CN102026619A - 液体缓冲的gdf-5制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于使骨形态发生蛋白溶液稳定化的改进制剂和方法。所述组合物包含GDF-5的醋酸盐缓冲溶液和其他赋形剂，其中所述溶液的pH值为约4.2至约5.3，从而提供在储存、处理和使用期间具有改善的GDF-5蛋白稳定性的生物学等渗溶液。

Description

液体缓冲的GDF-5制剂
相关专利申请
本专利申请为美国临时专利申请No.61/044,518的非临时性提交申请。
技术领域
本发明涉及骨形态发生蛋白的液体制剂，以改善稳定性、处理和储存。更具体地讲，本发明涉及包含溶于pH为约4.0至约5.5的生物等渗酸性溶液中的GDF-5、在体温下处理和递送过程中具有改进的蛋白质稳定性的液体制剂。
背景技术
GDF-5是骨形态发生蛋白(BMP)的一个成员，BMP是蛋白质的TGF-β超家族的一个亚类。GDF-5包括几种变体(variant)和突变体(mutant)，包括最初由Lee(美国专利No 5,801,014)从小鼠分离得到的mGDF-5在内。其他变体包括MP52，其关于人类的GDF-5的专利名称为(WO 95/04819)，人形式的GDF-5也称为hGDF-5和LAP-4(Triantfilou，et al.Nature Immunology 2，338-345(2001)(Triantfilou等人，《自然-免疫学》，第2卷第338-345页，2001年))；还包括CDMP-1，其为hGDF-5的蛋白等位变异体(WO 96/14335)；以及rhGDF-5，其为在细菌中生成的重组人形式(EP 0955313)；以及rhGDF-5-Ala83，其为rhGDF-5的单体变体；以及BMP-14，其为hGDF-5/CDMP-1类似蛋白质的总称；以及Radotermin，其为世界卫生组织指定的国际非专有名称(INN)；以及HMW MP52，其为MP52的高分子量蛋白变体；以及C465A，其为一种单体形式，其中用于分子间交联的半胱氨酸残基被丙氨酸取代；以及其他活性单体和单个氨基酸取代突变体，包括N445T、L441P、R438L、和R438K。出于本申请的目的，术语“GDF-5”意指包括GDF-5蛋白的所有变体和突变体，其中rhGDF-5是具有119个氨基酸的示例性成员。
BMP家族的所有成员享有包括羧基末端活性结构域在内的共同结构特征，和享有高度保守形式的半胱氨酸残基，这些残基产生3个分子内二硫键和一个分子间二硫键。活性形式可以是二硫键键合的单个家族成员的同源二聚体或两个不同成员的异源二聚体(参见Massague，et al.Annual Review of Cell Biology 6：957(1990)(Massague等人，《细胞生物学年评》，第6卷第957页，1990年)；Sampath，et al.Journal of Biological Chemistry 265：13198(1990)(Sampath等人，《生物化学杂志》，第265卷第13198页，1990年)；Celeste et al.PNAS87：9843-47(1990)(Celeste等人，《美国国家科学院院刊》，第87卷第9843-9847页，1990年)；美国专利No.5,011,691和美国专利No.5,266,683)。GDF-5蛋白的正确折叠和这些二硫键的形成对于生物机能是必要的，错折叠会导致产生无活性聚集体和切割片段。
由遗传修饰的细菌生成BMP(特别是GDF-5)利用了质粒载体转化大肠杆菌(E.coli)，从而生成高产量的单体GDF-5蛋白质(参见例如授予Hotten的US 6,764,994和授予Makishima的US 7,235,527)。所述单体从内含体获得，经过纯化，然后再折叠成GDF-5蛋白的同源二聚体，以产生GDF-5蛋白的生物活性二聚体。通向二聚体的各步骤利用到各种药学上不可接受的材料来修饰溶解度，以便能够分离和纯化GDF-5蛋白。
