JP3567103B2 - ヘッジホッグ蛋白質の薬学的組成物およびその使用 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘッジホッグ蛋白質の組成物、好ましくは薬学的組成物、およびその使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘッジホッグ（ｈｈ）蛋白質は、胚発生における多数の構造の形成を担う分泌シグナル蛋白質のファミリーとして認識されている（Ｊ．Ｃ．Ｓｍｉｔｈ、Ｃｅｌｌ ７６ （１９９４） １９３−１９６；Ｎ．Ｐｅｒｒｉｍｏｎら、Ｃｅｌｌ ８０ （１９９５） ５１７−５２０；Ｃ．Ｃｈｉａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ８３ （１９９６） ４０７；Ｍ．Ｊ．Ｂｉｔｇｏｏｄら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６ （１９９６） ２９８−３０４；Ａ．Ｖｏｒｔｋａｍｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３ （１９９６） ６１３；Ｃ．Ｊ．Ｌａｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１ （１９９５） ２３４９）。生合成においては、シグナル配列の分解および自己触媒による分解の後に、２０ｋＤのＮ末端ドメインおよび２５ｋＤのＣ末端ドメインが得られる。Ｎ末端ドメインは、天然型ではコレステロールまたはパルミトイルにより修飾されている（Ｊ．Ａ．Ｐｏｒｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４ （１９９６） ２５５−２５９、Ｐｅｐｉｎｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３ （１９９８） １４０３７−１４０４５）。高等生物においては、ｈｈファミリーは、ソニック（ｓｏｎｉｃ）ｈｈ、インディアン（ｉｎｄｉａｎ）ｈｈ、およびデザート（ｄｅｓｅｒｔ）ｈｈという少なくとも３つのメンバーからなっている（Ｓｈｈ、Ｉｈｈ、Ｄｈｈ；Ｍ．Ｆｉｅｔｚら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ （増補版） （１９９４） ４３−５１）。原核細胞で製造した場合と、真核細胞で製造した場合とでは、組換え作製されたヘッジホッグ蛋白質の活性に違いが見られた（Ｍ．Ｈｙｎｅｓら、Ｎｅｕｒｏｎ １５ （１９９５） ３５−４４およびＴ．Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２３７ （１９９７） ４６５−４６９）。
【０００３】
ハイネス（Ｈｙｎｅｓ）らは、形質転換されたヒト胎児腎臓２９３細胞の上清中のｈｈ（真核細胞ｈｈ）の活性を、大腸菌から作製されたｈｈと比較し、腎臓細胞系の上清由来のｈｈの方が活性が４倍高いことを見出した。大腸菌から単離されたｈｈは、２つの付加的なＮ末端アミノ酸 （Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を保持しているか、または５〜６アミノ酸短縮されているｈｈを５０％含むため、真核細胞においてのみ発現する付加的な補足因子、翻訳後修飾、Ｎ末端の違い、または高い凝集状態（例えば、ニッケル・アガロース・ビーズへの結合による）が、この活性増大の可能性のある理由として議論されている。
【０００４】
ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）らは、形質転換されたニワトリ胚線維芽細胞の上清中のｓｈｈの活性を、Ｎ末端のポリヒスチジン部分を保持している大腸菌から単離されたｓｈｈ融合蛋白質と比較している。線維芽細胞の上清中のｓｈｈは、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞におけるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）の刺激に関して、精製された大腸菌蛋白質よりも７倍高い活性を有している。真核細胞の上清にのみ存在し、ＡＰの誘導をより強力にする骨形成因子（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ／ＢＭＰ）のような分子が、活性増大の理由として議論されている。
【０００５】
ペピンスキー（Ｐｅｐｉｎｓｋｉ）ら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３ （１９９８） １４０３７〜１４０４５）は、パルミチン酸によって修飾されたｓｈｈ型を同定している。このｓｈｈ変異型は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイで見ると、非修飾型よりも３０倍活性が高い。
【０００６】
キント（Ｋｉｎｔｏ）ら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４０４ （１９９７） ３１９−３２３）は、ｈｈを分泌する線維芽細胞が、コラーゲン上の筋肉内移植において異所性の骨形成を誘導することを開示している。このように、ヘッジホッグ蛋白質は、骨形成誘導活性を有している。また、ヘッジホッグ蛋白質は軟骨細胞の形成を刺激する（Ｓｔｏｔｔら、１９９７）。
【０００７】
薬学的に有効なインビボ活性のためには、少なくとも１６時間にわたり体内の作用部位に高い局所ヘッジホッグ濃度が維持されなければならないことが、［Ｙａｎｇら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２４ （１９９７） ４３９３−４４０４］から分かる。ヤング（Ｙａｎｇ）らにより開示された担体系は、マーティ（Ｍａｒｔｉ）らが［Ｎａｔｕｒｅ ３７５ （１９９５） ３２２−３２５］に開示している、ヘッジホッグが負荷されたクロマトグラフィー媒体アフィゲル（Ａｆｆｉｇｅｌ）ＣＭ、Ｎｉ−アガロース、またはロペツ・マーティネツ（Ｌｏｐｅｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ）らが［Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５ （１９９５） ７９１−７９６］で使用したアフィゲル・ブルー（Ａｆｆｉｇｅｌ Ｂｌｕｅ）、またはそこで使用されたヘパリン−アガロース粒子と同様に、免疫原性であり、炎症反応を引き起こす可能性があるため、薬学的適用にはあまり適当でない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、安定した、好ましくは水性のヘッジホッグ蛋白質組成物（好ましくは薬学的組成物）を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この目的は、薬学的有効量のヘッジホッグ蛋白質を含み、また添加剤として亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、硫酸イオン、シクロデキストリン、非イオン性界面活性剤、ならびに、硫酸コンドロイチンもしくはヘパリンなどの陰イオン性サッカライドを含む、好ましくは薬学的な、ヘッジホッグ蛋白質組成物によって達成される。
【００１０】
