CZ308799A3 - Ve vodě rozpustný farmaceutický preparát v iontovém komplexu a jeho použití - Google Patents

Abstract

Ve vodě rozpustný preparát obsahující komplex iontového farmaceuticky účinného polypeptidu vybraného ze skupiny složené z hedgehog proteinů, kostních morfogenetických proteinů, růstových fektorů, erytropoetinu, trombopoetinu, GCSF, interleukinů a interferonů. Tento preparátje navíc charakterizován přítomností amfifilní sloučeniny. Polypeptida amfifilní sloučenina tvoří iontový komplex, který nezvyšuje rozpustnost polypeptidu, a kterýje vhodný ke zvýšení aktivity polypeptidu a/nebo k pozvolnému uvolňováni polypeptidu.

Description

Ve vodě rozpustný farmaceutický preparát v iontovém komplexu a jeho použití

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká preparátu obsahujícího polypeptid, který je biologicky účinný v důsledku interakce s extracelulárním receptorem na buněčné membráně. Řečený polypeptid je přítomen v řečeném preparátu v iontovém komplexu s amfifilní sloučeninou. Vynález se dále týká použití řečeného preparátu.

Dosavadní stav techniky

Použití amfifilních sloučenin jako systému pro dopravení léků je v medicíně dobře známo (srovnej s US Patents US-P 5,650,393; US-P 5,688,761; US-P 5,665,328; US-P 5,124,081; US-P 5,109,038). Tvorba komplexů ve formě micel mezi povrchově aktivními substancemi a farmaceutickými látkami je také známa, například pro zlepšení transdermálního a transmembránového průniku aktivních léků (Tomlinson a Davis, J. Colloid. Interf., Sci. 74 (1980) 349) . Je také známo, že farmaceutické látky obvykle lépe přestupují přes biologické membrány v neionizované formě než v ionizovaném stavu. (Cools a Jansen, J. Pharm. Pharmacol. 35 (1983) 689-691). Dále je známo, že peptidy, které jsou přítomny v mnohonásobné ionizované formě za fyziologického pH, nejsou nejvýhodnější pro transport do místa účinku (dopravení léku), protože nabité molekuly a obzvláště polypeptidy jsou málo rozpustné v lipidech (Hirai et al., Int. J. Pharm. 7 (1991) 317-325). Dále je také známo z práce autorů Okada et al., J. Pharm. Sci 72 (1993) 75-78, že je výhodné navázat lipofilní proti-iont k iontové části látky a tímto zlepšit interakci s biologickými membránami, což vede k usnadnění transportu bílkovin přes intestinální membrány.

• · • · A · · · • · A · · A ••A A A·· · · ·

A A A A A · « · ·

Například Hazzenga a Berner popsali v časopise J. Controlled Release 16 (1991) 77-88 vylepšenou metodu transdermálního transportu aktivní látky ve formě obojetného iontu.

Další metody ke zlepšení interakce látek s biologickými membránami popsali například Lee et al., Critical Rev. Therp. Drug Carrier Systems 8 (1991) 91-192, Morimoto et al., Arch. Int. Pharmacodyn. 302 (1989) 18-26, a Aungst, Int. J. Pharm. 33 (1986) 225-234. U všech těchto metod však bylo cílem zvýšit hydrofobicitu aktivní látky za účelem usnadnění jejího průniku přes biologické membrány, jako je například kůže, a dopravení této látky do buňky. K tomuto účelu jsou používány povrchově aktivní látky v koncentracích vyšších než je kritická micelární koncentrace (CMC, Womack et al., Biochim. Biophys. Acta 733 (1983) 210). Nevýhodou těchto metod je fakt, že používané vysoké koncentrace povrchově aktivních látek mají výrazný vliv na buněčnou membránu a mohou ji poškodit.

Je známo z WO 94/08599, že pro vytvoření aktivní látky navázané na nosič může být použit homogenní roztok aktivní látky s následným přidáním přiměřeného množství aniontového detergentu. Vytvořený precipitát se izoluje a poté opět rozpouští v organickém rozpouštědle. Homogenní roztok, který obsahuje komplex aniontového detergentu a aktivní látky může být poté použit k vložení nebo rozptýlení aktivní látky do pevné matrice. Navíc je ve WO 94/08599 zmíněno, že může být vytvořen komplex bílkoviny s aniontovým detergentem a z něj může být aktivní látka kontrolované uvolněna.

Je známo, že aktivita bílkovin se může zlepšit kovalentní vazbou s hydrofobními sloučeninami, jako jsou mastné kyseliny nebo steroidy. Tyto metody jsou však komplikované a vedou k tvorbě nehomogenních produktů v důsledku chemické kopulační reakce (srovnej s např. Ekrami, H.M. et al., FEBS Letters 371 (1995) 283-286, Pepinski, R.B. et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 14037-14045).

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je příprava preparátů s farmaceuticky účinnými polypeptidy, kteréžto preparáty zvyšují aktivitu těchto polypeptidů.

Předmět vynálezu je docílen pomocí preparátu, nejlépe farmaceutického preparátu, obsahujícího farmaceuticky účinný polypeptid vybraný ze skupiny složené z hedgehog proteinů, kostních morfogenetických proteinů, růstových faktorů, erytropoetinu, trombopoetinu, G-CSF, interleukinů a interferonů. Tento preparát je navíc charakterizován přítomností amfifilní sloučeniny, s kterou řečený polypeptid tvoří iontový komplex. Tvorbou tohoto komplexu se nezvyšuje rozpustnost řečeného polypeptidů. Preparát neobsahuje žádné organické rozpouštědlo. Preparát může pro účely skladování lyofilizován.

V předkládaném vynálezu jsou polypeptid i amfifilní sloučenina v použitých koncentracích jednotlivě rozpustné ve vodných roztocích, zejména pak v pufrech. Hydrofobizace polypeptidů a tím i zhoršení, nebo alespoň nezlepšení rozpustnosti ve vodě, je dáno kombinací použitých látek, která má za následek tvorbu komplexu prostřednictvím iontových interakcí. Překvapivě se ukázalo, že v této formě se aktivita polypeptidů významně zvýšila.

Podle předkládaného vynálezu jsou množství a poměr mezi amfifilní látkou a polypeptidem zvoleny takovým způsobem, že vodný preparát obsahující iontový komplex je čirý roztok. Pokud vytváření komplexu mezi polypeptidem a amfifilní sloučeninou vede k zakalení roztoku, měl by být roztok určený k přímému podání pacientovi nejprve zfiltrován k odstranění zákalu. Pokud • · má být preparát před podáním pacientovi imobilizován na nosiči, není třeba zákal odstraňovat.