一般蛋白质的降解在文献中已有充分的记述，但是骨形态发生蛋白特别是GDF-5的储存和溶解度未得到充分的记述。当pH在6以下时，BMP-2在大于1mg/ml的浓度下都容易溶解，在pH6以上时，可通过添加1M NaCl、30％异丙醇或0.1mM肝素提高溶解度(Ruppert，etal Eur J Biochem 237，295-302(1996)(Ruppert等人，《欧洲生物化学杂志》，第237卷第295-302页，1996年))。GDF-5的溶解度比BMP-2的溶解度更加有限，并且GDF-5在生理pH范围和缓冲液中几乎不溶。GDF-5仅在极端pH下溶于水(Honda，et al，Journal ofBioscience and Bioengineering 89(6)，582-589(2000)(Honda等人，《生物学与生物工程杂志》，第89卷第6期第582-589页，2000年))。GDF-5在约9.5至12.0的碱性pH下可溶，但是在这些条件下蛋白质会快速降解，因此用酸性条件来制备GDF-5蛋白。
骨形态发生蛋白的用途已在BMP-2和骨生长的案例中进行充分地描述。与BMP-2相比，GDF-5在肌骨骼发育的其他区域，甚至在细胞生物化学和调控的其他区域的活性更强。GDF-5在这些其他区域的用途为各种疾病和医学状况的潜在治疗提供坚实的基础。储存、处理和递送到靶组织的主要挑战是GDF-5蛋白分子的稳定性。本体GDF-5蛋白通常储存于零度以下的温度并且冻干产品储存于2-8℃以保护蛋白质不被降解，但是许多用途要求使用液体制剂，包括将液体产品递送到可植入的药物输送泵中。
我们已在以往的研究中表明，可使用高含量的赋形剂(例如60％的海藻糖)延长GDF-5蛋白在体温下受保护的时间。然而这些制剂不是等渗的，必须在注射前进行稀释。获得具有GDF-5蛋白合理的溶解度的同时又具有稳定性的GDF-5蛋白的生物相容性制剂存在极大的挑战。因此需要改进的制剂用来储存、处理和递送GDF-5蛋白溶液。
发明内容
本发明涉及缓冲的等渗GDF-5蛋白溶液的制剂，其在体温下具有改进的储存和处理性能，并为GDF-5蛋白分子提供了稳定性。本发明的一个优选实施例包括溶于5-10mM醋酸盐缓冲液(pH 4.5-5)的0.1mg/ml rhGDF-5，以及作为赋形剂的10％海藻糖，从而使得GDF-5蛋白在37摄氏度下储存32天后可保留大约90％。
附图说明
图1示出了溶于5mM醋酸盐缓冲液(pH 4.5)的0.1mg/ml rhGDF-5在37摄氏度储存32天后的稳定性(如HPLC所证实)。
图2示出了溶于5mM醋酸盐缓冲液(pH 4.5)的0.1mg/ml rhGDF-5(含有10％海藻糖)的稳定性(如HPLC所证实)。
图3示出了溶于5mM醋酸盐缓冲液(pH 4.5)的0.1mg/ml rhGDF-5(含有10％海藻糖和0.1％HO-ectoine(1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸))在37摄氏度储存32天后的稳定性(如HPLC所证实)。
图4示出了溶于5mM醋酸盐缓冲液(pH 4.5)的0.1mg/ml rhGDF-5(含有10％海藻糖和0.1％四氢甲基嘧啶羧酸(ectoine))在37摄氏度储存32天后的稳定性(如HPLC所证实)。
图5示出了溶于5mM醋酸盐缓冲液(pH 5.0)的0.1mg/ml rhGDF-5(含有10％海藻糖)在37摄氏度储存32天后的稳定性(如HPLC所证实)。