驚くべきことに、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、硫酸イオン、シクロデキストリン、非イオン性界面活性剤、および／または硫酸コンドロイチンもしくはヘパリンなどの陰イオン性サッカライドからなる群より選択される１種類もしくは数種類の添加剤は、好ましくは、水性溶液の中で、（薬学的組成物、または別の形状の）ヘッジホッグ蛋白質を安定化できることが判明している。その結果、ヘッジホッグ蛋白質の活性を長期間にわたって、例えば、室温で維持できるようになり、また、ヘッジホッグ蛋白質組成物を室温で長期間保存することができるようになる。また、本発明に係る添加剤は、ヘッジホッグの凍結乾燥物を（好ましくは、大量の、または薬学的な組成物として）安定化するのにも適しており、さらに、これらはインプラント、微粒子、ゲルなどのヘッジホッグ蛋白質調製物を製造する過程で、また高い温度（例えば、３７℃）で、ヘッジホッグ蛋白質を安定化させる。
【００１１】
本発明に係る組成物においては、（１）薬学的に有効な用量のヘッジホッグ蛋白質ならびに添加剤として、亜鉛イオン、硫酸イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、アルギニンもしくはアルギニニウムイオン、シクロデキストリン、非イオン性界面活性剤、および／または陰イオン性サッカライドを含むヘッジホッグ蛋白質組成物であることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明に係る組成物においては、（２）硫酸亜鉛を含む、上記（１）記載の組成物であることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明に係る組成物においては、（３）硫酸シクロデキストリンを含む、上記（１）記載の組成物であることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明に係る組成物においては、（４）アルギニンまたはアルギニニウムイオンを含む、上記（１）記載の組成物であることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明に係る組成物においては、（５）硫酸アルギニニウムを含む、上記（４）記載の組成物であることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明に係る組成物においては、（６）亜鉛イオンを０．０１〜１００ ｍｍｏｌ／ｌの濃度で含む、上記（１）または（２）記載の組成物であることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明に係る組成物においては、（７）ヘッジホッグ蛋白質が、生物適合性のある親水性担体に結合している、上記（１）から（６）のいずれか一項記載の組成物であることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明に係る組成物においては、（８）親水性担体がポリマーである、上記（１）から（７）のいずれか一項記載の組成物であることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明に係る組成物においては、（９）薬学的組成物が、ヘッジホッグ蛋白質を０．１〜１００ ｍｇ／ｍｌの濃度で含む、上記（１）から（８）のいずれか一項記載の組成物であることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明に係る組成物においては、（１０）ｐＨ ３から１０の範囲に緩衝剤で調整されている、上記（１）から（９）のいずれか一項記載の組成物であることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明に係る組成物においては、（１１）ヘッジホッグ蛋白質が、生物適合性担体に結合している、上記（１）から（１０）記載の組成物であることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明に係る製造法においては、（１２）本薬剤の必須成分として、薬学的用量のヘッジホッグ蛋白質、および、添加剤として亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、硫酸イオン、シクロデキストリン、非イオン性界面活性剤、アルギニニウム、アルギニニウムイオン、および／または陰イオン性サッカライドが用いられる、ヘッジホッグ蛋白質を含む組成物の製造法であることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明に係る方法においては、（１３）ヘッジホッグ蛋白質を０．１〜１００ ｍｇ／ｍｌの濃度で使用する、上記（１２）記載の方法であることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明に係る方法においては、（１４）上記（１）から（１１）のいずれか一項記載の薬学的に許容される組成物の形状のヘッジホッグ蛋白質を人体に局所的に投与する、人体においてヘッジホッグ蛋白質を徐放させる方法であることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明に係る方法においては、（１５）ヘッジホッグ蛋白質を０．１〜１００ ｍｇ／ｍｌの濃度で投与する、上記（１４）記載の方法であることを特徴とする。
【００２６】
また、本発明に係る組成物においては、（１６）添加剤として、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、硫酸イオン、シクロデキストリン、非イオン性界面活性剤、アルギニニウム、アルギニニウムイオン、または陰イオン性サッカライドからなる群より選択される１種類または数種類の添加剤を、ヘッジホッグ蛋白質に対して過剰なモル量含む、ヘッジホッグ蛋白質の水性組成物であることを特徴とする。
【００２７】
また、本発明に係る乾燥物においては、（１７）上記（１）から（１１）のいずれか一項記載の組成物または上記（１６）記載の水性組成物の凍結乾燥物であることを特徴とする。
【００２８】
【発明の実施の形態】
本発明に係るヘッジホッグ蛋白質の水性溶液の中で、添加剤は、ヘッジホッグ蛋白質に対してモル過剰状態にある。この過剰は、好ましくは１〜１０００倍であり、特に好ましくは１〜１００倍である。本発明に係る水性溶液は、ヘッジホッグ蛋白質を担体物質と組み合わせたものを製造するのに特に適している。
【００２９】
したがって、本発明のさらなる主題は、本発明にしたがって、ヘッジホッグ蛋白質に対してモル過剰量の添加剤を含むことを特徴とするヘッジホッグ蛋白質の水性溶液である。この溶液は、好ましくは、緩衝液処理されるか、および／または凍結乾燥されている。
【００３０】
本発明に係る添加剤の量は、それら自体は重要ではないので、広い範囲にわたって変化させることができる。適量は、添加剤の薬学的な親和性と、薬学的に許容される濃度での安定化作用の程度によって決まる。安定化剤としては、亜鉛イオンが特に好ましく、例えば、０．０１〜１００ ｍｍｏｌ／ｌの濃度で添加するのが好都合である。この濃度は、ヘッジホッグ蛋白質を安定化させるのに有意な効果がある。好ましくは、亜鉛イオンを、薬学的に適合する量添加する。
【００３１】
