JP2012161635A - 骨の修復のための骨形成デバイスおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】骨欠損および軟骨欠損の修復のための改良された骨形成デバイスおよびそれを使用する方法が本明細書において開示される。このデバイスおよび方法は、当該分野におけるデバイスよりもより少ない骨形成タンパク質を用いて増強された安定性を有する修復組織の加速された形成を促進する。本発明の修復に受容可能である欠損は、重症サイズ欠損、非重症サイズ欠損、非癒合性骨折、骨折、骨軟骨欠損、肋骨下欠損、および離断性骨軟骨炎のような変性疾患から生じる欠損を含むがこれらに限定されない。
【選択図】なし
Description
本願は、1997年3月20日に出願された同時係属中の米国仮出願番号08/822.186の継続出願であり、その内容の全体が本明細書で参考として援用される。
本明細書において開示される発明は、骨形成タンパク質を用いた、骨および軟骨欠損修復のための物質および方法に関する。
真の軟骨形成組織モルフォゲンとして作用する能力がある、1つのクラスのタンパク質が現在同定されている。すなわち、これらのタンパク質は、前駆細胞の、機能的な骨、軟骨、腱および/または靭帯組織への増殖および分化をそれ自体で誘導し得る。このクラスのタンパク質を、本明細書中で「骨形成タンパク質」または「形態形成タンパク質」または「モルフォゲン」と呼ぶ。これらには、当初は異所性の軟骨内性骨形態形成を誘導するそれらの能力により同定された、骨形態形成タンパク質(BMP)ファミリーのメンバーが含まれる。骨形成タンパク質は、一般的に、増殖因子のTGF−βスーパーファミリーのサブグループとして当該分野で分類されている(Hogan(1996)Genes&Development 10:1580−1594)。タンパク質のモルフォゲンファミリーのメンバーは、哺乳動物骨形成タンパク質−1(OP−1、BMP−7およびDrosophilaホモログ60Aとしても知られる)、骨形成タンパク質−2(OP−2、BMP−8としても知られる)、骨形成タンパク質−3(OP−3)、BMP−2(BMP−2AまたはCBMP−2A、およびDrosophilaホモログDPPとしても知られる)、BMP−3、BMP−4(BMP−2BまたはCBMP−2Bとしても知られる)、BMP−5、BMP−6、ならびにそのマウスホモログVgr−1、BMP−9、BMP−10、BMP−11、BMP−12、GDF3(Vgr2としても知られる)、GDF8、GDF9、GDF10、GDF11、GDF12、BMP−13、BMP−14、BMP−15、GDF−5(CDMP−1またはMP52としても知られる)、GDF−6(CDMP−2としても知られる)、GDF−7(CDMP−3としても知られる)、XenopusホモログVglおよびNODAL、UNIVIN、SCREW、ADMP、ならびにNEURALを含む。このファミリーのメンバーは、共通の構造特色を共有する。(前駆体「プロ形態」からプロセシングされ、二量体化する能力がある成熟ポリペプチド鎖を生じ、そして約97〜106アミノ酸のカルボキシ末端活性ドメインを含む)分泌ポリペプチド鎖をコードする。全てのメンバーは、このドメインにおけるシステインの保存パターンを共有し、そしてこれらのタンパク質の活性形態は、単一のファミリーメンバーのジスルフィド結合ホモ二量体、または2つの異なるメンバーのヘテロ二量体のいずれかであり得る(例えば、Massague(1990)Annu.Rev.Cell Biol.6:597;Sampathら、(1990)J.Biol.Chem.265:13198を参照のこと)。特許文献1;特許文献2、Ozkaynakら(1990)EMBO J. 9:2085−2093、Whartonら(1991)PNAS 88:9214−9218)、(Ozkaynak(1992)J.Biol.Chem. 267:25220−25227、および特許文献2);(Celesteら(1991)PNAS 87:9843−9847);(Lyonsら(1989)PNAS 86:4554−4558)もまた参照のこと。これらの開示は、これらの骨形成タンパク質の、アミノ酸およびDNAの配列ならびに化学的および物理的特徴を記載する。Wozneyら(1988)Science 242:1528−1534);BMP9(特許文献3、1993年1月7日に公開);DPP(Padgettら(1987)Nature 325:81−84;およびVg−1(Weeks(1987)Cell 51:861−867)もまた参照のこと。
本発明は、骨形成タンパク質および非合成性、非ポリマー性マトリクス(例えば、コラーゲンまたはβリン酸三カルシウム(β−TCP))を、結合剤と混合することによって、骨修復能力および軟骨修復能力の増強を伴う改良された骨形成デバイスを得たという知見に基づく。このような改良されたデバイスは、修復速度を加速し得るのみならず、これらのデバイスはまた、高品質で安定な修復組織(特に、軟骨組織)の形成を促進し得る。さらに、上記の利点は、標準骨形成デバイスによって要求されるよりも有意に少ない骨形成タンパク質を用いて達成され得る。理論に拘束されることを望まないが、上記の予測されない特性は、おそらく、非ポリマー性マトリクスおよび結合剤との間の補完的または相乗的な相互作用に帰し得る。存在する整形技術および再構築技術に鑑みて、これらの知見は、予期されず、そしてこれまで理解されていなかった。
(項目1)局所性の骨形成または軟骨形成を誘導するためのデバイスであって、以下:
骨形成タンパク質;
非合成、非ポリマー性物質に由来するマトリクス;および
結合剤、
を含む骨形成デバイス。
(項目2)前記骨形成タンパク質が、OP−1;OP−2;OP−3;BMP2;BMP
3;BMP4;BMP5;BMP6;BMP9;BMP−10;BMP−11、BMP−12、BMP−15、BMP−16、DPP;Vg1;Vgr;60Aタンパク質;GDF−1;GDF−3、GDF−5、GDF−6、GDF−7、GDF−8、GDF−9、GDF−10、GDF−11;およびそれらの各々のアミノ酸配列改変体からなる群より選択される、項目1に記載のデバイス。
(項目3)前記骨形成タンパク質が、OP−1;OP−2、BMP2;BMP4;BMP
5;BMP6;およびそれらの各々のアミノ酸配列改変体からなる群より選択される、項目1に記載のデバイス。
(項目4)前記骨形成タンパク質が、ヒトOP−1の、保存された7つのシステインドメ
インを含む、C末端102〜106アミノ酸と少なくとも70%の相同性を有するアミノ酸配列を含む、項目1に記載のデバイス。
(項目5)前記骨形成タンパク質がOP−1である、項目1に記載のデバイス。
(項目6)少なくとも2つの異なる骨形成タンパク質を含む、項目1に記載のデバイス。
(項目7)前記マトリクスが、コラーゲン、鉱質除去骨、アパタイト、ヒドロキシアパタ
イト、リン酸三カルシウム、およびそれらの混合物からなる群より選択される、項目1に記載のデバイス。
(項目8)前記マトリクスがコラーゲンである、項目1に記載のデバイス。
(項目9)前記マトリクスがβ−リン酸三カルシウムである、項目1に記載のデバイス。
(項目10)少なくとも2つの異なるマトリクス物質を含む、項目1に記載のデバイス。
(項目11)前記結合剤が、マンニトール、デキストラン、白色ワセリン、マンニトール
/デキストランの組合せ、マンニトール/白色ワセリンの組合せ、ゴマ油、アルキルセルロース類、フィブリンのり、およびそれらの混合物からなる群から選択される、項目1に記載のデバイス。
(項目12)前記結合剤がアルキルセルロース類からなる群より選択される、項目1に記
載のデバイス。
(項目13)前記結合剤がメチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒド
ロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシアルキルセルロース、およびそれらの混合物からなる群より選択される、項目1に記載のデバイス。
(項目14)前記結合剤がカルボキシメチルセルロースまたはそのナトリウム塩である、
項目1に記載のデバイス。
(項目15)前記結合剤がフィブリンのりであり、該フィブリンのりが哺乳動物フィブリ
ノーゲンおよびトロンビンの混合物である、項目1に記載のデバイス。
(項目16)前記デバイスが少なくとも2つの異なる結合剤を含む、項目1に記載のデバ
イス。
(項目17)湿潤剤をさらに含む、項目1に記載のデバイス。
(項目18)前記湿潤剤が生理食塩水である、項目17に記載のデバイス。
(項目19)局所性の骨形成または軟骨形成を誘導するためのデバイスであって、以下:
約1.25mgの骨形成タンパク質OP−1;
約1000mgのコラーゲンマトリクス;および
少なくとも約180mgのカルボキシメチルセルロース、
を含む、デバイス。
(項目20)少なくとも約2.5mgのOP−1をさらに含む、項目19に記載のデバイ
ス。
(項目21)少なくとも約200mgのカルボキシメチルセルロースをさらに含む、項目
19または20に記載のデバイス。
(項目22)局所性の骨形成または軟骨形成を誘導するためのデバイスであって、以下:
約0.4mgの骨形成タンパク質;
約1000mgのコラーゲンマトリクス;および
少なくとも約20mgのフィブリンのり、
を含む、デバイス。
(項目23)約40mgのフィブリンのりをさらに含む、項目22に記載のデバイス。
(項目24)局所性の骨形成または軟骨形成を誘導するためのデバイスであって、以下:
約1.2mgの骨形成タンパク質;
約1000mgのβ−リン酸三カルシウム;および
少なくとも約40mgのフィブリンのり、
を含む、デバイス。
(項目25)約220mgのフィブリンのりをさらに含む、項目22または24に記載の
デバイス。
(項目26)前記フィブリンのりが哺乳動物フィブリノーゲンとトロンビンとの混合物で
ある、項目22または24に記載のデバイス。
(項目27)前記トロンビン含量が約2.0U〜約25Uである、項目26に記載のデバ
イス。
(項目28)前記トロンビン含量が約5.0U〜約25Uである、項目26に記載のデバ
イス。
(項目29)前記トロンビン含量が約2.5U〜約5.0Uである、項目26に記載のデ
バイス。
(項目30)約20mg〜約180mgのフィブリノーゲン含量をさらに含む、項目26
に記載のデバイス。
(項目31)骨形成タンパク質およびキャリアを含む局所性の骨形成または軟骨形成を誘
導するためのデバイスであって、該キャリアが50部(w/w)のマトリクスに対して1部(w/w)の結合剤を含む、デバイス。
(項目32)前記キャリアが25部(w/w)のマトリクスに対して1部(w/w)の結
合剤を含む、項目31に記載のデバイス。
(項目33)前記キャリアが10部(w/w)のマトリクスに対して1部(w/w)の結
合剤を含む、項目31に記載のデバイス。
(項目34)前記キャリアが5部(w/w)のマトリクスに対して1部(w/w)の結合
剤を含む、項目31に記載のデバイス。
(項目35)前記キャリアが5部(w/w)未満のマトリクスを含む、項目31に記載の
デバイス。
(項目36)骨形成タンパク質およびキャリアを含む局所性の骨形成または軟骨形成を誘
導するためのデバイスであって、該キャリアが1部(w/w)のマトリクスに対して10部(w/w)の結合剤を含む、デバイス。
(項目37)前記キャリアが10部(w/w)未満の結合剤を含む、項目36に記載のデ
バイス。
(項目38)生理食塩水をさらに含む、項目19、22、24、31、または36に記載
のデバイス。
(項目39)骨欠損、軟骨欠損または骨軟骨欠損の修復のために局所性の骨形成または軟
骨形成を誘導するための方法であって、以下の工程:
項目1、19、22、24、31、または36に記載のデバイスを欠損部位に提供する工程、
を包含する、方法。
(項目40)前記骨形成が軟骨内骨形成である、項目39に記載の方法。
(項目41)前記軟骨形成が関節軟骨形成である、項目39に記載の方法。
(項目42)前記欠損部位が、以下:重症サイズ欠損、非重症サイズ欠損、分節非癒合欠
損、非癒合性骨折、骨折、骨軟骨欠損、および肋軟骨下欠損からなる群より選択される、項目39に記載の方法。
(項目43)前記欠損部位に提供される骨形成デバイスの容積が該欠損部位を満たすのに
充分である、項目39に記載の方法。
(項目44)局所性の骨形成または軟骨形成を誘導するためのデバイスであって、以下:
骨形成タンパク質OP−1;
コラーゲンマトリクス;および
カルボキシメチルセルロース、
を含むデバイス。
(項目45)局所性の骨形成または軟骨形成を誘導するためのデバイスであって、以下:
骨形成タンパク質OP−1;
コラーゲンマトリクス;および
フィブリンのり、
を含むデバイス。
(項目46)項目1に記載のデバイスを用いる局所性の骨形成または軟骨形成を誘導する