图6示出了溶于5mM醋酸盐缓冲液(pH 5.0)的0.1mg/ml rhGDF-5(含有10％海藻糖和0.1％GABA)在37摄氏度储存32天后的稳定性(如HPLC所证实)。
图7示出了溶于5mM醋酸盐缓冲液(pH 5.0)的0.1mg/ml rhGDF-5(含有10％海藻糖、0.1％牛磺酸和0.01％TEA-HCl)在37摄氏度储存32天后的稳定性(如HPLC所证实)。
图8示出了溶于5mM醋酸盐缓冲液(pH 5.0)的0.1mg/ml rhGDF-5(含有10％海藻糖、0.1％甜菜碱和0.1％ectoine)在37摄氏度储存32天后的稳定性(如HPLC所证实)。
图9示出了溶于10mM醋酸盐缓冲液(pH 4.5)的0.1mg/mlrhGDF-5(含有10％海藻糖)在37摄氏度储存32天后的稳定性(如HPLC所证实)。
图10示出了溶于10mM醋酸盐缓冲液(pH 4.5)的0.1mg/mlrhGDF-5(含有0.01％TEA-HCl和0.1％甜菜碱)在37摄氏度储存32天后的稳定性(如HPLC所证实)。
图11为示出了溶于10mM醋酸盐缓冲液(p H5)的0.1mg/mlrhGDF-5(含有10％海藻糖)在37摄氏度储存32天后的稳定性的HPLC色谱图(如90％主峰保留所证实)。
图12为示出了溶于5mM马来酸盐缓冲液(pH 4.5)的0.1mg/mlrhGDF-5(含有10％海藻糖)在37摄氏度储存32天后的降解情况的HPLC色谱图(如＜70％主峰保留所证实)。
具体实施方式
出于本专利申请的目的，以下术语的定义可用来清晰、简明地指出受权利要求书保护的本发明的主题。如本文所用，术语“生长分化因子5”(本文称为“GDF-5”)应理解为包括GDF-5蛋白分子的所有同义词、变体和突变体，包括(但不限于)GDF-5、mGDF-5、hGDF-5、MP-52、LAP-4、radotermin、CDMP-1、C465A、和rhGDF-5，其中rhGDF-5为该组的示例性成员。该术语还应理解为包括已被证实具有生物活性的单聚GDF-5蛋白。
术语“室温”(本文缩写成“RT”或“R.T.”)应理解为意指普通办公室或实验室的环境温度，为约18至约25摄氏度。如本文所用，术语“体温”应理解为意指哺乳动物的平均体温，为约34至40摄氏度，公认人的体温为约37摄氏度。
如本文所用，当涉及“本体蛋白质(bulk protein)”或“本体溶液(bulksolution)”时，术语“本体(bulk)”应理解为意指溶于约1至约10mM HCl并在-80摄氏度保存的GDF-5纯化溶液，等同于术语“储备(stock)”、“储备蛋白质(stock protein)”和“储备溶液(stock solution)”。
术语“缓冲液”应理解为在文献中具有通用的含义，即，作为名词，为共轭酸碱对，其在加入酸或碱时，能为液体提供维持稳定pH的能力；作为动词，术语“缓冲液”应理解为描述通过加入缓冲溶液维持溶液的pH的行为。示例性缓冲共轭碱包括(但不限于)醋酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐以及它们的组合，其中醋酸盐为该组的示例性成员。
如本文所用，术语“等渗”、“等渗性”和“生物等渗性”在文献中具有通用的含义，是指具有与人的血浆相等的同渗容摩的溶液，并且为约290mosm/L，其中偏差为约+/-20mosm/L。
如本文所用，术语“赋形剂”应理解为意指除缓冲液以外，加入蛋白质组合物中的任何额外的成分或添加剂。示例性赋形剂包括海藻糖、蔗糖、棉子糖、葡萄糖、甘露糖醇、氧化三甲胺(TMAO)、三乙醇胺盐酸盐(TEA-HCl)、牛磺酸、β-丙氨酸、甜菜碱、四氢甲基嘧啶羧酸(ectoine)、HO-ectoine、γ-氨基丁酸(GABA)以及它们的组合。