シクロデキストリンは好ましくは、本発明にしたがって、硫酸シクロデキストリンとして存在する。その濃度は、好ましくは、重量にして１〜２０％である。低分子量のヘパリン（およそ３ ｋＤａ）が、好ましくは、陰イオン性ポリサッカライドとして用いられる。この濃度は、好ましくは、低分子量ヘパリンについては０．５〜５０ ｍｇ／ｍｌであり、高分子量ヘパリンについては、これに相当するモル量で用いる。硫酸イオンは、好ましくは、硫酸亜鉛として添加する。この硫酸イオン濃度は、好ましくは、０．０１〜１００ ｍｍｏｌ／ｌである。カルシウムイオンとマグネシウムイオンは、好ましくは、０．０１〜１００ ｍｍｏｌ／ｌの濃度で用いられる。非イオン性界面活性剤は、好ましくはポリオキシソルベート（例えば、登録商標Ｔｗｅｅｎ ２０、登録商標Ｔｗｅｅｎ ８０）であり、好ましくは０．０１〜０．１ ％ （ｗ／ｖ）の範囲である。
【００３２】
ヘッジホッグ蛋白質は、好ましくは、生物適合性のある担体上に存在するが、このとき担体は、活性を有する折畳み構造になったヘッジホッグ蛋白質を結合しており、ヘッジホッグ蛋白質を、活性のある状態でかつ徐放性の様式で、インビボで局所的に放出することができる。このような処方剤は、特に、骨および軟骨の欠損を修復するのに適しているが、ニューロンの欠損を修復するのにも、または全身に輸送するためにも利用することができる。
【００３３】
好ましい態様において、本組成物、好ましくは薬学的組成物は、生物適合性のある親水性の担体に結合したヘッジホッグ蛋白質を含み、例えば、インプラントとして使用することができる。この担体は、好ましくは、以下の特徴を有するポリマーである：
・ イオン性相互作用によって、負に荷電した担体としてヘッジホッグ蛋白質に結合する、
・ 担体に結合しても、ヘッジホッグ蛋白質は変性しない、
・ 該担体は、中性条件下で、モノマー当り、少なくとも０．１から１、好ましくは０．１から２の負に荷電した残基を含む、
・ 電荷は、硫酸基、カルボキシル基、またはリン酸基などの酸性基の形で媒介される、
・ および、担体の平均分子量は、少なくとも５０，０００ Ｄａである。
【００３４】
ヘッジホッグ蛋白質は、これらが、負に荷電した、可溶性または不溶性のポリマー基質に結合しているときには、可逆的に、かつ活性のある形で徐放性の様式でインビボにて担体から解離させられることが判明している。このような担体基質は、例えば、欧州特許出願第９８１０４４１６．７号に記載されている。
【００３５】
好ましくは、薬学的効果は、骨誘導については、［キント（Ｋｉｎｔｏ）ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ４０４ （１９９７） ３１９〜３２３］で、神経細胞への影響については、［ミアオ（Ｍｉａｏ）ら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ， １７ （１９９７） ５８９１〜５８９９］で、また、軟骨細胞誘導に関しては、［ストット（Ｓｔｏｔｔ）ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １１０ （１９９７） ２６９１〜２７０１］で説明されているように、神経細胞に対する神経学的効果、軟骨形成および／または軟骨誘導、好ましくは骨形成および／または骨誘導として理解される。
【００３６】
局所適用されたときに適切な薬学的効力を発揮するよう、ヘッジホッグ蛋白質でコートされた担体マトリックスを製造するためには、高濃度のヘッジホッグ蛋白質の溶液が必要である。ヘッジホッグ蛋白質でコートされた薬学的に適当な担体は、好ましくは、担体１ｍｌ当たり０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ、またはそれ以上のヘッジホッグ蛋白質濃度を含んでいる必要がある。０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度のヘッジホッグ蛋白質を含む担体は、特に有用である。ヘッジホッグ蛋白質は、本質的に難溶解性である。しかし、驚くべきことに、アルギニンまたはアルギニニウムイオン（好ましくは硫酸アルギニニウム）を含む溶液中では、ヘッジホッグ蛋白質の溶解性がかなり増大すること、ヘッジホッグ蛋白質が酸化から保護されていること、およびヘッジホッグ蛋白質の安定性が低濃度（１ｍｇ／ｍｌ以下）で改善されることが明らかとなった。従って、本発明のさらなる主題は、アルギニンまたはアルギニニウムイオンをさらに含み、好ましくは緩衝剤により調整されている、本発明に係るヘッジホッグ蛋白質の１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度の水溶液である。本発明のさらなる主題は、ヘッジホッグ蛋白質でコートされた担体マトリックスの製造法である。該方法は、１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度でヘッジホッグ蛋白質を含み、本発明に係る添加物およびアルギニンまたはアルギニニウムイオン、好ましくは硫酸アルギニニウムを含む本発明に係るヘッジホッグ蛋白質溶液で該担体マトリックスをインキュベートし、こうしてコートされた該担体マトリックスが単離されることを特徴とする。
【００３７】
そのような溶液は、薬学的に有効な濃度のヘッジホッグ蛋白質を含む担体マトリックスを作製するのに適しており、薬学的な適用に適している。アルギニン、アルギニニウムイオン、または硫酸アルギニニウムの濃度は、好ましくは１０から７００ｍｍｏｌ／ｌ、最も好ましくは１０〜５ｍｍｏｌ／ｌであり、ｐＨ域は好ましくは５〜８、最も好ましくは６から８である。
【００３８】
本発明における活性とは、ポリペプチドが哺乳動物細胞において誘導することができる、アルカリホスファターゼ（アルカリホスファターゼの発現の刺激）の活性（アルカリホスファターゼ・アッセイにおける活性）と理解される。この方法においては、マウス線維芽細胞系をウシ胎児血清を含む培地中で培養する。次に、濾過滅菌した試料を添加し、約５日後、細胞を溶解し、発色性基質（ｐＮＰ、ｐ−ニトロフェノール）の分解により、細胞溶解物中のアルカリホスファターゼを決定する（Ｊ．Ａｓａｈｉｎａ， Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ． ２２２ （１９９６） ３８−４７およびＴ．Ｎａｋａｍｕｒａ （１９９７）前記）。
【００３９】
本発明において、ヘッジホッグ蛋白質とは、胚発生における多数の構造の形成を担う分泌シグナル蛋白質と理解される。特に好ましくはソニックｈｈ、インディアンｈｈ、またはデザートｈｈが使用される（Ｆｉｅｔｚ Ｍ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（増補版）（１９９４）４３−５１）。ソニックｈｈ蛋白質の処理型（Ｎ末端成熟シグナルドメイン）（配列：ＥＭＢＬデータバンク、Ｎｏ．Ｌ３８５１８）が、好ましくは使用される。ヘッジホッグ・ファミリーの蛋白質は、明白なアミノ酸配列相同性を示す。そのため、ソニック・ヘッジホッグ蛋白質の上記の配列と８０％以上の相同性を有するヘッジホッグ蛋白質をコードする核酸を表すことも好ましい。例えば欧州特許出願第９８１０２０９５．１号および第９８１０７９１１．４号に記載されているヘッジホッグ誘導体が好ましくは用いられる。
【００４０】
ヒト・ソニック・ヘッジホッグ前駆体蛋白質は、Ｌ３８５１８なる番号でＥＭＢＬデータベースに開示されている配列の１位〜４６２位のアミノ酸を含む。１位〜２３位アミノ酸はシグナル・ペプチドを表しており、２４位〜１９７位アミノ酸は成熟シグナル・ドメインを表しており、３２位〜１９７位アミノ酸は８アミノ酸短縮されたシグナル・ドメインを表しており、１９８位〜４６２位アミノ酸は自己分解後の自己プロセシング・ドメインを表している。