ためのキットであって、以下:
(a)骨形成タンパク質およびマトリクス物質を収容するように適合されている第一の容器;および
(b)結合剤を収容するように適合されている第二の容器、
を含み、ここで、該骨形成タンパク質およびマトリクス物質が部分(a)の該第一の容器に提供され、そして該結合剤が部分(b)の該第二の容器に提供される、キット。
(項目47)湿潤剤を収容するように適合されている第三の容器をさらに含む、項目46に記載のキット。
(項目48)前記第一の容器および前記第二の容器が同一である、項目46に記載のキット。
請求された発明の主題をより明白および正確に記載するために、以下の定義を、以下の記載された説明および添付の請求の範囲において使用される特定の用語の意味に関する指針を提供することが意図される。
A.骨形態形成タンパク質の生化学的、構造的、機能的特性
骨形成タンパク質または骨形態形成タンパク質であると本明細書中で同定および/または認識した天然に生じるタンパク質は、TGF−βスーパーファミリーまたはスーパー遺伝子ファミリーとして知られる配列関連タンパク質の緩い進化的グループ分け内の、別個のサブグループを形成する。天然に生じる骨モルフォゲンは、それらのC末端領域(ドメイン)において実質的なアミノ酸配列相同性を共有する。代表的に、上述の天然に生じる骨形成タンパク質は、N末端シグナルペプチド配列(代表的に、約30残基未満)、続いて成熟C末端ドメインを生じるために切断される「プロ」ドメインを有する前駆体として翻訳される。シグナルペプチドは、Von Heijne(1986)Nucleic Acids Research 14:4683−4691の方法を用いて所定の配列において予測され得る切断部位で、翻訳の際に迅速に切断される。プロドメインは、代表的に、完全にプロセシングされた成熟C末端ドメインより約3倍大きい。
DPP: Padgettら (1987) Nature 325: 81−84:
Vg−1: Weeks (1987) Cel1 51: 861−867; BMP−9: W095/33830 (PCT/US95/07084); BMP10:
W094/26893 (PCT/US94/05290); BMP−11: W094/26892 (PCT/US94/05288); BMP12: W095/16035 (PCT/US94/14030); BMP−13: W095/16035 (PCT/US94/14030); GDF−1: W092/00382 (PCT/US91/04096) およびLeeら (1991) PNAS 88: 4250−4254; GDF−8: W094/21681 (PCT/US94/03019); GDF−9: W094/15966 (PCT/US94/00685); GDF−10: W095/10539 (PCT/US94/11440); GDF−11: W096/01845 (PCT/US95/08543); BMP−15: W096/36710 (PCT/US96/06540); MP121: W096/01316 (PCT/EP95/02552); GDF−5 (CDMP−1、MP52): W094/15949 (PCT/US94/00657) およびW096/14335 (PCT/US94/12814)およびW093/16099 (PCT/EP93/00350); GDF−6 (CDMP−2、BMP13): W095/01801 (PCT/US94/07762)およびW096/14335およびW095/10635 (PCT/US94/14030); GDF−7 (CDMP−3、BMP12):W095/10802 (PCT/US94/07799)およびW095/10635 (PCT/US94/14030)。別の実施態様では、有用なタンパク質は、生物学的に活性な生合成構築物を包含する。これは、新規な生合成モルフォゲンタンパク質、および2つ以上の公知のモルフォゲン由来の配列を用いて設計されたキメラタンパク質を包含する。米国特許第5,011,691号に開示される生合成構築物(この開示内容は本明細書中に参考として援用される(例えば、COP−1、COP−3、COP−4、COP−5、COP−7、およびCOP−16))もまた参照のこと。
Inc.)により便宜的に実施される、Needlemanら((1970) J. Mol. Biol. 48:443−453)の方法を用いてそれらと並置する。 上述のように、候補配列中の内部ギャップおよびアミノ酸挿入は、候補配列と参照配列との間の定義された関係(アミノ酸配列相同性または同一性のレベルで従来表される)を算定する目的のために無視される。「アミノ酸配列相同性」とは、本明細書中では、アミノ酸同一性および類似性の両方を包含すると理解される。相同配列は、同一および/または類似のアミノ酸残基を共有し、ここで、類似の残基は、並置した参照配列において相当するアミノ酸残基についての保存置換、またはその「許容される点変異」である。従って、参照配列と70%のアミノ酸相同性を共有する候補ポリペプチド配列は、並置した残基の任意の70%が参照配列において相当する残基に同一であるか、またはその保存的置換のいずれかであるものである。現在好ましい実施態様では、参照配列はOP−1である。従って、本明細書中で有用な骨形態形成タンパク質は、天然に生じても、生合成的に生成されても、好ましい参照配列の対立遺伝子改変体、系統発生的対照改変体および他の改変体(例えば、「ムテイン」または「変異体タンパク質」を含む)、ならびに一般的な形態形成ファミリータンパク質の新規のメンバー(上記で示され、そして同定されたものを含む)を含む。特定の特に好ましい形態形成ポリペプチドは、ヒトOP−1の好ましい参照配列と少なくとも60%のアミノ酸同一性、さらにより好ましくはそれと少なくとも65%のアミノ酸同一性を共有する。
残基21のXaa=(Ala、Ser、Gly、Met、Gln、His、Glu、Asp、Leu、Asn、LysまたはThr); 残基22のXaa=(AlaまたはPro); 残基23のXaa=(Tyr、Phe、Asn、AlaまたはArg); 残基24のXaa=(Tyr、His、Glu、PheまたはArg); 残基26のXaa=(Glu、Asp、Ala、Ser、Tyr、His、Lys、Arg、GlnまたはGly); 残基28のXaa=(Glu、Asp、Leu、Val、Lys、Gly、Thr、AlaまたはGln); 残基30のXaa=(Ala、Ser、Ile、Asn、Pro、Glu、Asp、Phe、GlnまたはLeu); 残基31のXaa=(Phe、Tyr、Leu、Asn、GlyまたはArg); 残基32のXaa=(Pro、Ser、AlaまたはVal); 残基33のXaa=(Leu、Met、Glu、PheまたはVal); 残基34のXaa=(Asn、Asp、Thr、Gly、Ala、Arg、LeuまたはPro); 残基35のXaa=(Ser、Ala、Glu、Asp、Thr、Leu、Lys、GlnまたはHis); 残基36のXaa=(Tyr、His、Cys、Ile、Arg、Asp、Asn、Lys、Ser、GluまたはGly); 残基37のXaa=(Met、Leu、Phe、Val、GlyまたはTyr); 残基38のXaa=(Asn、Glu、Thr、Pro、Lys、His、Gly、Met、ValまたはArg); 残基39のXaa=(Ala、Ser、Gly、ProまたはPhe); 残基40のXaa=(Thr、Ser、Leu、Pro、HisまたはMet); 残基41のXaa=(Asn、Lys、Val、ThrまたはGln); 残基42のXaa=(His、TyrまたはLys); 残基43のXaa=(Ala、Thr、LeuまたはTyr); 残基44のXaa=(Ile、Thr、Val、Phe、Tyr、MetまたはPro); 残基45のXaa=(Val、Leu、Met、IleまたはHis); 残基46のXaa=(Gln、ArgまたはThr); 残基47のXaa=(Thr、Ser、Ala、AsnまたはHis); 残基48のXaa=(Leu、AsnまたはIle); 残基49のXaa=(Val、Met、Leu、ProまたはIle); 残基50のXaa=(His、Asn、Arg、Lys、TyrまたはGln); 残基51のXaa=(Phe、Leu、Ser、Asn、Met、Ala、Arg、Glu、GlyまたはGln); 残基52のXaa=(Ile、Mel、Leu、Val、Lys、Gln、AlaまたはTyr); 残基53のXaa=(Asn、Phe、Lys、Glu、Asp、Ala、Gln、Gly、LeuまたはVal); 残基54のXaa=(Pro、Asn、Ser、ValまたはAsp); 残基55のXaa=(Glu、Asp、Asn、Lys、Arg、Ser、Gly、Thr、Gln、ProまたはHis); 残基56のXaa=(Thr、His、Tyr、Ala、Ile、Lys、Asp、Ser、GlyまたはArg); 残基57のXaa=(Val、Ile、Thr、Ala、LeuまたはSer); 残基58のXaa=(Pro、Gly、Ser、AspまたはAla); 残基59のXaa=(Lys、Leu、Pro、Ala、Ser、Glu、ArgまたはGly); 残基60のXaa=(Pro、Ala、Val、ThrまたはSer); 残基61のXaa=(Cys、ValまたはSer); 残基63のXaa=(Ala、ValまたはThr); 残基65のXaa=(Thr、Ala、Glu、Val、Gly、AspまたはTyr);
残基66のXaa=(Gln、Lys、Glu、ArgまたはVal); 残基67のXaa=(Leu、Met、ThrまたはTyr); 残基68のXaa=(Asn、Ser、Gly、Thr、Asp、Glu、LysまたはVal); 残基69のXaa=(Ala、Pro、GlyまたはSer); 残基70のXaa=(Ile、Thr、LeuまたはVal); 残基71のXaa=(Ser、Pro、Ala、Thr、AsnまたはGly); 残基72のXaa=(Val、Ile、LeuまたはMet); 残基74のXaa=(Tyr、Phe、Arg、Thr、TyrまたはMet); 残基75のXaa=(Phe、Tyr、His、Leu、Ile、Lys、GlnまたはVal); 残基76のXaa=(Asp、Leu、AsnまたはGlu); 残基77のXaa=(Asp、Ser、Arg、Asn、Glu、Ala、Lys、GlyまたはPro); 残基78のXaa=(Ser、Asn、Asp、Tyr、Ala、Gly、Gln、Met、Glu、AsnまたはLys); 残基79のXaa=(Ser、Asn、Glu、Asp、Val、Lys、Gly、GlnまたはArg); 残基80のXaa=(Asn、Lys、Thr、Pro、Val、Ile、Arg、SerまたはGln);
残基81のXaa=(Val、Ile、ThrまたはAla); 残基82のXaa=(Ile、Asn、Val、Leu、Tyr、AspまたはAla); 残基83のXaa=(Leu、Tyr、LysまたはIle); 残基84のXaa=(Lys、Arg、Asn、Tyr、Phe、Thr、GluまたはGly); 残基85のXaa=(Lys、Arg、His、Gln、Asn、GluまたはVal); 残基86のXaa=(Tyr、His、GluまたはIle); 残基87のXaa=(Arg、Glu、Gln、ProまたはLys); 残基88のXaa=(Asn、Asp、Ala、Glu、GlyまたはLys); 残基89のXaa=(MetまたはAla); 残基90のXaa=(Val、Ile、Ala、Thr、SerまたはLys); 残基91のXaa=(ValまたはAla); 残基92のXaa=(Arg、Lys、Gln、Asp、Glu、Val、Ala、SerまたはThr); 残基93のXaa=(Ala、Ser、Glu、Gly、ArgまたはThr); 残基95のXaa=(Gly、AlaまたはThr); 残基97のXaa=(His、Arg、Gly、LeuまたはSer)。さらに、rBMP3bおよびmGDF−10においては残基53の後にIleが存在し; GDF−1においては残基54の後にTが存在し; BMP3においては残基54の後にVが存在し; BMP−8およびDorsalinにおいては残基78の後にGが存在し; hGDF−1においては残基37の後にPro、Gly、Gly、Proが存在する。
残基41のXaa=(TyrまたはCys); 残基50のXaa=(ValまたはLeu); 残基52のXaa=(SerまたはThr); 残基56のXaa=(PheまたはLeu); 残基57のXaa=(IleまたはMet); 残基58のXaa=(AsnまたはLys); 残基60のXaa=(Glu、AspまたはAsn); 残基61のXaa=(Thr、AlaまたはVal);残基65のXaa=(ProまたはAla); 残基71のXaa=(GlnまたはLys); 残基73のXaaの(AsnまたはSer); 残基75のXaa=(IleまたはThr); 残基80のXaa=(PheまたはTyr); 残基82のXaa=(AspまたはSer); 残基84のXaa=(SerまたはAsn); 残基89のXaa=(LysまたはArg); 残基91のXaa=(TyrまたはHis);および残基97のXaa=(ArgまたはLys)。