如本文所用，术语“TMAO”应理解为意指三甲胺氧化物；如本文所用，术语“TEA-HCl”应理解为意指三乙胺盐酸盐；如本文所用，术语“GABA”应理解为意指γ-氨基丁酸。
如本文所用，术语“张力调节剂”应理解为意指一种溶质，将该溶质加到蛋白质溶液中用来使溶液等渗。除了调节溶液的张力外，该溶质也可具有其他化学或生物学性质。示例性张力调节剂包括盐(例如氯化钠)和某些碳水化合物，包括(但不限于)海藻糖、蔗糖、棉子糖、葡萄糖和甘露糖醇。应注意这些张力调节剂也可视为赋形剂，然而不是所有的赋形剂都可用作张力调节剂。需要加入用以影响张力的一些赋形剂的量会产生其他不可取的效应，因而限制了它们作为张力调节剂的实用性。然而，在非常小的量时，这些其他赋形剂材料提供可用和可取的性质而基本上不会影响溶液的张力。
如本文所用，术语“HPLC”应理解为具有高压液相色谱法的通用含义，也称为高效液相色谱法，并且也包括术语“反相HPLC”或“rp-HPLC”。
自从发现了GDF-5并随后开发出其人体的重组形式以来，一直是将GDF-5溶于10mM HCl溶剂体系中在-80摄氏度下储存，以保护GDF-5的蛋白质结构。GDF-5与大量科学文献所报道的其他BMP(包括BMP-2在内)相比溶解度较差。关于GDF-5溶解性和稳定性的报道很少，如果有的话。GDF-5单体蛋白质的制备和分离以及后续再折叠成二聚体与生物活性二聚体的处理和储存相比提出了一组独立的情形和问题。操作生物相容性制剂中的成熟二聚体GDF-5蛋白，提出了另外一组问题，而文献给出的关于GDF-5二聚体蛋白的溶解度和稳定性的物理化学信息极少。
肌骨骼发育中GDF-5的广谱活性以及GDF-5受体在不同组织中的表达为治疗和处理提供了大量的机会。用GDF-5治疗的一个主要缺陷为该蛋白质的脆弱性。我们已研究了很多不同缓冲体系和赋形剂的用途以便改善GDF-5蛋白溶液在储存、处理和递送期间的稳定性，并且本文描述了有用的制剂用来与该蛋白一起作用。
我们已在以往的研究中表明，可使用高含量的赋形剂(例如60％的海藻糖)延长GDF-5蛋白在体温下受保护的时间。然而，这些制剂不是等渗的，要求在使用前进行稀释。另外，这些溶液很粘稠，可能难以处理。
我们对不同GDF-5溶液进行了数次研究，以检测缓冲液体系和赋形剂是否改进了具有生物等渗性和稳定性(尤其在体温下)的GDF-5蛋白溶液的储存和处理。GDF-5蛋白的稳定性用反相HPLC(本文简称为“HPLC”)来测定，并且主峰的保留百分数用来测定GDF-5蛋白的稳定性或降解情况。我们以往的研究结果已表明，这是测定GDF-5蛋白分子稳定性的可靠方法，GDF-5蛋白的降解易于通过由于氧化、脱酰胺、聚集、裂解和片段化而造成的主峰的降低和外来峰的出现来观察。这些结果也在本发明实验中得到证实。
例如，图11示出了溶于10mM醋酸盐缓冲液(pH 5.0)的0.1mg/mlrhGDF-5在37摄氏度储存32天后的HPLC色谱图，图中显示90％主峰保留以及额外的次峰的出现。与此相反，图12示出了溶于5mM马来酸盐缓冲液(pH 4.5)的0.1mg/ml rhGDF-5(含有10％海藻糖)在37摄氏度储存32天后的降解情况，图中显示仅66％主峰保留以及额外的峰的出现。我们也根据溶液的视觉清晰度对溶液进行了评估，模糊的或浑浊的溶液表明GDF-5蛋白溶解性差和/或出现聚集。