Popis vynálezu

Farmaceuticky účinný polypeptid je polypeptid, který může být přítomen v iontové formě, a který je rozpoznán a navázán receptorem na buněčný povrch (extracelulární receptor) k dosažení své biologické aktivity. Mezi takové polypeptidy patří růstové faktory (např. NGF, TGF-β, FGF, GDF, insulin-like growth factors - inzulínu podobné růstové faktory), erytropoetin, trombopoetin, G-CSF, interferony, jako například Interferon-a2b, interleukiny, jako například Interleukin-2 nebo Interleukin-12, kostní morfogenetické proteiny, jako například BMP-2, nebo hedgehog proteiny, jako jsou sonic, indián, nebo desert hedgehog proteiny. Preferuje se zejména použití hedgehog proteinů. Obzvláště jsou používány polypeptidy, u kterých se zvyšuje aktivita (terapeutický efekt a/nebo aktivita proteinu in vitro) v komplexu definovaném předkládaným vynálezem 10 a vícekrát ve srovnání s formou polypeptidu, který není vázán v komplexu. Iontová forma polypeptidu může být získána jeho přítomností v prostředí, které se liší alespoň o 0,5 jednotky pH od jeho disociační konstanty (pK).

Za amfifilní sloučeniny jsou v předkládaném vynálezu považovány hydrofobní surfaktanty aniontové, kationtové nebo obojetné povahy, mastné kyseliny, alkyl sulfonát, nebo lipidy. Mezi preferované aniontové surfaktanty patří aniontové detergenty zahrnující steroidní tenzidy jako deoxycholát, cholát, taurocholát, taurodeoxycholát, dehydrocholát (užitečný pro kationtové polypeptidy); mezi preferované surfaktanty obojetné povahy patří CHAPS (3[-cholamidopropyl)dimetylamono]-1-propan sulfonát) a Zwittergent® (N-dodecyl-A,A-dimetyl-3-amono-l-

·♦ ♦ · ·· ·· ···· ···· • b b · · · · • · · · · · · · · 9 • · · · · · ···· bb ·· ·· propan sulfonát); a mezi preferované kationtové detergenty patří cetyltrometylamonium bromid nebo dodecylamonium chlorid (užitečný pro aniontové polypeptidy); mezi preferované mastné kyseliny patří kyselina palmitová (užitečná pro kationtové polypeptidy); a mezi preferované lipidy patří lipidy jako například fosfatidyl serin (užitečný pro aniontové polypeptidy) a fosfatidát (užitečný pro kationtové polypeptidy).

Amfifilní sloučenina je přidávána k preparátu za podmínek, které hydrofobizuji a tedy snižují, nebo alespoň nezvyšují, rozpustnost polypeptidu ve vodě. Je důležité, že podle předkládaného vynálezu je vytvářen ve vodě rozpustný iontový komplex mezi polypeptidem a amfifilní sloučeninou. Poměr polypeptidu k amfifilní sloučenině v komplexu závisí na použitém pH a hodnotách pK obou látek, a na koncentračním poměru. Nejlépe je použít pH, které se liší alespoň o polovinu jednotky pH od hodnot pK polypeptidu a pomocné substance. Čím více amfifilní sloučeniny je přidáno, tím více se tato amfifilní sloučenina váže k polypeptidu a tím více se stává komplex hydrofobním. To může vést k precipitaci komplexu a tudíž k přítomnosti směsi rozpustných a nerozpustných komplexů, které již nejsou ve vodě zcela rozpustné. Přidání neiontového detergentu jako například polyoxameru Tween® však může alespoň částečně obnovit rozpustnost komplexu ve vodě, nebo může být preparát v případě nutnosti zfiltrován. V tomto případě může být neiontový detergent přítomen také v koncentracích, které vedou k tvorbě micel. Musí být poznamenáno, že typ a koncentrace amfifilní sloučeniny jsou zvoleny, zejména pro proteiny ve formě polypeptidů, takovým způsobem, aby molekulová struktura polypeptidu zůstala ve své přirozené aktivní formě a tudíž nedošlo ke snížení aktivity polypeptidu. Desetinásobný molární nadbytek amfifilní sloučeniny je obvykle pro tento účel dostačující. Je preferováno přidat 0,001 až 0,05% (w/v) amfifilní sloučeniny k 5 μς proteinu na ml.

9 9 • · 9 • 9 ·

Pokud je použit podle předkládaného vynálezu denaturační surfaktant, jako například sodium dodecyl sulfát (SDS), může být použit pouze v nízkých koncentracích. Je známo, že SDS ve vysokých koncentracích denaturuje bílkoviny, čímž zvyšuje jejich rozpustnost ve vodě, ovšem v denaturované neaktivní formě. Amfifilní sloučeniny jako je SDS mohou ve vyšších koncentracích také tvořit micely spolu s komplexy popsanými v předkládaném vynálezu. Tyto micely zvyšují rozpustnost polypeptidu. Přítomnost nežádoucí denaturace polypeptidu amfifilní sloučeninou může být snadno určena pomocí známých metod. Mezi takové metody patří například určení aktivity, nebo fyzikálně-chemické metody k určení struktury, jako jsou IR, CD a fluorescenční spektroskopie.

Za vodný, ve vodě rozpustný farmaceutický preparát ve smyslu předkládaného vynálezu by měl být považován takový preparát, který skutečně neobsahuje žádné nerozpustné částice s farmaceuticky aktivním polypeptidem. Za takový vodný farmaceutický preparát by měl být považován preparát, který není viditelně zakalen. Takto rozpustné preparáty je možné připravit, když je iontový komplex definovaný předkládaným vynálezem zcela rozpustný ve vodě při použitých koncentracích polypeptidu a surfaktantu, nebo když je nerozpuštěný komplex odstraněn filtrací. Podle předkládaného vynálezu neobsahuje vodný preparát navíc žádná organická rozpouštědla. Při výrobě preparátů může být navíc nezbytné rozpouštět amfifilní sloučeniny, jako jsou mastné kyseliny, v malém množství organického rozpouštědla (do 5%, nejlépe však do 1% objemu preparátu).