1984);およびB.Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)を参照のこと。
すでに説明したように、本明細書で使用される「結合剤」とは、本明細書中で規定される骨形成タンパク質およびマトリクスと混合される場合、骨形成および/または軟骨形成を促進する任意の生理学的に適合性の物質を意味する。特定の現在好ましい実施態様において、結合剤は、標準骨形成デバイスよりも劣性の骨形成タンパク質を使用してこのような修復を促進する。好ましい結合剤の他の特徴の中には、いくつかの例をあげると、デバイスを次のようにさせる能力がある:柔軟性、成形可能、および/または可鍛性;注射可能;骨、軟骨、筋肉および他の組織に対して接着性;洗浄および/または手術間の灌注の際の崩壊に対して耐性;および手術(縫合および術後の間の除去(dislodging)に対する耐性。さらに、現在の好ましい実施態様において、結合剤は、比較的低い割合で存在する場合、前述の特徴および利益を達成し得る。例えば、現在好ましい改良されたデバイスは、約1量部の結合剤および5量部のマトリクスを含む。別の現在好ましいデバイスは、1量部結合剤および3量部マトリクスを含む。本明細書中で例証されるように、広く分散する割合の改良されたデバイスは、骨形成および軟骨形成を誘導し得る。約1:1〜4:1から10:1に達し、少なくとも10:1を含む、ならびに約1:2〜1:5から1:10に達し、少なくとも1:10を含み、さらに1:25〜1:50に及ぶ、結合剤の量部対マトリクスの量を有する改良されたデバイスが本明細書において例示される。結合剤対マトリクスの任意の割合が、本発明を実行するために使用され得る。必要とされるのは、骨形成および軟骨形成を達成するために、マトリクスおよび骨形成タンパク質と結合剤とを混合することのみである。以下で議論するように、特定の結合剤は、マトリクスに対して同じ割合またはそれを越える割合で使用され得るが、しかしこのような薬剤は、任意のマトリクス希釈効果を測定するために本明細書中で教示されるように試験されるべきである。
本明細書中で教示されるように、カルボキシメチルメチルセルロース(CMC)は、現在好ましい結合剤である。CMCは,Hercules Inc.、Aqualon(登録商標)Division、Delaware; FMC Corporation, Pennsylvania; British Celanese,Ltd.,United Kingdom;およびHenkel KGaA,United Kingdomのような供給業者から市販されるがこれらに限定されない。カロボキシメチルセルロースナトリウムは、90,000〜700,000の範囲に及ぶ代表的な分子量の範囲を有するセルロースのカルボキシメチルエーテルのナトリウム塩である。CMCは、部分的に以下に基づいて候補結合剤として同定された:CMCは粘性増強剤として経口および局所的薬学的組成で広く使用される。CMCはまた、乳化剤(0.25〜1.0%)、ゲル化剤(4.0〜6.0%)、注射用剤(0.05〜0.75%)、および錠剤結合剤(1.0〜6.0%)として、化粧品、洗面用化粧品および食料品において使用される。
毒性試験は、CMC含有の改良されたデバイスを、標準デバイスの毒性と比較することで行った。標準デバイスを、2.5mg OP−1/gのコラーゲンマトリクスを用いて作製した。CMC含有の改良されたデバイスを、1:5の比率で標準デバイスに低い粘性のCMC(Aqualon(登録商標))を添加し、続いて照射することによって作製した。標準デバイスまたは偽デバイス(すなわち骨形成タンパク質なし)の25mgアリコートおよびCMC含有の改良デバイスまたは偽CMCデバイスの30mgアリコートを、本明細書中の他の部分に記載されるようにラット皮下部位に移植した(動物一匹あたり1つの移植片)。各処方からの3つの移植片を移植後7日、14日、21日および28日で除去し、そして骨形成および軟骨形成について、そして局部的組織反応について組織学的に評価した。有害な細胞反応は観測されず、そして炎症および線維芽形成を評価することによって決定されるように、CMCの任意の有害な効果を示す証拠はなかった。CMC含有の改良デバイスの組織学的プロフィールは、一般に標準OP−デバイスと類似した。標準的な教示を使用して測定される血清カルシウムおよびアルカリホスファターゼレベルはまた、標準骨形成デバイスのレベルに伴った。最終的に、未成熟ラットおよび成熟ラットについての標準的な毒性分析を使用したが、有意な病変は検出されなかった。
以下に記載する一連の日常的な試験に基づいて、標準骨形成デバイスの生物活性は、CMCとの混合によって悪影響を受けなかった。むしろ生物活性は、少なくとも両方のデバイス配置と比較し得るが、手術中にデバイスを操作する能力ならびに手術および創傷縫合間に欠損部位でデバイスを保持する能力は、CMCによって増強される。これらの試験のために、照射されたCMCを、移植前に標準デバイスに添加した。
CMC含有の標準デバイスに対する標準的OPデバイスの安定性を比較する試験(表2を参照のこと)を実施した。インビトロ分析および骨形成バイオアッセイ(本明細書中の他の場所に記載される)の両方に基づいて、CMC含有の改良されたデバイスは、少なくとも1年間30℃で保存した場合、標準デバイスと同じ位に安定であることが観測された。データはまた、CMCが標準OPデバイスと予め混合され得、そして単一の生成物配置のために最後に(terminally)滅菌され得ることを示唆する。このような単一生成物は、以下に例示されるような局部的な骨および軟骨欠損の修復のために有用である。
当該分野で認識されるUSP法を、CMCのようなバルク結合剤の同定および特徴付けのために用いた。試験は、化学的同一性、粘度、pH、乾燥時の損失、および重金属についての試験を含んでいた。材料をまた、滅菌前の生体負荷について、ならびに内毒素、pH、外観、および照射後の滅菌性についても試験した。照射された材料の粘度、外観、およびpHをモニターするために安定性試験を行った。全てのレベルおよび特徴は、標準的な方法および技術を用いて決定した場合に受容可能であった。
照射前および照射(γ照射、2.5〜3.0メガラド)後のCMCの粘度を比較する研究を行った。データは、当該分野で報告されたように、照射後に粘度が減少することを示した。これは、生物学的活性にも結合剤としてのその全体的な有用性にも影響を与えない(本明細書中に示す研究を参照のこと)が、当業者は、改良された骨形成デバイスの粘度または流動率特性を評価する場合にこの特徴を考慮すべきである。研究をまた、照射CMCの安定性を評価するために行った。結果は、照射されたCMCが4℃および30℃の両方で少なくとも6ヶ月間安定であることを示した。粘度を、安定性のパラメーターとして測定した。同様の分析および評価を、所望の処方物において使用される他の結合剤またはデバイス材料について行い得る。
本明細書中で教示される「フィブリンのり」は、別の現在好ましい結合剤である。フィブリンのりは、哺乳動物フィブリノーゲンおよびトロンビンの混合物を含む。ヒトフィブリノーゲンは、Tissucol(登録商標)(ImmunoAG, Vienna, Austria)、Beriplast(登録商標)(Behringwerke、Marburg、Germany)、Biocoll(登録商標)(Centre de Transfusion Sanguine de Lille(Pours, France))およびTransglutine(登録商標)(CNTS Fractionation Centre, Strasbourg, France)のような製品(しかし、これらに限定されない)において市販される。ヒトトロンビンは、ImmunoAG, Vienna, Austriaから市販される。フィブリンのりはまた、他の哺乳動物供給源(例えば、ウシおよびマウスの供給源など)からのフィブリノーゲンおよびトロンビンから作製され得る。
フィブリンのりを含有する改良されたデバイスを標準デバイスと比較する毒性研究を行った。標準デバイスを、47.5%エタノール/0.01% TFA中の10μgのOP−1および25mgコラーゲンを混合し、そしてこの混合物を一晩凍結乾燥することにより調製した。標準デバイスを、移植前に100μLリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で湿らせた。フィブリンのりを含有する改良されたデバイスを、50μLウシフィブリノーゲン(Sigma F8630, 10mg/ml)および50μLウシトロンビン(50 U/mL)を、上記の通りに調製した標準デバイスに、移植直前に添加することにより調製した。次いで、標準デバイスおよびフィブリンのりを含有する改良されたデバイスを、ラットの皮下部位に本明細書中の他の場所に記載の通りに移植した。移植片を、骨および軟骨形成について、ならびに局所組織反応について組織学的に評価した。フィブリンのりを含有する改良されたデバイスは、低炎症応答および低い線維性形成を誘発した。フィブリンのりを含有する改良されたデバイスの組織学的プロフィールは、標準デバイスの組織学的プロフィールにほぼ類似していた。炎症応答と、フィブリンのりを含有する改良されたデバイスが骨形成を促進する能力との間の相関は全く現れなかった。
研究を、インビトロでの異なるトロンビン濃度での、フィブリンのりを含有する改良されたデバイスからのOP−1の放出反応速度を評価するために行った。放出反応速度は、より多量のトロンビンの添加により改良された。この研究では、5%ラクトース溶液中の12.5μLのOP−1を、50mgのβ−TCP、25μLのヒトフィブリノーゲン、および25 U/mLのヒトトロンビンまたは50 U/mLのヒトトロンビンのいずれかと混合した。混合物をガラスのバイアルに移し、そして1mLの仔ウシ血清を各々に添加した。次いで、サンプルを37℃/60rpmにてインキュベートさせた。0〜1時間、1〜3時間、3〜5時間、および5〜24時間にて血清サンプルを採取し、そして日常的なELISAにより分析した。結果を以下の表にまとめる。
一般的な考察
本発明のデバイスは、日常的な方法を用いて処方され得る。必要とされる全てのことは、デバイスの送達される容積は、欠損部位での容積未満であり得る(しかし、必ずしもそうである必要はない)を心に留めた上での、1デバイスあたりの骨形成タンパク質の所望の最終濃度の決定である。タンパク質の所望の最終濃度は、タンパク質の比活性、ならびに欠損の型、容積、および/または解剖学的位置に依存する。さらに、タンパク質の所望の最終濃度は、レシピエントの年齢、性別、および/または総合的な健康に依存し得る。代表的には、少なくとも約2.5cm長の重症サイズ分節欠損について、ギャップを修復するのに充分な骨形成を誘導するために標準デバイスを用いて0.5mg〜1.75mgの骨形成タンパク質が観察されている。非重症サイズ欠損または新たな骨折の場合、欠損を修復するために標準骨形成デバイスを用いて約0.1〜0.5mgのタンパク質が観察されている。一般に、本明細書中に記載される好ましいマトリクスで使用するためのタンパク質濃度は、1デバイスあたり約0.4mg〜約3.0mgの範囲であり得る。投与量の最適化は単に日常的な実験を必要とし、そして当業者の技術レベル内である。
以下の型の研究に基いて、約1.0gの標準骨形成デバイスに対する約0.2gのCMCが、現在好ましい取扱い特性を有する改良されたデバイスを生じることを確立した。種々の比のCMCおよびコラーゲンを合わせ、次いで生理食塩水を用いて湿らせた。CMCおよびマトリクスの、得られた各混合物を、15mlのコニカル遠心管中の水に懸濁し、そして旋回式シェーカー(100rpm)中に置いた。沈澱時間を、緩んだかまたは放出されたコラーゲンマトリクスの粒子がチューブ上の所定のマークまで沈澱する時に記録した。表3および図1にまとめたデータは、約0.15〜0.25g CMC/gコラーゲンの範囲が粘着性、統合性、および取扱い特性を最大にし得ることを示唆する。
以下の型の研究に基いて、約1gのβ−TCPに添加された約500μLのフィブリノーゲン(pH7.4にてPBS中80mg/mL)および500μLのトロンビン(0.9% NaCl中50 U/mLまたは25 U/mL)が、現在好ましい取扱い特性を有する改良されたデバイスを生じることが確立された。取扱い特性に関する論点は、フィブリンのりの凝固時間、およびフィブリンのりを含有する改良されたデバイスのコンシステンシーを含む。成形可能なパテのコンシステンシーを有するデバイスが好ましい。のりが一旦凝固すると、パテの形を変更することは、より困難になる。従って、より長い凝固時間はまた、デバイスの好ましい特徴である。
