ES2253851T3

ES2253851T3 - Composicion farmaceutica estable de proteinas hedgehog y uso de la misma.

Info

Publication number: ES2253851T3
Application number: ES99115245T
Authority: ES
Inventors: Apollon Papadimitriou
Original assignee: Curis Inc
Current assignee: Curis Inc
Priority date: 1998-08-07
Filing date: 1999-08-02
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2019-08-02
Also published as: HUP9902655A2; DK0978285T3; IL131238A0; MA26667A1; AU4344899A; JP3567103B2; DE69928472D1; US6207718B1; ATE310531T1; NO993804L; AU761341B2; HK1025740A1; EP0978285B1; NO993804D0; JP2000063283A; DE69928472T2; HUP9902655A3; CA2279743C; HU9902655D0; CA2279743A1

Abstract

Una composición de una proteína de hedgehog que contiene como aditivo, iones zinc, iones magentesio, iones calcio, iones sulfato, ciclodextrina, un detergente no iónico y/o un sacárido aniónico que es especialmente estable a temperatura ambiente.

Description

Composición farmacéutica estable de proteínas hedgehog y uso de la misma.

La invención concierne a una composición farmacéutica de proteínas hedgehog y su uso.

Las proteínas hedgehog (hh) se entienden como una familia de proteínas de señal segregadas que son responsables de la formación de numerosas estructuras en embriogénesis (J.C. Smith, Cell 76 (1994) 193-196, N. Perrimon, Cell 80 (1995) 517-520, C. Chiang y col., Nature 83 (1996) 407, M.J. Bitgood y col., Curr. Biol. 6 (1996) 298-304, A. Vortkamp y col., Science 273 (1996) 613, C.J. Lai y col., Development 121 (1995) 2349). Durante su biosíntesis se obtienen un dominio terminal-N de 20 kDa y un dominio terminal-C de 25 kDa después de la división de la secuencia de señal y la división autocatalítica. En su forma natural el dominio terminal-N se modifica con colesterol o palmitoil (J.A. Porter y col., Science 274 (1996) 255-259, Pepinsky y col., J. Biol. Chem. 273 (1998) 14037-14045). En formas de vida superiores la familia hh está compuesta por al menos tres miembros, a saber, sonic, indian y desert hh(shh, ihh, dhh; M. Fietz y col., Development (Suppl.) (1994) 43-51). Se observaron diferencias en la actividad de las proteínas hedgehog que se habían producido de modo recombinante después de la producción en procariotas y eucariotas (M. Hynes y col., Neuron 15 (1995) 35-44 y T. Nakamura y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 237 (1997) 465-469).

Hynes y col. comparan la actividad de hh en el sobrenadante de células (eucarióticas hh) 293 embrionarias humanas de riñón transformadas con las hh producidas a partir de E. Coli y encuentran una actividad cuatro veces más alta de hh de los sobrenadantes de la línea celular de riñón. Se ha descrito que la razón de este aumento de actividad es un factor potencial adicional accesorio que se expresa solamente en células eucarióticas, una modificación post-translacional, un término-N diferente puesto que la hh aislada desde E. Coli contiene 50% de una forma hh que lleva dos aminoácidos terminales-N adicionales (Gli-Ser) o está acortada por 5-6 aminoácidos, o un estado de agregación superior (por ejemplo, por unión a gránulos de agarosa de níquel).

Nakamura y col. comparan la actividad de shh en el sobrenadante de fibroblastos transformados de embriones de pollo con una proteína de fusión shh aislada de E. Coli que todavía tiene una parte de polihistidina terminal-N. La shh en el sobrenadante de los fibroblastos tiene una actividad siete veces más alta que la proteína purificada de E. Coli con respecto a la estimulación de fosfatasa alcalina (AP) en células C3H10T 1/2. Se ha postulado que el aumento de actividad es debido a moléculas tales como por ejemplo proteínas morfogenéticas óseas (BMPs) que sólo están presentes en el sobrenadante de células eucarióticas y provocan la inducción más fuerte de AP.

Pepinsky y col., (J. Biol. Chem. 273 (1998) 14037-14045) han identificado una forma shh que está modificada con ácido palmítico. Esta shh mutante es 30 veces más potente que la fórmula sin modificar en el ensayo C310HT 1/2.