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je proces výroby vodného farmaceutického preparátu definovaného tímto vynálezem. Tento proces je charakterizován tím, že farmaceuticky účinný polypeptid a amfifilní sloučenina, která zhoršuje, nebo alespoň nezlepšuje rozpustnost farmaceuticky účinného polypeptidu ve vodě, jsou zkombinovány v takovém koncentračním poměru a při • *9 · · 99 9 9 »9 9 · 9 9 99 9 « 99 99 999 9 999 9 999 ••••9 · 9 9 •999 «9 »9 ·· · * »» takovém pH, že se vytváří iontovou interakcí mezi polypeptidem a pomocnou substancí iontový komplex.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je použití farmaceutického preparátu definovaného v předkládaném vynálezu pro systémové nebo lokální podání u člověka nebo savců.

Použití hedgehog proteinu ve farmaceutickém preparátu je preferovanou formou farmaceuticky účinného polypeptidu. Je známo, že aktivita hedgehog proteinů se může zvýšit kovalentní, hydrofobní modifikací (European Patent Application No. 99108032,6).

V předkládaném vynálezu se překvapivě ukázalo, že aktivita hedgehog proteinů může být do značné míry zvýšena vytvořením iontového komplexu mezi hedgehog proteinem a amfifilní sloučeninou. V preferované formě byl získán desetinásobný i vyšší nárůst aktivity hedgehog proteinu (ve srovnání s rekombinantním hedgehog proteinem produkovaným E. coli).

V důsledku těchto fakt je preferovaným předmětem předkládaného vynálezu farmaceutický preparát obsahující komplex hedgehog proteinu a amfifilní sloučeniny vytvořený iontovými interakcemi, v kterém je sloučenina přítomna v koncentraci, která zhoršuje, nebo alespoň nezlepšuje rozpustnost řečeného hedgehog proteinu.

Hedgehog (hh) proteiny tvoří rodinu sekretovaných signálních proteinů, které jsou v embryogenezi zodpovědné za rozvoj celé řady struktur (J.C. Smith, Cell 76 (1994) 193-196, N. Perrimon, Cell 80 (1995) 517-520, C. Chiang et al., Nátuře 83 (1996) 407, M.J. Bitgood et al., Curr. Biol. 6 (1996) 296, A. Vortkamp et al., Science 273 (1996) 613, C.J. Lai et al., Development 121 (1995) 2349). Během své biosyntézy se po naštěpení signální sekvence a autokatalytickém štěpení vytvářejí 20 kD Nterminální a 25 kD C-terminální domény. Ve své přirozené formě

Φφ Φ· ΦΦ ΦΦ • · · · Φ Φ φ Φ

ΦΦΦΦ «ΦΦΦ 9 9 9 ΦΦΦ Φ ΦΦΦ φφφ

ΦΦΦ < Φ

ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ

9« «φ ♦ · Φ « • · *

9 9 • · ·

ΦΦΦΦ « φ je N-terminální doména modifikována cholesterolem a palmitoylem (J.A. Porter et al., Science 274 (1996) 255-259 a Pepinski et al., J.Biol. Chem. 273 (1998) 14037-14045). U vyšších životních forem je rodina hh proteinů tvořena alespoň třemi druhy, a to sonic, indián a desert hh proteiny (Shh, Ihh, Dhh; M. Fietz et al., Development (Suppl.) (1994) 43-51). Byly pozorovány rozdíly v aktivitě rekombinantních hedgehog proteinů produkovaných v prokaryotních a eukaryotních buňkách (M. Hyneš et al., Neuron 15 (1995) 35-44 a T. Nakamura et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 237 (1997) 465-469).

Pro použití jsou obzvláště preferovány sonic, indián, nebo desert hh proteiny (Fietz M. et al·., Development (Suppl.) (1994) 43-51), zejména pak hh protein o sekvenci popsané v EMBL databance pod číslem L38518. Proteiny z hedgehog rodiny jsou výrazně homologní ve své aminokyselinové sekvenci, což je důvodem, proč je žádoucí použít nukleové kyseliny kódující hedgehog proteiny, které jsou z 80% a více homologní s výše zmíněnou sekvencí sonic hedgehog proteinu. Hedgehog proteiny jsou preferovány, jak je například popsáno v International Application No. WO 99/28454 a v European Patent Application No. 99108032,6.

Prekurzor lidského sonic hedgehog proteinu je tvořen aminokyselinami 1-462 ze sekvence popsané v EMBL databance pod č. L38518. Aminokyseliny 1-23 představují signální peptid, aminokyseliny 32-197 představují vyzrálou signální doménu, aminokyseliny 32-197 představují signální doménu zkrácenou o 8 aminokyselin a aminokyseliny 198-462 představují C-terminální doménu odštěpenou po autoproteolytickém rozštěpení.

Farmaceutický efekt hedgehog proteinů spočívá zejména v neurologickém účinku na nervové buňky, na osteogenezi a/nebo osteoindukci, dále pak zejména v účinku na chondrogenezi a/nebo chondroindukci, jak bylo popsáno autory Kinto et al., v časopise FEBS Letters, 404 (1997) 319-323 pro kostní indukci, ·· 4 4 4 4 ·· · · 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 · 4 4 ··· · · · · 4 4 4 4 • · 4 4 4 · 4*44 44 4 444

44444 4 4 4 • 94 4 44 44 44 44 44 autory Miao et al. v časopise J. Neurosci. 17 (1997) 5891-5899 pro efekt na nervové buňky a autory Stott et al·., v časopise J. Cell Sci 110 (1997) 2691-2701 pro indukci buněk chrupavky.

Vysoce koncentrované roztoky hedgehog proteinů jsou nezbytné pro přípravu nosičových matric, které jsou obaleny komplexy, nebo ty jsou v nich zapuštěny, takovým způsobem, že mají dostatečnou farmaceutickou účinnost při lokální aplikaci. Ukázalo se, že nosiče určené k farmaceutickému použití by měly obsahovat hedgehog protein v koncentraci nejlépe 0,1-10 mg/ml nosiče a více. Hedgehog proteiny jsou ze své povahy špatně rozpustné. Překvapivě se však ukázalo, že rozpustnost hedgehog proteinů se dramaticky zvyšuje a jejich stabilita v nízkých koncentracích (méně než 1 mg/ml) se zlepšuje při použití roztoků obsahujících arginin nebo ionty této aminokyseliny. Z tohoto důvodu je proto vhodné přidávat arginin nebo argininové ionty do vodných roztoků a ke komplexu s navázaným komplexem.

