された（Massagueら， Cell，49:437，1987）。ＭＩＳは、ヌードマウスにおいてヒト子宮内膜癌腫瘍の 増殖を阻害することが示され(Donahoeら，Ann．Surg.，194: 472，1981)、そしてインヒビンαは、卵巣及び精巣の両方における腫瘍の発育を 抑制することが示された(Matzukら，Nature，360:313，1992)。ＧＤＦ−７は、 類似の活性を有し得、従って神経起源の腫瘍の治療用の如き抗増殖剤として有用 であり得る。 ＴＧＦ−βファミリーのメンバーの多くは、組織修復の重要な媒介物質でもあ る。ＴＧＦ−βはコラーゲンの生成に顕著な作用を有すること、及び新生マウス 内でめざましい血管形成反応を起こすことが示された(Roberts ら，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA，83:4167，1986)。ＢＭＰは、新たな骨増殖を誘発することが できるので骨折及び他の骨格欠損症の治療に有効である（Glowackiら，Lancet， 1:959，1981；Fergusonら，Clin．Orthoped．Relat．Res.，227:265，1988；Joh nson ら，Clin．Orthoped．Relat．Res.，230:257，1988）。ＧＤＦ−７は、類 似の活性を有し得るので、例えば外傷又は熱傷により起こる組織傷害の修復に有 用であり得る。 ここで用いられる“実質的に純粋”という用語は、他のタンパク質、脂質、炭 水化物又は天然に随伴している他の物質を実質的に含まないＧＤＦ−７のことを いう。当業者は、タンパク質精製の標準的技術を用いてＧＤＦ−７を精製するこ とができる。この実質的に純粋なポリペプチドは、非還元性ポリアクリルアミド ゲル上で単一の主バンドを示すであろう。ＧＤＦ−７ポリペプチドの純度は、ア ミノ末端アミノ酸配列分析によっても測定することができる。ＧＤＦ−７ポリペ プチドには、ＧＤＦ−７の活性が残っている限り、このポリペプチドの機能性断 片が含まれる。ＧＤＦ−７の生物活性を含有するより小さなペプチドが本発明に 包含 される。 本発明は、ＧＤＦ−７タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。 これらポリヌクレオチドには、ＧＤＦ−７をコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲ ＮＡ配列が含まれる。ＧＤＦ−７の全部又は一部をコードする全てのポリヌクレ オチドも、それらがＧＤＦ−７活性を有するポリペプチドをコードする限り、こ こに含まれるものと理解される。かかるポリヌクレオチドには、天然に存在する ポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、及び故意に操作したポリヌクレオチ ドが含まれる。例えば、ＧＤＦ−７ポリヌクレオチドを部位特異的突然変異誘発 に付してもよい。ＧＤＦ−７のポリヌクレオチド配列にはアンチセンス配列も含 まれる。本発明のポリヌクレオチドには、遺伝コードの結果として縮重している 配列が含まれる。２０の天然アミノ酸があり、その殆どが１を越えるコドンによ り特定される。従って、そのヌクレオチド配列によりコードされるＧＤＦ−７ポ リペプチドのアミノ酸配列が機能的に不変である限り、全ての縮重ヌクレオチド 配列が本発明に包含される。 ここに具体的に開示されているのは、ＧＤＦ−７遺伝子の一部を含有するゲノ ミックＤＮＡ配列である。この配列は、ＧＤＦ−７前駆体タンパク質の予想Ｃ− 末端領域に対応するオープンリーディングフレームを含有する。コードされるポ リペプチドは、潜在的な五塩基タンパク質分解性プロセシング部位を含有すると 予想される。この前駆体のこの部位での開裂は、約１４，９００の予想分子量を 有する１４６アミノ酸の成熟生物活性Ｃ−末端断片を生じるであろう。 推定タンパク質分解性プロセシング部位の次に続くＧＤＦ−７のＣ−末端領域 は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの既知メンバーと有意な相同性を示す。この ＧＤＦ−７配列は、他のファミリーメンバー内に高度に保存されている殆どの残 基を含有する（図３を参照のこと）。既知のファミリーメンバーのうち、ＧＤＦ −７はＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４に最も相同性である（５７％配列同一性）（図 ４を参照のこと）。 組換えＧＤＦ−７−次アミノ酸配列の僅かな修飾で、ここに記載したＧＤＦ− ７ポリペプチドに比較して実質的に等しい活性を有するタンパク質が生じ得る。 かかる修飾は、部位特異的突然変異誘発のように故意であっても自然に生じたも のであってもよい。ＧＤＦ−７の生物活性が依然として存在する限り、これら修 飾によりもたらされる全てのポリペプチドがここに含まれる。更に、１又は２以 上のアミノ酸の欠失も、その結果生じる分子の構造の修飾を、その生物活性を大 きく変化させることなくもたらすことができる。これは、より広い有用性を有す るであろうより小さな活性分子の開発をもたらし得る。例えば、ＧＤＦ−７生物 活性に不要なアミノ末端又はカルボキシ末端アミノ酸を除去することができる。 本発明のＧＤＦ−７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列には、開示し た配列及びその保存的変異体が含まれる。ここで用いる“保存的変異”という用 語は、他の生物学的に類似の残基によるアミノ酸残基の置換を意味する。保存的 変異の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンの如き１つの疎 水性残基の別の疎水性残基との置換；又はアルギニンのリシンとの 置換、グルタミン酸のアスパラギン酸との置換、又はグルタミンのアスパラギン との置換等の如き１つの極性残基の別の極性残基との置換が含まれる。