Kinto y col., FEBS Letters, 404 (1997) 319-323 describieron que fibroblastos que segregan hh inducen formación ectópica ósea en una implantación i.m. sobre colágeno. Así, las proteínas hedgehog tienen una actividad osteoinductiva. Las proteínas hedgehog también pueden estimular la formación de células cartilaginosas (Stott y col., 1997).

Es conocido de Yang y col., Development 124 (1997) 4393-4404 que concentraciones locales altas de hedgehog tienen que prevalecer durante un período de al menos 16 h en el sitio de acción en el cuerpo para una actividad en vivo farmacéuticamente eficaz. El sistema de soporte descrito por Yang y col., es decir medio de cromatografía Affigel CM cargado con hedgehog, la agarosa de Ni descrita por Marti y col., en Nature 375 (1995) 322-325 o Affigel azul usado por López Martínez y col., en Curr. Biol. 5 (1995) 791-796 o las partículas de agarosa heparínica que usan ellos son menos adecuados para una aplicación farmacéutica puesto que son inmunogénicos y pueden provocar reacciones inflamatorias.

El documento EP 0 947 201 enseña proteínas hedgehog acomplejadas para matrices hidrófilas. La solicitud describe un listado de posibles matrices, y algunas de estas matrices contienen sulfato. Un ejemplo de una matriz que contiene sulfato que se enseña en la solicitud es sulfato de condroitina. Sin embargo, la solicitud no enseña ni sugiere el uso de iones de cinc e iones de sulfato como un aditivo a la propia composición hedgehog. Las enseñanzas de la solicitud se referían, más bien, a la pertenencia del sulfato a la composición de una matriz de soporte.

Los documentos EP 0 953 575 y EP 0 953 576 no enseñan el uso de iones de cinc e iones de sulfato como un aditivo. La única referencia a sulfato en estas solicitudes concierne al uso de sulfato sódico como un reactivo que se usa cuando se secan de modo hidrófobo conjugados hedgehog modificados.

El objeto de la invención es proporcionar una composición farmacéutica estable, preferiblemente acuosa de una proteína hedgehog.

El objeto se consigue por medio de una composición farmacéutica de una proteína hedgehog que contiene una proteína hedgehog en una cantidad farmacéuticamente eficaz y, como un aditivo, iones cinc e iones sulfato, cada uno a concentraciones de 0,01-100 mmol/l.

Sorprendentemente se ha obtenido el resultado de que iones cinc, e iones sulfato, y opcionalmente aditivos adicionales que se seleccionan del grupo de iones magnesio, ciclodrextrina, detergentes no iónicos, sacáridos aniónicos tales como sulfato de condroitina o heparina, pueden estabilizar proteínas hedgehog (como una composición farmacéutica o en otra forma), preferiblemente en solución acuosa. Como resultado, se puede mantener la actividad de la proteína hedgehog durante un prolongado período por ejemplo a temperatura ambiente y las composiciones de proteínas hedgehog pueden ser almacenadas durante un prolongado período a temperatura ambiente. Los aditivos según la invención también son adecuados para estabilizar liofilizados hedgehog (preferiblemente como un granel o una composición farmacéutica) y también estabilizan las proteínas hedgehog durante la producción de preparaciones de hedgehog tales como implantes, micropartículas, geles, etc. y a mayores temperaturas (por ejemplo 37ºC).

En la solución acuosa de la proteína hedgehog según la invención, el aditivo está en un exceso molar relativo a las proteínas hedgehog. Este exceso es preferiblemente 1-1000 veces y en particular preferiblemente 1-100 veces. La solución acuosa según la invención es especialmente adecuada para producir combinaciones de proteínas hedgehog con sustancias de soporte.

Por lo tanto, un asunto objetivo adicional de la invención es una solución acuosa de una proteína hedgehog que se caracteriza porque contiene un exceso molar de aditivo según la invención con relación a la proteína hedgehog. Preferiblemente, esta solución se tampona y/o liofiliza.