【００４１】
本発明に係る組成物は、薬学的に有効な用量のｈｈ蛋白質を含んでおり、局所的に、または全身に投与することができる。本発明に係る蛋白質は、ヘッジホッグファミリーの別の蛋白質、または骨形成因子（ＢＭＰ）などの骨成長因子（Ｗｏｚｎｅｙら、Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， Ｂｏｎｅ， Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， （１９９３） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． １３１〜１６７）、または上皮小体ホルモン（Ｋａｒａｂｌｉｓら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ８ （１９９４） ２７７〜２８９）、またはインシュリン様成長因子（ＩＧＦ−ＩまたはＩＩ）、またはトランスフォーミング増殖因子ファミリー（ＴＧＦ−β、ＧＤＦ）と組み合わせて用いることが好ましい。
【００４２】
本発明に係る組成物は、好ましくは細胞に対する接着機能をも有する、本質的に構造物質として作用するポリマーを好ましくは含む。例えば、コラーゲンが、このような構造物質である。この場合、構造物質は、本発明によって説明されている親水性の生物適合性担体よりも低い濃度で存在することが好ましい。
【００４３】
該組成物の製造には、糖（マンニトール、ショ糖、ラクトース、グルコース、トレハロース、好ましくは２０〜１００ｍｇ／ｍｌ）またはグリシン、アルギニン、メチオニン、システインなどのアミノ酸のような補助物質、ならびにクエン酸、チオグリセロール、アセチルシステイン、ポリエチレングリコール（１〜１０重量％）などの酸化防止剤、界面活性剤、好ましくはポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０）またはポリオキシエチレンのような非イオン性界面活性剤（好ましくは０．０１〜０．１重量％）、抗炎症成分、局所麻酔剤、抗生物質、ならびに／または脂質、脂肪酸、およびグリセロールのような安定剤を添加することがさらに好ましい。
【００４４】
さらなる好ましい態様において、シュラミン（ｓｕｒａｍｉｎ）を含む、本発明に係るヘッジホッグ蛋白質の組成物が好ましく、これは有利に使用されうる。
【００４５】
該組成物は、付加的な薬学的補助物質を含んでいてもよい。
【００４６】
好ましい態様において、該組成物は、０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度でヘッジホッグ蛋白質を含む。
【００４７】
好ましい態様において、該組成物は、好ましくはｐＨ３からｐＨ１０の範囲で、特に好ましくはｐＨ５から８の範囲で、生体適合性を有する薬学的に許容される緩衝剤をさらに含む。驚くべきことに、本発明に係る添加物は、酸性の範囲でヘッジホッグ蛋白質を安定化させるのに有効であることが判明した。該組成物のｐＨ値は、ヘッジホッグ蛋白質中に複合した亜鉛の変性および解離を防止するため、ｐＨ４より大きいことが好都合である。緩衝剤の濃度は、好ましくは１〜５００ｍｍｏｌ／ｌ、特に５〜１５０ｍｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは１０〜１００ｍｍｏｌ／ｌである。最も好ましい態様において、３００ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、または１０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム、５００ｍｍｏｌ／ｌの塩化アルギニン（ｐＨ６．０）が使用される。
【００４８】
【実施例】
以下の実施例は、本発明、すなわち特許請求の範囲から生じる本発明の保護されるべき範囲を明らかにするものである。記載された方法は、改変後であっても本発明の主題を開示する具体例として理解されたい。
【００４９】
実施例１．
さまざまなヘッジホッグ製剤のＤＳＣ（示差走査熱量測定）分析
ＤＳＣ（ナノ示差走査熱量計、米国ユタ州にあるカロリメトリーサイエンス社（Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｕｔａｈ， ＵＳＡ））によって、加熱速度２ Ｋ／分で、さまざまな安定化剤を含む緩衝液、またはそれらを含まない緩衝液（５０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ， ｐＨ ７．２、および１５０ ｍＭ アルギニン−Ｃｌ， ｐＨ ７．４）中で、蛋白質濃度約０．５ ｍｇ／ｍｌのヘッジホッグ蛋白質溶液を分析した。以下の安定化剤を用いた：
・ 酢酸亜鉛（メルク社（Ｍｅｒｃｋ））
・ 硫酸亜鉛（メルク社（Ｍｅｒｃｋ））
・ ヘパリン（低分子量、シグマ社（Ｓｉｇｍａ））
・ 硫酸β−シクロデキストリン（アルドリッチ社（Ａｌｄｒｉｃｈ））
・ 硫酸アルギニン。
【００５０】
各製剤について決定された遷移温度（Ｔｔ）が、表１にまとめられている。示されたデータからは、本文中に示された物質の添加によって遷移温度が上昇するため、ヘッジホッグ蛋白質の安定性が増大することが分かる。測定された温度値は、絶対的な値と解すべきではなく、各処方剤の互いに対する安定性の差を示すものと理解するべきである。
【００５１】
さまざまな製剤におけるヘッジホッグ蛋白質の遷移温度を下記の表１に示す。
【００５２】
実施例２．
ソニックヘッジホッグの３７℃での安定性
ヒトのソニックヘッジホッグ蛋白質をさまざまに処方して、３７℃でインキュベートする。サンプルを一定の時間に取り出し、ｒｐＨＰＬＣによって分析した。
【表２】
【表３】
【００５３】
処方Ｂにおけるｈｓｈｈの方が、処方Ａよりも安定しているのは明らかである。アルギニンを含む製剤では、ｓｈｈの酸化がかなり遅くなり、また、温度によって誘導されるｈｓｈｈの凝集が避けられるため、回収率が高くなる。
【００５４】
実施例３．
疎水性になるよう改変されたｓｈｈの３７℃での安定性
疎水性になるよう改変されたヒトソニックヘッジホッグ蛋白質（欧州特許第９８ １１６ ７３３．１号にしたがって調製されたパルミトイル化ｓｈｈ）をさまざまに処方して３７℃でインキュベートする。サンプルをさまざまな時間で取り出し、ｒｐＨＰＬＣによって分析した。
【表４】
【表５】
【００５５】
ｈｓｈｈは、処方Ａよりも処方Ｂ中の方が安定しているのは明らかである。温度によって誘導されるｈｓｈｈの凝集が避けられるため、こちらの回収率の方が高い。
【００５６】
【発明の効果】
