ES2219299T3 - Composicion farmaceutica de proteinas hedgehog modificadas hidrofobicamento y su uso. - Google Patents

Abstract

Composición farmacéutica que contiene una proteína hedgehog modificada hidrofóbicamente y una proteína biodegradable como vehículo, en la que dicha proteína biodegradable une la proteína hedgehog y libera dicha proteína de una manera sostenida.

Description

Composición farmacéutica de proteínas hedgehog modificadas hidrofóbicamente y su uso.

La invención se refiere a una composición farmacéutica de proteínas hedgehog modificadas hidrofóbicamente y su uso, en particular para la liberación local de estas proteínas en huesos o cartílagos.

Por proteínas hedgehog (hh) se entiende una familia de proteínas señal segregadas que son responsables de la formación de numerosas estructuras en la embriogénesis (J. C. Smith, Cell 76 (1994) 193 - 196, N. Perrimon, Cell 80 (1995) 517 - 520, C. Chiang et al., Nature 83 (1996) 407, M. J. Bitgood et al., Curr. Biol. 6 (1996) 296, A. Vortkamp et al., Science 273 (1996) 613, C. J. Lai et al., Development 121 (1995) 2349). Durante su biosíntesis, se obtienen un dominio N-terminal de 20 kD y un dominio C-terminal de 25 kD tras la escisión de la secuencia señal y su escisión autocatalítica. En su forma natural, el dominio N-terminal está modificado con colesterol (J. A. Porter et al., Science 274 (1996) 255 - 259). En las formas de vida superiores, la familia hh está compuesta por al menos tres elementos, concretamente "sonic", "indian" y "desert" hh (shh, Ihh, Dhh; M. Fietz et al., Development (Supl.) (1994) 43 - 51). Se observaron diferencias en la actividad de las proteínas hedgehog que se produjeron de manera recombinante, tras su producción en procariotas y eucariotas (M. Hynes et al., Neuron 15 (1995) 35 - 44 y T. Nakamura et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 237 (1997) 465 - 469).

Hynes et al. comparan la actividad de hh en el sobrenadante de 293 células de riñón de embrión humano transformadas (hh eucarióticas) con las hh producidas a partir de E.coli y hallan una actividad cuatro veces mayor de las hh procedentes de los sobrenadantes de la línea celular de riñón. Se ha debatido que el motivo de este aumento de actividad es un factor accesorio adicional potencial que sólo se expresa en las células eucarióticas, una transformación posterior a la traducción, un extremo N-terminal diferente puesto que la hh aislada a partir de E. coli contiene un 50% de una forma de hh que porta dos aminoácidos (Gly-Ser) N-terminal adicionales o se acorta en 5 - 6 aminoácidos, o un estado de agregación superior (por ejemplo,mediante la unión a perlas de níquel-agarosa).

Nakamura et al., comparan la actividad de shh en el sobrenadante de fibroblastos transformados de embrión de pollo con una proteína de fusión de shh aislada de E.coli que todavía tiene una parte de polihistidina N-terminal. La shh en el sobrenadante de los fibroblastos tiene una actividad siete veces superior a la de la proteína de E.coli purificada con respecto a la estimulación de la fosfatasa alcalina (FA) en la mitad de las células C3H10T. Se postula que el aumento de la actividad es debido a moléculas tales como, por ejemplo, proteínas morfogenéticas óseas (BMP) que sólo están presentes en el sobrenadante de las células eucarióticas y producen la inducción más fuerte de la FA.

Kinto et al., FEBS Letters, 404 (1997) 319 - 323, describen que los fibroblastos que segregan hh inducen formación de hueso ectópica en una implantación intramuscular sobre colágeno. Así, las proteínas hedgehog tienen una actividad osteoinductiva.

Del documento WO 90/08551, se conoce un procedimiento para la producción de sistemas de administración de proteínas con una liberación sostenida que utilizan alginato. Se forma un sistema bifásico en el que la primera fase contiene una concentración elevada de la proteína (disolución saturada) y la segunda fase contiene alginato. Sin embargo, tal separación de fases es difícil y complicada de llevar a cabo cuando se producen composiciones farmacéuticas en grandes cantidades.