“保存的 変異”という用語には、未置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を用いること も含まれる。但し、その置換ポリペプチドに対して生じる抗体はその未置換ポリ ペプチドとも免疫反応できることを条件とする。 本発明のＤＮＡ配列は、幾つかの方法により得ることができる。例えば、この ＤＮＡは、当該技術分野で周知のハイブリダイゼーション技術を用いて単離する ことができる。これらには、１）相同性ヌクレオチド配列を検出するためのプロ ーブを用いたゲノミック又はｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーション、 ２）興味の対象であるＤＮＡ配列にアニーリングできるプライマーを用いるゲノ ミックＤＮＡ又はｃＤＮＡ上でのポリメラーゼ複製連鎖反応（ＰＣＲ）、及び３ ）構造的特徴を共有するクローン化ＤＮＡ断片を検出するための発現ライブラリ ーの抗体スクリーニング、が含まれるがこれらに限定されない。 好ましくは、本発明のＧＤＦ−７ポリヌクレオチドは、哺乳動物、最も好まし くは、マウス、ラット、又はヒトから誘導される。適切なプローブが入手可能で あれば、核酸ハイブリダイゼーションに依拠するスクリーニング操作で、あらゆ る生物からあらゆる遺伝子配列を単離するのが可能である。問題のタンパク質を コードする配列の一部分に対応するオリゴヌクレオチドプローブは、化学的に合 成することができる。これには、短い長さのオリゴペプチドのアミノ酸配列が既 知でなければならない。このタンパク質をコードするＤＮＡ配列は遺伝コードか ら推定することができ るが、コードの縮重を考慮に入れなければならない。配列が縮重したものである 場合には混合付加反応（mixed additionreaction）を行うことが可能である。こ れは、変性した二本鎖ＤＮＡの不均一混合液を含む。かかるスクリーニングのた めに、ハイブリダイゼーションを好ましくは一本鎖ＤＮＡ又は変性した二本鎖Ｄ ＮＡのいずれかで行う。興味の対象であるポリペプチドに関連するｍＲＮＡ配列 が極端に少ない量しか存在しない供給源から誘導されるｃＤＮＡクローンの検出 には、ハイブリダイゼーションが特に有用である。換言すると、非特異的結合の 回避に向けたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いることによ り、例えば、特定のｃＤＮＡクローンのオートラジオグラフィーでの可視化を、 該標的ＤＮＡのその完全な相補体である単一プローブに対する混合液中でのハイ ブリダイゼーションによりできるようにすることが可能である(Wallace ら，Nuc leic Acids Res.，9:879，1981)。 ＧＤＦ−７をコードする特定のＤＮＡ配列は、１）ゲノミックＤＮＡからの二 本鎖ＤＮＡ配列の単離；２）興味の対象であるポリペプチドに必要なコドンを得 るためのＤＮＡ配列の化学的製造；及び３）真核供与体細胞から単離したｍＲＮ Ａの逆転写による二本鎖ＤＮＡ配列の in vitro 合成、によっても得ることがで きる。この後の方の場合には、一般にｃＤＮＡといわれるｍＲＮＡの二本鎖ＤＮ Ａ相補体が最終的に生成する。 組換え操作に用いる特定のＤＮＡ配列のための上記の３種の方法のうち、ゲノ ミックＤＮＡ単離物の単離が最も一般性に劣る。これは、特に、イントロンの存 在のために哺乳動物ポリペプチド の微生物発現を得るのが望ましい場合に当てはまる。 ＤＮＡ配列の合成は、所期のポリペプチド産物のアミノ酸残基の全配列が分か っているときは、しばしば選り抜きの方法である。所期のポリペプチドのアミノ 酸残基の全配列が分かっていないときには、ＤＮＡ配列の直接合成は可能ではな いので、選択される方法はｃＤＮＡ配列の合成である。興味の対象であるｃＤＮ Ａ配列を単離する標準的操作の中で抜きん出ているのは、高レベルの遺伝子発現 を有する供与体細胞内に豊富なｍＲＮＡの逆転写から誘導されるプラスミド又は ファージ保有ｃＤＮＡライブラリーの形成である。ポリメラーゼ連鎖反応法と組 み合わせて用いると、希薄な発現産物であっもクローン化できる。ポリペプチド のアミノ酸配列のかなりの部分が分かっている場合には、標的ｃＤＮＡ中に存在 すると推定される配列と二重体になる標識した一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ又 はＲＮＡプローブ配列を作って、一本鎖型に変性されたｃＤＮＡのクローン化コ ピー上で行われるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション操作に用いることがで きる(Jay ら，Nucl．Acid Res.，11:2325，1983)。 λｇｔ１１の如きｃＤＮＡ発現ライブラリーを、ＧＤＦ−７に特異的な抗体を 用いて、少なくとも１のエピトープを有するＧＤＦ−７ペプチドについて間接的 にスクリーニングすることができる。かかる抗体はポリクローナル的に誘導され てもモノクローナル的に誘導されてもよく、ＧＤＦ−７ ｃＤＮＡの存在を示す 発現産物を検出するのに用いることができる。 ＧＤＦ−７をコードするＤＮＡ配列は、適する宿主細胞内へのＤＮＡ移入によ り in vitro で発現することができる。“宿主細 胞”は、ベクターがその中で増殖できてそのＤＮＡが発現できる細胞である。こ の用語は、被験体宿主細胞のあらゆる子孫を包含する。複製の間に突然変異が起 こることがあるので、全ての子孫が親細胞と同一という訳ではないことが了解さ れる。しかしながら“宿主細胞”という用語を用いるときは、かかる子孫が含ま れる。安定な移入とは、外来ＤＮＡが宿主内で継続的に維持されることを意味す るのであるが、その方法は当該技術分野で既知である。 本発明では、ＧＤＦ−７ポリヌクレオチド配列を組換え発現ベクター内に挿入 してもよい。“組換え発現ベクター”という用語は、ＧＤＦ−７遺伝子配列の挿 入又は組み込みにより操作されたプラスミド、ウイルス又は当該技術分野で既知 のその他のビヒクルのことをいう。かかる発現ベクターは、宿主の挿入遺伝子配 列の効率的な転写を促進するプロモーター配列を含有する。