本発明により、特に室温で、安定的なヘッジホッグ蛋白質組成物、およびその薬学的組成物が提供された。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘッジホッグ蛋白質の組成物、好ましくは薬学的組成物、およびその使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘッジホッグ（ｈｈ）蛋白質は、胚発生における多数の構造の形成を担う分泌シグナル蛋白質のファミリーとして認識されている（Ｊ．Ｃ．Ｓｍｉｔｈ、Ｃｅｌｌ ７６ （１９９４） １９３−１９６；Ｎ．Ｐｅｒｒｉｍｏｎら、Ｃｅｌｌ ８０ （１９９５） ５１７−５２０；Ｃ．Ｃｈｉａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ８３ （１９９６） ４０７；Ｍ．Ｊ．Ｂｉｔｇｏｏｄら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６ （１９９６） ２９８−３０４；Ａ．Ｖｏｒｔｋａｍｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３ （１９９６） ６１３；Ｃ．Ｊ．Ｌａｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１ （１９９５） ２３４９）。生合成においては、シグナル配列の分解および自己触媒による分解の後に、２０ｋＤのＮ末端ドメインおよび２５ｋＤのＣ末端ドメインが得られる。Ｎ末端ドメインは、天然型ではコレステロールまたはパルミトイルにより修飾されている（Ｊ．Ａ．Ｐｏｒｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４ （１９９６） ２５５−２５９、Ｐｅｐｉｎｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３ （１９９８） １４０３７−１４０４５）。高等生物においては、ｈｈファミリーは、ソニック（ｓｏｎｉｃ）ｈｈ、インディアン（ｉｎｄｉａｎ）ｈｈ、およびデザート（ｄｅｓｅｒｔ）ｈｈという少なくとも３つのメンバーからなっている（Ｓｈｈ、Ｉｈｈ、Ｄｈｈ；Ｍ．Ｆｉｅｔｚら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ （増補版） （１９９４） ４３−５１）。原核細胞で製造した場合と、真核細胞で製造した場合とでは、組換え作製されたヘッジホッグ蛋白質の活性に違いが見られた（Ｍ．Ｈｙｎｅｓら、Ｎｅｕｒｏｎ １５ （１９９５） ３５−４４およびＴ．Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２３７ （１９９７） ４６５−４６９）。
【０００３】
ハイネス（Ｈｙｎｅｓ）らは、形質転換されたヒト胎児腎臓２９３細胞の上清中のｈｈ（真核細胞ｈｈ）の活性を、大腸菌から作製されたｈｈと比較し、腎臓細胞系の上清由来のｈｈの方が活性が４倍高いことを見出した。大腸菌から単離されたｈｈは、２つの付加的なＮ末端アミノ酸 （Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を保持しているか、または５〜６アミノ酸短縮されているｈｈを５０％含むため、真核細胞においてのみ発現する付加的な補足因子、翻訳後修飾、Ｎ末端の違い、または高い凝集状態（例えば、ニッケル・アガロース・ビーズへの結合による）が、この活性増大の可能性のある理由として議論されている。
【０００４】
ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）らは、形質転換されたニワトリ胚線維芽細胞の上清中のｓｈｈの活性を、Ｎ末端のポリヒスチジン部分を保持している大腸菌から単離されたｓｈｈ融合蛋白質と比較している。線維芽細胞の上清中のｓｈｈは、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞におけるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）の刺激に関して、精製された大腸菌蛋白質よりも７倍高い活性を有している。真核細胞の上清にのみ存在し、ＡＰの誘導をより強力にする骨形成因子（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ／ＢＭＰ）のような分子が、活性増大の理由として議論されている。
【０００５】
ペピンスキー（Ｐｅｐｉｎｓｋｉ）ら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３ （１９９８） １４０３７〜１４０４５）は、パルミチン酸によって修飾されたｓｈｈ型を同定している。このｓｈｈ変異型は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイで見ると、非修飾型よりも３０倍活性が高い。
【０００６】
キント（Ｋｉｎｔｏ）ら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４０４ （１９９７） ３１９−３２３）は、ｈｈを分泌する線維芽細胞が、コラーゲン上の筋肉内移植において異所性の骨形成を誘導することを開示している。このように、ヘッジホッグ蛋白質は、骨形成誘導活性を有している。また、ヘッジホッグ蛋白質は軟骨細胞の形成を刺激する（Ｓｔｏｔｔら、１９９７）。
【０００７】
薬学的に有効なインビボ活性のためには、少なくとも１６時間にわたり体内の作用部位に高い局所ヘッジホッグ濃度が維持されなければならないことが、［Ｙａｎｇら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２４ （１９９７） ４３９３−４４０４］から分かる。ヤング（Ｙａｎｇ）らにより開示された担体系は、マーティ（Ｍａｒｔｉ）らが［Ｎａｔｕｒｅ ３７５ （１９９５） ３２２−３２５］に開示している、ヘッジホッグが負荷されたクロマトグラフィー媒体アフィゲル（Ａｆｆｉｇｅｌ）ＣＭ、Ｎｉ−アガロース、またはロペツ・マーティネツ（Ｌｏｐｅｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ）らが［Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５ （１９９５） ７９１−７９６］で使用したアフィゲル・ブルー（Ａｆｆｉｇｅｌ Ｂｌｕｅ）、またはそこで使用されたヘパリン−アガロース粒子と同様に、免疫原性であり、炎症反応を引き起こす可能性があるため、薬学的適用にはあまり適当でない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、安定した、好ましくは水性のヘッジホッグ蛋白質組成物（好ましくは薬学的組成物）を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この目的は、薬学的有効量のヘッジホッグ蛋白質を含み、また添加剤として亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、硫酸イオン、シクロデキストリン、非イオン性界面活性剤、ならびに、硫酸コンドロイチンもしくはヘパリンなどの陰イオン性サッカライドを含む、好ましくは薬学的な、ヘッジホッグ蛋白質組成物によって達成される。
【００１０】
驚くべきことに、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、硫酸イオン、シクロデキストリン、非イオン性界面活性剤、および／または硫酸コンドロイチンもしくはヘパリンなどの陰イオン性サッカライドからなる群より選択される１種類もしくは数種類の添加剤は、好ましくは、水性溶液の中で、（薬学的組成物、または別の形状の）ヘッジホッグ蛋白質を安定化できることが判明している。その結果、ヘッジホッグ蛋白質の活性を長期間にわたって、例えば、室温で維持できるようになり、また、ヘッジホッグ蛋白質組成物を室温で長期間保存することができるようになる。また、本発明に係る添加剤は、ヘッジホッグの凍結乾燥物を（好ましくは、大量の、または薬学的な組成物として）安定化するのにも適しており、さらに、これらはインプラント、微粒子、ゲルなどのヘッジホッグ蛋白質調製物を製造する過程で、また高い温度（例えば、３７℃）で、ヘッジホッグ蛋白質を安定化させる。
