ES2219299T3 - Composicion farmaceutica de proteinas hedgehog modificadas hidrofobicamento y su uso. - Google Patents
Composicion farmaceutica de proteinas hedgehog modificadas hidrofobicamento y su uso.Info
- Publication number
- ES2219299T3 ES2219299T3 ES00902654T ES00902654T ES2219299T3 ES 2219299 T3 ES2219299 T3 ES 2219299T3 ES 00902654 T ES00902654 T ES 00902654T ES 00902654 T ES00902654 T ES 00902654T ES 2219299 T3 ES2219299 T3 ES 2219299T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- protein
- vehicle
- hedgehog
- pharmaceutical composition
- biodegradable
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Abstract
Composición farmacéutica que contiene una proteína hedgehog modificada hidrofóbicamente y una proteína biodegradable como vehículo, en la que dicha proteína biodegradable une la proteína hedgehog y libera dicha proteína de una manera sostenida.
Description
Composición farmacéutica de proteínas hedgehog
modificadas hidrofóbicamente y su uso.
La invención se refiere a una composición
farmacéutica de proteínas hedgehog modificadas hidrofóbicamente y su
uso, en particular para la liberación local de estas proteínas en
huesos o cartílagos.
Por proteínas hedgehog (hh) se entiende una
familia de proteínas señal segregadas que son responsables de la
formación de numerosas estructuras en la embriogénesis (J. C. Smith,
Cell 76 (1994) 193 - 196, N. Perrimon, Cell 80 (1995) 517 - 520, C.
Chiang et al., Nature 83 (1996) 407, M. J. Bitgood et
al., Curr. Biol. 6 (1996) 296, A. Vortkamp et al.,
Science 273 (1996) 613, C. J. Lai et al., Development 121
(1995) 2349). Durante su biosíntesis, se obtienen un dominio
N-terminal de 20 kD y un dominio
C-terminal de 25 kD tras la escisión de la secuencia
señal y su escisión autocatalítica. En su forma natural, el dominio
N-terminal está modificado con colesterol (J. A.
Porter et al., Science 274 (1996) 255 - 259). En las formas
de vida superiores, la familia hh está compuesta por al menos tres
elementos, concretamente "sonic", "indian" y "desert"
hh (shh, Ihh, Dhh; M. Fietz et al., Development (Supl.)
(1994) 43 - 51). Se observaron diferencias en la actividad de las
proteínas hedgehog que se produjeron de manera recombinante, tras su
producción en procariotas y eucariotas (M. Hynes et al.,
Neuron 15 (1995) 35 - 44 y T. Nakamura et al., Biochem.
Biophys. Res. Comm. 237 (1997) 465 - 469).
Hynes et al. comparan la actividad de hh
en el sobrenadante de 293 células de riñón de embrión humano
transformadas (hh eucarióticas) con las hh producidas a partir de
E.coli y hallan una actividad cuatro veces mayor de las hh
procedentes de los sobrenadantes de la línea celular de riñón. Se ha
debatido que el motivo de este aumento de actividad es un factor
accesorio adicional potencial que sólo se expresa en las células
eucarióticas, una transformación posterior a la traducción, un
extremo N-terminal diferente puesto que la hh
aislada a partir de E. coli contiene un 50% de una forma de
hh que porta dos aminoácidos (Gly-Ser)
N-terminal adicionales o se acorta en 5 - 6
aminoácidos, o un estado de agregación superior (por
ejemplo,mediante la unión a perlas de
níquel-agarosa).
Nakamura et al., comparan la actividad de
shh en el sobrenadante de fibroblastos transformados de embrión de
pollo con una proteína de fusión de shh aislada de E.coli que
todavía tiene una parte de polihistidina N-terminal.
La shh en el sobrenadante de los fibroblastos tiene una actividad
siete veces superior a la de la proteína de E.coli purificada
con respecto a la estimulación de la fosfatasa alcalina (FA) en la
mitad de las células C3H10T. Se postula que el aumento de la
actividad es debido a moléculas tales como, por ejemplo, proteínas
morfogenéticas óseas (BMP) que sólo están presentes en el
sobrenadante de las células eucarióticas y producen la inducción más
fuerte de la FA.
Kinto et al., FEBS Letters, 404 (1997) 319
- 323, describen que los fibroblastos que segregan hh inducen
formación de hueso ectópica en una implantación intramuscular sobre
colágeno. Así, las proteínas hedgehog tienen una actividad
osteoinductiva.