2.Tissucol(登録商標)は、Immuno AG(Vienna, Austria)からである。
3.Beriplast(登録商標)は、Behringwerke(Marburg,
Germany)からである。
4.Transglutine(登録商標)は、CNTS Franctionation Centre(Strasbourg, France)からである。
本発明の特定の実施態様では、好ましいマトリクス材料はβ−TCPである。本発明においてマトリクスとして使用するための非合成、非ポリマー性材料の好ましい特徴は、以下を含むがこれらに限定されない:周囲の組織による高いマトリクス吸収速度および低い炎症応答。上記で考察したように、約212μm〜約425μmの範囲の粒子サイズを有する焼結高燃焼β−TCPは、現在最も好ましいが、他の粒子サイズは本発明の実施に用いられ得る。
β−TCPマトリクスの吸収速度は、標準的な画像分析法を用いて決定した。画像分析は、Ca/P顆粒の粒子サイズ分布を評価する方法である。Ca/P顆粒の粒子サイズは、ラットにおける移植の前および後で比較される。外植片の軟組織は、次亜塩素酸ナトリウムにより溶解され、そして残りのCa/P顆粒は水で数回洗浄され、そして室温にて乾燥される。粒子は、グリセロールと混合され、そしてスライドガラス上に載せられる。粒子サイズは、標準的な画像分析システム(例えば、ビデオカメラにより顕微鏡へ接続されたBioquant OS/2)を用いて顕微鏡検査により決定される。領域および最大直径を示すアレイが、個々の粒子の寸法を表すために選択される。256レベルセットにおける0〜88のグレイスケールを示す粒子の画像を選択し、そして測定する。個々の粒子からの生のデータは、平均および標準偏差を算出するために用いられる。少なくとも50個の粒子が各データセットにおいて測定される。
以下に示す研究では、β−TCP(Clarkson、番号211096、BD=0.86、212〜425μm、9/6/97)は、10μgのOP−1ありまたはなしでCMC/血液ペーストにおいて処方され、そしてラット皮下部位に移植される。移植片を、インビボでの6週間後および12週間後に取り出し、上記の画像分析法を用いて分析する。6週間目の結果を以下の表4Dにまとめる。結果は、6週間後にβ−TCPのサイズが334μmから184μm(OP−1なし)および166μm(OP−1あり)に減少することを示す。OP−1処置サンプルと非処置サンプルとの間のサイズの相違は、有意ではない。しかし、6週間後にβ−TCPの直径において約50%の減少が存在する。
一般に、小さな粒子は、大きな粒子よりも早く吸収されると仮定され得る。結果は、OP−1なしで、β−TCP(212〜425μm)が、わずかに上昇した炎症応答を誘発したことを示した。しかし、炎症反応は、OP−1の用量が10μgから20μgへ増加するにつれて減少した。以前の動物試験は、10μm未満の小さな粒子が、高炎症応答を誘発することを示した。それゆえ、212〜425μmのサイズの焼結β−TCP(100%)粒子の使用は、吸収速度、低炎症、およびラット皮下モデルにおける骨形成を支持する能力の間の平衡である。
A. 骨形成活性のバイオアッセイ:軟骨内骨形成および関連性質
次に述べることは、出願者の発明の範囲内の真正の骨形成または骨形態形成タンパク質を同定および特徴づけるための例示的なプロトコルならびに骨形成デバイスを示す。
1. 免疫組織化学および組織学
手短に言えば、真正の関節軟骨の同定が、超微細構造的パラメータおよび/または生物化学的パラメータを使用して達成され得ることは、当該分野に公知である。例えば、関節軟骨は、同一視できる領域を所有する軟骨組織の連続層を形成する。表層領域を、硫酸化プロテオグリカンの相対的欠損を示すために、トルイジンブルーで染色していないかまたは不十分に染色している平板化形態および細胞外ネットワークを有する軟骨細胞によって特徴づける。トルイジンブルーを、一般的に、骨および軟骨を染色するために使用する。これは、青〜紫に色が変化する色素の凝集および重合を導く組織において、高密度にぼんやりしたネガティブ電荷の存在に基づく異なる色を生成する異染色性の染色である。骨は、酸性ムコ多糖を有する軟骨が濃い紫に染色されるのに対して青色に染色される。中央のおよび深い領域の軟骨細胞は、トルイジンブルーで染色することによって証明されたように、球状の外見を有し、そしてマトリクスは、大量の硫酸化プロテオグリカンを含む。コラーゲン線維は、マトリクスの至るところに、拡散的に存在する。軟骨細胞は、大量の粗面小胞体を有し、そして細胞外ネットワークによって包囲される。細胞周囲のネットワークは、無数の薄い、非縞状のコラーゲン線維を含む。領域間のネットワークにおけるコラーゲンは、関節軟骨に類似する電子半透明非結晶物質において緻密ではなく、そして包埋されていない。ネットワークのテリトリー間領域におけるコラーゲン線維は、軟骨組織のテリトリー間領域においてコラーゲン線維の特徴的に周期性のバンド形成を示す。
偏光光学顕微鏡を、修復組織の限度と欠損に隣接する残留関節軟骨との間の接合部における原線維嵌合を評価するために使用し得る。このような顕微鏡法を、欠損からのサフラニン−O染色切片を使用して実施し得る。特定の場合において、偏光光学顕微鏡は、修復プロセスのより正確な見地を当業者に提供する。例えば、光学顕微鏡を使用して、欠損の末梢の修復組織は、残留軟骨と十分に並んで表われ得る。しかし、偏光光学顕微鏡を使用すると、修復組織のコラーゲン線維が、残留軟骨のものとあまり統合しないことが観察され得る。修復軟骨と残存軟骨との間の線維連続性の不足は、最適以下の修復の指標である。従って、修復軟骨と残存軟骨との間の干渉を定性的に評価する場合、原線維の連続性を、好ましくは本明細書以下に例示されるような偏光光学顕微鏡を使用して評価する(Shapiroら、Journal of Bone and Joint Surgery
75:532−553(1993)(この開示を本明細書に参考として援用する)もまた参照のこと)。
A.カルボキシメチルセルロースを含む改良された骨形成デバイスを使用する重症サイズ分節欠損状の修復
1.実験1:単一デバイス一致(イヌ)
この研究は、当該分野で認識されるイヌモデルでの重症サイズの尺骨分節の欠損を修復するためのコラーゲンマトリクスとカルボキシメチルセルロースと合わせたOP−1の効力を示す。
すでに記載しているように、組換えヒト骨形成タンパク質−1(rhOP−1)から成る標準デバイスは、コラーゲンマトリクスの1グラムあたり2.5mgのrhOP−1割合でウシ骨I型コラーゲンマトリクスと混合した。rhOP−1からなる改良デバイスと、ウシ骨I型コラーゲンマトリクスおよびカルボキシメチルセルロース(CMC)と混合した。単一デバイスを、滅菌したバイアルに補充した。
成体雄性雑種イヌを、周知の骨修復および再造形の特徴を理由として、利用した。全ての動物は、少なくとも2年齢であり、そして40〜50ポンドの重量であった。全ての動物は、Martin Creek Kennels,USDA number 71−B−108,Willowford,AKによって供給された。単一のサイズを選択および重量の動物を選択するのに特別な注意を払って、骨の幾何学および負荷における変動を制限する。動物を、手術後にX線でスクリーニングして、適切なサイズ、骨格成熟度、および明らかな骨の異常性が存在しないことを確認する。
標準無菌的技術を使用して、手術を、ハロタンガス麻酔下で実施した。長さ約4.0cmの外側切開を行い、そして尺骨の露出を、切開および鋭い切開を使用して得た。1つの2.5cm分節の骨膜欠損を、のこぎりを使用して中央−尺骨において作製した。この欠損は、中央軸直径約2〜2.5倍であり、そして重症サイズ欠損を表す。すなわち、欠損は、自然に治癒しない。術間測定を、取り除いた骨の分節から行った。橈骨を、機械的安定性について維持したが、内側固定または外側固定は全く使用しなかった。この部位を、骨の細片を取り除くために生理食塩水で水をひき、そして骨髄細胞に溢流した。そのサイズを乾燥し、そして恒常性を達成した後、移植片を、注意深く欠損中に置いた。軟組織は、移植片を含むために層中に慎重に閉じられた。次いで、手順を、対側において繰り返した。
前肢のX線像を、術後8週間まで隔週で、次いで術後12週間で屠殺して再び入手した。標準化した照射被爆時間および強度を使用し、そしてサンドバックを、一貫した様式で末端位置に使用した。X線像を、欠損治癒の質およびスピードを評価するために、早期のX線像を評価し、そして比較する。X線像の等級付けは、以下のスケールに従った。
研究期間の終わりに、動物を、静脈内にバルビツール酸塩の過剰投与を用いて屠殺した。尺骨および橈骨を、すぐにまとめて集め、そして菱形に浸漬した生理食塩水に置いた。両方の尺骨を、拡大写真にし、そして標識とX線像を接触させた。軟組織を、欠損部位からはなれて注意深く解剖した。水冷のこぎりを、サンプルサンプルの中央においた欠損部位を有する9cmの単一の長さに尺骨を切るために使用し得る。
手動操作による治癒が十分であると思われる場合、切片作成後、直ちに、ストロークコントロールを50mm/分の一定置換速度で作動させたMTS閉鎖式油圧試験装置(Minneapolis,MN)でルーチン的操作法を使用し、標本をねじりの破損について試験した。簡単には、骨切片の各末端を円筒状のアルミニウムスリーブに取り付け、メタクリル酸メチルで接着した。一方の末端をしっかりと固定し、他方を反対時計方向に回転させた。イヌの尺骨は、僅かに湾曲しているので、試験装置の標本と同軸の回転を保つように標本を取り付けた。サーボ油圧材料試験システムにより、6cmのレバーアームにねじり力をかけた。機械ストローク制御装置による測定と同時に、移植片置換を記録し、一方、負荷量を負荷セルから記録した。力―角度置換曲線を作成し、この曲線から、破損に対するねじりおよび角度変形量を得た後、破損に対するエネルギー吸収量を負荷量―置換曲線下の面積として計算した。
力学的試験の後または未試験標本の切片作成後、直ちに、個々の標本を10%緩衝化ホルマリン溶液に浸積して固定した。水冷ダイアモンド鋸上で標本を縦方向に二分して分けた。この操作により、非脱灰粉砕切片および非脱灰ミクロトーム切片など異なる組織調製物用に各標本から二つの部分を得た。
X線写真による評価
本研究において、標準的OPデバイスで処置した部分的欠損と比較して、CMC/OP−1デバイスを投与した部位のX線写真による骨治癒特性に有意差はなかった。一般に、新骨形成は、全欠損において、早くも術後2週間で認められた。新骨形成は、濃密化、圧密化および再造形をし続け、術後12週間目に動物を屠殺した。初期の骨髄腔形成を伴う新皮質の発生が6週間評価と8週間評価との間に生じた。 CMC/OP−1デバイス処置欠損のX線写真による最終的な等級は、5.33±0.58であった。標準的OP−1デバイスを投与した欠損の最終X線写真は、4.67±0.58であった。
術後2週間で、痕跡の放射線濃密物質が右欠損に存在したが、この欠損は、完全に架橋されなかったか、または新骨で満たされなかった。術後4週間までに、新骨の量および放射密度が有意に増加した。欠損は繋がっていたが、新骨は、十分含有されなかった。骨膜縁にそって新骨の圧密が幾分あった。この動物の左欠損と比較して同量の新骨が形成されていた。術後6週間目、新骨の放射線密度は増加し、欠損は、完全に繋がり、広範囲にわたる新骨で満たされた。宿主骨末端に初期再造形が認められ、新骨の組み込みが開始した。術後8週間目、新骨は再造形を続け、さらに多くの新骨容積が欠損縁を接合した。宿主骨末端に新骨が組み込まれ、新皮質の形成を暗示する縁にそった新骨の濃密化があった。残留単体物質は、X線写真により認められなかった。屠殺時、X線透過性領域が右側欠損の中央に存在したが、新骨縁の濃密化は、新皮質の形成を暗示した。X線写真による最終的な等級は、最高スコアの6点中、5点であった。
術後2週間で、痕跡の放射線濃密物質が欠損中に存在したが、この欠損は、新骨で架橋されなかったか、または満たされなかった。術後4週間までに、新骨の量および放射性密度は有意に増加し、欠損は繋がり、新骨で満たされていた。術後6週間目、新骨の放射性密度は増加し、欠損は完全に繋がり、広範囲の新骨で満たされていた。初期再造形が認められ、さらに多くの新骨容積が欠損縁を接合した。新骨は一様な密度で、宿主末端の組み込みが開始した。術後8週間目、新骨は再造形を続け、宿主骨末端が組み込まれ、欠損縁にそって新骨の濃密化が開始していた。屠殺時、欠損縁に沿った新骨の濃密化は、新皮質の初期再形成を暗示した。欠損中央内の新骨密度は、右側欠損に形成された新骨より大きかったが、外観は、この動物の左右の側面で有意差はなかった。X線写真による最終的な等級は、最高スコア6点中、5点であった。