De Kikuchi, A. et al., J. Controlled Release 47 (1997) 21 - 29, se conoce una liberación pulsátil de dextrano a partir de complejos de alginato de calcio. Sin embargo, no se describe por Kikuchi el acoplamiento de las proteínas hedgehog a tales complejos.

En Trends in Biotechnology 14 (1996) 451 - 452, Robinson, C. J. et al., describen la implantación intraventricular de microesferas de alginato como un método para la aplicación local de NGF (factor de crecimiento nervioso) o células que segregan NGF. Sin embargo, no se describe una aplicación de las proteínas hedgehog.

En J. Cell Physiol. 152 (1992) 422 - 429, Downs, E. C. et al describen el uso de esferas de alginato de calcio como un sistema de administración de factores de la angiogénesis. Sin embargo, no se describe el uso de este método o este sistema de administración para las proteínas hedgehog.

En Biotechnol. Bioeng. 31 (1988) 607 - 612, Crey, C. J. y J. Dowsett describen el uso de esferas de alginato de calcio/zinc como un sistema de administración para la insulina. Sin embargo, no se describe una aplicación de este procedimiento para producir sistemas de administración para las proteínas hedgehog.

Se conoce de Yang et al., Development 124 (1997) 4393 - 4404, que las altas concentraciones locales de proteína hedgehog deben prevalecer durante un periodo de al menos 16 h en el sitio de acción en el organismo, para una actividad in vivo farmacéuticamente eficaz. El sistema de vehículo para esto descrito por Yang et al., es decir, el medio cromatográfico cargado con proteína hedgehog, Affigel CM, el Ni-agarosa descrito por Marti et al., en Nature 375 (1995) 322 - 325 o el Affigel blue utilizado por López-Martínez et al., en Curr. Biol. 5 (1995) 791 - 796 o las partículas de heparina-agarosa que utilizaron son menos adecuados para una aplicación farmacéutica puesto que son inmunógenos y pueden producir reacciones inflamatorias.

Los inventores encontraron que el colágeno vehículo biocompatible y biodegradable descrito por Kinto et al. para las células que expresan hh es también inadecuado para una aplicación farmacéutica local óptima de las proteínas hedgehog. Se encontró que cuando los vehículos de colágeno se cargan con proteínas hedgehog en condiciones fisiológicas (pH de aproximadamente 7 y en ácidos débiles (hasta pH 4,5)), la mayoría de las proteínas hedgehog aplicadas se liberan de la matriz en el plazo de unos minutos. Cuando la carga se lleva a cabo en condiciones ácidas (por debajo de pH 4,5) se desnaturaliza una gran cantidad de la proteína hedgehog aplicada y se une irreversiblemente al vehículo.

En el documento EP-A-947201, se describe una composición farmacéutica de una proteína hedgehog que se caracteriza porque la proteína hedgehog se une a un vehículo hidrófilo que es biocompatible, en la que el vehículo es un polímero que une la proteína hedgehog como un vehículo cargado negativamente debido a interacciones iónicas, la proteína hedgehog no se desnaturaliza durante su unión al vehículo, contiene al menos de 0,1 a 2 restos cargados negativamente por monómero en condiciones neutras, la carga está en la forma de grupos ácidos, tiene un peso molecular medio de al menos 50.000 Da y no contiene agarosa.

El objeto de la invención es prever una composición farmacéutica de una proteína hedgehog modificada hidrofóbicamente que contiene un vehículo biocompatible, en la que el vehículo une la proteína hedgehog como una estructura activa plegada y puede liberarla localmente in vivo en una forma activa y de una manera sostenida. Tales formulaciones son particularmente adecuadas para la reparación de defectos del hueso y el cartílago y también pueden utilizarse para reparar defectos neuronales o para una administración sistémica.

El objeto se consigue mediante una composición farmacéutica de una proteína hedgehog modificada hidrofóbicamente que se caracteriza porque esta composición contiene proteínas hedgehog modificadas hidrofóbicamente y una proteína biodegradable o un producto de degradación proteolítica de la misma como vehículo, en la que dicha proteína biodegradable une la proteína hedgehog y libera la proteína de una manera sostenida.