Del documento WO 90/08551, se conoce un
procedimiento para la producción de sistemas de administración de
proteínas con una liberación sostenida que utilizan alginato. Se
forma un sistema bifásico en el que la primera fase contiene una
concentración elevada de la proteína (disolución saturada) y la
segunda fase contiene alginato. Sin embargo, tal separación de fases
es difícil y complicada de llevar a cabo cuando se producen
composiciones farmacéuticas en grandes cantidades.
De Kikuchi, A. et al., J. Controlled
Release 47 (1997) 21 - 29, se conoce una liberación pulsátil de
dextrano a partir de complejos de alginato de calcio. Sin embargo,
no se describe por Kikuchi el acoplamiento de las proteínas hedgehog
a tales complejos.
En Trends in Biotechnology 14 (1996) 451 - 452,
Robinson, C. J. et al., describen la implantación
intraventricular de microesferas de alginato como un método para la
aplicación local de NGF (factor de crecimiento nervioso) o células
que segregan NGF. Sin embargo, no se describe una aplicación de las
proteínas hedgehog.
En J. Cell Physiol. 152 (1992) 422 - 429, Downs,
E. C. et al describen el uso de esferas de alginato de
calcio como un sistema de administración de factores de la
angiogénesis. Sin embargo, no se describe el uso de este método o
este sistema de administración para las proteínas hedgehog.
En Biotechnol. Bioeng. 31 (1988) 607 - 612, Crey,
C. J. y J. Dowsett describen el uso de esferas de alginato de
calcio/zinc como un sistema de administración para la insulina. Sin
embargo, no se describe una aplicación de este procedimiento para
producir sistemas de administración para las proteínas hedgehog.
Se conoce de Yang et al., Development 124
(1997) 4393 - 4404, que las altas concentraciones locales de
proteína hedgehog deben prevalecer durante un periodo de al menos 16
h en el sitio de acción en el organismo, para una actividad in
vivo farmacéuticamente eficaz. El sistema de vehículo para esto
descrito por Yang et al., es decir, el medio cromatográfico
cargado con proteína hedgehog, Affigel CM, el
Ni-agarosa descrito por Marti et al., en
Nature 375 (1995) 322 - 325 o el Affigel blue utilizado por
López-Martínez et al., en Curr. Biol. 5
(1995) 791 - 796 o las partículas de
heparina-agarosa que utilizaron son menos adecuados
para una aplicación farmacéutica puesto que son inmunógenos y pueden
producir reacciones inflamatorias.
Los inventores encontraron que el colágeno
vehículo biocompatible y biodegradable descrito por Kinto et
al. para las células que expresan hh es también inadecuado para
una aplicación farmacéutica local óptima de las proteínas hedgehog.
Se encontró que cuando los vehículos de colágeno se cargan con
proteínas hedgehog en condiciones fisiológicas (pH de
aproximadamente 7 y en ácidos débiles (hasta pH 4,5)), la mayoría de
las proteínas hedgehog aplicadas se liberan de la matriz en el plazo
de unos minutos. Cuando la carga se lleva a cabo en condiciones
ácidas (por debajo de pH 4,5) se desnaturaliza una gran cantidad de
la proteína hedgehog aplicada y se une irreversiblemente al
vehículo.
En el documento
EP-A-947201, se describe una
composición farmacéutica de una proteína hedgehog que se caracteriza
porque la proteína hedgehog se une a un vehículo hidrófilo que es
biocompatible, en la que el vehículo es un polímero que une la
proteína hedgehog como un vehículo cargado negativamente debido a
interacciones iónicas, la proteína hedgehog no se desnaturaliza
durante su unión al vehículo, contiene al menos de 0,1 a 2 restos
cargados negativamente por monómero en condiciones neutras, la carga
está en la forma de grupos ácidos, tiene un peso molecular medio de
al menos 50.000 Da y no contiene agarosa.
El objeto de la invención es prever una
composición farmacéutica de una proteína hedgehog modificada
hidrofóbicamente que contiene un vehículo biocompatible, en la que
el vehículo une la proteína hedgehog como una estructura activa
plegada y puede liberarla localmente in vivo en una forma
activa y de una manera sostenida. Tales formulaciones son
particularmente adecuadas para la reparación de defectos del hueso y
el cartílago y también pueden utilizarse para reparar defectos
neuronales o para una administración sistémica.
El objeto se consigue mediante una composición
farmacéutica de una proteína hedgehog modificada hidrofóbicamente
que se caracteriza porque esta composición contiene proteínas
hedgehog modificadas hidrofóbicamente y una proteína biodegradable o
un producto de degradación proteolítica de la misma como vehículo,
en la que dicha proteína biodegradable une la proteína hedgehog y
libera la proteína de una manera sostenida.