Aktivita hedgehog proteinu je v předkládaném vynálezu vyjadřována jako aktivita alkalické fosfatázy (stimulace exprese alkalické fosfatázy), kterou polypeptid aktivuje v savčích buňkách (aktivita v testu alkalické fosfatázy). V této metodě je kultivována buněčná linie myších fibroblastů v médiu obsahujícím fetální telecí sérum. Následně je přidán sterilní zfiltrovaný vzorek, buňky jsou po zhruba 5 dnech zlyzovány a v buněčném lyzátu je určena aktivita alkalické fosfatázy pomocí naštěpení chromogenního substrátu (pNP, pnitrofenol) (J. Asahina, Exp. Cell. Res. 222 (1996) 38-47 a T. Nakamura (1997)).

Farmaceutický preparát, který je předmětem vynálezu, obsahuje farmakologicky účinnou dávku hh proteinu a může být podán systémově, lépe však lokálně. Je vhodné použít proteiny, které jsou předmětem vynálezu, v kombinaci s dalšími proteiny rodiny hedgehog proteinů, nebo s kostními růstovými faktory, jako jsou • · • · · · · ··· · · · · ···· • · · · · · ··· · ··· ··· ····· · · · ···· ·· · · · · · · · · kostní morfogenetické proteiny (BMP) (Wozney et al., Cell. Mol. Biol. of Bone, Bone Morphogenetic Proteins and their Gene Expression (1993) Academie Press lne., 131-167), nebo s parathyroidními hormony (Karablis et al., Genes and Development 8 (1994) 277-289), nebo s inzulínu podobnými růstovými faktory (IGF-I nebo II), nebo se zástupci rodiny transformujících růstových proteinů (TGF-β, GDF). Tyto další proteiny mohou, ale také nemusí, být přítomny v komplexech, které jsou předmětem vynálezu.

Z tohoto důvodu je dalším předmětem vynálezu proces tvorby ve vodě rozpustného farmaceutického preparátu obsahujícího hedgehog protein spočívající v kombinaci tohoto hedgehog proteinu s amfifilní sloučeninou za podmínek umožňujících vytvoření iontového komplexu mezi hedgehog proteinem a amfifilní sloučeninou.

Dalším předmětem vynálezu je použití tohoto komplexu hedgehog proteinu za účelem vytvoření farmaceutického preparátu, v kterém je komplex použit jako nezbytná součást preparátu a je volitelně zkombinován s vhodnými pomocnými farmaceutickými substancemi nejlépe ve vodném roztoku pufru. Dalším použitím komplexu s hedgehog proteinem, který je předmětem vynálezu, je jeho použití ve směsi rozpuštěné a precipitované formy, nebo jen v precipitované formě, které umožňují prodloužené uvolňování hedgehog proteinu, nebo lokální aplikaci v místě účinku in vivo. Uvolňování proteinu v místě účinku je pomalejší z této směsi, než z kompletně rozpuštěného farmaceutického preparátu.

Při výrobě farmaceutického preparátu je navíc vhodné přidat pomocné látky, jako jsou chlorid sodný, cukry (manitol, sacharóza, laktóza, glukóza, threalóza, nejlépe v koncentracích 20-100 mg/ml), nebo aminokyseliny, jako jsou glycin, arginin, methionin, cystein, stejně tak jako antioxidancia, jako jsou • · • · · · · · ··· · ··<

• · · · · · ····· ·· ·· · ·

EDTA, citrát, thioglycerol, acetylcystein, polyetylén glykol (1-10% váhově), protizánětlivé látky, lokální anestetika, antibiotika a/nebo stabilizační látky.

Další preferovanou formou farmaceutického preparátu obsahujícího hedgehog protein, který je předmětem vynálezu, je preparát obsahující suramin. Tato forma může být s výhodou použita.

Nej lepší formou farmaceutického preparátu, který může obsahovat další farmaceutické pomocné látky, je lyofilizovaná forma.

Farmaceutický preparát by měl obsahovat hedgehog protein v koncentraci 0,1-10 mg/ml, nejlépe 0,1-5 mg/ml.

V preferované formě obsahuje farmaceutický preparát navíc farmaceuticky přijatelný pufr, který je biokompatibilní, v rozmezí pH 4-10, nejlépe pak v rozmezí 6-8. Koncentrace pufru je 10-500 mmol/1, nejlépe 10-100 mmol/1. Je výhodné zvolit takovou koncentraci solí, která neinterferuje s tvorbou komplexu z důvodu vysoké iontové síly.

Další formou vynálezu komplex, který je biokompatibilní nosič, je farmaceutický preparát obsahující předmětem vynálezu, navázaný na který může být použit k implantaci.

Nosičem je nejlépe polymer, který

- nezpůsobuje denaturaci hedgehog proteinu po jeho navázání na nosič,

- má průměrnou molekulovou váhu alespoň 10000 Da.

Mezi takové polymery patří například hyaluronová kyselina, kolagen, alginát nebo organické polymery, jako například PLGA (kopolymer polylaktové a glykolové kyseliny), nebo jeho deriváty. Pokud je komplex navázaný na nosič, není nezbytné, aby byl komplex zcela rozpustný v roztoku, jak je to potřeba ···· ···· ···· • · · · ·· · · ·· · • · · · · · ··· · ··· ··· ······ ·· ···· · · ·· · · · · · · v případě vodných farmaceutických preparátů popsaných výše. Po lokální aplikaci nosiče s navázaným komplexem, nejlépe jako komplex hedgehog polypeptidu lokálně aplikovaný na kostní tkáň či tkáň chrupavky, dochází k pomalému uvolňování rozpustné formy z komplexu, čímž se rozvíjí požadovaný biologický efekt.

Dalším předmětem vynálezu je použití daného farmaceutického preparátu, který je imobilizován (reverzibilně navázán) na biokompatibilním nosiči, a který je určen k lokálnímu podání u člověka nebo u zvířat. Mezi takové biokompatibilní nosiče patří například kyselina hyaluronová, kolagen, alginát, nebo organické polymery, jako je PLGA nebo jeho deriváty.

Komplex, který je předmětem vynálezu, je lokalizován na biokompatibilním nosiči, z něhož může být lokálně in vivo uvolněn v aktivní formě. Takovéto preparáty jsou zejména vhodné pro terapii defektů kostí a chrupavek, ale mohou být také použity k terapii neuronálních defektů, nebo pro systémové podání.