Sorprendentemente, ha resultado que las proteínas hedgehog modificadas hidrofóbicamente pueden liberarse in vivo de tal vehículo de una manera reversible, activa y sostenida sin producir reacciones inmunogénicas y/o inflamatorias in vivo. El vehículo puede ser un vehículo sólido tal como una esponja o un vehículo inyectable tal como un gel. El vehículo biodegradable preferido es colágeno o la gelatina producto de la hidrólisis. También son adecuadas otras proteínas fibrosas vehículo tales como la fibrina o la elastina y pueden utilizarse como fibras proteicas intactas, como proteína solubilizada o como proteína parcialmente hidrolizada.

El colágeno se entiende, según la invención, preferiblemente como colágeno soluble, colágeno insoluble (preferiblemente reticulado) atelocolágeno o gelatina. Según la invención, el colágeno puede estar presente como una matriz sólida (precipitado o liofilizado reticulado o no reticulado, como fibras, como una dispersión o como un gel). El colágeno producido de manera recombinante, así como el colágeno de tipo I o de tipo II y mezclas de los mismos son particularmente adecuados. Por ejemplo, las fibras de colágeno pueden prepararse según la patente británica número 1204438. Por ejemplo, puede prepararse colágeno soluble mediante procedimientos tales como los descritos en las patentes británicas números 990276 y 1184502. El producto que se prepara mediante estos métodos puede denominarse como microgel y contiene una mezcla de colágeno en diversas formas de agregación. El colágeno hidrolizado puede obtenerse preferiblemente tratando el colágeno con tripsina. Esto da como resultado una mezcla polidispersa de polipéptidos con un peso molecular en el intervalo de entre aproximadamente 5000 y 70000. Preferiblemente, el colágeno se desnaturaliza en primer lugar, por ejemplo, mediante tratamiento térmico antes del tratamiento con tripsina.

El vehículo biodegradable, preferiblemente colágeno, se utiliza preferiblemente como una esponja, tal como por ejemplo, la esponja de colágeno Helistat^{MR} de la empresa Integra Life Sciences Company, EE.UU.

Preferiblemente, se utiliza un colágeno como la matriz de vehículo, particular y preferiblemente como una matriz de vehículo soluble o insoluble. La matriz de vehículo se compone particular y preferiblemente de una combinación del vehículo biodegradable y un polisacárido aniónico, tal como preferiblemente ácido hialurónico (así como formas químicamente reticuladas del mismo), condroitín sulfato, poli(sulfato de vinilo), queratán sulfato, dextrán sulfato, pectina, carragenina y otros hidrocoloides, alginato sulfatado, dermatán sulfato, alginato, preferiblemente alginato de calcio o complejos de proteína y polisacáridos tales como los descritos, por ejemplo, en la patente de los EE.UU. número 4.614.794 (Fibracol^{MR}, Johnson and Johnson, EE.UU.) en los que el porcentaje en peso de los polisacáridos cargados es del 10 - 50%. Una matriz insoluble en el sentido de la invención significa que la matriz no se descompone sustancialmente ni se disuelve significativamente en una disolución tampón neutra in vitro en un plazo de 10 - 20 horas a temperatura ambiente. A este respecto, se prefiere que el vehículo utilizado según la invención contenga menos del 50%, preferiblemente menos del 20% y particular, preferible y esencialmente ninguna cantidad de polisacárido neutro. Es particularmente adecuada una combinación de colágeno con ácido hialurónico con un peso molecular de al menos 10^{6} dalton, en particular con un peso molecular de 4 x 10^{6} dalton.

Una liberación sostenida se entiende según la invención como una liberación de la proteína hedgehog en una dosis farmacológicamente eficaz durante un periodo definido de al menos 14 horas. Un efecto farmacológicamente se entiende como un efecto neurológico sobre las células nerviosas, una condrogénesis y/o una condroinducción y preferiblemente una osteogénesis y/o una osteoinducción, tal como se describe en Kinto et al., FEBS Letters, 404 (1997) 319 - 323, para la inducción ósea, por Miao et al. en J. Neurosci. 17 (1997) 5891 - 5899 para el efecto sobre las células nerviosas y por Stott et al. en J. Cell Sci. 110 (1997) 2691 - 2701 para la inducción de células de cartílago.