Sorprendentemente, ha resultado que las proteínas
hedgehog modificadas hidrofóbicamente pueden liberarse in
vivo de tal vehículo de una manera reversible, activa y
sostenida sin producir reacciones inmunogénicas y/o inflamatorias
in vivo. El vehículo puede ser un vehículo sólido tal como
una esponja o un vehículo inyectable tal como un gel. El vehículo
biodegradable preferido es colágeno o la gelatina producto de la
hidrólisis. También son adecuadas otras proteínas fibrosas vehículo
tales como la fibrina o la elastina y pueden utilizarse como fibras
proteicas intactas, como proteína solubilizada o como proteína
parcialmente hidrolizada.
El colágeno se entiende, según la invención,
preferiblemente como colágeno soluble, colágeno insoluble
(preferiblemente reticulado) atelocolágeno o gelatina. Según la
invención, el colágeno puede estar presente como una matriz sólida
(precipitado o liofilizado reticulado o no reticulado, como fibras,
como una dispersión o como un gel). El colágeno producido de manera
recombinante, así como el colágeno de tipo I o de tipo II y mezclas
de los mismos son particularmente adecuados. Por ejemplo, las fibras
de colágeno pueden prepararse según la patente británica número
1204438. Por ejemplo, puede prepararse colágeno soluble mediante
procedimientos tales como los descritos en las patentes británicas
números 990276 y 1184502. El producto que se prepara mediante estos
métodos puede denominarse como microgel y contiene una mezcla de
colágeno en diversas formas de agregación. El colágeno hidrolizado
puede obtenerse preferiblemente tratando el colágeno con tripsina.
Esto da como resultado una mezcla polidispersa de polipéptidos con
un peso molecular en el intervalo de entre aproximadamente 5000 y
70000. Preferiblemente, el colágeno se desnaturaliza en primer
lugar, por ejemplo, mediante tratamiento térmico antes del
tratamiento con tripsina.
El vehículo biodegradable, preferiblemente
colágeno, se utiliza preferiblemente como una esponja, tal como por
ejemplo, la esponja de colágeno Helistat^{MR} de la empresa
Integra Life Sciences Company, EE.UU.
Preferiblemente, se utiliza un colágeno como la
matriz de vehículo, particular y preferiblemente como una matriz de
vehículo soluble o insoluble. La matriz de vehículo se compone
particular y preferiblemente de una combinación del vehículo
biodegradable y un polisacárido aniónico, tal como preferiblemente
ácido hialurónico (así como formas químicamente reticuladas del
mismo), condroitín sulfato, poli(sulfato de vinilo), queratán
sulfato, dextrán sulfato, pectina, carragenina y otros
hidrocoloides, alginato sulfatado, dermatán sulfato, alginato,
preferiblemente alginato de calcio o complejos de proteína y
polisacáridos tales como los descritos, por ejemplo, en la patente
de los EE.UU. número 4.614.794 (Fibracol^{MR}, Johnson and
Johnson, EE.UU.) en los que el porcentaje en peso de los
polisacáridos cargados es del 10 - 50%. Una matriz insoluble en el
sentido de la invención significa que la matriz no se descompone
sustancialmente ni se disuelve significativamente en una disolución
tampón neutra in vitro en un plazo de 10 - 20 horas a
temperatura ambiente. A este respecto, se prefiere que el vehículo
utilizado según la invención contenga menos del 50%, preferiblemente
menos del 20% y particular, preferible y esencialmente ninguna
cantidad de polisacárido neutro. Es particularmente adecuada una
combinación de colágeno con ácido hialurónico con un peso molecular
de al menos 10^{6} dalton, en particular con un peso molecular de
4 x 10^{6} dalton.
Una liberación sostenida se entiende según la
invención como una liberación de la proteína hedgehog en una dosis
farmacológicamente eficaz durante un periodo definido de al menos 14
horas. Un efecto farmacológicamente se entiende como un efecto
neurológico sobre las células nerviosas, una condrogénesis y/o una
condroinducción y preferiblemente una osteogénesis y/o una
osteoinducción, tal como se describe en Kinto et al., FEBS
Letters, 404 (1997) 319 - 323, para la inducción ósea, por Miao
et al. en J. Neurosci. 17 (1997) 5891 - 5899 para el efecto
sobre las células nerviosas y por Stott et al. en J. Cell
Sci. 110 (1997) 2691 - 2701 para la inducción de células de
cartílago.