【００１１】
本発明に係る組成物においては、（１）薬学的に有効な用量のヘッジホッグ蛋白質ならびに添加剤として、亜鉛イオン、硫酸イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、アルギニンもしくはアルギニニウムイオン、シクロデキストリン、非イオン性界面活性剤、および／または陰イオン性サッカライドを含むヘッジホッグ蛋白質組成物であることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明に係る組成物においては、（２）硫酸亜鉛を含む、上記（１）記載の組成物であることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明に係る組成物においては、（３）硫酸シクロデキストリンを含む、上記（１）記載の組成物であることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明に係る組成物においては、（４）アルギニンまたはアルギニニウムイオンを含む、上記（１）記載の組成物であることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明に係る組成物においては、（５）硫酸アルギニニウムを含む、上記（４）記載の組成物であることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明に係る組成物においては、（６）亜鉛イオンを０．０１〜１００ ｍｍｏｌ／ｌの濃度で含む、上記（１）または（２）記載の組成物であることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明に係る組成物においては、（７）ヘッジホッグ蛋白質が、生物適合性のある親水性担体に結合している、上記（１）から（６）のいずれか一項記載の組成物であることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明に係る組成物においては、（８）親水性担体がポリマーである、上記（１）から（７）のいずれか一項記載の組成物であることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明に係る組成物においては、（９）薬学的組成物が、ヘッジホッグ蛋白質を０．１〜１００ ｍｇ／ｍｌの濃度で含む、上記（１）から（８）のいずれか一項記載の組成物であることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明に係る組成物においては、（１０）ｐＨ ３から１０の範囲に緩衝剤で調整されている、上記（１）から（９）のいずれか一項記載の組成物であることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明に係る組成物においては、（１１）ヘッジホッグ蛋白質が、生物適合性担体に結合している、上記（１）から（１０）記載の組成物であることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明に係る製造法においては、（１２）本薬剤の必須成分として、薬学的用量のヘッジホッグ蛋白質、および、添加剤として亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、硫酸イオン、シクロデキストリン、非イオン性界面活性剤、アルギニニウム、アルギニニウムイオン、および／または陰イオン性サッカライドが用いられる、ヘッジホッグ蛋白質を含む組成物の製造法であることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明に係る方法においては、（１３）ヘッジホッグ蛋白質を０．１〜１００ ｍｇ／ｍｌの濃度で使用する、上記（１２）記載の方法であることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明に係る方法においては、（１４）上記（１）から（１１）のいずれか一項記載の薬学的に許容される組成物の形状のヘッジホッグ蛋白質を人体に局所的に投与する、人体においてヘッジホッグ蛋白質を徐放させる方法であることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明に係る方法においては、（１５）ヘッジホッグ蛋白質を０．１〜１００ ｍｇ／ｍｌの濃度で投与する、上記（１４）記載の方法であることを特徴とする。
【００２６】
また、本発明に係る組成物においては、（１６）添加剤として、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、硫酸イオン、シクロデキストリン、非イオン性界面活性剤、アルギニニウム、アルギニニウムイオン、または陰イオン性サッカライドからなる群より選択される１種類または数種類の添加剤を、ヘッジホッグ蛋白質に対して過剰なモル量含む、ヘッジホッグ蛋白質の水性組成物であることを特徴とする。
【００２７】
また、本発明に係る乾燥物においては、（１７）上記（１）から（１１）のいずれか一項記載の組成物または上記（１６）記載の水性組成物の凍結乾燥物であることを特徴とする。
【００２８】
【発明の実施の形態】
本発明に係るヘッジホッグ蛋白質の水性溶液の中で、添加剤は、ヘッジホッグ蛋白質に対してモル過剰状態にある。この過剰は、好ましくは１〜１０００倍であり、特に好ましくは１〜１００倍である。本発明に係る水性溶液は、ヘッジホッグ蛋白質を担体物質と組み合わせたものを製造するのに特に適している。
【００２９】
したがって、本発明のさらなる主題は、本発明にしたがって、ヘッジホッグ蛋白質に対してモル過剰量の添加剤を含むことを特徴とするヘッジホッグ蛋白質の水性溶液である。この溶液は、好ましくは、緩衝液処理されるか、および／または凍結乾燥されている。
【００３０】
本発明に係る添加剤の量は、それら自体は重要ではないので、広い範囲にわたって変化させることができる。適量は、添加剤の薬学的な親和性と、薬学的に許容される濃度での安定化作用の程度によって決まる。安定化剤としては、亜鉛イオンが特に好ましく、例えば、０．０１〜１００ ｍｍｏｌ／ｌの濃度で添加するのが好都合である。この濃度は、ヘッジホッグ蛋白質を安定化させるのに有意な効果がある。好ましくは、亜鉛イオンを、薬学的に適合する量添加する。
【００３１】
シクロデキストリンは好ましくは、本発明にしたがって、硫酸シクロデキストリンとして存在する。その濃度は、好ましくは、重量にして１〜２０％である。低分子量のヘパリン（およそ３ ｋＤａ）が、好ましくは、陰イオン性ポリサッカライドとして用いられる。この濃度は、好ましくは、低分子量ヘパリンについては０．５〜５０ ｍｇ／ｍｌであり、高分子量ヘパリンについては、これに相当するモル量で用いる。硫酸イオンは、好ましくは、硫酸亜鉛として添加する。この硫酸イオン濃度は、好ましくは、０．０１〜１００ ｍｍｏｌ／ｌである。カルシウムイオンとマグネシウムイオンは、好ましくは、０．０１〜１００ ｍｍｏｌ／ｌの濃度で用いられる。非イオン性界面活性剤は、好ましくはポリオキシソルベート（例えば、登録商標Ｔｗｅｅｎ ２０、登録商標Ｔｗｅｅｎ ８０）であり、好ましくは０．０１〜０．１ ％ （ｗ／ｖ）の範囲である。
【００３２】