La cantidad de aditivos según la invención se puede variar en un amplio intervalo. Las cantidades adecuadas dependen de la compatibilidad farmacéutica del aditivo y de la magnitud de la acción estabilizante a una concentración farmacéuticamente aceptable. Los iones cinc se añaden a una concentración de 0,01-100 mmol/l. Esta concentración tiene un significativo efecto estabilizante sobre las proteínas hedgehog. Los iones cinc se añaden preferiblemente a dosis farmacéuticamente compatibles.

Preferiblemente, puede estar presente ciclodextrina según la invención como sulfato de ciclodextrina. Las concentraciones están preferiblemente entre 1 y 20% en peso. Heparina de bajo peso molecular (alrededor de 3 kDa) se usa preferiblemente como polisacárido aniónico. La concentración es preferiblemente 0,5-50 mg/ml para heparina de bajo peso molecular y las correspondientes cantidades molares se usan para heparina de alto peso molecular. Los iones sulfato se añaden preferiblemente como sulfato de cinc. La concentración de ión sulfato es 0,01-100 mmol/l. Los iones calcio y magnesio se usan preferiblemente a una concentración de 0,01-100 mmol/l. Los detergentes no iónicos son preferiblemente polioxisorbatos (por ejemplo Tween®20, Tween® 80), preferiblemente a una concentración de 0,01 a 0,1% (peso/volumen).

La proteína hedgehog se presenta preferiblemente sobre un soporte biocompatible en cuyo caso el soporte se une a la proteína hedgehog en su estructura activa, plegada y puede liberar localmente proteína hedgehog en vivo en su forma activa y de una manera retardada. Formulaciones de este tipo son particularmente adecuadas para la reparación de defectos en huesos y cartílagos, aunque también se pueden usar para reparar defectos neuronales o para una liberación sistémica.

En una realización preferida, la composición, y preferiblemente la composición farmacéutica contiene la proteína hedgehog unida a un soporte hidrófilo que es biocompatible y se puede usar por ejemplo como un implante. El soporte es preferiblemente un polímero que

-: se une a la proteína hedgehog como un soporte cargado negativamente como resultado de interacciones iónicas,

-: la proteína hedgehog no se desnaturaliza cuando se une al soporte,

-: el soporte contiene al menos 0,1 a 1, preferiblemente 0,1 a 2 restos cargados negativamente por monómero bajo condiciones neutras,

-: la carga es intermediada en forma de grupos ácidos tales como grupos sulfato, carboxilo o fosfato,

-: y el peso molecular medio del soporte es al menos 50.000 Da.

Se ha obtenido el resultado de que las proteínas hedgehog se pueden liberar reversiblemente y activamente en vivo desde un soporte de una manera retardada cuando se unen a una matriz de polímero cargada negativamente, soluble o insoluble.

Un efecto farmacéutico se entiende preferiblemente como un efecto neurológico sobre células nerviosas, una condrogénesis y/o una condroinducción y preferiblemente osteogénesis y/u osteoinducción como se describe en Kinto y col., FEBS Letters, 404 (1997) 319-323 para inducción ósea, por Miao y col. en Neurosci. 17 (1997) 5891-5899 para el efecto sobre células nerviosas y por Stott y col., en J. Cell Sci. 110 (1997) 2691-2701 para inducción de células cartilaginosas.

Se requieren soluciones de proteínas hedgehog a concentraciones altas para producir matrices de soporte que estén revestidas con proteínas hedgehog de tal manera que exhiban una eficacia farmacéutica adecuada cuando se apliquen localmente. Se ha obtenido el resultado de que unos soportes farmacéuticos adecuados revestidos con proteína hedgehog deberían contener preferiblemente una concentración de proteína hedgehog de 0,1-10 mg/ml de soporte y más. Son preferiblemente ventajosos los soportes que contienen proteínas hedgehog a una concentración de 0,1-10 mg/ml de soporte o más. Las proteínas hedgehog son inherentemente poco solubles. Sin embargo, se ha obtenido sorprendentemente el resultado de que la solubilidad de las proteínas hedgehog aumenta considerablemente, las proteínas hedgehog están protegidas de la oxidación y la estabilidad de las proteínas hedgehog mejora a concentraciones bajas (1 mg/ml o menor) en soluciones que contienen arginina o iones arginium (preferiblemente sulfato de arginium). Por lo tanto, un asunto objetivo adicional de la invención son las soluciones acuosas de proteínas hedgehog según la invención a una concentración de 1 mg/ml y más, que contienen arginina o iones arginium y que están preferiblemente tamponadas. Un asunto objetivo adicional de la invención es un procedimiento para la producción de una matriz de soporte revestida con proteína hedgehog que se caracteriza porque se incuba la matriz de soporte con una solución de proteína hedgehog según la invención a una concentración de 0,1-10 mg/ml de proteína hedgehog que contiene los aditivos según la invención y arginina o iones arginium, preferiblemente como sulfato de arginium, y se aisla la matriz de soporte revestida de esta manera.