Se utiliza preferiblemente un vehículo degradable
enzimáticamente como el vehículo, que se degrada por enzimas (por
ejemplo, proteasas) segregadas por las células en las que se ha
producido la aplicación local in vivo. Sin embargo, la
semivida del vehículo debe ser de al menos 12 h pero puede ser de
varias semanas. Si el vehículo está compuesto por un polisacárido,
este vehículo se degrada preferiblemente por glucosidasas y por
hidrolasas que están presentes en y se segregan por la célula. Sin
embargo, tal biodegradabilidad del vehículo no es necesaria en cada
caso. Si la liberación se lleva a cabo para tratar osteoporosis o
enfermedades neuronales, es innecesaria la biodegradabilidad. Sin
embargo, tales vehículos son preferiblemente poco solubles en
condiciones fisiológicas y, por tanto, se absorben por el organismo
durante un periodo prolongado (de varias semanas a meses).
Se requieren disoluciones de proteínas hedgehog
en concentraciones elevadas para producir matrices del vehículo que
se recubren con proteínas hedgehog de tal manera que muestran una
eficacia farmacéutica adecuada cuando se aplican localmente. Ha
resultado que los vehículos farmacéuticamente aceptables recubiertos
con proteína hedgehog deben contener preferiblemente una
concentración de la proteína hedgehog de 1 - 20 mg/ml de vehículo y
más. Son particularmente ventajosos los vehículos que contienen
proteínas hedgehog en una concentración de 10 mg/ml de vehículo
(volumen de disolución, volumen de gel o volumen de esponja) o más.
Las proteínas hedgehog son intrínsecamente poco solubles. Una
cuestión objeto de la invención es un procedimiento para la
producción de una matriz de vehículo recubierta con proteína
hedgehog que se caracteriza porque la matriz de vehículo se incuba
con una disolución de proteína hedgehog en una concentración de 3
mg/ml, que contiene arginina o iones argininio y se aísla la matriz
de vehículo recubierta de esta manera.
Tales disoluciones son adecuadas para producir
matrices de vehículo que contienen proteínas hedgehog en
concentraciones farmacéuticamente eficaces y son adecuadas para
aplicaciones farmacéuticas. Por tanto, una cuestión objeto adicional
de la invención es un vehículo de colágeno que contiene 3 mg de
proteína hedgehog modificada hidrofóbicamente o más, preferiblemente
10 mg o más por ml de matriz de vehículo y arginina o iones
argininio (preferiblemente, sulfato de argininio). La concentración
de arginina es preferiblemente de entre 10 y 500 mmol/l,
preferiblemente en el intervalo de pH de entre 6 y 8.
La actividad dentro del sentido de la invención
se entiende como la actividad de la fosfatasa alcalina (estimulación
de la expresión de la fosfatasa alcalina) que puede inducir el
polipéptido en las células de mamíferos (actividad en la prueba de
la fosfatasa alcalina). En este método, se cultiva una línea celular
de fibroblastos de ratón en un medio que contiene suero bovino
fetal. Posteriormente a la adición de una muestra estéril filtrada,
las células se lisan tras aproximadamente 5 días y se determina la
fosfatasa alcalina en el lisado celular por medio de la escisión de
un sustrato cromogénico (pNP, p-nitrofenol) (J.
Asahina, Exp. Cell. Res. 222 (1996) 38 - 47 y T. Nakamura
(1997)).
Una proteína hedgehog modificada hidrofóbicamente
(lipofilizada) se entiende en la invención como una proteína señal
segregada lipofilizada que es responsable de la formación de
numerosas estructuras en la embriogénesis. Se utilizan preferible y
particularmente sonic, indian o desert hh (Fietz M. et al.,
Development (Supl.) (1994) 43 - 51). Preferiblemente, se utiliza la
forma procesada (dominio N-terminal maduro) de la
proteína sonic hh descrita en el banco de datos del EMBL (European
Molecular Biology Laboratory, laboratorio europeo de Biología
Molecular) bajo el número L38518. Las proteínas de la familia
hedgehog muestran una pronunciada homología en su secuencia de
aminoácidos, que es por lo que también es preferible que se expresen
aquellos ácidos nucleicos que codifican para las proteínas hedgehog,
que son homólogas en un 80% o más con la secuencia mencionada
anteriormente de la proteína sonic hedgehog.