Farmaceutický preparát, který je předmětem vynálezu, obsahuje nejlépe polymer, který v podstatě slouží jako strukturální látka a má také adhezní funkci. Takovou strukturální látkou je například kolagen.

Další preferovanou formou farmaceutického preparátu, který je předmětem vynálezu, je lokální podání preparátu ke snížení systémových vedlejších reakcí, které se mohou vyskytnou mimo místo požadovaného účinku. Lokální podání farmaceuticky účinného polypeptidu, který není kompletně imobilizován a nemá extrémně krátký poločas, může vést alespoň částečně k uvolnění polypeptidu mimo požadované místo účinku, kde může způsobit nežádoucí systémové reakce. Tyto nežádoucí systémové reakce mohou být pomocí předkládaného vynálezu výrazně sníženy, nebo jim může být zcela zabráněno. Uvedená metoda je vhodná pro polypeptidy, které jsou lOx a vícekrát účinnější v iontovém • · komplexu ve srovnání s volnou formou, a kde komplex má nižší rozpustnost ve vodném pufrovacím roztoku než polypeptid, který není v komplexu. Mezi takové polypeptidy patří zejména hedgehog proteiny, cytokiny a růstové faktory, jako je NGF.

Iontový komplex polypeptidu a amfifilní sloučeniny je podle předkládaného vynálezu aplikován nejlépe lokálně v takovém množství, v kterém polypeptid v komplexu vykazuje aktivitu korespondující s terapeutickou dávkou (efektivní dávkou) in vivo. Množství komplexu musí být zvoleno takovým způsobem, že když komplex disociuje, k čemuž dochází za fyziologických podmínek například při jeho 10-20 násobném naředšní např. v krvi, tvoří aktivita polypeptidu pouze 20% nebo méně z terapeutické dávky. Z tohoto důvodu při takovém lokálním podání komplexu vykazuje farmaceuticky účinný polypeptid plný terapeutický efekt. Příkladem je lokální růst kostní tkáně v požadovaném místě, pokud je polypeptidem kostní růstový faktor, nebo cytostatický či apoptózu navozující efekt, pokud je polypeptidem tumoricidní látka. Dojde-li k rozptýlení komplexu, je komplex naředěn za fyziologických podmínek převládajícími mimo místo účinku. To vede k disociaci komplexu. Výsledkem je snížení koncentrace polypeptidu v komplexu a zvýšení koncentrace polypeptidu, který není v komplexu. Protože aktivita polypeptidu, který není v komplexu, je výrazně nižší než aktivita polypeptidu v komplexu, dochází také ke snížení terapeutického efektu mimo místa účinku.

Dalším předmětem vynálezu je použití farmaceutického preparátu pro lokální aplikaci u člověka, které je charakterizováno tím, že polypeptid v komplexu vykazuje aktivitu, která koresponduje s jeho terapeutickou dávkou, zatímco stejné množství polypeptidu, který není v komplexu, vykazuje aktivitu odpovídající 20% nebo méně než je terapeutická dávka.

• ·

Příklady provedeni vynálezu

Následující příklady, publikace a obrázky dále objasňují předkládaný vynález. Rozsah ochrany vynálezu vychází z patentových nároků. Popsané metody by měly být vnímány jako příklady, které neustále popisují předmět vynálezu, a to i po modifikacích.

Obr. 1 ukazuje závislost indukce alkalické fosfatázy v buněčném testu proteinem shh se zvyšujícími se koncentracemi deoxycholátu.

Obr. 2 ukazuje závislost tvorby agregátu na koncentraci deoxycholátu.

Příklad 1

Analýza aktivity různých preparátů s hedgehog proteinem v buněčném testu:

Indukce alkalické fosfatázy

Do každé jamky mikrotitrační desky s 96 jamkami je vloženo 5000 buněk myší mesenchymální pluripotentní linie C3H10T1/2 (ATCC CCL-226). Buňky jsou v médiu obsahujícím DMEM, 2mM glutamin, 100 IU penicilinu na 1 ml, 100 gg streptomycinu na 1 ml a 10% fetální telecí sérum. Následující den je médium nahrazeno médiem' obsahujícím lidský protein shh (0,5 nebo 50 gg/ml), které je různého složení (0, 0,00016, 0,00052, 0,0013, 0,0019 nebo 0,01% deoxycholátu sodného), nebo jsou preparáty s hedgehog proteinem, které mají odlišné složení, přidány přímo. Test je ukončen po pěti dnech. Poté jsou odstraněny supernatanty a buňky jsou promyty pomocí PBS. Buňky jsou lyžovány 50 μΐ 0,1% Tritonu® X-100 a zamrazeny při -20° C. Po rozmražení jsou použity alikvóty po 25 μΐ pro stanovení koncentrace bílkoviny a pro určení aktivity alkalické fosfatázy.

9

·

999 999

9

99

Stanovení koncentrace bílkoviny podle pokynů výrobce Pierce:

Ke směsi je přidáno 75 μΐ redestilované vody, poté je přidáno 100 μΐ BCA činidla pro stanovení bílkoviny (Pierce Micro BCA, No 23225). Absorbance je měřena po 60 minutách při 550 nm.

Stanoveni aktivity alkalické fosfatázy podle pokynů výrobce Sigma:

Ke směsi je přidáno 100 μΐ reakčního pufru (Sigma 221). Substrátová kapsle (Sigma 104-40) je rozpuštěna v 10 ml vody, poté je pipetou přidáno k testované směsi 100 μΐ tohoto roztoku. Absorbance je měřena při 405 nm. Během reakce dochází alkalickou fosfatázou k přeměně p-nitrofenylfosfátu na pnitrofenol (pNP). Změřené absorbance jsou převedeny na nanomoly pNP pomocí standardních křivek.

Aktivity preparátů s hedgehog proteinem různých složení jsou zobrazeny na Obr. 1. Ten ukazuje, že při stejných koncentracích proteinu se aktivity vyšetřovaných hedgehog preparátů výrazně zvyšují se zvyšujícími se koncentracemi deoxycholátu.

Příklad 2

Hydrofobní iontově párová titrace hshh proteinu (dimeru)

Rekombinantní lidský sonic hedgehog protein (dimer, 0,8 mg/ml v 50 mM Tris-Cl, pH 7,4 nebo v 0,1% Tweenu 80, 50 mM Tris-Cl, pH 7,4) je smísena se zvyšujícími se koncentracemi deoxycholátu sodného. Jako indikátor zakalení (tvorby ve vodě nerozpustných agregátů složených z iontových komplexů protein-detergent) je měřena absorbance při 360 nm. Z Obr. 2 je jasné, že přechod k ve vodě nerozpustným agregátům se objevuje nad zhruba 0,04% koncentrací deoxycholátu sodného. Tvorbě ve vodě nerozpustných agregátů může být velké části zabráněno přítomností 0,1% Tweenu 80. Uvedené absorbance korigovány pro naředění.