已证实许多化合物可用于其他蛋白制剂，包括醋酸盐、乳酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、磷酸盐和酒石酸盐的缓冲体系，以及其他赋形剂，例如海藻糖、甘露糖醇、蔗糖、棉子糖、三甲胺氧化物、三甲胺盐酸盐、三乙胺盐酸盐、β-丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、牛磺酸、甜菜碱、ectoine、HO-ectoine、L-脯氨酸、天门冬氨酸钾盐、天门冬氨酸钠盐、热休克蛋白、葡聚糖、环状糊精、甘氨酸、精氨酸、PEG、聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物、脂质、磷脂、甘油二酯、维生素E醋酸酯和PEG-维生素E琥珀酸酯。然而，这些与GDF-5一起使用的赋形剂的用途或益处还没有已知的证据或文献报道。
我们的实验设计成等渗溶液，目的是继续维持GDF-5蛋白分子的溶解度和稳定性。浓度为0.1mg/ml的GDF-5蛋白用于所有的实验。结果表明，5mM醋酸盐缓冲液(pH 4.5)可用来保持澄清的液体，并显示GDF-5蛋白在37摄氏度储存32天后，大约90％HPLC主峰保留(稳定性)(参见图1)。
在所研究的实验条件下，其他赋形剂的加入没有增强或减弱GDF-5蛋白的稳定性，但是这些额外的赋形剂可在其他条件下提供其他益处。因此，这些其他赋形剂多达0.2％的加入，或甚至可多达约0.5％，在本研究条件下可对该蛋白质的稳定性几乎没有影响，但是在其他条件下可增强了该蛋白的溶解度或稳定性。将醋酸盐缓冲液的pH增加到5.0，没有减弱GDF-5蛋白的稳定性(参见表2)。因此，5mM醋酸盐缓冲液(pH为约4.2至约5.3)的制剂中加入10％海藻糖来调节张力，并加入以下一种或多种赋形剂：0.1重量％的牛磺酸、甜菜碱、β-丙氨酸、TMAO、GABA、ectoine、HO-ectoine、0.01重量％的TMAO或TEA-HCl、以及它们的各种组合，为GDF-5蛋白在37摄氏度储存32天提供保护(参见表1和2以及图1-8)。
然后，我们测试了类似系列的制剂和赋形剂(pH 5.5)，然而所有这些样品都是浑浊的，表明GDF-5蛋白溶解性差和/或出现聚集(参见表3)。没有对这些样品进行HPLC扫描。
我们也测试了溶于几种5mM甘氨酸盐酸盐缓冲液(pH范围为3.9至5.0)的0.1mg/ml GDF-5蛋白溶液的稳定性。测试含有和不含有用以调节张力的10％海藻糖，以及含有牛磺酸、甜菜碱、β-丙氨酸和TEA-HCl的不同赋形剂组合的该样品。所有这些样品都生成浑浊的溶液(参见表4)，未进一步用HPLC检测。相似地，我们也测试了溶于其他缓冲体系的0.1mg/ml GDF-5蛋白溶液的稳定性，包括含有10％海藻糖的5mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4.4)、含有10％海藻糖的0.25mMHCl溶液(pH 3.5)以及不含有海藻糖的0.25mM HCl溶液(pH 3.5)。所有这些结果也都是浑浊的，表明GDF-5蛋白溶解性差和/或出现聚集，没有对这些样品进行HPLC扫描(参见表4)。因此，令人惊讶地是，较高pH的醋酸盐缓冲体系与其他通常已知的以较低pH用于生物相容性制剂的缓冲液相比，能对GDF-5蛋白分子提供优越的溶解度和保护性，而通常认为较低pH能增强GDF-5的稳定性。
然后我们还测试了溶于10mM醋酸盐缓冲体系(在pH 4.5和pH5.0下，含有选定的赋形剂的组合)中的0.1mg/ml GDF-5蛋白溶液的稳定性。所有这些溶液都是澄清的，并且在37摄氏度储存后的后续测试显示这些制剂为GDF-5蛋白分子提供了保护，这可由在37摄氏度储存32天后大约85％主峰保留所证实(参见表5和表6)。还在10mM醋酸盐缓冲液(pH 5.0)中加入10％蔗糖(而不是海藻糖)作为张力调节剂并加入各种其他赋形剂的条件下进行了测试，在这样的条件下也得到了积极的结果，HPLC测得几乎90％主峰保留(参见表7)。
虽然在所测试的时间、温度、pH和渗透度的研究条件下，所测试的多种赋形剂和赋形剂的组合没有显示优异的结果，但是它们也没有对GDF-5蛋白稳定性造成不利影响。因此，它们可在其他体系、方法或条件，例如在特定的生物组织、器官或细胞类型或在较长的时间段或在其他温度条件下显示有益效果。