Tal lipofilización se consigue preferiblemente
mediante modificación química. Tal conjugado de proteína hedgehog
contiene preferiblemente un polipéptido adicional que está unido
covalentemente (preferiblemente en el extremo
C-terminal y/o el extremo
N-terminal) y se compone de preferiblemente 10 - 30
aminoácidos hidrófobos y/o aquellos aminoácidos que forman las
hélices transmembrana. El polipéptido adicional contiene particular
y preferiblemente de 2 - 12 lisinas y/o argininas pero sin la parte
de polihistidina que sería adecuada para purificar el conjugado en
una columna de quelato de Ni. Es preferible también unir
covalentemente (preferiblemente en el extremo
C-terminal y/o el extremo
N-terminal) de 1 - 4 restos hidrocarbonados
alifáticos, saturados o insaturados, con una longitud de cadena de
10 - 24 átomos de C o esteroides con una acción lipófila
(hidrófoba). Además, se prefiere acoplar covalentemente
tiocompuestos hidrófobos, tales como en particular el tiocolesterol
y tioalcanos, tioalquenos, a proteínas hh a través de un puente
disulfuro formado oxidativamente (preferiblemente en el extremo
C-terminal y/o el extremo N-terminal
y en este caso en la cisteína N-terminal).
La proteína se hidrofobiza mediante tales restos
lipofilizantes que mejoran su interacción con las membranas
lipídicas de las células eucarióticas, en particular de las células
de los mamíferos.
En consecuencia, una proteína lipofilizada según
la invención se entiende como una proteína hidrofobizada que tiene
un aumento de la hidrofobicidad superficial en comparación con una
proteína sin modificar, lo que aumenta su afinidad por moléculas
apolares o anfífilos. El aumento del grado de lipofilicidad de la
proteína puede medirse mediante el grado de integración en una capa
lipídica, tal como se describe por ejemplo en Haque, Z. et
al., J. Agric. Food Chem. 30 (1982), 481. Métodos para la
modificación hidrófoba (lipofilizante) de proteínas se describen,
por ejemplo, por Haque, Z. et al., J. Agric. Food Chem. 31
(1983), 1225 - 1230; Webb, R. J. et al., Biochemistry 37
(1998) 673 - 679; Hancock, J. F., Cell 63 (1990) 133 - 139; A
Practical guide to membrane protein purification, Ed. G.v. Jagow,
Hermannn Schägger (1994), (capítulo 16, páginas 535 - 554).
Tales proteínas hedgehog modificadas
hidrofóbicamente se describen por ejemplo en la solicitud de patente
europea 953 576.
La proteína precursora sonic hedgehog humana se
compone de los aminoácidos 1 - 462 de la secuencia descrita en el
banco de datos del EMBL bajo el número L38518. Los aminoácidos 1 -
23 representan el péptido señal, los aminoácidos 24 - 197
representan el dominio señal maduro, los aminoácidos 32 - 197
representan dominio señal acortado en 8 aminoácidos y los
aminoácidos 198 - 462 representan el dominio autoprocesado
C-terminal tras la escisión autoproteolítica.
La composición farmacéutica según la invención
contiene una dosis farmacológicamente eficaz de la proteína hh y
puede administrarse localmente. Es preferible utilizar las proteínas
según la invención en combinación con otras proteínas de la familia
hedgehog o factores de crecimiento óseo tales como las proteínas
morfogenéticas óseas (BMP) (Wozney et al., Cell. Mol. Biol.
of Bone, Bone Morphogenetic Proteins and their Gene Expression
(1993) Academic Press Inc., 131 - 167) u hormonas paratiroideas
(Karablis et al., Genes and Development 8 (1994) 277 - 289)
o factores de crecimiento similares a la insulina
(IGF-I o II) o factores de crecimiento
transformadores (TGF-\beta).
La composición farmacéutica se produce mediante
la incubación de la proteína hedgehog lipofilizada con el vehículo o
con el vehículo que contiene colágeno a un valor de pH de 4,5 o más.
Preferiblemente, la incubación se lleva a cabo a un valor de pH
neutro (pH 6 - 8) y preferiblemente en una disolución tamponada. A
un pH de 4,5 o valores superiores de pH, la proteína hedgehog
lipofilizada se une al vehículo mediante interacciones hidrófobas.
Si la matriz de vehículo contiene adicionalmente un vehículo
hidrófilo que puede unir proteínas por medio de interacciones
iónicas (por ejemplo, un polisacárido aniónico), la proteína
hedgehog también puede interaccionar entonces con esta parte del
vehículo por medio de interacciones iónicas. Por este motivo, la
razón de colágeno con respecto al resto hidrófilo del vehículo puede
variar en un amplio intervalo. Sin embargo, es preferible que la
razón del resto de colágeno con respecto al resto hidrófilo del
vehículo sea de 1,5: 1 o más.