Soluciones de este tipo son adecuadas para producir matrices de soporte que contienen proteínas hedgehog en concentraciones farmacéuticamente eficaces y son adecuadas para aplicaciones farmacéuticas. La concentración de arginina o iones arginium o sulfato de arginium está preferiblemente entre 10 y 700 mmol/l, lo más preferiblemente entre 10 y 500 mmol/l, preferiblemente en el intervalo de pH entre 5 y 8, lo más preferiblemente en el intervalo de pH entre 6 y 8.

Actividad dentro del sentido de la invención se entiende como la actividad de fosfatasa alcalina (estimulación de la expresión de fosfatasa alcalina) que el polipéptido puede inducir en células de mamífero (actividad en el ensayo de fosfatasa alcalina). En este método se cultiva una línea celular fibroblástica de ratón en un medio que contiene suero fetal de ternera. Posteriormente, se añade la muestra estéril filtrada, las células se fraccionan después de unos 5 días y se determina la fosfatasa alcalina en el lisado celular por medio de la escisión de un substrato cromogénico (pNP, p-nitrofenol) (Asahina, Exp. Cell. Res. 222 (1996) 38-47 y T. Nakamura (1997)).

Una proteína hedgehog se entiende por la invención como una proteína señal que es responsable de la formación de numerosas estructuras en embriogénesis. Preferiblemente, se usan en particular hh sonic, indian o desert (Fietz, M. y col., Development (Suppl.) (1994) 43-51. Preferiblemente se usa la forma procesada (dominio señal maduro terminal-N) de la proteína hh sonic (secuencia: banco de datos EMBL, Nº L38518). Las proteínas de la familia hedgehog exhiben una homología pronunciada en su secuencia de aminoácidos, razón por la que es preferible también expresar los ácidos nucleicos que codifican para las proteínas hedgehog que son 80% o más homólogos para la secuencia anteriormente mencionada de proteína hedgehog sonic. Preferiblemente se usan los derivados hedgehog que se describen por ejemplo en la solicitud de patente europea Nº EP 0953575.

La proteína humana precursora de hedgehog sonic está compuesta de los aminoácidos 1-462 de la secuencia descrita en el banco de datos EMBL bajo el Nº L38518. Los aminoácidos 1-23 representan el péptido señal, los aminoácidos 24-197 representan el dominio señal maduro, los aminoácidos 32-197 representan el dominio señal acortado por ocho aminoácidos y los aminoácidos 198-462 representan el dominio terminal-C autoprocesado después de la escisión autoproteolítica.

La composición según la invención contiene una dosis farmacológicamente eficaz de proteína hh y se puede administrar localmente o sistémicamente. Es preferible usar las proteínas según la invención en combinación con otras proteínas de la familia hedgehog o factores de crecimiento óseo tales como proteínas morfogenéticas óseas (BMPs) (Wozney y col., Cell. Mol. Biol. of Bone, Bone Morphogenetic Proteins and Their Gene Expression (1993) Academic Press Inc., 131-167) u hormonas paratiroideas (Karablis y col., Genes and Development 8 (1994) 277-289) o factores de crecimiento tipo insulina (IGF-I o II) o familia del factor transformador de crecimiento (TGF-\beta, GDFs).

La composición según la invención contiene preferiblemente un polímero que actúa esencialmente como la sustancia estructural que preferiblemente también tiene una función de adhesión para las células. El colágeno es por ejemplo una sustancia estructural de este tipo. En este caso es preferible que la sustancia estructural esté presente a una concentración más baja que el soporte hidrófilo biocompatible que se ha descrito para la invención.