ヘッジホッグ蛋白質は、好ましくは、生物適合性のある担体上に存在するが、このとき担体は、活性を有する折畳み構造になったヘッジホッグ蛋白質を結合しており、ヘッジホッグ蛋白質を、活性のある状態でかつ徐放性の様式で、インビボで局所的に放出することができる。このような処方剤は、特に、骨および軟骨の欠損を修復するのに適しているが、ニューロンの欠損を修復するのにも、または全身に輸送するためにも利用することができる。
【００３３】
好ましい態様において、本組成物、好ましくは薬学的組成物は、生物適合性のある親水性の担体に結合したヘッジホッグ蛋白質を含み、例えば、インプラントとして使用することができる。この担体は、好ましくは、以下の特徴を有するポリマーである：
・ イオン性相互作用によって、負に荷電した担体としてヘッジホッグ蛋白質に結合する、
・ 担体に結合しても、ヘッジホッグ蛋白質は変性しない、
・ 該担体は、中性条件下で、モノマー当り、少なくとも０．１から１、好ましくは０．１から２の負に荷電した残基を含む、
・ 電荷は、硫酸基、カルボキシル基、またはリン酸基などの酸性基の形で媒介される、
・ および、担体の平均分子量は、少なくとも５０，０００ Ｄａである。
【００３４】
ヘッジホッグ蛋白質は、これらが、負に荷電した、可溶性または不溶性のポリマー基質に結合しているときには、可逆的に、かつ活性のある形で徐放性の様式でインビボにて担体から解離させられることが判明している。このような担体基質は、例えば、欧州特許出願第９８１０４４１６．７号に記載されている。
【００３５】
好ましくは、薬学的効果は、骨誘導については、［キント（Ｋｉｎｔｏ）ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ４０４ （１９９７） ３１９〜３２３］で、神経細胞への影響については、［ミアオ（Ｍｉａｏ）ら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ， １７ （１９９７） ５８９１〜５８９９］で、また、軟骨細胞誘導に関しては、［ストット（Ｓｔｏｔｔ）ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １１０ （１９９７） ２６９１〜２７０１］で説明されているように、神経細胞に対する神経学的効果、軟骨形成および／または軟骨誘導、好ましくは骨形成および／または骨誘導として理解される。
【００３６】
局所適用されたときに適切な薬学的効力を発揮するよう、ヘッジホッグ蛋白質でコートされた担体マトリックスを製造するためには、高濃度のヘッジホッグ蛋白質の溶液が必要である。ヘッジホッグ蛋白質でコートされた薬学的に適当な担体は、好ましくは、担体１ｍｌ当たり０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ、またはそれ以上のヘッジホッグ蛋白質濃度を含んでいる必要がある。０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度のヘッジホッグ蛋白質を含む担体は、特に有用である。ヘッジホッグ蛋白質は、本質的に難溶解性である。しかし、驚くべきことに、アルギニンまたはアルギニニウムイオン（好ましくは硫酸アルギニニウム）を含む溶液中では、ヘッジホッグ蛋白質の溶解性がかなり増大すること、ヘッジホッグ蛋白質が酸化から保護されていること、およびヘッジホッグ蛋白質の安定性が低濃度（１ｍｇ／ｍｌ以下）で改善されることが明らかとなった。従って、本発明のさらなる主題は、アルギニンまたはアルギニニウムイオンをさらに含み、好ましくは緩衝剤により調整されている、本発明に係るヘッジホッグ蛋白質の１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度の水溶液である。本発明のさらなる主題は、ヘッジホッグ蛋白質でコートされた担体マトリックスの製造法である。該方法は、１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度でヘッジホッグ蛋白質を含み、本発明に係る添加物およびアルギニンまたはアルギニニウムイオン、好ましくは硫酸アルギニニウムを含む本発明に係るヘッジホッグ蛋白質溶液で該担体マトリックスをインキュベートし、こうしてコートされた該担体マトリックスが単離されることを特徴とする。
【００３７】
そのような溶液は、薬学的に有効な濃度のヘッジホッグ蛋白質を含む担体マトリックスを作製するのに適しており、薬学的な適用に適している。アルギニン、アルギニニウムイオン、または硫酸アルギニニウムの濃度は、好ましくは１０から７００ｍｍｏｌ／ｌ、最も好ましくは１０〜５ｍｍｏｌ／ｌであり、ｐＨ域は好ましくは５〜８、最も好ましくは６から８である。
【００３８】
本発明における活性とは、ポリペプチドが哺乳動物細胞において誘導することができる、アルカリホスファターゼ（アルカリホスファターゼの発現の刺激）の活性（アルカリホスファターゼ・アッセイにおける活性）と理解される。この方法においては、マウス線維芽細胞系をウシ胎児血清を含む培地中で培養する。次に、濾過滅菌した試料を添加し、約５日後、細胞を溶解し、発色性基質（ｐＮＰ、ｐ−ニトロフェノール）の分解により、細胞溶解物中のアルカリホスファターゼを決定する（Ｊ．Ａｓａｈｉｎａ， Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ． ２２２ （１９９６） ３８−４７およびＴ．Ｎａｋａｍｕｒａ （１９９７）前記）。
【００３９】
本発明において、ヘッジホッグ蛋白質とは、胚発生における多数の構造の形成を担う分泌シグナル蛋白質と理解される。特に好ましくはソニックｈｈ、インディアンｈｈ、またはデザートｈｈが使用される（Ｆｉｅｔｚ Ｍ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（増補版）（１９９４）４３−５１）。ソニックｈｈ蛋白質の処理型（Ｎ末端成熟シグナルドメイン）（配列：ＥＭＢＬデータバンク、Ｎｏ．Ｌ３８５１８）が、好ましくは使用される。ヘッジホッグ・ファミリーの蛋白質は、明白なアミノ酸配列相同性を示す。そのため、ソニック・ヘッジホッグ蛋白質の上記の配列と８０％以上の相同性を有するヘッジホッグ蛋白質をコードする核酸を表すことも好ましい。例えば欧州特許出願第９８１０２０９５．１号および第９８１０７９１１．４号に記載されているヘッジホッグ誘導体が好ましくは用いられる。
【００４０】
ヒト・ソニック・ヘッジホッグ前駆体蛋白質は、Ｌ３８５１８なる番号でＥＭＢＬデータベースに開示されている配列の１位〜４６２位のアミノ酸を含む。１位〜２３位アミノ酸はシグナル・ペプチドを表しており、２４位〜１９７位アミノ酸は成熟シグナル・ドメインを表しており、３２位〜１９７位アミノ酸は８アミノ酸短縮されたシグナル・ドメインを表しており、１９８位〜４６２位アミノ酸は自己分解後の自己プロセシング・ドメインを表している。
【００４１】
本発明に係る組成物は、薬学的に有効な用量のｈｈ蛋白質を含んでおり、局所的に、または全身に投与することができる。本発明に係る蛋白質は、ヘッジホッグファミリーの別の蛋白質、または骨形成因子（ＢＭＰ）などの骨成長因子（Ｗｏｚｎｅｙら、Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， Ｂｏｎｅ， Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， （１９９３） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． １３１〜１６７）、または上皮小体ホルモン（Ｋａｒａｂｌｉｓら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ８ （１９９４） ２７７〜２８９）、またはインシュリン様成長因子（ＩＧＦ−ＩまたはＩＩ）、またはトランスフォーミング増殖因子ファミリー（ＴＧＦ−β、ＧＤＦ）と組み合わせて用いることが好ましい。