Además, es preferible para la producción de la
composición farmacéutica añadir sustancias auxiliares tales como un
azúcar (manitol, lactosa, glucosa, sacarosa, trehalosa,
preferiblemente de 20 - 100 mg/ml) o aminoácidos tales como glicina
o arginina, inhibidores de la oxidación tales como la metionina así
como antioxidantes tales como EDTA, citrato, polietilenglicol (1 -
10% en peso), detergentes, preferiblemente detergentes no iónicos
(preferiblemente del 0,005 - 1% en peso) tales como polisorbatos
(Tween®20 o Tween®80) o polioxietilenos, agentes antiinflamatorios,
anestésicos locales, antibióticos y/o estabilizadores tales como
lípidos, ácidos grasos y glicerol.
En una realización preferida adicional, se
prefiere una composición farmacéutica de la proteína hedgehog según
la invención que contiene suramina y ésta puede utilizarse
ventajosamente.
La composición farmacéutica puede contener
sustancias farmacéuticas auxiliares adicionales.
En una realización preferida, la composición
farmacéutica contiene la proteína hedgehog lipofilizada en una
concentración de 0,1 - 100 mg/ml.
En una realización preferida, la composición
farmacéutica contiene adicionalmente un tampón farmacéuticamente
aceptable que es biocompatible, preferiblemente en el intervalo de
entre pH 4 y pH 10, particular y preferiblemente en el intervalo de
entre pH 6 y 8. El valor de pH de la composición farmacéutica debe
ser ventajosamente superior a pH 4, con el fin de evitar la
desnaturalización y el desprendimiento del zinc complejado en la
proteína hedgehog. La concentración del tampón es preferiblemente de
1 - 500 mmol/l, en particular de 5 - 150 mmol/l y particular y
preferiblemente de 10 - 100 mmol/l. En una realización adecuada, se
utiliza como tampón, tampón de fosfato de potasio 300 mmol/l, pH 6,0
o cloruro de arginina 300 mmol/l, fosfato de potasio 10 mM, pH
6,0.
Los siguientes ejemplos, publicaciones y las
figuras aclaran adicionalmente la invención, cuyo alcance protector
resulta de las reivindicaciones de la patente. Los métodos descritos
han de entenderse como ejemplos que describen todavía el contenido
de la invención incluso después de hacer modificaciones.
Figura 1: Liberación in vitro de shh
modificada hidrofóbicamente a partir de una matriz de colágeno
(Helistat^{MR}).
Figura 2: Liberación in vitro de
dipalmitil-shh a partir de una matriz de
colágeno/alginato (Fibracol^{MR}).
Se aplicaron gota a gota alícuotas de 0,1 ml de
disoluciones de proteínas hedgehog modificadas de manera diversa
(palmitil-shh = 1xC16-shh,
dipalmitil-shh = 2xC16-shh o
colesteril-shh = Chol-shh) a
esponjas de colágeno (Helistat^{MR}, Integra Life Sciences,
EE.UU.) con dimensiones de 10 x 10 x 3 mm. Los vehículos cargados se
congelaron (-70ºC), se liofilizaron y analizaron. Para esto, las
esponjas se incubaron a 37ºC en un volumen adecuado de PBS (solución
salina tamponada con fosfato). Se determina la cantidad de hh
liberada por medio de rp-HPLC (HPLC en fase inversa)
(véase la figura 1).
El análisis de la cinética de liberación in
vitro muestra que Shh se libera de una manera sostenida o en
pequeñas cantidades de la matriz de colágeno durante un periodo de
20 h (figura 1).
Puede observarse que in vitro sólo
aproximadamente el 20% de la 2xC16-shh cargada se
libera en las condiciones establecidas. El 80% restante de la
proteína aplicada puede liberarse in vivo mediante la
biodegradación del vehículo. Esta situación puede simularse in
vitro mediante la degradación enzimática del vehículo de
colágeno con colagenasa recombinante. Para esto, se transfirió una
esponja de colágeno cargada con 2xC16-shh que se
había incubado durante 14 h en las condiciones de liberación (véase
anteriormente) a 490 \mul de tampón (50 mM de
HEPES-NaOH, 800 mM de NaCl, 0,1% de Tween, pH 7,4) y
se añadieron 10 \mul de colagenasa recombinante I (1 mg/ml, en 10
mM de Tris-Cl, 1 mM de CaCl_{2}, pH 7,4). Tras la
incubación durante 2 h a 37ºC, se analiza la proteína hedgehog
liberada por medio de HPLC en fase inversa y una prueba de actividad
in vitro (inducción de la fosfatasa alcalina en células
C3H10T1/2). Está claro a partir de este análisis que la fracción no
liberada de 2xC16-shh (véase anteriormente), que
permanece en el vehículo de colágeno en condiciones de liberación,
puede liberarse por medio de digestión con colagenasa y su actividad
no se pierde en este proceso (aproximadamente una recuperación del
80%).