Además es preferible para la producción de la composición añadir sustancias auxiliares tales como azúcares (manitol, sacarosa, lactosa, glucosa, trehalosa, preferiblemente 20-100 mg/ml) o aminoácidos tales como glicina o arginina, metionina, cisteína, así como antioxidantes tales como citrato, tioglicerol, acetilcisteína, polietilenglicol (1-10% en peso), detergentes, preferiblemente detergentes no iónicos (preferiblemente 0,01-0,1% en peso) tales como polisorbatos (Tween®20 o Tween®80) o polioxietilenos, agentes antiinflamatorios, anestésicos locales, antibióticos y/o estabilizantes tales como lípidos, ácidos grasos y glicerol.

En una realización preferida adicional, se prefiere una composición de proteína hedgehog según la invención que contiene suramina y se puede usar ventajosamente.

La composición puede contener sustancias farmacéuticas auxiliares adicionales.

En una realización preferida, la composición contiene proteína hedgehog a una concentración de 0,1-100 mg/ml.

En una realización preferida, la composición contiene adicionalmente un tampón farmacéuticamente aceptable que es biocompatible, preferiblemente en el intervalo entre pH 3 y pH 10, preferiblemente en particular en el intervalo entre pH 5 y 8. Sorprendentemente, se ha obtenido el resultado de que los aditivos según la invención también pueden estabilizar eficazmente las proteínas hedgehog en el intervalo ácido. El valor de pH de la composición debería ser ventajosamente mayor que pH 4 con el fin de prevenir la desnaturalización y desprendimiento del cinc acomplejado en la proteína hedgehog. La concentración del tampón es preferiblemente 1-500 mmol/l, en particular 5-150 mmol/l y particularmente preferiblemente 10-100 mmol/l. En las realizaciones más preferidas se usa 300 mmol/l de tampón de fosfato potásico, pH 6 ó 10 mmol/l de fosfato potásico, 500 mmol/l de cloruro de arginina, pH 6.

Los siguientes ejemplos y publicaciones explican adicionalmente la invención, de la que el alcance protector se deriva de las reivindicaciones de patente. Los procedimientos que se describen han de entenderse como ejemplos que describen aún más el asunto objetivo de la invención incluso después de modificaciones.

Ejemplo 1 Análisis DSC (Calorimetría diferencial de barrido) de diversas formulaciones hedgehog

Se analizaron soluciones de proteína hedgehog con una concentración de proteína de alrededor de 0,5 mg/ml en diversos tampones (50 mM HEPES-NaOH, pH 7,2 y 150 mM de arginina-Cl, pH 7,4) con y sin estabilizantes por medio de DSC (Calorímetro Nano Diferencial de Barrido, Calorimetry Sciences Corporation, UTA, EE.UU.) a una velocidad de calentamiento de 2ºK/min. Se usaron los siguientes estabilizantes:

-: acetato de cinc (Merck)

-: sulfato de cinc (Merck)

-: heparina (peso molecular bajo, Sigma)

-: \beta-ciclodextrina sulfatada (Aldrich)

-: sulfato de arginina.

Las temperaturas de transición (T_{t}) determinadas para las formulaciones respectivas se resumen en la tabla. A partir de los datos que se muestran, se puede ver que la adición de las sustancias mencionadas en el texto aumenta la temperatura de transición y aumenta así la estabilidad de la proteína hedgehog. Los valores de temperatura medidos no se deberían entender como valores absolutos sino que más bien representan diferencias en la estabilidad de las formulaciones individuales en relación de unas con otras.

Temperaturas de transición para proteínas hedgehog en diversas formulaciones:

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Formulaciones	T_{t} [ºC]
Hepes-NaOH 50 mM, pH 7,2	52,0
Hepes-NaOH 50 mM, acetato de cinc 1 mM, pH 7,2	56,8
Hepes-NaOH 50 mM, sulfato de cinc 1 mM, pH 7,2	60,6
Cloruro de arginina 150 mM, pH 7,4	53,5
Cloruro de arginina 150 mM, \beta-ciclodextrina sulfatada 5% (peso/volumen), pH 7,4	55,6
Cloruro de arginina 150 mM, heparina 20 mg/ml, pH 7,4	57,8
Sulfato de arginina 150 mM, pH 6,0	63,4

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Estabilidad de hedgehog sonic a 37ºC

Se incuba proteína hedgehog sonic humana en diversas formulaciones a 37ºC. Se tomaron muestras a los tiempos indicados y se analizaron por medio de HPLC rp.