発現ベクターは、典 型的には、複製起点、プロモーター、並びにその形質転換細胞の表現型選択を可 能にする特定の遺伝子を含有する。本発明に用いるのに適するベクターには、細 菌内での発現のためのＴ７に基づく発現ベクター（Rosenberg ら，Gene，56:125 ，1987）、哺乳動物細胞内での発現のためのｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（Lee と Nathans，J．Biol．Chem.，263:3521，1988）及び昆虫細胞内での発現のための バキュロウイルス誘導ベクターが含まれるが、これらに限定されない。このＤＮ Ａセグメントは、調節要素、例えば、プロモーター（例えば、Ｔ７、メタロチオ ネインＩ、又はポリヘドリンプロモーター）に発効的に連結したベクター内に存 在することができる。 ＧＤＦ−７をコードするポリヌクレオチド配列は、原核生物内でも真核生物内 でも発現することができる。宿主には、微生物、酵母、昆虫及び哺乳動物が含ま れ得る。原核生物内で真核性又はウイルス性配列を有するＤＮＡ配列を発現する 方法は、当該技術分野で周知である。宿主内で発現及び複製できる生物学的に機 能性のウイルス及びプラスミドＤＮＡベクターは、当該技術分野で知られている 。かかるベクターが、本発明のＤＮＡ配列を組み込むのに用いられる。好ましく は、ＧＤＦ−７の成熟Ｃ−末端領域は、ＧＤＦ−７の全コーディング配列を含有 するｃＤＮＡクローンから発現される。また、ＧＤＦ−７のＣ−末端部分を、Ｔ ＧＦ−βファミリーの別のメンバーのプロ領域との融合タンパク質として発現し ても、別のプロ領域と同時発現してもよい（例えば、Hammondsら，Molec．Endoc rin．5:149，1991；Gray，A.と Mason，A.，Science，247:1328，1990 を参照の こと）。 組換えＤＮＡでの宿主細胞の形質転換は、当業者にとって周知である慣用的技 術により行うことができる。宿主が大腸菌の如き原核性である場合、ＤＮＡ取り 込みができるコンピテント細胞は、対数増殖期後に採取してから当該技術分野で 周知の操作を用いるＣａＣｌ₂法により処理した細胞から調製することができる 。また、ＭｇＣｌ₂又はＲｂＣｌを用いてもよい。形質転換は、必要なら宿主細 胞のプロトプラストの形成後に行うこともできる。 宿主が真核生物である場合には、リン酸カルシウム共沈；マイクロインジェク ション、エレクトロポレーション、リポソーム内に包み込んだプラスミドの挿入 の如き慣用的な機械的操作；又はウイルスベクターのようなＤＮＡの形質移入の 方法を用いること ができる。真核細胞は、本発明のＧＤＦ−７をコードするＤＮＡ配列、及び単純 ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子の如き選択可能な表現型をコードする第二外来 ＤＮＡ分子で同時形質転換することもできる。他の方法は、シミアンウイルス４ ０（ＳＶ４０）又はウシパピローマウイルスの如き真核性ウイルスベクターを用 いて、真核細胞を一過的に感染又は形質転換して本タンパク質を発現させること である（例えば、Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory ，Gluzman編，1982 を参照のこと）。 本発明により提供される微生物発現ポリペプチド又はその断片の単離及び精製 は、分取クロマトグラフィー及びモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を 関与させる免疫学的分離法を含む慣用的手段により行うことができる。 本発明は、ＧＤＦ−７ポリペプチド又はその機能性断片と免疫反応性の抗体を 包含する。異なるエピトープ特異性を有するプールされたモノクローナル抗体か ら本質的になる抗体、並びに別個のモノクローナル抗体調製物が提供される。モ ノクローナル抗体は、当業者にとって周知の方法により本タンパク質の断片を含 有する抗原から作られる(Kohlerら，Nature，256:495，1975)。この発明で用い られる抗体という用語は、ＧＤＦ−７上のエピトープ決定基に結合できる無傷分 子並びにＦａｂ及びＦ(ａｂ’)₂の如きその断片を包含させようとするものであ る。 “細胞増殖性障害”という用語は、形態学的及び遺伝子型的の両方でしばしば 周辺組織と違って見える悪性及び非悪性細胞集団を意味する。悪性細胞（即ち、 癌）は、多段階経過の結果発育する。アンチセンス分子であるＧＤＦ−７ポリヌ クレオチドは、種 々の器官系、特に、例えば、神経組織内の細胞の悪性腫瘍を治療するのに有用で ある。本質的に、ＧＤＦ−７の発現の変調に病因学的に関連するあらゆる障害は 、ＧＤＦ−７抑制剤での治療に感受性であると考えられる。かかる障害の１つは 、例えば、悪性細胞増殖性障害である。 本発明は、抗ＧＤＦ−７抗体をＧＤＦ−７関連障害を有する疑いがある細胞に 接触させて該抗体への結合を検出することを含む、神経組織の細胞増殖性障害を 検出する方法を提供する。ＧＤＦ−７と反応性の抗体は、ＧＤＦ−７への結合の 検出を可能にする化合物で標識される。本発明の目的のためには、ＧＤＦ−７ポ リペプチドに特異的な抗体を用いて、生体液及び組織中のＧＤＦ−７のレベルを 検出する。検出できる量の抗原を含有するあらゆる検体を用いることができる。 この発明の好ましいサンプルは神経組織である。疑いのある細胞内のＧＤＦ−７ のレベルを正常細胞内のレベルと比較して、その被験体がＧＤＦ−７関連細胞増 殖性障害を有するかどうか確認することができる。好ましくは、被験体はヒトで ある。 本発明の抗体は、 in vitro 又は in vivo 免疫診断又は免疫治療を施すのが 望ましいあらゆる被験体に用いることができる。本発明の抗体は、例えば、それ らを液相で用いることも固相担体に結合させることもできるイムノアッセイに用 いるのに適している。加えて、これらイムノアッセイにおける抗体は、種々の方 法で検出できるように標識することができる。