本发明的一个目的是提供溶于生物相容缓冲体系的GDF-5蛋白的制剂，该缓冲体系在体温下处理和储存期间提供改进的蛋白稳定性，如至少80％的HPLC主峰保留所证实。本发明的另一个目的是提供GDF-5蛋白的等渗溶液，其在体温下储存和处理期间是稳定的，如至少80％的HPLC主峰保留所证实。本发明的另一个目的是提供GDF-5蛋白的等渗溶液，该等渗溶液含有pH为约4.3至约5.2的醋酸盐缓冲液，还含有选自海藻糖、蔗糖、棉子糖、葡萄糖、甘露糖醇以及它们的组合的10重量％的张力调节剂，其在体温下储存和处理期间是稳定的，如至少80％的HPLC主峰保留所证实。
本发明的另一个目的是通过提供具有生物等渗的醋酸盐缓冲溶剂体系以及约4.2至约5.3的pH来提供保存GDF-5蛋白溶液的方法，其中GDF-5蛋白在体温至达到并包括37摄氏度下处理和储存多达32天是稳定的，如至少80％的HPLC主峰保留所证实。
以下实例实质上仅意在说明本发明，而非限制本发明的范围。本领域技术人员会容易想到也会被认为落入本发明范围内的其他实施例。
实例1
让本体冷冻rhGDF-5蛋白溶液过夜解冻。将储备溶液的一部分用于5mM的醋酸盐缓冲液(pH 4.5)并用10％的海藻糖进行试验，将溶液的张力调为等渗，以及用各种其他的赋形剂来评价GDF-5蛋白的稳定性，这由溶液的透明度和主峰的HPLC分析表征。收集在37摄氏度下储存5天、11天、22天和32天后的数据。在实验中包括只有缓冲液的对照样品以及缓冲液加10％海藻糖的对照样品。结果示于下面的表1中。令人惊讶的是，与其他样品相比，单独的缓冲液提供了几乎相当的GDF-5蛋白保护。进行试验的其他赋形剂都未表现出任何明显的GDF-5蛋白稳定性改善或减弱。图1示出了HPLC主峰％和对照样品(只含pH 4.5的醋酸盐缓冲液)浓度回收％的图表，表明GDF-5蛋白在37摄氏度下5、11、22和32天后大约90％的保留(稳定性)。图2示出了HPLC主峰％和样品(含pH 4.5的醋酸盐缓冲液加10％的海藻糖)浓度回收％的类似图表，也表明了GDF-5蛋白在37摄氏度下32天后大约90％的保留。图3和图4示出了HPLC主峰％和样品(分别含10％海藻糖加0.1％HO-ectoine，或10％海藻糖加0.1％ectoine)浓度回收％的类似图表，也表明了GDF-5蛋白在37摄氏度下32天后大约90％的保留。关于进行试验的赋形剂的各种组合的完整列表以及所得的结果，参见下表1。注意，所有的值都几乎相当，表明pH 4.5的醋酸盐缓冲液能够维持约90％的GDF-5蛋白稳定性，无论是否添加其他赋形剂。
表1.数据表明溶于5mM醋酸盐缓冲液(pH 4.5)，还用10％的海 藻糖和其他赋形剂进行试验的0.1mg/mL rhGDF-5的稳定性。
Figure BPA00001248573900111
Figure BPA00001248573900121
实例2
在该实验中，将rhGDF-5也配制成溶于5mM醋酸盐缓冲液中的约0.1mg/mL的溶液，但是pH为5.0而不是实例1中的4.5。加入10％的海藻糖来调节张力，以及加入如表2中所示的各种其他赋形剂。如表2中所示，这些制剂也能在37摄氏度下稳定32天。图5示出了HPLC主峰％和样品(具有5mM醋酸盐缓冲液(pH 5.0)和10％的海藻糖)浓度回收％的图表，表明GDF-5蛋白在37摄氏度下储存32天后大约90％的保留。图6示出了HPLC主峰％和样品(具有pH 5.0的醋酸盐缓冲液、10％海藻糖和0.1％GABA)浓度回收％的图表，也表明了GDF-5蛋白在37摄氏度下储存32天后大约90％的保留。图7示出了HPLC主峰％和样品(具有pH 5.0的醋酸盐缓冲液、10％的海藻糖、0.1％的牛磺酸和0.01％的TEA-HCl)浓度回收％的图表，也表明了GDF-5蛋白在37摄氏度下储存32天后大约90％的保留。图8示出了HPLC主峰％和样品(具有pH 5.0的醋酸盐缓冲液、10％的海藻糖、0.1％的甜菜碱和0.1％的ectoine)浓度回收％的图表，也表明了GDF-5蛋白在37摄氏度下储存32天后大约90％的保留。