全動物の左右の標本は共に、類似した肉眼的外観を有した。動物2例では、左右の欠損はしっかりと癒合され、ほぼ同じ容積の新骨を有した。第3の動物では、左右の側面で同容積の新骨を有したが、左側は、完全に癒合されなかった。
CMC/OP−1デバイスで処置した欠損平均破砕負荷量は、59.33N±26.77(n=3)であった。平均破砕負荷量は、標準的OP−1デバイスを投与した対側の平均破砕負荷量の79%であった。これは、先に試験した無傷対照強度の91%に相当した。平均角変形量は、38.22±0.69度であった。平均破砕吸収エネルギー量は、97.47±47.21Nm度であった。
全般的に、コラーゲンマトリクスを有する標準的rhOP−1デバイスで処置した欠損と一致する正常骨形成が観察された。最終容積並びに再造形の質および程度は、CMC/OP−1および標準的OP−1デバイスを比較して、同等であった。動物間比較で、最終新骨形成および再造形度において変動が認められた。CMC/OP−1デバイス処置欠損の平均組織学的等級は、最高総スコア16点中、12.67±1.04点であった。標準的OP−1デバイス処置欠損の平均組織学的等級は、最高総スコア16点中、11.41±0.95点であった。
さらに、この実験は、イヌ尺骨部分欠損モデルにおける重症サイズの大きな部分欠損を治癒するため、標準的および低用量の両OP−1製剤を使用し、カルボキシメチルセルロース(CMC)を混合した標準的骨形成デバイスの有効性を示す。
標準的OP−1デバイス(第11表ではOP−1を表す)は、2.5mg rhOP−1/gコラーゲンマトリクスの割合でウシ骨I型コラーゲンマトリクスと混合した組み換えヒト骨形成蛋白質−1(rhOP−1)からなる。一種のCMCデバイス(標準用量、第11表ではOP−1/CMC,OPCMCを表す)は、カルボキシメチルセルロースと組み合わせたOP−1デバイスからなる。低用量OP−1デバイスは、1.25mg rhOP−1/gコラーゲンマトリクスからなる(第10表ではLOPを表す)。標準および低用量の両用量の各OP−1デバイスは、CMCと別に包装したデバイス1gからなる。CMCは、バイアル当たり200mgを包装した。これは、上記に記載のCMCを他成分のコラーゲンマトリクスおよび骨形成タンパク質と同時包装したユニタリデバイスと対照的である。
成熟雑種犬計12匹を使用した。左右相称に2.5cmの重症サイズの尺骨部分的欠損を作製した。動物6例の右側欠損に標準的OP−1デバイスを受けた。この群の左側欠損には、標準用量OP−1/CMCデバイスを受けた。第二群の動物6例の右側欠損に低用量OP−1デバイスを受け、左側欠損には低用量OP−1/CMCデバイスを受けた。隔週でX線写真を撮影し、治癒経過を検討した。屠殺時、全動物をインブロックで回収し、ねじりの物理学試験を行った。尺骨切片を組織反応、残留移植片並びに新骨形成および治癒の質および量について組織検査により評価した。
上記に記載のように、解剖サイズ並びに骨修復および再造形特性が公知のため、成熟雄雑種犬を使用した。全動物は、骨格的に成長し、35〜50ポンドの体重であった。
上記に記載したものと類似した標準的手術法を使用して、長さ約4cmの側面切開を行い、鈍角および鋭角切開法を使って尺骨を暴露した。尺骨の中央に振動鋸を除いて2.5cmの部分的骨骨膜欠損を作製した。この欠損は、中骨幹の約2〜2.5倍で、重症サイズの欠損、すなわち、欠損が自然治癒すると思われる欠損に相当した。手術中の測定は、除去骨切片で行った。切片の長さ、切片の二つの外径および切片の中心径を、手術報告書にmmで記録した。物理学的に安定化させるため、とう骨を維持した。この部位を生理食塩水で洗浄し、骨屑および溢流した骨髄細胞を除去した。部位を乾燥し、生体恒常性が得られた後、移植片を欠損に据えた。軟組織を層で閉じ、移植片を包含させた。次に、この操作を反対側で繰り返した。
上記のように、術後8週間まで隔週で前脚のX線写真を得、次いで術後12週間目、屠殺時に再度撮影を行った。
手順は上記のものと同様であった。研究期間終了時に、動物を屠殺し、直ちに、尺骨および橈骨をまとめて採取し、そして生理食塩水に浸積したダイヤパー(diaper)内に置いた。欠損部位から軟組織を丁寧に切開して除いた。帯鋸を使用して尺骨を、試験標本の中央を中心とする欠損部位を有する9cmの均一長に切断した。
プロトコルは、上記のものと同様であった。簡単に説明すると、50mm/分の一定置換速度でストロークを制御して作動させたMTS閉鎖型油圧試験機(Minneapolis,MN)上で、標本をねじれ破損について試験した。ねじれ力を、サーボ油圧材料試験システムにより、6cmのレバーアームでかけた。負荷を負荷セルから記録しつつ、機械ストローク制御器により測定するようにして移植物置換の同時記録を行った。力―角度置換曲線を作成し、この曲線から破損ねじりおよび角変形量を得、破損エネルギー吸収量を負荷―置換曲線下の面積として計算した。
上記に記載のように、非脱灰切片を示す固定標本を70〜100%に勾配させたエチルアルコール溶液中で脱水した。次に、標本をメタクリル酸メチルモノマー中に入れ、そしてポリマー化させた。標本を高速水冷切り出し鋸で厚さ約700〜1,000μmの切片に切断して粉砕切片を得た。これらの切片をアクリルスライドに取り付け、そして厚さ100μmに粉砕した。日常のマイクロラジオグラフィー後、切片を約50μmにさらに粉砕し、そして以下の修復パラメーターを評価する組織学的等級付けのために塩基性フクシンおよびトルイジンブルーで染色した:癒合の質、皮質および海綿骨の外観および質、骨髄成分の存在、骨再造形および炎症応答。
術後12週目(屠殺)で、標準用量OP−1/CMC部位は、最大平均X線写真等級、5.17/6.0点に達した。標準的OP−1デバイスの最終的なX線写真等級は、5.00/6.0であった。低用量OP−1部位の平均最終X線写真等級は3.83/6.0であった。低用量OP−1/CMC部位の平均等級は、4.67/6.0であった。全時間の期間で、標準用量OP−1/CMC部位は、CMC無添加の標準的OP−1より大きな平均X線写真等級を有した。全時間の期間で、低用量OP−1/CMC部位は、CMC部位無添加の低用量OP−1より大きな平均X線写真等級を有した。
術後2週間目で、新骨形成が低用量OP−1で処置した欠損6例中1例で認められた。欠損周辺に微量の放射濃密物質が存在したが、新骨は、欠損を架橋または繋げなかった。術後2週間目での平均X線写真等級は、0.17/6.0点であった。術後4週間目、2週間目に新骨形成を示した同じ部位は、新骨容積の増加を示した。4例の欠損は、繋がり、そして1例の欠損は、4週間目に新骨で満たされた。二つの部位は、術後4週間目ではほとんど活性を示さなかった。4週間目の平均X線写真等級は、1.83/6.0であった。術後6週間までに、低用量OP−1処置部位2例は繋がり、新骨で満たされた。2例の部位は繋がったが、新骨で不完全に満たされていた。1匹の動物は、若干早く新骨の形成を示した。1匹の動物は、新骨形成を全く示さなかった。6週間目の平均X線写真等級は、2.83/6.0であった。6〜8週間で、さらなる新骨の形成は認められなかったが、新骨の濃密化が幾分認められ、そして若干早く再造形が生じた。8週間目の平均X線写真等級は、3.17/6.0であった。屠殺時の術後12週間目で、欠損はすべて、いくつかの良好に含有した新骨を示したが、その密度は、宿主骨周辺より有意に低かった。時に、宿主骨新骨接合部にX線透過性が存在した。12週間目の平均X線写真等級は、3.83/6.0であった。
術後2週間目に、早期の新骨形成が低用量OP−1/CMCで処置した欠損6例中3例で認められた。新骨は、繋がらなかったか、または欠損を満たさなかったが、手術部位内にかなり含有された。2週間目の平均X線写真等級は0.83/6.0であった。術後4週間目、新骨形成は、欠損6例中5例に存在し、欠損を繋げ、欠損をほとんど満たしていた。4週間目、平均X線写真等級は2.33/6.0であった。6週間目で、欠損に存在する新骨密度は増加した。欠損6例中3例に宿主骨の早期の取り込みが認められた。1匹の動物は、6週間目に両側の新骨形成を何ら示さなかった。この時点の平均X線写真等級は3.00/6.0であった。6〜8週間で、さらなる新骨形成は生じなかった。早期再造形および宿主骨の取り込みが明白であった。1匹の動物は、X線写真の外観に全く変化はなかった。8週間目での平均X線写真等級は3.33/6.0であった。予想外に、低用量OP−1/CMC部位は、CMC無添加の低用量OP−1部位より、より広範囲な新骨形成および再造形を示した。欠損が新骨で完全に満たされた部位において、新骨の密度は、周囲の宿主骨より低かった。12週間目(屠殺時)の平均X線写真等級は、4.67/6.0であった。
本研究における結果は、標準OP−1デバイスのこれまでの実験すべてと一致した。術後2週間目で、OP−1デバイスで処置した欠損6例中4例は、早期の新骨形成を示した。欠損2例で、広範囲に新骨が欠損を繋げたが、新骨は、欠損を満たさなかった。総合的に、新骨は十分含有されなかった。2週間目の平均X線写真等級は1.50/6.0であった。術後4週間目で、欠損6例すべてで新骨の量および密度の増加が生じた。新骨は、全欠損を繋げた。6部位中4部位で、欠損が新骨で完全に満たされていたようであった。4週間目の平均X線写真等級は3.00/6.0であった。術後6週間目で、新骨密度が増加した。残りの欠損には、新骨は十分含まれなかった。全般的に、宿主骨末端の早期取り込みが6部位中3部位で観察された。6週間目の平均X線写真等級は、3.67/6.0であった。6〜8週間目で、宿主骨のほとんど完全な取り込みが、6部位中3部位で明らかとなったが、全欠損において尺骨輪郭方向に再造形が生じていた。8週間目の平均X線写真等級は4.50/6.0であった。術後12週間(屠殺)までに、広範囲な再造形が生じていたが、新骨容積は、まだ尺骨輪郭を接合しなかった。新骨はしばしば、周囲軟組織に広がるが、標準OP−1デバイスで処置した欠損の全例で皮質のいくらかの再形成が認められた。12週間目の平均X線写真等級は5.00/6.0であった。
術後2週間目で、OP−1/CMCデバイスで処置した欠損6例中4例で、早期の新骨形成が認められた。欠損4例中1例でのみ新骨が十分含有されていた。欠損6例中2例で、新骨が欠損を繋げ、そして満たしたようであった。2週間目の平均X線写真等級は1.67/6.0であった。術後4週間目で、欠損6例すべてにおいて、広範囲に新骨が生じていた。新骨は、十分に含有されていなかったが、宿主の早期の取り込みが2部位で観察された。4週間目の平均X線写真等級は1.67/6.0であった。4〜6週間で、宿主の広範囲な再造形および取り込みが欠損の全例で生じた。新骨は、十分に含まれていなかったが、軟組織における新骨は再吸収を開始していた。6週間目での平均X線写真等級は、4.33/6.0であった。8週間目までに、宿主骨の完全な取り込みが2部位で認められ、そして少なくとも1部位で早期の新皮質形成が明らかであった。8週間目での平均X線写真等級は4.67/6.0であった。術後12週間(屠殺)目で、欠損6例中3例は、宿主骨末端に広範囲な取り込みを有した。新骨は、なお欠損の外側に存在したが、広範囲な再造形が生じていた。12週間目での平均X線写真等級は5.17/6.0であった。
CMC添加および無添加の低用量移植片での処置部位は、CMC添加および無添加の高用量OP−1部位と比較して、より少ない新骨容積を示した。高用量部位はすべて、肉眼的にしっかりと癒合されたが、低用量OP−1での処置部位12例中、3例は、屠殺時でもまだしっかりと癒合されていなかった。
全例で、形成された新骨の量は、元の欠損容積を超えなかった。新骨形成はかなり含まれていたが、6切片中2切片で骨は完全に癒合されていなかった。
低用量OP−1で処置した欠損と同様に、新骨形成をかなり含有した。低用量OP−1/CMCでの処置部位6例中1例は、完全に癒合されなかった。代表的に、新骨容積は、元の欠損容積よりも少なかった。
前の実験と同様に、標準OP−1デバイスでの処置部位の新骨容積は、元の欠損容積の2〜3倍大きかった。欠損はすべて、しっかりと癒合された。欠損6例中5例で、新骨が広範囲に軟組織に広がり、橈骨に融合された。欠損1例で、形成した新骨の容積は、他の部位より低かった。
OP−1/CMCで処置した欠損6例中5例の新骨容積は、元の宿主骨容積を超え、そして軟組織へ広がった。新骨容積は、元の欠損容積の2〜3倍であった。1匹の動物で上記に明記したように、両側で骨容積の減少が観察された。
力学的試験の要約を表7および表8に示す。
予想外に、標準OP−1/CMCデバイスで処置した部位は、最大平均組織学的スコア、12.08/16.0点を達成した。低用量OP−1/CMC部位は、標準OP−1デバイス部位の平均組織学的スコア、10.88/16.0点より僅かに高い11.07/15.0点を達成した。低用量OP−1部位の平均組織学的等級は、9.58/16.0点であった。