本発明の抗体を用いることができ るイムノアッセイのタイプの例は、直接又は間接のいずれかの形式の競合及び非 競合イムノアッセイである。かかる イムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及びサンドイッチ（イ ムノメトリック）アッセイである。本発明の抗体を用いる抗原の検出は、フォワ ード、リバース、又は同時モードのいずれかで行われるイムノアッセイを用いて 行うことができ、このイムノアッセイには、生理学的サンプルでの免疫組織化学 的アッセイも含まれる。当業者は、過度に実験を重ねることなく他のイムノアッ セイ形式を知っているか又は容易に見分けられるであろう。 本発明の抗体を多くの異なる担体に結合させて、本発明のポリペプチドを含む 抗原の存在を検出するのに用いることができる。周知の担体の例には、ガラス、 ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミ ラーゼ、天然及び変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース及び磁鉄鉱 が含まれる。担体の性質は、本発明の目的のためには可溶性であっても不溶性で あってもよい。当業者は、抗体を結合させるための他の適する担体を知っている か、又は定型的な実験を用いてそうしたものを探知できるであろう。 当業者にとって既知の多くの異なる標識及び標識方法がある。本発明に用いる ことができる標識のタイプの例には、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、コロ イド状金属、化学発光化合物、リン光化合物、及び生物発光化合物が含まれる。 当業者は、抗体への結合のための他の適する標識を知っているか、又は定型的な 実験を用いてそうしたものを探知できるであろう。 より大きな感度をもたらすこともできる他の技術は、低分子量ハプテンに抗体 をカップリングさせることからなるものである。これらハプテンは、次いで第二 反応により特異的に検出することができる。例えば、アビジンと反応するビオチ ン、又は特異的抗ハプテン抗体と反応できるジニトロフェニル、プリドキサール 、及びフルオレセインの如きハプテンを用いるのが普通である。 抗原の in vivo 検出のために本発明のモノクローナル抗体を用いるには、検 出できるように標識された該抗体を診断に有効な用量与える。“診断に有効な” という用語は、検出できるように標識されたモノクローナル抗体の量が、そのモ ノクローナル抗体が特異的である本発明のポリペプチドを含む抗原を有する部位 の検出を可能にするのに十分な量で投与されることを意味する。 検出できるように標識されたモノクローナル抗体の投与される濃度は、本ポリ ペプチドを有する細胞への結合がバックグランドに比較して検出可能となるのに 十分であるべきである。更に、検出できるように標識されたモノクローナル抗体 は、最良の標的対バックグランドのシグナル比が得られるように、循環系から速 やかに浄化されるのが望ましい。 一般に、 in vivo 診断のための検出できるように標識されたモノクローナル 抗体の用量は、その個体の年齢、性別、及び疾患の程度の如き要因に依存して変 動するであろう。かかる用量は、例えば、多数回注射するかどうか、抗原負担、 及び当業者にとって既知の他の要因に依存して変動し得る。 in vivo 診断的画像化（diagnostic imaging）については、利用できる検出装 置のタイプが所与の放射性同位元素を選択するに 際しての主要な要因である。選ばれる放射性同位元素は、所与のタイプの装置に とって検出可能なタイプの崩壊を持たなければならない。 in vivo 診断のため の放射性同位元素を選択するに際してのもう一つ重要な要因は、宿主に関して有 害な放射線が最小限であることである。理想的には、in vivo 画像化に用いる放 射性同位元素は粒子放出を欠いているが、慣用的なガンマカメラで容易に検出で きる１４０〜２５０ｋｅＶ幅の大きな数の光子を生じるであろう。 in vivo 診断のため、放射性同位元素をイムノグロブリンに直接結合させても 介在官能基を用いて間接的に結合させてもよい。金属イオンとして存在する放射 性同位元素をイムノグロブリンに結合させるのにしばしば用いられる介在官能基 は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）及びエチレンジアミン四酢酸（Ｅ ＤＴＡ）及び類似の分子の如き二官能性キレート剤である。本発明のモノクロー ナル抗体に結合できる金属イオンの典型的な例は、¹¹¹Ｉｎ、⁹⁷Ｒｕ、⁶⁷Ｇａ、^{6 8} Ｇａ、⁷²Ａｓ、⁸⁹Ｚｒ、及び²⁰¹Ｔｌである。 本発明のモノクローナル抗体は、in vivo 診断の目的で、磁気共鳴画像化（Ｍ ＲＩ）又は電子スピン共鳴（ＥＳＲ）におけるように常磁性同位元素で標識する こともできる。一般に、診断画像を可視化するあらゆる慣用的方法を用いること ができる。通常、ガンマ及び陽電子放出放射性同位元素がカメラ画像化に用いら れ、ＭＲＩには常磁性同位元素が用いられる。かかる技術に特に有用な元素には 、¹⁵⁷Ｇｄ、⁵⁵Ｍｎ、¹⁶²Ｄｙ、⁵²Ｃｒ、及び⁵⁶Ｆｅが含まれる。 本発明のモノクローナル抗体を in vitro 及び in vivo で用いて被験体にお けるＧＤＦ−７関連疾患の改善の経過を追跡することができる。かくして、例え ば、本発明のポリペプチドを含む抗原を発現する細胞数の増加若しくは減少又は 種々の体液中に存在するかかる抗原の濃度の変化を測定することによって、ＧＤ Ｆ−７関連疾患を改善することを狙った特定の治療法が有効であるかどうかを確 認することが可能となろう。“改善”という用語は、治療を受けている被験体の ＧＤＦ−７関連疾患の好ましくない作用が少なくなることを意味する。 本発明は、正常細胞内での発現に比較して変調して発現され得るヌクレオチド 配列を同定するものであり、従ってこの配列に向けた適切な治療技術又は診断技 術をデザインすることが可能となる。