表2.溶于5mM醋酸盐缓冲液(pH 5.0)，还用10％的海藻糖和其 他赋形剂进行试验的0.1mg/mL rhGDF-5的稳定性。
Figure BPA00001248573900131
Figure BPA00001248573900141
实例3
与实例1和2类似，将rhGDF-5配制成溶于5mM醋酸盐缓冲液(pH 5.5)的0.1mg/mL的溶液，含有10％的海藻糖和其他赋形剂，所有这些蛋白溶液都是浑浊的(见表3)。此外，也对5mM的柠檬酸盐缓冲液(pH 4.5)、甘氨酸盐酸盐缓冲液(pH 4.5)和0.25mM的盐酸溶剂进行了评价。观察这些制剂也为浑浊的，结果示于表4中。
表3.溶于5mM醋酸盐缓冲液(pH 5.5)，还含有10％海藻糖和其 他赋形剂的0.1mg/mL rhGDF-5的稳定性。
Figure BPA00001248573900142
Figure BPA00001248573900151
实例4
将rhGDF-5配制成溶于甘氨酸和柠檬酸盐缓冲液(各种pH值)，含有10％海藻糖和其他赋形剂的0.1mg/ml的溶液，所有这些蛋白溶液都是浑浊的(见表4)。
表4.溶于各种缓冲液中，含有10％海藻糖和其他赋形剂的 0.1mg/mL rhGDF-5的稳定性。
Figure BPA00001248573900152
Figure BPA00001248573900161
实例5
与实例1和2相似，将rhGDF-5配制成0.1mg/mL的溶液，但实例5使用10mM的醋酸盐缓冲液(pH 4.5)。向样品中加入10％的海藻糖来调节张力并用各种其他赋形剂进行试验。如表5所示这些制剂在37摄氏度下也可稳定32天。图9示出了HPLC主峰％和样品(具有10mM醋酸盐缓冲液(pH 4.5)和10％的海藻糖)浓度回收％的图表，表明GDF-5蛋白在37摄氏度下储存32天后大约87％的保留。图10示出了HPLC主峰％和样品(具有10mM醋酸盐缓冲液(pH 4.5)、0.01％TEA-HCl和0.1％甜菜碱)浓度回收％的图表，也表明了GDF-5蛋白在37摄氏度下储存32天后大约87％的保留。
表5.溶于10mM醋酸盐缓冲液(pH 4.5)，含有10％海藻糖和其他 赋形剂的0.1mg/mL rhGDF-5的稳定性。
Figure BPA00001248573900162
Figure BPA00001248573900171
实例6
与实例5相似，将rhGDF-5配制成溶于10mM醋酸盐缓冲液中的0.1mg/mL的溶液，但实例6的pH为5.0。向样品中加入10％的海藻糖来调节张力并用各种其他赋形剂进行试验。如表6所示这些制剂在37摄氏度下也可稳定32天。
表6.溶于10mM醋酸盐缓冲液(pH 5.0)，还用10％海藻糖和其他 赋形剂进行试验的0.1mg/mL rhGDF-5的稳定性。
Figure BPA00001248573900172
Figure BPA00001248573900181
实例7
与实例6相似，将rhGDF-5配制成溶于10mM醋酸盐缓冲液(pH5.0)中的0.1mg/mL的溶液。向实例7中的样品加入10％的蔗糖而不是海藻糖来调节张力。所有这些样品都得到了澄清的溶液，并通过HPLC分析表明大约90％的主峰保留(见表7)。