新骨形成は、全低用量OP−1での処置欠損で明白であったが、欠損内の新骨量はしばしば、欠損を満たさず、そして宿主骨末端と連続しなかった。1部位では、欠損は組織学的に完全に癒合された。新骨は、組織化および再造形の早期の段階においてであった。新たに鉱化した骨の領域もまた若干認められた。
低用量OP−1/CMC部位は、低用量OP−1部位と比較して類似した組織学的外観を有した。しかし、そして予想外に、新骨は、低用量OP−1部位と比較して低用量OP−1/CMC部位において、より頻繁に宿主骨と連続的であった。骨が宿主骨と連続した例では、新骨縁の早期再造形および濃密化が明らかであった。新骨治癒が完全でなかった例では、新たに鉱化した骨の領域ならびに欠損内の線維組織領域が明らかであった。一般的に、新骨は十分含有された。欠損境界にそって進行した再造形領域が若干観察された。
広範囲の新骨形成は、全欠損を架橋した。新骨縁の早期濃密化が生じていた。若干例において、新たに鉱化した骨の領域は、成熟骨領域を接合した。欠損中央部では、小領域の残留キャリア物質が時に存在した。炎症応答は観察されなかった。新骨は、しばしば軟組織に広がっていた。再造形は、欠損/新骨境界で最も進行した。これらの領域で骨は、層板構造に再造形していた。
標準OP−1部位と標準用量OP−1/CMC部位との間での組織学的外観に顕著な差は存在しなかった。新骨は広範囲に欠損を繋げ、そして欠損を満たした。最も広範囲な再造形は、新骨/宿主境界で生じた。再造形した骨は、これらの領域で層板構造を有した。新たな皮質の濃密化が認められたが、まだ完全ではなかった。時に、新骨形成によって取り囲まれた少量の捕捉された残留キャリア物質が観察された。付随する炎症応答はなかった。
改良された骨形成デバイスは、低用量OP−1で、予想外に、低用量OP−1の標準的デバイスによる誘導より、早くかつ大容積の新骨形成を誘導した。さらに、予想外に、改良された骨形成デバイスで処置した欠損部位は、術後12週間目に最大平均ねじり破損負荷を達成した。組織学的に、改良されたデバイスは、予想外に、最大平均スコアを達成し、そしてより頻繁に、宿主骨と連続的な新骨を示した。
1.実験1:ユニタリデバイスで処置されるような閉鎖された欠損の修復の時間過程(イヌ)
この非重症的サイズギャップ研究を、改良された骨形成デバイスの注射可能な配置を評価するために行った。研究設計は、4週間モデルでの3mmギャップを使用した。研究は、OP−1/CMC/コラーゲンマトリクス配置の注射後の欠損の治癒を評価した。各動物の対側アームは、コントロールであった。さらに、未処置の欠損についての治癒の時間過程を、4、8、および12週間で評価した。
目的のために飼育した成体雑種イヌ(18)を、それらの解剖学的サイズ、ならびに公知の骨修復および再造形の特徴のために、この研究において使用した。動物は、研究の開始時に約2〜4年齢であり、および20〜30kg(約)の重量であった。動物を、X線撮影的にスクリーニングし、正確なサイズ、骨格の成熟度、および明らかな骨異常が何も存在しないことを確認した。
CMCと混合されたコラーゲンマトリクス中に組換えヒト骨形成タンパク質−1(rhOP−1)を含有する、改良された骨形成デバイス処方物を試験した。コントロールは、偽デバイス単独からなった。
処方物2 :100μl酢酸/ラクトース緩衝液中の0.350mg rhOP−1
処方物3 :生理食塩水で湿潤された170mgコラーゲン−CMCマトリクス中の0.350mg rhOP−1
コントロール1:100μlゲル中の0mg rhOP−1
コントロール2:100μl酢酸/ラクトース緩衝液中の0mg rhOP−1
コントロール3:生理食塩水で湿潤された170mgコラーゲン−CMCマトリクス中の0mg rhOP−1
実験設計
両側の3mm尺骨分節欠損を、全ての動物において作製した。9匹の動物は、右側欠損において3つの実験試験処方物のうちの1つを受け、それによって各型の3つの部位を試験した。左側欠損に偽デバイスを移植した。これらの動物を、術後4週間で屠殺した。残存する9匹の動物は、両側に非移植欠損を受け、そして4、8、および12週間での時期で屠殺した(各時期で3匹)。上記のように、X線写真を撮影し、治癒の進行を研究した。rhOP−1処方物を受けた9匹の動物の屠殺の日の最終決定は、毎週のX線写真に基づいた。屠殺時に、全ての尺骨をひとまとめにして回収し、そしてねじりにおいて力学的に試験した。分節を、上述のように、組織応答、ならびに新規な骨形成の質および量、ならびに治癒の程度について、組織学によって評価した。
上記に考察したように、動物を設計した時間で屠殺し、そして尺骨および橈骨をひとまとめに迅速に採集した。両方の尺骨を拡大写真撮影し、そして接触X線写真を撮影した。軟組織を、非常に注意深く、欠損部位から切開してとりだした。水冷却した鋸を使用して9cmの均一な長さに尺骨を切断し、欠損部位を試験標本の中央においた。切片化後すぐに、標本を、上述のように、MTS閉ループ液圧試験機器(Minneapolis、MN)における破損に対するねじりにおいて試験した。
以下の観察および代表的なデータを、(術後4週間の)日に採集した。
CMCを含有する骨形成デバイス(注射可能な配置)は、閉鎖された欠損部位での非重症的なサイズの3mm尺骨分節欠損を修復するために使用され得る。
以下は、イヌにおける骨折治癒の加速のための、注射可能な、CMCを含有するrhOP−1処方物の効力の比較実験研究である。
この目的のために飼育した成体雄性雑種イヌをこの研究において利用した。骨の幾何学および負荷における変動性を制限するために、均一なサイズおよび重量の動物を選択するにおいて特別な注意が払われた。動物を、2週間の検疫期間の間、急性および慢性の医学的状態を排除するように、臨床学的におよびX線写真的にスクリーニングした。
移植片材料は、酢酸緩衝液処方物中の組換えヒト骨形成タンパク質−1(rhOP−1)、およびCMC−コラーゲン中のrhOP−1からなった。rhOP−1処方物を、ベヒクルのみのコントロールに対して比較した。酢酸緩衝液rhOP−1処方物は、100μl容積中に送達される、ラクトース/酢酸緩衝液中の3.5mg/ml OP−1からなった。ベヒクルコントロールは、ラクトース/酢酸緩衝液の100μl容積からなった。rhOP−1/CMC−コラーゲン処方物は、約0.43mlの生理食塩水で湿潤された、170mg CMC−コラーゲンマトリクス中の0.35mg rhOP−1からなり、ペーストのコンシステンシーを有した。コントロールCMC−コラーゲンは、約0.43mlの生理食塩水で湿潤された、170mg CMC−コラーゲンマトリクスからなり、そしてまた、100μlの注射可能な容積で送達された。
合計36匹の成体雑種イヌを利用した。両側の尺骨分節欠損(3.0mm長)を全ての動物において作製した。14匹の動物は、一方の欠損に0.35mg rhOP−1/酢酸緩衝液処方物の注射を受け、そして対側の欠損にrhOP−1非含有の酢酸緩衝液の注射を受けた。9匹の動物は、一方の欠損に03.5mgのrhOP−1/CMC−コラーゲン形成の注射を受け、そして対側の欠損にCMC−コラーゲン単独の注射を受けた。23匹の動物を、術後4、8、および12週間の時期に屠殺した。13匹のイヌは、移植片を伴わない両側の欠損を受け(欠損のみ)、そして術後4、8、12、および16週間の時期に評価した。
研究期間の終わりに、静脈内のバルビツール酸の過剰用量を使用して動物を屠殺した。尺骨および橈骨をひとまとめに迅速に採取し、そして生理食塩水を浸漬したダイアパー中に置いた。軟組織を欠損部位から注意深く切開して取り出す前に、両方の尺骨を拡大写真撮影し、そして接触X線写真を撮影した。次いで、生体力学的な試験評価のために、水冷却した鋸を使用して9cmの均一な長さに尺骨を切断し、欠損を試験標本の中央においた。
肉眼的な観察
全てのrhOP−1処置した欠損は、術後4週間の速さで新規な骨形成を有した。全ての処置した欠損は、手動で安定であり、および術後8週間と12週間との間で再造形を開始する硬い(solid)新規な骨と架橋した。いくつかの欠損において、新規な骨は、欠損末端を越えて、そして欠損の周囲の重層する軟組織にまで伸長した。
rhOP−1処置した欠損において、新規な骨の痕跡が、術後2週間までに、欠損部位においておよびその周囲に見られた。新規な骨の量および密度は、2から4週間増加し、宿主骨皮質は、不透明になりはじめた。術後4週間と8週間との間で、rhOP−1処置した欠損は、欠損末端にX線高密度な新規な骨の有意な量および側方で欠損の架橋を有した。12週間までに、宿主皮質は、X線高密度な架橋結合を伴って不透明化された。
処置群および時期による平均の力学的試験の結果を、表11Aおよび11Bにまとめる。rhOP−1で処置した欠損のねじり強度は、未処置のコントロールおよびベヒクルのみのコントロールよりも有意に大きく、そして以前に試験した無傷の尺骨の強度に接近した。rhOP−1/酢酸緩衝液処方物欠損の力学的強度は、術後4週間で無傷の尺骨強度の59%であり、術後8週間で77%であり、および術後12週間で98%であった。rhOP−1/CMC−コラーゲン欠損の力学的強度は、それぞれ、4週間、8週間、および12週間で、無傷の強度の36%、53%、および66%であった。
rhOP−1欠損およびコントロール欠損の組織学は、全体的な結果、X線写真的な結果、および力学的試験の結果と十分に相関した。rhOP−1処置された欠損において、欠損を橋渡しする増殖性の新規な骨形成が観察され、そしていくつかの場合において皮下組織に伸長した。新規な骨は、骨内膜尺骨領域および欠損皮質の近くの骨膜から形成した。新規な骨との架橋は、術後8週間までに通常完了したが、鉱化する軟骨の範囲が存在した。欠損は、高密度の編み合わされた骨と架橋および充填され、そして宿主骨皮質の再編成が、12週間までに観察された。
この研究の結果は、非重症的なサイズの欠損に注入された骨形成タンパク質が、骨修復を加速し得ることを実証する。イヌの尺骨における非重症的なサイズの欠損へのrhOP−1の局所的な経皮的な注入は、未処置のおよびベヒクルのみで処置されたコントロール欠損に比較して、増殖性の骨膜および骨内膜の新規な骨の形成を生じた。X線写真で、rhOP−1注入は、術後2〜3週間の早さで、新規な骨の散在性の石灰化および初期の骨折仮骨形成を生じ、術後8〜12週間までに有意な骨架橋および宿主皮質の組込みを伴った。rhOP−1で処置された非重症的なサイズの欠損の力学的強度は、12週目で無傷の尺骨の強度に達し、そしてコントロール欠損の治癒において観察される強度の2〜3倍であった。
1.実験1:OP−1の種々の用量を使用するヤギ骨折研究(閉鎖された欠損部位)
以下は、ヤギにおける新鮮に閉鎖された脛骨中央軸骨折欠損(5mmへの伸延)の比較的ランダム化された実験研究である。
ヤギが、ヒトの骨治癒速度に比較し得る骨治癒速度を有することが、当該分野において一般に認識される。従って、本研究の結果は、臨床学的設定に外挿され得る。さらに、ヤギの骨が、サイズ、構造、および力学的負荷に関してヒトの骨に対して類似性を示すことが、当業者によって理解される。
前投薬として、ケタミン10mg/kg筋肉内およびアトロピン1.5mg筋肉内(または当該分野において認識される前述の投薬の等価物)を、完全に動物を麻酔する約15分前に投与する。後者を、エトミデート(または当該分野において認識されるその等価物)0.3mg/kg静脈内で達成する。挿管後、麻酔を、1〜2%イソフラン(または当該分野において認識されるその等価物)で補充されたO2/N2O−混合物(1:1容量/容量)で維持する。
動物を、処置:上記のように処方される、少なくともOP−1、コラーゲンマトリクス、および結合剤(例えば、CMC)を含有する骨形成デバイスの注入可能な配置中の0.5mg OP−1(骨折の作製後直接的に)(群I)、少なくともOP−1、コラーゲン、および結合剤(例えば、CMC)を含有する注入可能なデバイス中の1.0mg OP−1(骨折の作製後直接的に)(群IV)、骨折の作製後直接的に注入されるOP−1デバイスの標準配置中の1.0mg OP−1(0.4グラムのOP−1デバイスに対応する)(群V)、およびOP−1での処置なし(群VI、コントロール)に従って、3匹の動物の5つの群(I〜V)に、および9匹の動物の1つの群(VI)に分割する。処置群は、以下のように要約される:
X線写真
X線は、標準化された手順に従ってなされ、2方向(前後および中間側面)において骨折部位を描写する。第1のX線写真を、骨折の作製のすぐ後に、そしてその後動物の屠殺まで2週間毎に撮影する。屠殺時でのX線写真は、ギブス包帯材料の除去後に作製され;その他全ては、インサイチュでギブス包帯材料を伴って作製される。これらは、2人の知らされていないX線写真家および外科医によって定性的に判断され、そして可能である場合、治癒プロセスを評価するための以下の等級づけスケールを適用する:
等級0:骨折の作製後に直接的に比較される差異なし
等級1:小量の仮骨
等級2:中程度の量の仮骨
等級3:多量の仮骨
等級4:骨折末端の消失
特別な注意が、骨折およびアラインメントの型に払われる。
左肢およびギブス包帯材料の除去後、ならびにX線写真の作製後、骨折範囲のCTスキャンを作製する。軟部組織は、より良好な質のスキャンのためにインサイチュで残存するべきである。骨折ギャップおよび仮骨の残存物が、この方法において可視可能にされ得る。さらに、仮骨の量を算定し得る。治癒プロセスの進行についてのより詳細な情報が、平面X線写真を用いるよりも、CTスキャンを用いて得られ得る。
CTスキャンおよびその後の脛骨からの全ての軟部組織の除去後、生体力学研究を行う。骨の高度な力学的試験のための方法を、以下のように開発する:15°の角度増加での24方向における屈曲剛性を測定し、そしてX−Y座標系におけるベクトルとして記載し、それによって長円を得る。長円を、対側の無傷の脛骨の長円と比較する。パラメータは、治癒効力の測定として作用するこの比較に由来し得る。最後に、破損に対するねじり試験を行い、そしてねじり強度、ねじり剛性、角度置換、および破損に対するエネルギー吸収を、対側の健常な脛骨のパーセントとして表す。対側の脛骨とのこの比較は、個体間の変化を減少するためになされる。
生体力学的試験後、骨フラグメントを組織学的実験のために、特別なリングとともに保持する。骨および軟骨についての、標準的な固定、包埋、および染色技術が、使用される。特別な注意が、線維性の、骨軟骨性の、または骨性の癒合の徴候に対して払われる。組織学的スコアリング系を、骨折ギャップにおける線維組織、軟骨、新規に形成された骨、および骨髄の量を定量するために適用する。
力学的、X線写真的、および断層撮影的、および組織学的なデータは、改良された骨形成デバイスの注入可能な配置が、閉鎖された部位骨折欠損の加速された修復を導き得ることを示すことが予測される。
改良された骨形成デバイス(注入可能な配置)が、閉鎖された欠損部位での新鮮な脛骨中央軸骨折欠損(5mmに伸延される)を修復するために使用され得る。
この独立した研究はまた、改良された骨形成デバイスを使用する骨折欠損の修復を研究するための動物モデルとして、ヤギを使用する。上述の技術に類似の技術を使用して、外部固定および5mmへの伸延とともに陥落を伴う新鮮に閉鎖された(ほとんど横行性のおよび単純な斜位の)骨幹骨折を、CMCを含有する骨形成デバイスを使用して処置する。
力学的、X線写真的、断層撮影的、組織学的なデータは、改良された骨形成デバイスの注入可能な配置が、閉鎖された部位骨折欠損の加速された修復を誘導し得ることを示すことが予測される。ある好ましい実施態様において、低用量の骨形成タンパク質が、特に改良された骨形成デバイスにおいて、修復を誘導するために効果的であることがまた予測される。
改良された骨形成デバイス(注入可能な配置)は、閉鎖された欠損部位で、新鮮に閉鎖された骨幹骨折(5mmに伸延される)を修復するために使用され得る。
1.実験1:十分な厚さの骨軟骨欠損(イヌ)
イヌ骨軟骨栓欠損モデルを使用する研究を、骨軟骨/軟骨欠損を修復するための改良された骨形成デバイスの効力を実証するために行った。移植片の4つの処方物を評価した。これらは(1)rhOP−1およびコラーゲンマトリクスを含む標準骨形成デバイス、(2)rhOP−1、コラーゲンマトリクス、およびカルボキシメチレルセルロース(CMC)結合剤を含む改良された骨形成デバイス、(3)コラーゲンマトリクスのみ、または(4)コラーゲンマトリクスおよびCMC結合剤を包含する。
標準骨形成デバイスは、ウシI型骨コラーゲンマトリクスとともに混合されたrhOP−1からなった(2.5mg rhOP−1/gマトリクス)。改良された骨形成デバイスは、20mgのCMCと組み合わされた、100mgのOP−1/コラーゲンマトリクスの標準骨形成デバイスを含んだ(合計120mg)。コントロールは、ウシI型骨コラーゲンマトリクス単独、およびCMCを伴うコラーゲンマトリクスからなった。両方を、100mgの量において供給した。
研究設計を表12にまとめる。
標準的な無菌技術を使用して、手術をイソフルオランガス麻酔下で行った。麻酔を、5.0mg/lb体重の投薬量で、ペントサルナトリウムの静脈内注射によって投与した。約4センチメートルの長さの内側の膝蓋傍(parapatellar)の切開を作製した。膝蓋を、大腿顆を曝露するために、側方に引っ込めた。欠損深度(6mm)の過剰なドリリングを防止するために特別に設計された鋸を有する5mmのドリルビットを使用して、最終的な欠損を作製した。滅菌生理食塩水を、移植の直前に、改良された骨形成デバイスに添加し、そして混合した。生理食塩水で欠損を洗浄し、骨残渣およびこぼれた髄細胞を除去した後、適切なデバイスを平滑なプローブ(probe)を使用して欠損部位に充填した。デバイスが関節をなす表面と平らになるように十分なデバイスを欠損内に置いた。次いで、関節被膜および軟組織を、層中に閉鎖した。手順を、適切な移植片を用いて、対側に対して反復した。
以下に記載するように、骨軟骨治癒を、日常的な手順を使用して肉眼的におよび組織学的に評価した。ラジオグラフを使用して治癒を評価した。
各々の採集された欠損を、肉眼的な見かけについて等級づけした。この分析は、関節内癒着の形成、関節表面の回復、軟骨の侵食および出現に基づく点を配分する。合計8点が最高である。肉眼的な等級づけのスケールを、表13に記載する。
全ての標本を、組織学的評価のために調製した。個々の標本を、4%パラホルムアルデヒド溶液中の浸漬によ0って固定した。さらに、本明細書中の他の場所に記載されるように、日常的な手順を使用して、組織分類づけ分析を、コラーゲンの型および組織組成のパーセントを特徴づけするために行った。各標本からの1つの、サフラニン−Oおよびファスト グリーン染色で染色した(マトリクス中のグリコサミノグリカン含量を示すために)脱石灰されていない切片を、評価のために戻した。
全ての手術は、術後の合併症を伴わずに平穏無事であった。概して、いくつかの医学的な膝の膨潤が、術後4日目に、全ての4匹の動物において両側に観察され、そして術後10日目までに静まった。動物は、移植された物質または実験手順に関連する任意の有害な反応を経験しなかった。
平均の肉眼的な評価の等級のまとめを、表15に示す。
未処置の欠損、およびOP−1、コラーゲンマトリクス、およびCMCの改良された骨形成デバイスで処置された欠損は、それぞれ、24の最高点のうちの15および16.5の最も高い平均の組織学的な等級を受けた。しかし、これらの群のそれぞれにおいて、1つの標本は、他のものよりも顕著により良好に見えた。しかし、コラーゲンマトリクスのみ、CMCを伴うコラーゲンマトリクス、および標準骨形成デバイスで処置された部位は、改良された骨形成デバイスで処置された部位よりも、わずかにより一貫して、およびより低くスコアされた(n<2)。平均の組織学的な等級のまとめを表16に示す。
この研究はまた、デバイスなし、2つの型のマトリクスのみの組成物(マトリクスおよびマトリクス/結合剤)、またはOP−1を伴う両方のマトリクス組成物で処置された欠損部位でのコラーゲン修復を比較するために、切片を染色した。
改良された骨形成デバイスで処置された骨軟骨欠損は、標準骨形成デバイス、コラーゲンマトリクスタンパク質単独、またはCMCと混合されたコラーゲンマトリクスで処置された欠損(これらのすべては、ほとんど組織化されない修復軟骨および肋軟骨下の骨形成を実証した)と比較して、より向上した軟骨再生、軟骨細胞および軟骨の表現型を、予想外に実証した。コラーゲンマトリクス、またはCMCを伴うコラーゲンマトリクスでの処置による不十分な修復は、コラーゲン足場単独の存在は、治癒を誘導するのに十分ではなく、そして治癒の進行および修復組織の組織化を、実際に阻止し得ることを示す。
この研究は、改良された骨形成デバイスによる骨軟骨/軟骨欠損の修復をさらに評価するために行われた。今日までに、研究は、6および12週間での改良された骨形成デバイスの効果を試験し、そして26および56週間での効果を試験することを継続する。これは、長期の修復安定性のデータを提供する。経時的な新規な軟骨の組織化を追跡し、これが、構造および機能に関して正常な組織に近づくか否かを決定した。デバイスの2つの処方物を、骨軟骨/軟骨欠損において評価し、以下を含んだ:1)改良された骨形成デバイス、または2)CMCおよびコラーゲンマトリクスのみを含有する擬似デバイス。
標準無菌技術を使用して、イソフルオランガス麻酔下で手術を行った。約4センチメートルの長さの内側の膝蓋傍の切開を作製した。膝蓋を、大腿顆を曝露するために、側方に引っ込めた。1/8インチのドリルビットを使用して、試験的な穴を、内側大腿顆の体重ベアリング領域において作製した。欠損深度(6mm)の過剰なドリリングを防止するために特別に設計された鋸を有する5mmのドリルビットを使用して、最終的な欠損を作製した。生理食塩水で豊富に洗浄し、骨残渣およびこぼれた髄細胞を除去した後、適切な実験デバイスを平滑なプローブ(probe)を使用して欠損部位に充填した、次いで、関節被膜および軟組織を、層中に非常に注意深く閉鎖した。この手順を、適切な移植片を用いて、反対側にも繰り返した。
4匹の動物それぞれを、6および12週間で屠殺し、そして4匹の動物を術後26および53週間で屠殺する。動物を、静脈内のバルビツール酸の過剰用量を使用して屠殺した。大腿骨をひとまとめに即座に回収し、そして生理食塩水を浸漬したダイアパーに置いた。欠損部位の高倍率の写真を撮影した。軟組織を、欠損部位から非常に注意深く切開して取り出した。大腿骨の近位末端を除去した。
6週間後、いくつかの上述の処置された動物を屠殺し、そして免疫組織学的評価を本明細書中のほかの場所で記載されるように行った。結果は以下のようである:全ての場合において、OP−1 CMC/コラーゲンデバイスで処置された欠損は、優れた修復を示した。OP−1 CMC/コラーゲンデバイスを用いて、軟骨組織と欠損との、予期されない完全なまたはほぼ完全な架橋が存在した。II型コラーゲン染色が、修復軟骨において観察されたが、I型コラーゲン染色はほとんどまたは全くなかった。プロテオグリカン染色は、II型コラーゲン局在化を追跡し、成熟な硝子質軟骨により密接に類似する範囲においてより暗い染色を伴った。サフラニンO染色に基づいて、軟骨の表面層における再生は、処置後6週目でなお完全でなかった。
1.実験1:軟骨欠損修復対骨軟骨欠損修復の長期評価(ヒツジ)
本実験は、大型動物モデルを使用する改良された骨形成デバイスによる、軟骨および骨軟骨欠損の両方の修復を評価する。関節軟骨の増加した厚さ、ならびに、サイズ、および体重を支える特徴がヒトと類似していることから、ヒツジが、ヒトでの臨床適用がそれから推定され得るモデル、特に軟骨欠損の修復のための改良された骨形成デバイスの臨床適用のためのモデルとされる。実験群は以下のとおりである:
骨格的に成熟した乳ヤギを使用する研究を、骨軟骨/軟骨欠損の修復のための改良された骨形成デバイスの効力を証明するために実施する。様々な濃度のrhOP−1を含む改良された骨形成デバイスの処方物を、模擬デバイスコントロールまたはデバイスなしコントロールと共に使用する。模擬デバイスは、カルボキシメチルセルロース(CMC)と混合されたコラーゲンからなる。さらに、手術後4、12、24ヶ月目に動物群を屠殺して、欠損修復率およびその安定性を比較する。以下に実験パラメータを要約する。
麻酔を誘導して、内側膝蓋アプローチにより左膝を開口する。膝蓋骨を外側にずらし内側顆を露出させる。鋭利な中空チューブで、内側顆の前方の体重を支える部分に欠損の外郭を作製する。チューブ内に配置された四角な尖った祖砥で、軟骨下骨に達する欠損を作製する。次に近位脛骨を露出させ、内側顆の欠損と同じ直径の骨膜弁(periosteal flap)を取る。骨膜弁を、欠損に形成層を向けて、レムナントに部分的に固定する。欠損を適切な試験物質で充填して、再吸収性縫合糸を使用して骨膜弁で覆う。CMCデバイスを欠損が充填されるまで注射器で添加して、その後弁を完全に縫合する。コントロール動物においては、コラーゲンおよびCMCのみを含む模擬デバイスを使用する。第2のコントロール群は、移植片を全く与えられないが、骨膜弁のみを与えられる。
無制限の、体重を支える活動が、手術後に許容され得る限り許可される。
体重を支えるパターンを、2、4、6、および8週間目、そしてその後は4週間毎に評価する。
前記のスキームに基づいて肉眼評価を行う。動物を屠殺後、膝拘縮の存在または不在を記録して、大腿の膝蓋骨および顆の両方を、癒着、関節表面の外形、回復軟骨の外観、および軟骨びらんの存在または不在について検査する。これらの特性のそれぞれについてスコア付けをする。マクロレンズを使用してカラースライドを撮影する。