かくして、細胞増殖性障害がＧＤＦ−７の 発現と関係している場合には、翻訳レベルでＧＤＦ−７発現を妨害する核酸配列 を用いることができる。このアプローチは、例えば、アンチセンス核酸及びリボ ザイムを用いて特定のＧＤＦ−７ ｍＲＮＡの翻訳を遮断するものであって、そ れはそのｍＲＮＡをアンチセンス核酸でマスクするか又はそれをリボザイムで開 裂させるかのいずれかによりなされる。 アンチセンス核酸は、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分に相補的なＤＮ Ａ又はＲＮＡ分子である（Weintraub，Scientific American，262:40，1990）。 細胞内で、このアンチセンス核酸は対応するｍＲＮＡとハイブリダイズして二本 鎖分子を形成する。その細胞は二本鎖であるｍＲＮＡを翻訳しないであろうから 、このアンチセンス核酸はそのｍＲＮＡの翻訳を妨害す ることになる。約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。とい うのは、それらは容易に合成されかつ標的ＧＤＦ−７産生細胞内に導入した際に 、より大きな分子よりもあまり問題を起こしそうにないからである。遺伝子の i n vitro 翻訳を阻害するためにアンチセンス法を用いることは、当該技術分野で 周知である（Marcus-Sakura，Anal．Biochem.，172:289，1988）。 リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと類似のやり方で他の一本鎖Ｒ ＮＡを特異的に開裂する能力を有するＲＮＡ分子である。これらＲＮＡをコード するヌクレオチド配列の修飾を通して、あるＲＮＡ分子内の特定のヌクレオチド 配列を認識してそれを開裂する分子を工学的に作ることが可能である(Cech，J． Amer．Med．Assn.，260:3030，1988)。このアプローチの主要な利点は、それら が配列特異性なので、特定の配列を有するｍＲＮＡだけを不活性化する点である 。 ２つの基本的なタイプのリボザイム、即ち、テトラヒメナ型(Hasselhoff，Nat ure，334:585，1988)及び“ハンマーヘッド”型がある。テトラヒメナ型リボザ イムは長さが４塩基の配列を認識し、“ハンマーヘッド”型リボザイムは長さが １１〜１８塩基の塩基配列を認識する。認識配列が長ければ長いほど、その配列 が標的ｍＲＮＡ種内に占有的に存在する可能性が大きくなる。従って、特定のｍ ＲＮＡ種を不活性化するには、ハンマーヘッド型リボザイムがテトラヒメナ型リ ボザイムよりも好ましく、しかも１８塩基認識配列がより短い認識配列よりも好 ましい。 本発明は、ＧＤＦ−７タンパク質により媒介される細胞増殖性障害又は免疫障 害を治療するための遺伝子治療法も提供する。か かる治療法は、ＧＤＦ−７アンチセンスポリヌクレオチドを増殖性障害を有する 細胞内に導入することによりその治療的効果をもたらすことになろう。アンチセ ンスＧＤＦ−７ポリヌクレオチドの送達は、キメラウイルスの如き組換え発現ベ クター又はコロイド分散系を用いて行うことができる。アンチセンス配列の治療 的送達に特に好ましいのは、標的設定されたリポソームの使用である。 ここに教示した遺伝子治療に用いることができる種々のウイルスベクターには 、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス又は、好ましくは、 レトロウイルスの如きＲＮＡウイルスが含まれる。好ましくは、レトロウイルス ベクターは、マウス又は鳥類レトロウイルスの誘導体である。単一の外来遺伝子 を挿入することができるレトロウイルスの例には、モロニーマウス白血病ウイル ス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイ（Harvey）マウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ） 、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が含 まれるが、これらに限定されない。多くの更なるレトロウイルスベクターが複数 の遺伝子を取り込むことができる。導入された細胞を同定及び世代形成させられ るように、これら全てのベクターは、選択マーカー用の遺伝子を移入するか又は 取り込むことができる。興味の対象であるＧＤＦ−７配列を、例えば、特定の標 的細胞上の受容体のリガンドをコードする別の遺伝子と一緒にウイルスベクター の中に挿入することにより、そのベクターはその時点で標的特異性となる。例え ば、糖、糖脂質又はタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することに より、レトロウイルスベクターを標的 特異性にすることができる。好ましい標的設定は、そのレトロウイルスベクター を標的とする抗体を用いることにより達成される。当業者は、過度な実験を重ね ることなく、ＧＤＦ−７アンチセンスポリヌクレオチドを含有するレトロウイル スベクターの標的特異的送達を可能にするためにレトロウイルスゲノム内に挿入 できる特定のポリヌクレオチド配列を知っているか、又は容易に探知できるであ ろう。 組換えレトロウイルスは不完全であるので、それらは感染性ベクター粒子を産 生するために助けを必要とする。この助けは、例えば、レトロウイルスの全ての 構造遺伝子をそのＬＴＲ内の調節配列の制御下でコードするプラスミドを含有す るヘルパー細胞系を用いることにより得ることができる。これらプラスミドには 、その包み込みメカニズムがキャプシド外被のためにＲＮＡ転写産物を認識でき るようにするヌクレオチド配列がない。この包み込みシグナルの欠失を有するヘ ルパー細胞系には、例えば、Ψ２、ＰＡ３１７及びＰＡ１２が含まれるが、これ らに限定されない。これら細胞系は、ゲノムが包み込まれないので、空のビリオ ンを産生する。包み込みシグナルは完全であるが構造遺伝子が興味の対象の他の 遺伝子により置き換えられたレトロウイルスベクターをかかる細胞内に導入する と、そのベクターは包み込まれてベクタービリオンを産生することができる。 