Se aplicaron gota a gota alícuotas de 0,05 ml de
una disolución de dipalmitil-shh (1 mg/ml) a
esponjas de colágeno-alginato (Fibracol^{MR},
Johnson & Johnson, EE.UU.) de aproximadamente 10 x 10 x 3 mm de
tamaño. Los vehículos cargados se congelaron (-70ºC), se
liofilizaron y analizaron. Para esto, las esponjas se incubaron a
37ºC en un volumen adecuado de PBS. Se determina la cantidad de
2xC16-shh liberada por medio de
rp-HPLC (véase la figura 2).
Puede observarse que in vitro sólo
aproximadamente el 10% de la 2xC16 cargada se libera en las
condiciones establecidas. El 90% restante de la proteína aplicada
puede liberarse in vivo mediante la biodegradación del
vehículo. Esta situación puede simularse in vitro mediante la
degradación enzimática parcial del vehículo con colagenasa
recombinante. Para esto, se transfirieron los vehículos cargados con
2xC16-shh que se habían incubado en las condiciones
de liberación (véase anteriormente) a 490 \mul de tampón (50 mM de
HEPES-NaOH, 800 mM de NaCl, 0,1% de Tween, pH 7,4) y
se añadieron 10 \mul de colagenasa recombinante I (1 mg/ml, en 10
mM de Tris-Cl, 1 mM de CaCl_{2}, pH 7,4). Tras la
incubación durante 2 h a 37ºC, se analiza la proteína hedgehog
liberada tras centrifugación por medio de HPLC en fase inversa. Está
claro a partir de este análisis que la fracción no liberada de
2xC16-shh, que permanece en el vehículo de
colágeno-alginato en condiciones de liberación,
puede liberarse por medio de digestión con colagenasa
(aproximadamente una recuperación del 80%; figura 2).
A practical guide to membrane protein
purification, Ed. G.v. Jagow, Hermann Schägger (1994),
capítulo 16, páginas 535 - 554.
Asahina, J., Exp. Cell. Res. 222
(1996) 38 - 47
Bitgood, M. J. et al., Curr. Biol.
6 (1996) 296
Patente británica número 1184502
Patente británica número 1204438
Patente británica número 990276
Chiang, C. et al., Nature 83
(1996) 407
Crey, C. J. et al., Biotechnol.
Bioeng. 31 (1988) 607 - 612
Downs, E. C. et al., J. Cellular
Physiology 152 (1992) 422 - 429
Documento EP-A 98 101 893.0
Solicitud de patente europea número
98107911.4
Solicitud de patente europea número
98116733.1
Fietz, M. et al., Development
(Supl.) (1994) 43 - 51
Hancock, J. F., Cell 63
(1990) 133 - 139
Haque, Z. et al., J. Agric. Food
Chem. 30 (1982) 481
Haque, Z. et al., J. Agric. Food
Chem. 31 (1983), 1225 - 1230
Hynes, M. et al., Neuron 15
(1995) 35 - 44
Karablis et al., Genes and
Development 8 (1994) 277 - 289
Kikuchi, A. et al., J. Controlled
Release 47 (1997) 21 - 29
Kinto et al., FEBS Letters, 404
(1997) 319 - 323
Lai, C. J. et al., Development 121
(1995) 2349
López-Martínez et al.,
en Curr. Biol. 5 (1995) 791 - 796
Marti et al., Nature 375
(1995) 322 - 325
Miao et al., J. Neurosci. 17
(1997) 5891 - 5899
Nakamura, T. et al., Biochem. Biophys.