組織学的評価の間、再生軟骨下骨の可視化を補助するため、および欠損の境界を定位するために、屠殺前、ヤギに二重標識テトラサイクリンを与える。これにより、欠損のより深い部分の骨充填の組織形態計測が可能となる。組織学的サンプルをまた、偏光顕微鏡観察を組み込むことによって検査し、通常の構造的特徴に関する情報を提供する。
プロテオグリカンの抽出:生化学的分析のために、欠損由来のコントロール軟骨および組織を、冷リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中に収集する。プロテオグリカンを、プロテイナーゼインヒビター(5mMベンズアミジン、0.1M 6‐アミノ‐n‐ヘキサン酸、10mM EDTA、5mMフェニルメチルスルホニルフルオライド、および5mM
n‐エチルマレイミド)の存在下で、4℃で60時間、pH5.8の4MグアニジンHCl、0.15M酢酸カリウムを用いて処理することにより、凍結乾燥切片から抽出する。抽出物と残渣を分離する。残渣を抽出緩衝液で十分にリンスし、抽出物に添加する。抽出物をコンドロイチンスルフェート含量について分析して、ゲル濾過に使用する。
磁気共鳴画像法(MRI)を2つの目的のために実施する。第一には、手術1カ月後に弁および移植片が適所に維持されていることをモニターするためである。第二には、群1C(術後2年またはそれ以上)を、4カ月め、12カ月めおよび屠殺時に、MRIで長期間追跡する。
改良された骨形成デバイスで処置された欠損は、模擬デバイスコントロールまたはデバイスなしコントロールと比較して、優れた軟骨再生、軟骨細胞および軟骨表現型を示すと予測される。低用量のOP−1は、少なくとも、より高い用量と同様な量的および質的修復を達成することもまた予測される。
本研究は、哺乳動物の軟骨形成を、組換え型ヒト骨形成タンパク質−1(rhOP−1)(単独で、またはコラーゲンマトリクスとの組合せで)および/または自己軟骨膜で処置された軟骨下病変において研究する。
15頭のヤギの左膝関節の内側大腿顆において、直径9mmの軟骨下欠損を作製した。その欠損を、以下の(a)または(b)または(c)と混合した新鮮な凝固血液からなる移植片で充填した:(a)自己耳軟骨膜の小粒子;(b)rhOP−1;(c)rhOP−1および耳軟骨膜。rh−OP−1を、コラーゲンマトリクス(OP−1デバイス)との組合せ、またはコラーゲンマトリクスなし(OP−1単独)のいずれかで添加した。欠損を骨膜弁で閉じ、これを軟骨に縫合した。1、2、および4カ月の移植期間後、各欠損の修復程度を標準的な組織学的技法(異染性および硝子質度)および周知の生化学的方法(プロテオグリカンのゲルクロマトグラフィー)により調査した。
この特定の研究において1および2カ月後に、コントロール(上記(a)の移植片)と種々のOP−1処置欠損との間には明確な差異はなかった。しかし、4カ月後には、3つのコントロール欠損のうち1つのみが、検出可能な軟骨形成を示したが、表19に示された組織学的および生化学的分析により示されるように、4つのOP−1処置欠損全てが、軟骨で完全にまたは部分的に充填された。
表19は、コラーゲンマトリクスの存在または非存在在で、OP−1なし(コントロール)で、またはOP−1+/−軟骨膜で、4カ月間処置された顆欠損の軟骨スコアを示す。
本研究結果は、ヤギの大きな軟骨下欠損においてOP−1が軟骨促進効用を有することを確認する。これは、OP−1が、関節軟骨の大きな病変を処置することにおいて臨床的妥当性を有し、そして哺乳動物において外傷または疾病により引き起こされる、体重を支える骨格の欠損の軟骨修復に特に有用であることを示す。
G.アパタイトおよび/またはリン酸三カルシウム(TCP)および/またはコラーゲンマトリクスを含む改良された骨形成デバイスを使用する、分節欠損修復(重症サイズおよび非重症サイズ)
様々なマトリクスまたはその混合物を含む改良されたデバイスを使用して、ウサギおよびイヌにおいて、種々の用量のOP−1で、分節尺骨欠損(重症サイズおよび非重症サイズ)を修復する。改良されたデバイスは、Pyrostaマトリクス(Osteo AG
, Switzerland)、ウシ骨由来のHApブロック;100%HAp顆粒(約300〜400または350〜450μ);100%TCP(約400μ);および50%HAp/50%TCP(約400μ)を含む。他の実施態様は、1またはそれ以上の適切な有孔性の前述のマトリクスを含む。改良された骨形成デバイスの特に好ましい1つの実施態様は、HApおよびコラーゲンのスポンジである、Collapataマトリクス
(Osteo AG, Switzerland)を含む。特に好ましい別の実施態様は、パテー状のコンシステンシーを有するデバイスを所望する場合には特に、1gのHAp顆粒または1gの75%HAp/25%TCP顆粒当たり約0.6gのCMCを含む。上記の別の好ましい実施態様は、β‐TCPおよびフィブリンのりを含む。
骨形成に対してフィブリンのりOP−1処方物を評価するために、4つのラット皮下研究を実施した。フィブリンのりの3つの異なる供給源を使用して、10μg OP−1での骨形成の量は同様であり、25%〜40%の範囲であった(表19A〜19Fを参照)。これらの研究においては、炎症と骨形成との間には明らかな相関は存在しなかった。結果は、ラットが、異なる種由来のフィブリンのりに対して異なって反応することを示した;例えば、0〜4のスケールに基づいて、Tissucolaからのヒトフィブリンのり
は、2〜2.7の炎症応答を誘発し(表19A参照)、ウシフィブリンのりは、2〜3.5の炎症応答を引き起こし(表19Bおよび19C参照)、そしてラットフィブリンのりは、1〜1.3の最も低い炎症応答を有した(表19D参照)。代表的には、3〜4の炎症応答は重症と定義され、1〜2は軽症から中程度と定義される。
合せた。すなわち、1つの凍結乾燥OP−1デバイス(25mg総重量、10μg OP−1)を、移植の直前に、ヒトフィブリノーゲン溶液(50μLのフィブリノーゲン70‐110mg/mLまたはリン酸緩衝化生理食塩水で2、4、または8倍希釈液)およびトロンビン溶液(50μL 500U/mLまたはリン酸緩衝化生理食塩水で2、4、または8倍希釈液)と組合せた。ポジティブコントロールは100μLのリン酸緩衝化生理食塩水で湿潤したOP−1デバイスである。結果を表19Fに示す。標準OP−1デバイスと異なる濃度のTissucolaを組合せたOP−1デバイスとの間の骨形成に有意な差異は見られなかった。また、フィブリノーゲン濃度は骨形成に有意な効果を持たなかった。
種々のマトリクスまたはその混合物を含むフィブリンのりを含有する改良されたデバイスを、当該分野で認識されている動物モデルでOP−1の投与量を変化させて、骨、骨軟骨性、または軟骨性欠損を修復するために使用する。好ましいデバイスの特定の実施態様は:フィブリンのり、コラーゲンおよびOP−1を含む。好ましいデバイスの他の実施態様は:フィブリンのり、β‐TCP、およびOP−1を含む。最後に、さらなる試験は、本発明における使用に適切な任意の前述のマトリクス材料を含む。
以下は、分節(重症サイズおよび非重症サイズ)欠損を治癒するための、フィブリンのりを含有する改良されたデバイスの効力に関する比較実験的研究である。
上記のように、本目的のために交配させた成犬雄性雑種イヌを本実験に使用する。骨の結合構造および負荷の変動を限定するために、均一のサイズおよび体重の動物を選択することに特別の注意を払う。
移植片材料を、酢酸緩衝液処方物中に組換えヒト骨形成タンパク−1(rhOP‐1)、フィブリンのりおよびコラーゲンまたはフィブリンのりおよびβ‐TCP中のいずれかにrhOP−1を含む。rhOP−1処方物を、ビヒクルのみであるコントロールと比較する。酢酸緩衝液rhOP−1処方物は、100μlの容量で導出されるラクトース/酢酸緩衝液中の3.5mg/ml OP−1から成る。ビヒクルコントロールは、100μl容量のラクトース/酢酸緩衝液から成る。試験処方物は、rhOP−1/フィブリンのり‐コラーゲンまたはrhOP−1/フィブリンのりβ‐TCPを含む。
両側の尺骨分節欠損、重症サイズまたは非重症サイズを全ての動物に作製する。動物の1群は、1つの欠損に0.35mgのrhOP−1/酢酸緩衝液処方物の注入を受容し、対側の欠損にはrhOP−1を含まない酢酸緩衝液を受容する。動物のその他の群は、rhOP−1/フィブリンのり‐コラーゲンまたはrhOP−1/フィブリンのり‐β‐TCP処方物の注入を一方の欠損に受容し、対側欠損にはフィブリンのり‐β‐TCPまたはコラーゲンのみを受容する。動物を手術後4、8、および12週間目に屠殺する。あるイヌは移植片を受けない(欠損のみ)両側欠損を受容し、術後4、8、12、および16週間目に評価される。
実験期間終了時に、静脈内バルビツール酸塩の過剰投与により動物を屠殺する。尺骨と撓骨を直後に一括して収集して、生理食塩水に浸潤した布内に置く。両尺骨を拡大写真に撮り、欠損部位から注意深く軟組織を切除する前に接触X線撮影をする。次に水冷却による鋸子を使用して、生体力学的試験評価のために、試験標本の中間部に欠損が位置するように尺骨を9cmの均一長さに切除する。
コラーゲンまたはβ‐TCPのような、前述の任意の好ましいマトリクスを持つフィブリンのりを含有する改良されたデバイスは、重症サイズおよび非重症サイズの分節欠損の両方の修復を促進することが予測される。
A.骨欠損の修復
1.治験1:新たな開放脛骨骨折
この実験は、骨折部位に手術的介入を必要とする脛骨の新たな骨折を有する患者についての、多施設的、予測的、無作為化研究である。
現在では世界的に年間に約2600万例の骨折がある。大多数の骨折が合併症なしに治癒し、「問題」とは見なされていない。しかし、患者が休職したり、通常活動に従事出来なくなり、活動に復帰することが不能になったり、活動する場合には、継続する痛みに苦しむ患者に伴う「生活の質への影響」がある。特に西洋社会の患者はこれらの問題に対する解決を期待するようになっている。
患者は、外傷に付随して生じる脛骨の開放骨折の手術的治療を必要とする。骨折は、治癒を可能とするために骨折部位において適切に安定化し得る可能性を持たなければならない。患者の骨格的成熟がX線画像で証明される。
型#1: 初期負傷時から7日以内に明確に閉合する。
患者を、処置後最低1年間追跡調査して、治癒を評価し、状態評価のために24ヶ月追跡調査する。
1)機能、体重負荷、および歩行のより早い回復による治癒時間減少の可能性;
2)遅延/破損/非癒合防止の可能性;
3)休職/欠席期間から、より早い/より短い期間での通常活動への復帰;
4)治癒促進のためのさらなる介入/手術手順の可能性の保留;
5)金属部品の合併症の低減;および
6) 骨移植を必要とする患者では、関連した様式で骨を収集するための第二の部位の手術を必要としないという恩恵。
ヒト被験者における新たな閉鎖骨幹骨折の修復を改良された骨形成デバイスを使用して評価する。特に、患者を、注入可能な改良された骨形成デバイスを用いて、閉鎖欠損部位にデバイスを注入することにより処置する。改良された骨形成デバイスを用いて処置されない患者と比較して、欠損修復の促進が予測される。
上記のように、治験1および2を、フィブリンのりを含む改良された骨形成デバイスの様々な構成を使用して反復する。そのようなデバイスが骨形成を促進することがさらに予測され、特定の実施態様においては、未処置被験者と比較して欠損修復を促進する。
実験1: 離断性骨軟骨炎
骨軟骨性欠損モデルは、離断性骨軟骨炎(OD)および外傷性欠損の治療のためのrhOP−1の臨床的使用を支持する。ODは、骨軟骨性欠損の局在した領域に生じる疾病である。この疾患の1つの原因は、局在した領域への虚血性損傷であるが、その正確な病因は知られていない。OD患者において、患部は、無血管状となり、引き続き重層関節軟骨内に変化を伴う。膝にODを罹患する患者は、関節の固定化、局在性の疼痛、腫脹および膝蓋骨後方摩擦音を含む症状を経験する。膝のOD患者を含む実験を、OD欠損を修復するために、標準骨形成デバイスの能力に対して、改良された骨形成デバイスの能力を比較するために実施した。
本発明は、その精神または本質的特性を逸脱することなくその他の特定の形態に含まれ得る。それゆえ、前述の実施態様は、本明細書中に記載の本発明を限定するのではなく、全ての局面の例示であると見なされるべきである。従って、本発明の範囲は、前述の記載よりはむしろ添付の請求の範囲により示され、それゆえ、請求の範囲の等価物の意図および範囲内にある全ての変化は、請求の範囲内に包含されることが意図される。
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- 明細書に記載の発明。
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