Příklad 3

Analýza preparátů s NGF bioaktivitní zkouškou: Zkouška vývoje dorzálních kořenových gangliových neuronů

Bioaktivita NGF byla stanovena morfometrickou analýzou dorzálních kořenových gangliových neuronů vyvinutých in vitro. Stručně shrnuto, z E7-E8 kuřecích embryí byly disekovány lumbální DRG, zbavené okolní pojivové tkáně a disociované rozmělněním v ohněm vyhlazené pasteurově pipetě po natrávení 0,1% trypsinem po dobu 20 minut při 37° C. Kontaminující buňky, jako například fibroblasty byly odstraněny umístěním celého buněčného preparátu na plastové kultivační misky na dobu 2 hodin. Za těchto podmínek se neurony neváží se substrátem, zatímco fibroblasty a další non-neuronální buňky adherují k umělé hmotě tkáňové kultury. „Čisté,, neurony byly získány stažením supernatantu a umístěny do plastových misek potažených poly-ornitinem/lamininem (48 jamek) v hustotě 10000 buněk na jamku v médiu HAM F14 obsahujícím 5% PBS. Pro NGF byla titrována křivka závislosti dávky na odpovědi od koncentrací přibližně 1 pg/ml do 15 ng/ml. Neurotrofická aktivita byla kvantifikována počítáním živých diferencovaných neuronů, u kterých se vyvinuly po 48 hodinové inkubaci s různými NGF preparáty neurity větší než dvojnásobek průměru perikaryonu. Data byla zobrazena jako průměr ze dvou stanovení diferencovaných neuronů vs. koncentrace NGF testovaných preparátů a byly určeny poloviční stimulační aktivity NGF (EC5.0), v několika preparátech různého složení (Tabulka 1).

Tabulka 1

Poloviční stimulační aktivita NGF preparátů (EC50)

Složení preparátu	EC50 (pg/ml)
NGF (žádné aditivum)	75
NGF (0,006% deoxycholátu sodného)	. 17
NGF (0,02% deoxycholátu sodného)	10

• toto · to* 99 « · · · • · 9

9 9 9

9 9

9999 99

9 9

9 9 • · • · to • · toto • to toto • «· to e toto · ••to toto· • · to· ··

Tato data jasně ukazují, že specifická aktivita NGF se zvyšuje v preparátech obsahujících amfifilní aditivum (zde: deoxycholát sodný).

Příklad 4

Farmaceutické preparáty s deoxycholátem

Ke tvorbě farmaceutického preparátu je použito 100 ml vodného roztoku Hshh (lidský sonic hedgehog protein) v koncentraci 5 mg/ml nebo 1 mg/ml, v 50 mmol/1 Tris pufru, pH 7,4. Tento roztok je 24 hodin dialyzován při 4°C proti roztoku preparátu bez deoxycholátu. Po provedení dialýzy je přidán deoxycholát sodný ze zásobního roztoku za stálého míchání tak, aby byl získán vodný farmaceutický preparát o koncentraci 1 mg/ml nebo 5 mg/ml Hshh proteinu v roztoku preparátu. Roztok je sterilně zfiltrován a uskladněn při 4°C. K injekčnímu podání pro člověka nebo zvíře je použito 0,05 až 2 ml roztoku.

4.1 Složení iontově hydrofobizovaného hedgehog proteinu ve vodném fosfátovém pufru (s nízkým obsahem deoxycholátu sodného)

Složení roztoku:

NaCl:

Natrium fosfátový pufr Deoxycholát sodný: pH: ,

150 mmol/1 10 mmol/1 0,05% (w/v) 7,4

4.2 Složení iontově hydrofobizovaného hedgehog proteinu ve vodném fosfátovém pufru (s vysokým obsahem deoxycholátu sodného)

Složení roztoku:

NaCl: 150 mmol/1

Natrium fosfátový pufr (Na): 10 mmol/1

Deoxycholát sodný: 0,1% (w/v) rt *· ·· 99

9 9 9 9 9 9

9 · · 9 9 9

999 9 999 999

9 9 9 ·· 99 99 99 ·* ·* • · · · · • · · · • e · · · • · · · ···· 99 pH:

7,4

4.3 Složení iontově hydrofobizovaného hedgehog proteinu ve fosfátovém pufru s nízkou iontovou silou (s nízkým obsahem deoxycholátu sodného)

Složení roztoku:

NaCl:

Kalium fosfátový pufr Deoxycholát sodný: pH:

mmol/1 20 mmol/1 0,05% (w/v) 6,5

4.4 Složení iontově hydrofobizovaného hedgehog proteinu ve fosfátovém pufru s nízkou iontovou silou (s vysokým obsahem deoxycholátu sodného)

Složení roztoku:

NaCl:

Kalium fosfátový pufr Deoxycholát sodný: pH:

mmol/1 20 mmol/1 0,1% (w/v) 6,5

Příklad 5

Farmaceutické preparáty iontově hydrofobizovaného hedgehog proteinu ve fosfátovém pufru s lipidy, mastnými kyselinami nebo steroidy

Ke tvorbě farmaceutického preparátu je použito 100 ml vodného roztoku Hshh proteinu v koncentraci 1 mg/ml nebo 2 mg/ml, v 50 mmol/1 Tris pufru, pH 7,4. Tento roztok je 24 hodin dialyzován při 4°C proti roztoku preparátu bez lipidů, mastných kyselin, nebo cholátu. Po provedení dialýzy je přidáno 0,01 g fosfatidátu, 0,01 g fosfatidyl šeřinu, 0,01 gpalmitátu, 0,05 g cholátu, 0,05 g taurodeoxycholátu, nebo 0,05 g taurocholátu ze zásobních roztoků za stálého míchání tak, aby byl získán vodný • · farmaceutický preparát o koncentraci 1 mg/ml nebo 2 mg/ml Hshh proteinu v roztoku preparátu. Roztok je sterilně zfiltrován a uskladněn při 4°C. K injekčnímu podání pro člověka nebo zvíře je použito 0,05 až 2 ml roztoku.