また、ＮＩＨ３Ｔ３又は他の組織培養細胞をレトロウイルス構造遺伝子ｇａｇ 、ｐｏｌ及びｅｎｖをコードするプラスミドで慣用的なリン酸カルシウムトラン スフェクションにより直接トランスフェクトすることができる。次いで、これら 細胞を興味の対象 の遺伝子を含有するベクタープラスミドでトランスフェクトする。得られる細胞 は、培地中にそのレトロウイルスベクターを放出する。 ＧＤＦ−７アンチセンスポリヌクレオチドのもう１つの標的設定送達系は、コ ロイド分散系である。コロイド分散系には、高分子複合体；ナノカプセル；マイ クロスフェア；ビーズ；及び油中水エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリ ポソームを含む脂質を基剤とした系；が含まれる。この発明の好ましいコロイド 系はリポソームである。リポソームは、in vitro 及び in vivoでの送達ビヒク ルとして有用である人工膜小嚢である。サイズが０．２〜４．０μｍの大きな単 層の小嚢（large unilamellarvesicle，ＬＵＶ）が、大きな高分子を含有する相 当なパーセンテージの水性緩衝液を封入できることが分かった。ＲＮＡ、ＤＮＡ 及び無傷ビリオンをその水性内部に封入して、生物活性な形で細胞に送達するこ とができる（Fraleyら，Trends Biochem．Sci.，6:77，1981）。哺乳動物細胞に 加えて、リポソームは、植物、酵母、及び細菌細胞にポリヌクレオチドを送達す るのに用いられてきた。リポソームが有効な遺伝子移入ビヒクルであるためには 、次の特徴が存在すべきである：(1)興味の対象である遺伝子を高い効率で封入 するがそれらの生物活性を弱めないこと；(2)非標的細胞に比較して標的細胞に 優先的かつ強固に結合すること；(3)標的細胞の細胞質にその小嚢の水性内容物 を高い効率で送達すること；及び（4）遺伝子情報を正確かつ効率的に発現する こと（Mannino ら，Biotechniques，6:682，1988）。 リポソームの組成は、通常、リン脂質、特に高い相転移温度の リン脂質の組み合わせであり、通常は、ステロイド、特にコレステロールが組み 合わさっている。他のリン脂質又は他の脂質を用いることもできる。リポソーム の物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、及び二価カチオンの存在に依存する。 リポソーム生成に有用な脂質の例には、ホスファチジルグリセロール、ホスフ ァチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ス フィンゴ脂質、セレブロシド及びガングリオシドの如きホスファチジル化合物が 含まれる。特に有用なものは、脂質部分が１４〜１８炭素原子、特に１６〜１８ 炭素原子を含有しそして飽和であるジアシルホスファチジルグリセロールである 。実例となるリン脂質には、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファ チジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。 リポソームの標的設定は、解剖学的及び機械学的要因に基づいて分類される。 解剖学的分類は、選択性のレベル、例えば、器官特異性、細胞特異性及びオルガ ネラ特異性のレベルに基づく。機械学的標的設定は、それが受動的であるか能動 的であるかに基づいて区別することができる。受動的標的設定は、洞様毛細血管 を含む器官内の細網内皮系（reticulo-endothelial system，ＲＥＳ）の細胞に 分布するリポソームの自然的傾向を用いる。一方、能動的標的設定は、リポソー ムをモノクローナル抗体、糖、糖脂質又はタンパク質の如き特異性リガンドにカ ップリングさせることにより又はリポソームの組成若しくはサイズを変えること によりリポソームを変性して、天然に存在する局在化部位以外の器官及び細胞型 に標的を定めることを包含する。 標的設定送達系の表面をいろいろな方法で修飾することができる。リポソーム 標的設定送達系の場合には、脂質基をリポソームの脂質二重層内に取り込ませて 、その標的指向性リガンドがそのリポソーム二重層と安定な結び付きを維持する ようにすることができる。脂質鎖を標的指向性リガンドに繋ぐために種々の連結 基を用いることができる。 神経組織内でのＧＤＦ−７の発現に起因して、本発明のポリペプチド、ポリヌ クレオチド及び抗体を用いる、この組織に関連する種々の用途がある。かかる用 途には、この組織に関係する細胞増殖性障害の治療が含まれる。加えて、ＧＤＦ −７は、種々の遺伝子治療操作に有用であり得る。 以下の実施例は、本発明を説明するものであって限定を意図するものではない 。それらは用いられるかも知れないものの典型であるが、当業者にとって既知の 他の操作を代わりに用いてもよい。 実施例１ 新規なＴＧＦ−βファミリーメンバーの同定及び単離 ＴＧＦ−βスーパーファミリーの新規なメンバーを同定するために、既知のフ ァミリーメンバー間の２つの保存領域に対応する縮重オリゴヌクレオチドをデザ インした。一方の領域はＭＩＳを除く全てのファミリーメンバーで保存されてい る２つのトリプトファン残基にまたがる領域であり、他方の領域はＣ−末端の近 くの不変システイン残基にまたがる領域であった。これらプライマーをマウスゲ ノミックＤＮＡ上で複製連鎖反応に用いた後、それらプライマーの５’末端に位 置する制限部位を用いてそれらＰＣ Ｒ産物をサブクローン化し、これらサブクローン化挿入体を保有する個々の大腸 菌コロニーを拾い上げ、そしてランダムシーケンシング（random sequencing） 及びハイブリダイゼーション分析の組み合わせを用いてこのスーパーファミリー の既知メンバーを除いた。 下記プライマーで得られたＰＣＲ産物の混合物からＧＤＦ−７を同定した。 