Se utiliza preferiblemente un vehículo degradable enzimáticamente como el vehículo, que se degrada por enzimas (por ejemplo, proteasas) segregadas por las células en las que se ha producido la aplicación local in vivo. Sin embargo, la semivida del vehículo debe ser de al menos 12 h pero puede ser de varias semanas. Si el vehículo está compuesto por un polisacárido, este vehículo se degrada preferiblemente por glucosidasas y por hidrolasas que están presentes en y se segregan por la célula. Sin embargo, tal biodegradabilidad del vehículo no es necesaria en cada caso. Si la liberación se lleva a cabo para tratar osteoporosis o enfermedades neuronales, es innecesaria la biodegradabilidad. Sin embargo, tales vehículos son preferiblemente poco solubles en condiciones fisiológicas y, por tanto, se absorben por el organismo durante un periodo prolongado (de varias semanas a meses).

Se requieren disoluciones de proteínas hedgehog en concentraciones elevadas para producir matrices del vehículo que se recubren con proteínas hedgehog de tal manera que muestran una eficacia farmacéutica adecuada cuando se aplican localmente. Ha resultado que los vehículos farmacéuticamente aceptables recubiertos con proteína hedgehog deben contener preferiblemente una concentración de la proteína hedgehog de 1 - 20 mg/ml de vehículo y más. Son particularmente ventajosos los vehículos que contienen proteínas hedgehog en una concentración de 10 mg/ml de vehículo (volumen de disolución, volumen de gel o volumen de esponja) o más. Las proteínas hedgehog son intrínsecamente poco solubles. Una cuestión objeto de la invención es un procedimiento para la producción de una matriz de vehículo recubierta con proteína hedgehog que se caracteriza porque la matriz de vehículo se incuba con una disolución de proteína hedgehog en una concentración de 3 mg/ml, que contiene arginina o iones argininio y se aísla la matriz de vehículo recubierta de esta manera.

Tales disoluciones son adecuadas para producir matrices de vehículo que contienen proteínas hedgehog en concentraciones farmacéuticamente eficaces y son adecuadas para aplicaciones farmacéuticas. Por tanto, una cuestión objeto adicional de la invención es un vehículo de colágeno que contiene 3 mg de proteína hedgehog modificada hidrofóbicamente o más, preferiblemente 10 mg o más por ml de matriz de vehículo y arginina o iones argininio (preferiblemente, sulfato de argininio). La concentración de arginina es preferiblemente de entre 10 y 500 mmol/l, preferiblemente en el intervalo de pH de entre 6 y 8.

La actividad dentro del sentido de la invención se entiende como la actividad de la fosfatasa alcalina (estimulación de la expresión de la fosfatasa alcalina) que puede inducir el polipéptido en las células de mamíferos (actividad en la prueba de la fosfatasa alcalina). En este método, se cultiva una línea celular de fibroblastos de ratón en un medio que contiene suero bovino fetal. Posteriormente a la adición de una muestra estéril filtrada, las células se lisan tras aproximadamente 5 días y se determina la fosfatasa alcalina en el lisado celular por medio de la escisión de un sustrato cromogénico (pNP, p-nitrofenol) (J. Asahina, Exp. Cell. Res. 222 (1996) 38 - 47 y T. Nakamura (1997)).

Una proteína hedgehog modificada hidrofóbicamente (lipofilizada) se entiende en la invención como una proteína señal segregada lipofilizada que es responsable de la formación de numerosas estructuras en la embriogénesis. Se utilizan preferible y particularmente sonic, indian o desert hh (Fietz M. et al., Development (Supl.) (1994) 43 - 51). Preferiblemente, se utiliza la forma procesada (dominio N-terminal maduro) de la proteína sonic hh descrita en el banco de datos del EMBL (European Molecular Biology Laboratory, laboratorio europeo de Biología Molecular) bajo el número L38518. Las proteínas de la familia hedgehog muestran una pronunciada homología en su secuencia de aminoácidos, que es por lo que también es preferible que se expresen aquellos ácidos nucleicos que codifican para las proteínas hedgehog, que son homólogas en un 80% o más con la secuencia mencionada anteriormente de la proteína sonic hedgehog.