Složení roztoku:

NaCl:

Natrium fosfátový pufr

Fosfatidát:

pH:

150 mmol/1 10 mmol/1 0,01% (w/v) 7,4

Složení roztoku:

NaCl:

Natrium fosfátový pufr :

Fosfatidylserin:

pH:

100 mmol/1 10 mmol/1 0,01% (w/v) 7,4

Složení roztoku:

NaCl:

Kalium fosfátový pufr

Palmitát sodný:

pH:

150 mmol/1 20 mmol/1 0,01% (w/v) 7,4

Složení roztoku:

NaCl:

Natrium fosfátový pufr

Cholát sodný:

pH:

150 mmol/1 10 mmol/1 0,05% (w/v) 7,4

Složení roztoku:

NaCl:

Natrium fosfátový pufr Taurodeoxycholát sodný PH:

100 mmol/1 10 mmol/1 0,05% (w/v) 7,4 • 9·· 9

999 999

Složení roztoku:

NaCl:

Kalium fosfátový pufr Taurocholát sodný: pH:

150 mmol/1 20 mmol/1 0,05% (w/v) 7,4

Příklad 6

Farmaceutické preparáty iontově hydrofobizovaného kostního morfogenetického proteinu (BMP-2) v argininových pufrech

Ke tvorbě farmaceutického preparátu je použito 100 ml vodného roztoku BMP-2 proteinu v koncentraci 0,4 mg/ml. Tento roztok je 24 hodin dialyzován při 4°C proti 500 mmol/1 argininu v 10 mM kalium fosfátovém pufru, pH 6,0. Po provedení dialýzy je přidáno 0,01 g (palmitátu), nebo 0,05 g (deoxycholátu nebo taurodeoxycholátu) ze zásobního roztoku za stálého míchání tak, aby byl získán vodný farmaceutický preparát o koncentraci 0,4 mg/ml BMP proteinu v roztoku preparátu. Roztok je sterilně zfiltrován a uskladněn při 4°C. K injekčnímu podání pro člověka nebo zvíře je použito 0,05 až 2 ml roztoku.

Složení roztoku: Arginin:

Kalium fosfátový pufr Deoxycholát sodný: pH:

Složení roztoku: Arginin:

Kalium fosfátový pufr Deoxycholát sodný: pH:

Složení roztoku: Arginin:

500 mmol/1 10 mmol/1 0,05% (w/v) 6,0

500 mmol/1 10 mmol/1 0,01% (w/v) 6,0

500 mmol/1 • · • · • · · ····· · · · ···· ·· ·· ·· ·· ··

Kalium fosfátový pufr : 10 mmol/1

Taurodeoxycholát sodný: 0,05% (w/v) pH: 6,0

Příklad 7

Farmaceutické preparáty iontově hydrofobizovaného Interleukinu2 ve fosfátovém pufru

Ke tvorbě farmaceutického preparátu je použito 100 ml vodného roztoku s 1 nebo 2 miliony IU Interleukinu-2 v 50 mM Tris pufru, pH 7,4. Tento roztok je 24 hodin dialyzován při 4°C proti roztoku preparátu bez amfifilní sloučeniny. Po provedení dialýzy je přidáno 0,05 g deoxycholátu, 0,01 g fosfatidyl šeřinu, nebo 0,01 g palmitátu sodného ze zásobních roztoků za stálého míchání tak, aby byl získán vodný farmaceutický preparát s 1 nebo 2 miliony IU Interleukinu-2 v roztoku preparátu. Roztok je sterilně zfiltrován a uskladněn při 4°C. K injekčnímu podání pro člověka nebo zvíře je použito 0,05 až 2 ml roztoku.

Složení roztoku:

NaCl:

Natrium fosfátový pufr

Deoxycholát:

pH:

150 mmol/1 10 mmol/1 0,05% (w/v) 7,4

Složení roztoku: NaCl:

Natrium fosfátový Fosfatidylserin: pH:

150 mmol/1 pufr : 10 mmol/1

0,01% (w/v)

7,4

Složení roztoku:

NaCl:

Kalium fosfátový pufr Palmitát sodný:

150 mmol/1 20 mmol/1 0,01% (w/v) • · · · ·· · · · · · • · · · · · ··· · ··· ··· ····· · · · ···· ·· ·· ·· ·· ·· pH:

7,4

Příklad 8

Farmaceutické preparáty iontově hydrofobizovaného Interferonualfa ve fosfátovém pufru

Ke tvorbě farmaceutického preparátu je použito 100 ml vodného roztoku se 4 nebo 40 milionů IU Interferonu-a2b v 50 mM Tris pufru, pH 7,4. Tento roztok je 24 hodin dialyzován při 4°C proti roztoku preparátu bez amfifilní látky. Po provedení dialýzy je přidáno 0,05 g deoxycholátu, 0,01 g fosfatidyl šeřinu, nebo 0,05 g taurodeoxycholátu ze zásobního roztoku za stálého míchání tak, aby byl získán vodný farmaceutický preparát s 4 nebo 40 miliony IU Interferonu-a2b v roztoku preparátu. Roztok je sterilně zfiltrován a uskladněn při 4°C. K injekčnímu podání pro člověka nebo zvíře je použito 0,05 až 2 ml roztoku.

Složení roztoku:

NaCl:

Natrium fosfátový pufr

Deoxycholát:

pH:

150 mmol/1 10 mmol/1 0,05% (w/v)

7,4

Složení roztoku:

NaCl: '

Natrium fosfátový pufr

Fosfatidylserin:

pH:

100 mmol/1 10 mmol/1 0,01% (w/v)

7,4

Složení roztoku:

NaCl:

Kalium fosfátový pufr Taurodeoxycholát sodný pH:

150 mmol/1 20 mmol/1 0,05% (w/v)

7,4

Příklad 9

Farmaceutxcke preparáty iontové hydrofobizovaného lidského NGF v acetátovém pufru

Ke tvorbě farmaceutického preparátu je použito 100 ml vodného roztoku obsahujícího 1 nebo 2 mg/ml lidského NGF ve 100 mM natrium acetátovém pufru, pH 6,0. K tomuto roztoku je přidáno 0,05 g deoxycholátu, 0,01 g fosfatidátu, nebo 0,05 g taurodeoxycholátu ze zásobního roztoku za stálého míchání tak, aby byl získán vodný farmaceutický preparát. Roztok je sterilně zfiltrován a uskladněn při 4 nebo zvíře je použito 0,05 až