SJL141: 5'-CCGGAATTCGGITGG(G/C/A)A(G/A/T/C)(A/G)A(T/C)TGG (A/G)TI(A/G)TI(T/G)CICC-3’（配列番号：１） SJL146: 5'-CCGGAATTC(G/A)CAI(G/C)C(G/A)CAIG(C/A)(G/A/T/C) C(G/T)IACI(G/A)(T/C)CAT-3’（配列番号：２） これらプライマーを用いるＰＣＲを２μｇマウスゲノミックＤＮＡで９４℃で １分間、５０℃で２分間、そして７２℃で２分間の４０サイクルで行った。 約２８０ｂｐのＰＣＲ産物をゲル精製し、ＥｃｏＲＩで消化し、再度ゲル精製 し、そして Bluescript ベクター（Stratagene，San Diego，CA）内にサブクロ ーン化した。個々のサブクローンを保有する細菌コロニーを９６ウェルマイクロ タイタープレート内に拾い取り、そしてそれら細胞をニトロセルロース上にプレ ートすることにより多数のレプリカを調製した。これらレプリカフィルターをこ のファミリーの既知メンバーに相当するプローブにハイブリダイズさせ、そして ハイブリダイズしないコロニーから配列分析用のＤＮＡを調製した。 アミノ酸配列 GW(H/Q/N/K/D/E)(D/N)W(V/I/M)(V/I/M)(A/S)P（配列番号：３） 及び M(V/I/M/T/A)V(R/S)(A/S)C(G/A)C（配列 番号：４）をそれぞれコードするＳＪＬ１４１及びＳＪＬ１４６のプライマーの 組み合わせで、分析した１４７のサブクローンの中から以前に同定された５種の 配列（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、インヒビンβＢ、ＧＤＦ−３及びＧＤＦ−５） と１種の新規な配列が生成し、この新規な配列をＧＤＦ−７と名付けた。 実施例２ ＧＤＦ−７の発現パターン及び配列 ＧＤＦ−７の発現パターンを確認するために、種々の組織から調製したＲＮＡ サンプルをノーザン分析及びＲＮアーゼ保護によりスクリーニングした。図１に 示すように、ＧＤＦ−７ ｍＲＮＡは、胎児及び新生児の脳内及び Neuro 2A 神 経芽細胞腫細胞系内で検出された。 ＧＤＦ−７遺伝子のより大きなセグメントを得るために、マウスゲノミックラ イブラリーをＧＤＦ−７ ＰＣＲ産物から誘導したプローブでスクリーニングし た。ＧＤＦ−７ゲノミッククローンの部分配列を図２ａに示す。この配列は、Ｇ ＤＦ−７前駆体タンパク質の予想Ｃ−末端領域に対応するオープンリーディング フレームを含有する。この予想されるＧＤＦ−７配列は、潜在的タンパク質分解 性プロセシング部位を含有しており、これをボックスで囲んでいる。この部位で のこの前駆体の開裂で、１４,９００の予想分子量を有する長さが１４６アミノ 酸の成熟Ｃ−末端断片が生ずるであろう。 推定されるタンパク質分解性プロセシング部位の次に続くＧＤＦ−７のＣ−末 端領域は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの既知 メンバーに対して有意な相同性を示す（図３）。図３は、ＧＤＦ−７のＣ−末端 配列と、ヒトＧＤＦ−１(Lee，S.J.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88:4250-42 54，1991)、ヒトＢＭＰ−２及び４（Wozneyら，Science，242:1528-1534，1988 ）、ヒトＶｇｒ−１（Celesteら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87:9843-9847 ，1990）、ヒトＯＰ−１（Ozkaynakら，EMBO J.，9:2085-2093，1990）、ヒトＢ ＭＰ−５（Celesteら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87:9843-9847，1990）、 ヒトＢＭＰ−３（Wozneyら，Science，242:1528-1534，1988）、ヒトＭＩＳ（Ca teら，Cell，45:685-698，1986）、ヒトインヒビンα、βＡ、及びβＢ(Mason ら，Biochem．Biophys．Res．Commun.，135:957-964，1986)、ヒトＴＧＦ−β１ (Derynck ら，Nature，316:701-705，1985)、ヒトＴＧＦ−β２（deMartinら，E MBO J.，6:3673-3677，1987）、及びヒトＴＧＦ−β３（ten Dijke ら，Proc．N atl．Acad．Sci．USA，85:4715-4719，1988）の対応する領域とのアラインメン トを示す。保存システイン残基をボックスで囲んでいる。短い横線はアラインメ ントを最大にするために空けたギャップを表わす。 ＧＤＦ−７は、他のファミリーメンバーに高度に保存された殆どの残基を含有 し、それらには特徴的な間隔を有する７つのシステイン残基が含まれる。 図４は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの異なるメンバー間のアミノ酸相同性 を示す。数字は、第１保存システインからＣ−末端まで計算した各ペア間のアミ ノ酸同一性のパーセントを表わす。ボックスは、特定のサブグループ内で高度に 関連するメンバー間 の相同性を表わす。この領域では、ＧＤＦ−７はＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４に最 も相同性である（５７％配列同一性）。 現時点で好ましい態様に関して本発明を説明してきたが、本発明の精神から逸 脱することなく種々の修飾を行うことができることが理解されるべきである。従 って、本発明は、次の請求の範囲によって限定されるに過ぎない。 配列の概要 配列番号：１は、ＧＤＦ−７プライマーＳＪＬ１４１のヌクレオチド配列であ る。 配列番号：２は、ＧＤＦ−７プライマーＳＪＬ１４６のヌクレオチド配列であ る。 配列番号：３は、ＧＤＦ−７プライマーＳＪＬ１４１のアミノ酸配列である。 配列番号：４は、ＧＤＦ−７プライマーＳＪＬ１４６のアミノ酸配列である。 