Tal lipofilización se consigue preferiblemente mediante modificación química. Tal conjugado de proteína hedgehog contiene preferiblemente un polipéptido adicional que está unido covalentemente (preferiblemente en el extremo C-terminal y/o el extremo N-terminal) y se compone de preferiblemente 10 - 30 aminoácidos hidrófobos y/o aquellos aminoácidos que forman las hélices transmembrana. El polipéptido adicional contiene particular y preferiblemente de 2 - 12 lisinas y/o argininas pero sin la parte de polihistidina que sería adecuada para purificar el conjugado en una columna de quelato de Ni. Es preferible también unir covalentemente (preferiblemente en el extremo C-terminal y/o el extremo N-terminal) de 1 - 4 restos hidrocarbonados alifáticos, saturados o insaturados, con una longitud de cadena de 10 - 24 átomos de C o esteroides con una acción lipófila (hidrófoba). Además, se prefiere acoplar covalentemente tiocompuestos hidrófobos, tales como en particular el tiocolesterol y tioalcanos, tioalquenos, a proteínas hh a través de un puente disulfuro formado oxidativamente (preferiblemente en el extremo C-terminal y/o el extremo N-terminal y en este caso en la cisteína N-terminal).

La proteína se hidrofobiza mediante tales restos lipofilizantes que mejoran su interacción con las membranas lipídicas de las células eucarióticas, en particular de las células de los mamíferos.

En consecuencia, una proteína lipofilizada según la invención se entiende como una proteína hidrofobizada que tiene un aumento de la hidrofobicidad superficial en comparación con una proteína sin modificar, lo que aumenta su afinidad por moléculas apolares o anfífilos. El aumento del grado de lipofilicidad de la proteína puede medirse mediante el grado de integración en una capa lipídica, tal como se describe por ejemplo en Haque, Z. et al., J. Agric. Food Chem. 30 (1982), 481. Métodos para la modificación hidrófoba (lipofilizante) de proteínas se describen, por ejemplo, por Haque, Z. et al., J. Agric. Food Chem. 31 (1983), 1225 - 1230; Webb, R. J. et al., Biochemistry 37 (1998) 673 - 679; Hancock, J. F., Cell 63 (1990) 133 - 139; A Practical guide to membrane protein purification, Ed. G.v. Jagow, Hermannn Schägger (1994), (capítulo 16, páginas 535 - 554).

Tales proteínas hedgehog modificadas hidrofóbicamente se describen por ejemplo en la solicitud de patente europea 953 576.

La proteína precursora sonic hedgehog humana se compone de los aminoácidos 1 - 462 de la secuencia descrita en el banco de datos del EMBL bajo el número L38518. Los aminoácidos 1 - 23 representan el péptido señal, los aminoácidos 24 - 197 representan el dominio señal maduro, los aminoácidos 32 - 197 representan dominio señal acortado en 8 aminoácidos y los aminoácidos 198 - 462 representan el dominio autoprocesado C-terminal tras la escisión autoproteolítica.

La composición farmacéutica según la invención contiene una dosis farmacológicamente eficaz de la proteína hh y puede administrarse localmente. Es preferible utilizar las proteínas según la invención en combinación con otras proteínas de la familia hedgehog o factores de crecimiento óseo tales como las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) (Wozney et al., Cell. Mol. Biol. of Bone, Bone Morphogenetic Proteins and their Gene Expression (1993) Academic Press Inc., 131 - 167) u hormonas paratiroideas (Karablis et al., Genes and Development 8 (1994) 277 - 289) o factores de crecimiento similares a la insulina (IGF-I o II) o factores de crecimiento transformadores (TGF-\beta).

La composición farmacéutica se produce mediante la incubación de la proteína hedgehog lipofilizada con el vehículo o con el vehículo que contiene colágeno a un valor de pH de 4,5 o más. Preferiblemente, la incubación se lleva a cabo a un valor de pH neutro (pH 6 - 8) y preferiblemente en una disolución tamponada. A un pH de 4,5 o valores superiores de pH, la proteína hedgehog lipofilizada se une al vehículo mediante interacciones hidrófobas. Si la matriz de vehículo contiene adicionalmente un vehículo hidrófilo que puede unir proteínas por medio de interacciones iónicas (por ejemplo, un polisacárido aniónico), la proteína hedgehog también puede interaccionar entonces con esta parte del vehículo por medio de interacciones iónicas. Por este motivo, la razón de colágeno con respecto al resto hidrófilo del vehículo puede variar en un amplio intervalo. Sin embargo, es preferible que la razón del resto de colágeno con respecto al resto hidrófilo del vehículo sea de 1,5: 1 o más.