【００４２】
本発明に係る組成物は、好ましくは細胞に対する接着機能をも有する、本質的に構造物質として作用するポリマーを好ましくは含む。例えば、コラーゲンが、このような構造物質である。この場合、構造物質は、本発明によって説明されている親水性の生物適合性担体よりも低い濃度で存在することが好ましい。
【００４３】
該組成物の製造には、糖（マンニトール、ショ糖、ラクトース、グルコース、トレハロース、好ましくは２０〜１００ｍｇ／ｍｌ）またはグリシン、アルギニン、メチオニン、システインなどのアミノ酸のような補助物質、ならびにクエン酸、チオグリセロール、アセチルシステイン、ポリエチレングリコール（１〜１０重量％）などの酸化防止剤、界面活性剤、好ましくはポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０）またはポリオキシエチレンのような非イオン性界面活性剤（好ましくは０．０１〜０．１重量％）、抗炎症成分、局所麻酔剤、抗生物質、ならびに／または脂質、脂肪酸、およびグリセロールのような安定剤を添加することがさらに好ましい。
【００４４】
さらなる好ましい態様において、シュラミン（ｓｕｒａｍｉｎ）を含む、本発明に係るヘッジホッグ蛋白質の組成物が好ましく、これは有利に使用されうる。
【００４５】
該組成物は、付加的な薬学的補助物質を含んでいてもよい。
【００４６】
好ましい態様において、該組成物は、０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度でヘッジホッグ蛋白質を含む。
【００４７】
好ましい態様において、該組成物は、好ましくはｐＨ３からｐＨ１０の範囲で、特に好ましくはｐＨ５から８の範囲で、生体適合性を有する薬学的に許容される緩衝剤をさらに含む。驚くべきことに、本発明に係る添加物は、酸性の範囲でヘッジホッグ蛋白質を安定化させるのに有効であることが判明した。該組成物のｐＨ値は、ヘッジホッグ蛋白質中に複合した亜鉛の変性および解離を防止するため、ｐＨ４より大きいことが好都合である。緩衝剤の濃度は、好ましくは１〜５００ｍｍｏｌ／ｌ、特に５〜１５０ｍｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは１０〜１００ｍｍｏｌ／ｌである。最も好ましい態様において、３００ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、または１０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム、５００ｍｍｏｌ／ｌの塩化アルギニン（ｐＨ６．０）が使用される。
【００４８】
【実施例】
以下の実施例は、本発明、すなわち特許請求の範囲から生じる本発明の保護されるべき範囲を明らかにするものである。記載された方法は、改変後であっても本発明の主題を開示する具体例として理解されたい。
【００４９】
実施例１．
さまざまなヘッジホッグ製剤のＤＳＣ（示差走査熱量測定）分析
ＤＳＣ（ナノ示差走査熱量計、米国ユタ州にあるカロリメトリーサイエンス社（Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｕｔａｈ， ＵＳＡ））によって、加熱速度２ Ｋ／分で、さまざまな安定化剤を含む緩衝液、またはそれらを含まない緩衝液（５０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ， ｐＨ ７．２、および１５０ ｍＭ アルギニン−Ｃｌ， ｐＨ ７．４）中で、蛋白質濃度約０．５ ｍｇ／ｍｌのヘッジホッグ蛋白質溶液を分析した。以下の安定化剤を用いた：
・ 酢酸亜鉛（メルク社（Ｍｅｒｃｋ））
・ 硫酸亜鉛（メルク社（Ｍｅｒｃｋ））
・ ヘパリン（低分子量、シグマ社（Ｓｉｇｍａ））
・ 硫酸β−シクロデキストリン（アルドリッチ社（Ａｌｄｒｉｃｈ））
・ 硫酸アルギニン。
【００５０】
各製剤について決定された遷移温度（Ｔｔ）が、表１にまとめられている。示されたデータからは、本文中に示された物質の添加によって遷移温度が上昇するため、ヘッジホッグ蛋白質の安定性が増大することが分かる。測定された温度値は、絶対的な値と解すべきではなく、各処方剤の互いに対する安定性の差を示すものと理解するべきである。
【００５１】
さまざまな製剤におけるヘッジホッグ蛋白質の遷移温度を下記の表１に示す。
実施例２．
ソニックヘッジホッグの３７℃での安定性
ヒトのソニックヘッジホッグ蛋白質をさまざまに処方して、３７℃でインキュベートする。サンプルを一定の時間に取り出し、ｒｐＨＰＬＣによって分析した。
【表２】
処方Ｂにおけるｈｓｈｈの方が、処方Ａよりも安定しているのは明らかである。アルギニンを含む製剤では、ｓｈｈの酸化がかなり遅くなり、また、温度によって誘導されるｈｓｈｈの凝集が避けられるため、回収率が高くなる。
【００５４】
実施例３．
疎水性になるよう改変されたｓｈｈの３７℃での安定性
疎水性になるよう改変されたヒトソニックヘッジホッグ蛋白質（欧州特許第９８ １１６ ７３３．１号にしたがって調製されたパルミトイル化ｓｈｈ）をさまざまに処方して３７℃でインキュベートする。サンプルをさまざまな時間で取り出し、ｒｐＨＰＬＣによって分析した。
【表４】
ｈｓｈｈは、処方Ａよりも処方Ｂ中の方が安定しているのは明らかである。温度によって誘導されるｈｓｈｈの凝集が避けられるため、こちらの回収率の方が高い。
【００５６】
【発明の効果】
本発明により、特に室温で、安定的なヘッジホッグ蛋白質組成物、およびその薬学的組成物が提供された。
Claims (4)
- ０．１ 〜 １００ｍｇ／ｍｌ の薬学的に有効な用量のヘッジホッグ蛋白質ならびに添加剤として、亜鉛イオン、硫酸イオン、アルギニンもしくはアルギニニウムイオン、シクロデキストリン、非イオン性界面活性剤、および／または陰イオン性サッカライドを、ヘッジホッグ蛋白質を安定化するのに有効な量、且つヘッジホッグ蛋白質に対して過剰なモル量含むヘッジホッグ蛋白質の薬学的組成物。
- 必須成分として ０．１ 〜 １００ｍｇ／ｍｌ の薬学的用量のヘッジホッグ蛋白質、ならびに添加剤として亜鉛イオン、硫酸イオン、シクロデキストリン、非イオン性界面活性剤、アルギニニウム、アルギニニウムイオン、および／または陰イオン性サッカライドをヘッジホッグ蛋白質を安定化するのに有効な量、且つヘッジホッグ蛋白質に対して過剰なモル量含む薬学的組成物の製造法。
- 添加剤として、亜鉛イオン、硫酸イオン、シクロデキストリン、非イオン性界面活性剤、アルギニニウム、アルギニニウムイオン、または陰イオン性サッカライドからなる群より選択される１種類または数種類の添加剤を、ヘッジホッグ蛋白質を安定化するのに有効な量、且つヘッジホッグ蛋白質に対して過剰なモル量含み、 ０．１ 〜 １００ｍｇ／ｍｌ のヘッジホッグ蛋白質を含む水性の薬学的組成物。
- 請求項１記載の凍結乾燥物。
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