\newpage

Formulación A

PBS (10 mmol/l de fosfato potásico, 150 mmol/l de cloruro sódico, pH 7,4).

\vskip1.000000\baselineskip

Tiempo [h]	Recuperación [%]	shh oxidada [%]	shh nativa[%]
0	100	-	78
1	104	-	44
5	173	-	68
24	134	71	29
48	140	76	24
72	142	84	16
96	39	79	21
168	31	79	21

\vskip1.000000\baselineskip

Formulación B

Arginina-Cl 150 mM, 0,01% de Tween 80, pH 6,0).

\vskip1.000000\baselineskip

Tiempo [h]	Recuperación [%]	shh oxidada [%]	shh nativa[%]
0	100	-	79
1	100	-	75
5	93	-	81
24	108	40	60
48	139	45	55
72	144	58	42
96	124	76	24
168	118	86	14

\vskip1.000000\baselineskip

Es claro que hshh en la formulación B es más estable que en la formulación A. La oxidación de shh es considerablemente más lenta en la formulación que contiene arginina y la recuperación es más alta puesto que se previene la agregación de hshh inducida por la temperatura.

Ejemplo 3 Estabilidad de shh modificada hidrófobamente a 37ºC

Se incuba proteína hedgehog sonic humana modificada hidrófobamente en diversas formulaciones a 37ºC. Se tomaron muestras en diversos momentos y se analizaron por medio de HPLC rp.

\newpage

Formulación A

PBS (10 mmol/l de fosfato potásico, 150 mmol/l de cloruro sódico, pH 7,4).

Tiempo [h]	Recuperación [%]	shh nativa[%]
0	100	91
1	81	80
5	-	84
24	74	70
48	25	47
72	31	40
96	4	0
168	4	0

Formulación B

Arginina-Cl 150 mM, 0,01% de Tween 80, pH 6,0).

Tiempo [h]	Recuperación [%]	shh nativa[%]
0	100	89
1	114	89
5	107	89
24	-	84
48	132	85
72	129	78
96	111	73
168	88	66

Es claro que hshh es más estable en la formulación B que en la formulación A. La recuperación es más alta puesto que se previene la agregación de hshh inducida por la temperatura.

Listado de Referencias

Asahina, J., Exp. Cell. Res. 222 (1996) 38-47

Bitgood, M.J. y col., Curr. Biol. 6 (1996) 298-304

Chiang, C. y col., Nature 83 (1996) 407

Solicitud de Patente Europea nº 98102095.1

Solicitud de Patente Europea nº 98107911.4

Fietz, M. y col., Development (Suppl)(1994) 43-51

Hynes, M. y col., Neuron 15 (1995) 35-44

Karablis y col., Genes and Development 8 (1994) 277-289

Kinto y col., FEBS Letters, 404 (1997) 319-323

Lai, C.J. y col., Development 121 (1995) 2349

López-Martínez y col. en Curr. Biol. 5 (1995) 791-796

Marti y col., Nature 375 (1995) 322-325

Miao y col., J. Neurosci. 17 (1997) 5891-5899

Nakamura, T. y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 237 (1997) 465-469

Pepinski y col., J.Biol.Chem. 273 (1998) 14037-14045

Perrimon, N., Cell 80 (1995) 517-520

Porter, J.A. y col., Science 274 (1996) 255-259

Smith, J.C., Cell 76 (1994) 193-196

Stott y col., J. Cell Sci. 110 (1997) 2691-2701

Wortkamp, A. y col., Science 273 (1996) 613

Wozney y col., Cell. Mol. Biol. of Bone, Bone Morphogenetic Proteins and their Gene Expression, (1993) Academic Press Inc. 131-167

Yang y col., Development 124 (1997) 4393-4404.

Claims

1. Una composición farmacéutica de una proteína hedgehog que contiene una proteína hedgehog en una cantidad farmacéuticamente eficaz y, como un aditivo, iones cinc e iones sulfato, cada uno a una concentración de 0,01-100 mmol/l.