Además, es preferible para la producción de la composición farmacéutica añadir sustancias auxiliares tales como un azúcar (manitol, lactosa, glucosa, sacarosa, trehalosa, preferiblemente de 20 - 100 mg/ml) o aminoácidos tales como glicina o arginina, inhibidores de la oxidación tales como la metionina así como antioxidantes tales como EDTA, citrato, polietilenglicol (1 - 10% en peso), detergentes, preferiblemente detergentes no iónicos (preferiblemente del 0,005 - 1% en peso) tales como polisorbatos (Tween®20 o Tween®80) o polioxietilenos, agentes antiinflamatorios, anestésicos locales, antibióticos y/o estabilizadores tales como lípidos, ácidos grasos y glicerol.

En una realización preferida adicional, se prefiere una composición farmacéutica de la proteína hedgehog según la invención que contiene suramina y ésta puede utilizarse ventajosamente.

La composición farmacéutica puede contener sustancias farmacéuticas auxiliares adicionales.

En una realización preferida, la composición farmacéutica contiene la proteína hedgehog lipofilizada en una concentración de 0,1 - 100 mg/ml.

En una realización preferida, la composición farmacéutica contiene adicionalmente un tampón farmacéuticamente aceptable que es biocompatible, preferiblemente en el intervalo de entre pH 4 y pH 10, particular y preferiblemente en el intervalo de entre pH 6 y 8. El valor de pH de la composición farmacéutica debe ser ventajosamente superior a pH 4, con el fin de evitar la desnaturalización y el desprendimiento del zinc complejado en la proteína hedgehog. La concentración del tampón es preferiblemente de 1 - 500 mmol/l, en particular de 5 - 150 mmol/l y particular y preferiblemente de 10 - 100 mmol/l. En una realización adecuada, se utiliza como tampón, tampón de fosfato de potasio 300 mmol/l, pH 6,0 o cloruro de arginina 300 mmol/l, fosfato de potasio 10 mM, pH 6,0.

Los siguientes ejemplos, publicaciones y las figuras aclaran adicionalmente la invención, cuyo alcance protector resulta de las reivindicaciones de la patente. Los métodos descritos han de entenderse como ejemplos que describen todavía el contenido de la invención incluso después de hacer modificaciones.

Descripción de la figuras

Figura 1: Liberación in vitro de shh modificada hidrofóbicamente a partir de una matriz de colágeno (Helistat^{MR}).

Figura 2: Liberación in vitro de dipalmitil-shh a partir de una matriz de colágeno/alginato (Fibracol^{MR}).

Ejemplos Ejemplo 1 Liberación in vitro de proteínas hedgehog modificadas hidrofóbicamente a partir de una matriz de colágeno (Helis- tat^{MR})

Se aplicaron gota a gota alícuotas de 0,1 ml de disoluciones de proteínas hedgehog modificadas de manera diversa (palmitil-shh = 1xC16-shh, dipalmitil-shh = 2xC16-shh o colesteril-shh = Chol-shh) a esponjas de colágeno (Helistat^{MR}, Integra Life Sciences, EE.UU.) con dimensiones de 10 x 10 x 3 mm. Los vehículos cargados se congelaron (-70ºC), se liofilizaron y analizaron. Para esto, las esponjas se incubaron a 37ºC en un volumen adecuado de PBS (solución salina tamponada con fosfato). Se determina la cantidad de hh liberada por medio de rp-HPLC (HPLC en fase inversa) (véase la figura 1).

El análisis de la cinética de liberación in vitro muestra que Shh se libera de una manera sostenida o en pequeñas cantidades de la matriz de colágeno durante un periodo de 20 h (figura 1).

Puede observarse que in vitro sólo aproximadamente el 20% de la 2xC16-shh cargada se libera en las condiciones establecidas. El 80% restante de la proteína aplicada puede liberarse in vivo mediante la biodegradación del vehículo. Esta situación puede simularse in vitro mediante la degradación enzimática del vehículo de colágeno con colagenasa recombinante. Para esto, se transfirió una esponja de colágeno cargada con 2xC16-shh que se había incubado durante 14 h en las condiciones de liberación (véase anteriormente) a 490 \mul de tampón (50 mM de HEPES-NaOH, 800 mM de NaCl, 0,1% de Tween, pH 7,4) y se añadieron 10 \mul de colagenasa recombinante I (1 mg/ml, en 10 mM de Tris-Cl, 1 mM de CaCl_{2}, pH 7,4). Tras la incubación durante 2 h a 37ºC, se analiza la proteína hedgehog liberada por medio de HPLC en fase inversa y una prueba de actividad in vitro (inducción de la fosfatasa alcalina en células C3H10T1/2). Está claro a partir de este análisis que la fracción no liberada de 2xC16-shh (véase anteriormente), que permanece en el vehículo de colágeno en condiciones de liberación, puede liberarse por medio de digestión con colagenasa y su actividad no se pierde en este proceso (aproximadamente una recuperación del 80%).