表7.溶于10mM醋酸盐缓冲液(pH 5.0)中含有10％蔗糖和其他赋 形剂的0.1mg/mL rhGDF-5的稳定性。
实例8
与实例2相似，将rhGDF-5制剂制备为较高浓度的0.2mg/mL的rhGDF-5，其溶于5mM或10mM的醋酸钠缓冲液(pH 5)中，含有10％的海藻糖。将该制剂在不同的储存温度(包括37、40和5℃)下进行试验。稳定性结果示于表8中。
表8.溶于5mM或10mM醋酸盐缓冲液中含有10％海藻糖的 0.2mg/mL rhGDF-5在各种储存温度下的稳定性
Figure BPA00001248573900191
所有这些样品都得到了澄清的溶液。如通过HPLC所测，在37℃下储存34天的样品仍具有大约90％的rHGDF-5蛋白保留。40℃下的rHGDF-5蛋白回收率略低，为约85％。对于在5℃下储存至少7个月的样品，未观察到明显的改变。
结果表明配制于醋酸盐缓冲液中含有或不含其他赋形剂的rhGDF-5可在5℃下长时间储存。该制剂可在体温下递送超过一个月。等渗液体rhGDF-5制剂在高温、5℃和37℃下比之前所示的更加稳定。

Claims (14)

1.一种组合物，其包含溶于pH值为约4.2至约5.3的醋酸盐缓冲液中的GDF-5蛋白溶液。
2.根据权利要求1所述的组合物，其还包含选自下列的一种或多种赋形剂：海藻糖、蔗糖、棉子糖、葡萄糖、甘露糖醇、氧化三甲胺(TMAO)、三乙醇胺盐酸盐(TEA-HCl)、牛磺酸、β-丙氨酸、甜菜碱、1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸(ectoine)、HO-ectoine、γ-氨基丁酸(GABA)以及它们的组合。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述溶液为等渗的。
4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述赋形剂为海藻糖。
5.根据权利要求2所述的组合物，其中所述赋形剂为蔗糖。
6.根据权利要求2所述的组合物，其还包含选自下列的赋形剂：TMAO、TEA-HCl、牛磺酸、β-丙氨酸、甜菜碱、ectoine、HO-ectoine、GABA以及它们的组合。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述赋形剂的含量为约0.01重量％至约0.5重量％。
8.一种使GDF-5蛋白溶液稳定化的方法，其包括以下步骤：
a.提供GDF-5蛋白的样品，以及
b.加入pH值为约4.2至约5.3的缓冲醋酸溶液，从而提供稳定化的GDF-5溶液。
9.根据权利要求7所述的方法，其还包括加入选自下列的一种或多种赋形剂的步骤：海藻糖、蔗糖、棉子糖、葡萄糖、甘露糖醇以及它们的组合。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述赋形剂的加入量足以使蛋白溶液为等渗的。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述赋形剂为海藻糖。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述赋形剂为蔗糖。
13.根据权利要求9所述的方法，其还包括加入选自下列的一种或多种赋形剂的步骤：TMAO、TEA-HCl、牛磺酸、β-丙氨酸、甜菜碱、ectoine、HO-ectoine、GABA以及它们的组合。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述赋形剂的含量为约0.01重量％至约0.5重量％。
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