2. La composición farmacéutica según se describe en la reivindicación 1, en la que dicha composición contiene además un aditivo que se selecciona de arginina o iones arginium, y en la que dicha composición contiene arginina o iones arginium a una concentración de 10-700 mmol/l.

3. Una composición farmacéutica según se describe en la reivindicación 1, en la que dicha composición contiene además un aditivo que se selecciona de ciclodextrina, y en la que dicha composición contiene ciclodextrina a una concentración de 1-20% en peso.

4. Una composición farmacéutica según se describe en la reivindicación 1, en la que dicha composición contiene además un aditivo que se selecciona de un detergente no iónico, y en la que dicha composición contiene un detergente no iónico a una concentración de 0,01-0,1% (peso/volumen).

5. Una composición farmacéutica según se describe en la reivindicación 1, en la que dicha composición contiene además un aditivo que se selecciona de un sacárido aniónico, y en la que dicha composición contiene un sacárido aniónico a una concentración de 0,5-50 mg/ml.

6. La composición farmacéutica según se describe en la reivindicación 1, en la que dicha composición contiene sulfato de cinc.

7. La composición farmacéutica según se describe en la reivindicación 2, en la que dicha composición contiene sulfato de arginium.

8. La composición farmacéutica según se describe en las reivindicaciones 1 a 7, en la que la proteína hedgehog está unida a un soporte biocompatible.

9. La composición farmacéutica según se describe en la reivindicación 8, en la que el soporte biocompatible es un soporte hidrófilo, y dicho soporte hidrófilo es un polímero.

10. La composición farmacéutica según se describe en las reivindicaciones 1 a 9, en la que la composición farmacéutica contiene una proteína hedgehog a una concentración de 0,1-100 mg/ml.

11. La composición farmacéutica según se describe en las reivindicaciones 1 a 10, en la que la composición está tamponada en un intervalo entre pH 3 y 10.

12. Procedimiento para la producción de una composición farmacéutica que contiene como componentes esenciales una proteína hedgehog y un aditivo, en el que dicha composición contiene una proteína hedgehog en una cantidad farmacéuticamente eficaz y, como un aditivo, iones cinc e iones sulfato, en el que dicha composición contiene dicho aditivo, cada uno a una concentración de 0,01-100 mmol/l.

13. Procedimiento para la producción de una composición farmacéutica según se describe en la reivindicación 12, en el que dicha composición contiene además un aditivo que se selecciona de arginina o iones arginium, y en el que dicha composición contiene arginina o iones arginium a una concentración de 10-700 mmol/l.

14. Procedimiento para la producción de una composición farmacéutica según se describe en la reivindicación 12, en el que dicha composición contiene además un aditivo que se selecciona de ciclodextrina, y en el que dicha composición contiene ciclodextrina a una concentración de 1-20% en peso.

15. Procedimiento para la producción de una composición farmacéutica según se describe en la reivindicación 12, en el que dicha composición contiene además un aditivo que se selecciona de un detergente no iónico, y en el que dicha composición contiene un detergente no iónico a una concentración de 0,01-0,1% (peso/volumen).

16. Procedimiento para la producción de una composición farmacéutica según se describe en la reivindicación 12, en el que dicha composición contiene además un aditivo que se selecciona de un sacárido aniónico, y en el que dicha composición contiene un sacárido aniónico a una concentración de 0,5-50 mg/ml.

17. Procedimiento según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 12-16, en el que se usa una proteína hedgehog a una concentración de 0,1-100 mg/ml.

18. Uso de una proteína hedgehog para la preparación de una composición farmacéuticamente aceptable según se describe en las reivindicaciones 1 a 11 para la liberación retardada de la proteína hedgehog en el cuerpo humano, y en el que la proteína hedgehog está diseñada para ser administrada localmente en el cuerpo humano.

19. Uso según se describe en la reivindicación 18, en el que la composición contiene dicha proteína hedgehog a una concentración de 0,1-100 mg/ml.

20. Composición acuosa de una proteína hedgehog según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

21. Liofilizado de una composición según se describe en las reivindicaciones 1 a 11 o de una composición acuosa según se describe en la reivindicación 20.