Ejemplo 2 Liberación in vitro de la proteína hedgehog modificada hidrofóbicamente (dipalmitil-shh) a partir de una matriz de colágeno/alginato (Fibracol^{MR})

Se aplicaron gota a gota alícuotas de 0,05 ml de una disolución de dipalmitil-shh (1 mg/ml) a esponjas de colágeno-alginato (Fibracol^{MR}, Johnson & Johnson, EE.UU.) de aproximadamente 10 x 10 x 3 mm de tamaño. Los vehículos cargados se congelaron (-70ºC), se liofilizaron y analizaron. Para esto, las esponjas se incubaron a 37ºC en un volumen adecuado de PBS. Se determina la cantidad de 2xC16-shh liberada por medio de rp-HPLC (véase la figura 2).

Puede observarse que in vitro sólo aproximadamente el 10% de la 2xC16 cargada se libera en las condiciones establecidas. El 90% restante de la proteína aplicada puede liberarse in vivo mediante la biodegradación del vehículo. Esta situación puede simularse in vitro mediante la degradación enzimática parcial del vehículo con colagenasa recombinante. Para esto, se transfirieron los vehículos cargados con 2xC16-shh que se habían incubado en las condiciones de liberación (véase anteriormente) a 490 \mul de tampón (50 mM de HEPES-NaOH, 800 mM de NaCl, 0,1% de Tween, pH 7,4) y se añadieron 10 \mul de colagenasa recombinante I (1 mg/ml, en 10 mM de Tris-Cl, 1 mM de CaCl_{2}, pH 7,4). Tras la incubación durante 2 h a 37ºC, se analiza la proteína hedgehog liberada tras centrifugación por medio de HPLC en fase inversa. Está claro a partir de este análisis que la fracción no liberada de 2xC16-shh, que permanece en el vehículo de colágeno-alginato en condiciones de liberación, puede liberarse por medio de digestión con colagenasa (aproximadamente una recuperación del 80%; figura 2).

Bibliografía

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Yang et al., Development 124 (1997) 4393 - 4404

Claims (10)

1. Composición farmacéutica que contiene una proteína hedgehog modificada hidrofóbicamente y una proteína biodegradable como vehículo, en la que dicha proteína biodegradable une la proteína hedgehog y libera dicha proteína de una manera sostenida.

2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, que contiene colágeno soluble como vehículo.

3. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, que contiene colágeno reticulado, insoluble.

4. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que contiene un ácido hialurónico o alginato.

5. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que contiene una proteína hedgehog en una concentración de 0,1 - 100 mg/ml.

6. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la composición se tampona en un intervalo de pH entre 4,5 y 10.

7. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que contiene arginina o iones argininio.

8. Procedimiento para la producción de una composición farmacéutica, en el que se combina una proteína hedgehog modificada hidrofóbicamente en una cantidad terapéuticamente eficaz con una proteína biodegradable como vehículo, y en el que dicha proteína biodegradable une la proteína hedgehog y libera dicha proteína de una manera sostenida.

9. Procedimiento para la producción de una matriz de vehículo de proteína biodegradable, insoluble que contiene una proteína hedgehog modificada hidrofóbicamente, en el que la matriz de vehículo se incuba con una disolución que contiene la proteína hedgehog en una concentración de 3 mg/ml o más y arginina o iones argininio en una concentración de 10 mmol/l o más y se aísla la matriz de vehículo recubierta de esta manera, y en que dicha proteína biodegradable une la proteína hedgehog y libera dicha proteína de una manera sostenida.

10. Procedimiento para la producción de una composición de liberación sostenida según la reivindicación 1, en el que se combina una proteína hedgehog modificada hidrofóbicamente en una cantidad terapéuticamente eficaz con un vehículo de proteína biodegradable.