配列番号：５は、ＧＤＦ−７のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である 。 配列番号：６は、ＧＤＦ−７の推定アミノ酸配列である。 配列番号：７は、ＧＤＦ−７のＣ−末端アミノ酸配列である。 配列番号：８は、ＧＤＦ−１のＣ−末端アミノ酸配列である。 配列番号：９は、ＢＭＰ−２のＣ−末端アミノ酸配列である。 配列番号：１０は、ＢＭＰ−４のＣ−末端アミノ酸配列である。 配列番号：１１は、Ｖｇｒ−１のＣ−末端アミノ酸配列である。 配列番号：１２は、ＯＰ−１のＣ−末端アミノ酸配列である。 配列番号：１３は、ＢＭＰ−５のＣ−末端アミノ酸配列である。 配列番号：１４は、ＢＭＰ−３のＣ−末端アミノ酸配列である。 配列番号：１５は、ＭＩＳのＣ−末端アミノ酸配列である。 配列番号：１６は、インヒビン−αのＣ−末端アミノ酸配列である。 配列番号：１７は、インヒビン−β−αのＣ−末端アミノ酸配 列である。 配列番号：１８は、インヒビン−β−βのＣ−末端アミノ酸配列である。 配列番号：１９は、ＴＧＦ−β−１のＣ−末端アミノ酸配列である。 配列番号：２０は、ＴＧＦ−β−２のＣ−末端アミノ酸配列である。 配列番号：２１は、ＴＧＦ−β−３のＣ−末端アミノ酸配列である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＡＡ 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＡＡＮ ＡＤＵ 9284−4Ｃ ＡＤＵＤ 48/00 9051−4Ｃ 48/00 49/00 9454−4Ｃ 49/00 Ａ Ｃ０７Ｈ 21/04 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ０７Ｋ 14/52 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ１２Ｎ 1/21 7804−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 9358−4Ｂ 21/08 21/08 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．実質的に純粋な増殖分化因子−７（ＧＤＦ−７）及びその機能性断片。 ２．請求項１のＧＤＦ−７ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチ ド配列。 ３．該ポリヌクレオチドが哺乳動物細胞から単離される、請求項２のポリヌクレ オチド配列。 ４．哺乳動物細胞がマウス、ラット、及びヒトの細胞からなる群から選ばれる、 請求項３のポリヌクレオチド。 ５．請求項２のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。 ６．ベクターがプラスミドである、請求項５のベクター。 ７．ベクターがウィルスである、請求項５のベクター。 ８．請求項５のベクターで安定に形質転換された宿主細胞。 ９．細胞が原核細胞である、請求項８の宿主細胞。 10．細胞が真核細胞である、請求項８の宿主細胞。 11．請求項１のポリペプチド又はその断片と反応性の抗体。 12．抗体がポリクローナルである、請求項11の抗体。 13．抗体がモノクローナルである、請求項11の抗体。 14．細胞増殖性障害を検出する方法であって、請求項11の抗体をＧＤＦ−７関連 障害を有する疑いがある被験体の検体と接触させて該抗体の結合を検出すること を含む方法。 15．細胞が神経細胞である、請求項14の方法。 16．検出が in vivo である、請求項14の方法。 17．抗体が検出できるように標識されている、請求項16の方法。 18．検出できる標識が、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、及び化 学発光化合物からなる群から選ばれる、請求項17の方法。 19．検出が in vitro である、請求項14の方法。 20．抗体が検出できるように標識されている、請求項19の方法。 21．標識が、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、 及び酵素からなる群から選ばれる、請求項20の方法。 22．ＧＤＦ−７の発現と関連する細胞増殖性障害を治療する方法であって、該細 胞をＧＤＦ−７活性を抑制する試剤と接触させることを含む方法。 23．試剤が抗ＧＤＦ−７抗体である、請求項22の方法。 24．試剤がＧＤＦ−７アンチセンス配列である、請求項22の方法。 25．細胞が神経細胞である、請求項22の方法。 26．ＧＤＦ−７活性を抑制する試剤がベクターを用いて細胞に導入される、請求 項22の方法。 27．ベクターがコロイド状分散系である、請求項26の方法。 28．コロイド状分散系がリポソームである、請求項27の方法。 29．リポソームが本質的に標的特異性である、請求項28の方法。 30．リポソームが解剖学的に標的設定されている、請求項29の方法。 31．リポソームが機械学的に標的設定されている、請求項30の方法。 32．機械学的標的設定が受動的なものである、請求項31の方法。 33．機械学的標的設定が能動的なものである、請求項31の方法。 34．リポソームが、糖、糖脂質、及びタンパク質からなる群から選ばれる部分と カップリングすることにより能動的に標的設定されている、請求項33の方法。 35．タンパク質部分が抗体である、請求項34の方法。 36．ベクターがウィルスである、請求項35の方法。 37．ウィルスがＲＮＡウィルスである、請求項36の方法。 38．ＲＮＡウィルスがレトロウィルスである、請求項37の方法。 39．レトロウィルスが本質的に標的特異性である、請求項38の方法。 40．標的特異性のための部分がレトロウィルスゲノムの中に挿入されたポリヌク レオチドによりコードされる、請求項39の方法。 41．標的特異性の部分が、糖、糖脂質、及びタンパク質からなる群から選ばれる 、請求項40の方法。 42．タンパク質が抗体である、請求項41の方法。