Složení roztoku;

Lidský NGF:

Natrium acetátový pufr :

Deoxycholát:

pH:

Složení roztoku:

Lidský NGF:

Natrium acetátový pufr :

Fosfatidát:

pH:

. K injekčnímu podání pro člověka 2 ml roztoku.

mg/ml

100 mmol/1

0,05% (w/v)

6,0 mg/ml 100 mmol/1 0,01% (w/v) 6,0

Složení roztoku:

Lidský NGF:

Natrium acetátový pufr Taurodeoxycholát sodný pH:

mg/ml 100 mmol/1 0,05% (w/v) 6,0

Příklad 10

Příprava alginátového gelu obsahujícího hedgehog proteiny

Alikvotní množství roztoku preparátu z Příkladu 4.1 je promícháno s 1% (w/v) vodným zásobním roztokem alginátu sodného (Pronova Bioplymer, Norsko) tak, aby se vytvořila gelatinózní směs alginátu s proteinem. Tento gel je přímo použit v množstvích 0,05 až 2 ml jako matrice k injekčnímu podání.

Příklad 11

Příprava směsi kolagenu obsahující BMP-2

100 μΐ jednoho z roztoků preparátů z Příkladu 6 je po kapkách přidáno ke kolagenové houbovité hmotě (Helistat, Integra Life Science, USA) o rozměru 10 x 10 x 3 mm. Naplněné nosiče jsou poté zamrazeny (-70°C) a zlyofilizovány. Houbovitá hmota je lokálně použita k hojení zlomenin kostí.

• · • · ·

Seznam citací

Asahina, J., Exp. Cell. Res. 222 (1996) 38-47

Aungst, Int.J.Pharm. 33 (1986) 225-234

Bitgood, M.J. et al., Curr. Biol. 6 (1996) 296

Chiang, C. et al., Nátuře 83 (1996) 407

Cools a Jansen, J.Pharm.Pharmacol.35 (1983) 689-691

Ekrami, J.M. et al., FEBS Letters 371 (1995) 283-286

European Patent Application No. 99108032.6

Fietz, M. et al., Development (Suppl) (1994) 43-51

Hazzenga a Berner, J.Controlled Release 16 (1991) 77-88

Hirai et al., Int. J. Pharm. 7 (1991) 317-325

Hyneš, M. et al., Neuron 15 (1995) 35-44

Karablis et al., Genes and Development 8 (1994) 277-289

Kinto et al., FEBS Letters, 404 (1997) 319-323

Lai, C.J. et al., Development 121 (1995) 2349

Lee et al., Critical. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 8 (1991) 91-192

Miao et al., J. Neurosci. 17 (1997) 5891-5899

Morimoto et al., Arch. Int. Pharmacodyn. 302 (1989) 18-26 Nakamura, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 237 (1997) 465-469

Okada et al., J. Pharm. Sci. 72 (1993) 75-78

Pepinski, R.B. et al., J. Biol. Chem. 273 (1989) 14037-14045

Perrimon, N., Cell 80 (1995) 517-520

Porter J.A. et al., Science 274 (1996) 255-259

Smith, J.C., Cell 76 (1994) 193-196

Stott et al., J.Cell Sci. 110 (1997) 2691-2701

Tomlinson a Davis, J. Colloid Interf., Sci. 74 (1980) 349

US-P 5,650,393

US-P 5,109,038

US-P 5,124,081

US-P 5,665,328

US-P 5,688,761

Vortkamp, A. et al., Science 273 (1996) 613 • · ··· ···

WO 99/28454

Womack et al., Biochim. Biophys. Acta 733 (1983) 210

Wozney et al., Cell. Mol. Biol. of Bone, Bone Morphogenetic Proteins and their Gene Expression, (1993) Academie Press Inc.

Claims (3)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   4’

   X Vodný preparát obsahující farmaceuticky účinný polypeptid vybraný ze skupiny složené z hedgehog proteinů, kostních morfogenetických proteinů, růstových faktorů, erytropoetinu, trombopoetinu, G-CSF, interleukinů a interferonů. Tento preparát je navíc charakterizován přítomností amfifilní sloučeniny. Polypeptid a amfifilní sloučenina tvoří iontový komplex, který nezvyšuje rozpustnost polypeptidu.

   (A* —

   Preparát definovaný v patentovém nároku cúMUv lyofilizované formě. \ <3· / y'. Preparát definovaný v patentovém nároku č. 2, v kterém je komplex zmobilizován na biokompatibilním nosiči.

   *

   Preparát definovaný v patentovém nároku č. 3, v kterém je komplex přítomen ve směsi rozpuštěné a precipitované formy.

   Preparát definovaný v patentovém nároku č. 1 až 4, v kterém má řečený preparát ve vodném roztoku hodnotu pH, která se liší alespoň o polovinu jednotky pH od pK hodnot řečeného polypeptidu a řečeného surfaktantu.

   č· . Preparát definovaný v patentovém nároku č. 1 až 5, v kterém je polypeptidem hedgehog protein.

   l·

   XT. Preparát definovaný v patentovém nároku č. 1 až 6, v kterém je amfifilní sloučeninou deoxycholát.

   r

   Použití preparátu definovaného v patentových nárocích 1 až 7 pro pozvolné uvolňování nebo lokální aplikaci hedgehog proteinu u člověka.

   99 99 99 99 99 99

   9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

   9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

   9 9 999 9 9999 999 999

   9 9 9 9 9 9 9 9

   9999 99 99 99 99 99
2. 2%. Proces přípravy farmaceutického preparátu pro lokální aplikaci u člověka. V tomto preparátu je jako nezbytná složka preparátu použit komplex farmaceuticky účinného preparátu vybraný ze skupiny složené z hedgehog proteinů, kostních morfogenetických proteinů, růstových faktorů, erytropoetinu, trombopoetinu, G-CSF, interleukinů a interferonů, s iontově navázanou amfifilní sloučeninou, a pomocná sloučenina je přítomna pouze v koncentraci která nezvyšuje rozpustnost řečeného polypeptidu ve vodě.

   4>.
3. 3T. Proces přípravy definovaný v patentovém nároku 9, charakterizovaný tím, že je komplex imobilizován na biokompatibilním nosiči.

   25. Metoda ke zvýšení aktivity polypeptidu, který je rozpoznáván a vázán buněčným receptorem. Tato metoda je charakterizována tvorbou iontového komplexu mezi řečeným polypeptidem a amfifilní sloučeninou.