Res. Comm. 237 (1997) 465 - 469
Perrimon, N., Cell 80 (1995)
517 - 520
Porter, J. A. et al., Science 274
(1996) 255 - 259
Robinson, C. J. et al., Trends in
Biotechnology 14 (1996) 451 - 452,
Smith, J. C., Cell 76 (1994)
193 - 196
Stott et al., J. Cell Sci. 110
(1997) 2691 - 2701
Patente de los EE.UU. 4.614.794
Vortkamp, A. et al., Science 273
(1996) 613
Webb, R. J. et al., Biochemistry 37
(1998) 673 - 679
Documento WO 90/08551
Wozney et al., Cell. Mol. Biol. of
Bone, Bone Morphogenetic Proteins and their Gene Expression,
(1993) Academic Press Inc. 131 - 167
Yang et al., Development 124
(1997) 4393 - 4404
Claims (10)
1. Composición farmacéutica que contiene una
proteína hedgehog modificada hidrofóbicamente y una proteína
biodegradable como vehículo, en la que dicha proteína biodegradable
une la proteína hedgehog y libera dicha proteína de una manera
sostenida.
2. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1, que contiene colágeno soluble como vehículo.
3. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1, que contiene colágeno reticulado, insoluble.
4. Composición farmacéutica según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, que contiene un ácido hialurónico o
alginato.
5. Composición farmacéutica según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, que contiene una proteína hedgehog en
una concentración de 0,1 - 100 mg/ml.
6. Composición farmacéutica según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la composición se tampona
en un intervalo de pH entre 4,5 y 10.
7. Composición farmacéutica según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 6, que contiene arginina o iones
argininio.
8. Procedimiento para la producción de una
composición farmacéutica, en el que se combina una proteína hedgehog
modificada hidrofóbicamente en una cantidad terapéuticamente eficaz
con una proteína biodegradable como vehículo, y en el que dicha
proteína biodegradable une la proteína hedgehog y libera dicha
proteína de una manera sostenida.
9. Procedimiento para la producción de una matriz
de vehículo de proteína biodegradable, insoluble que contiene una
proteína hedgehog modificada hidrofóbicamente, en el que la matriz
de vehículo se incuba con una disolución que contiene la proteína
hedgehog en una concentración de 3 mg/ml o más y arginina o iones
argininio en una concentración de 10 mmol/l o más y se aísla la
matriz de vehículo recubierta de esta manera, y en que dicha
proteína biodegradable une la proteína hedgehog y libera dicha
proteína de una manera sostenida.
10. Procedimiento para la producción de una
composición de liberación sostenida según la reivindicación 1, en el
que se combina una proteína hedgehog modificada hidrofóbicamente en
una cantidad terapéuticamente eficaz con un vehículo de proteína
biodegradable.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP99101643 | 1999-02-04 | ||
EP99101643A EP1025861A1 (de) | 1999-02-04 | 1999-02-04 | Pharmazeutische Zusammensetzung von hydrophob modifizierten Hedgehog-Proteinen und deren Verwendung |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2219299T3 true ES2219299T3 (es) | 2004-12-01 |
Family
ID=8237445
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES00902654T Expired - Lifetime ES2219299T3 (es) | 1999-02-04 | 2000-02-03 | Composicion farmaceutica de proteinas hedgehog modificadas hidrofobicamento y su uso. |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20060128621A1 (es) |
EP (2) | EP1025861A1 (es) |
JP (1) | JP2002536343A (es) |
AT (1) | ATE265234T1 (es) |
AU (1) | AU777729B2 (es) |
CA (1) | CA2361832A1 (es) |
DE (1) | DE60010230T2 (es) |
ES (1) | ES2219299T3 (es) |
PT (1) | PT1150716E (es) |
WO (1) | WO2000045848A1 (es) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2001255767A1 (en) * | 2000-04-28 | 2001-11-12 | Curis, Inc. | Methods and reagents for tissue engineering of cartilage in vitro |
JP5004505B2 (ja) * | 2006-05-18 | 2012-08-22 | 株式会社サンギ | 口腔用組成物 |
EP2268673B1 (en) * | 2008-03-28 | 2017-10-25 | The Regents of The University of California | Polypeptide-polymer conjugates and methods of use thereof |
US10765759B2 (en) | 2015-12-09 | 2020-09-08 | The Regents Of The University Of California | Methods of treating an ocular disease or disorder |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4518579A (en) * | 1979-08-31 | 1985-05-21 | Holles Laboratories | pH stabilized fluorescing ophthalmic composition containing fluorexon |
GB2148901A (en) * | 1983-10-04 | 1985-06-05 | Johnson & Johnson | Protein/polysaccharide complexes |
JPH04502768A (ja) * | 1989-01-26 | 1992-05-21 | アボット バイオテク,インコーポレイテッド | 疎水性蛋白質水溶液の安定化及び持続的放出ビヒクル |
US6231881B1 (en) * | 1992-02-24 | 2001-05-15 | Anton-Lewis Usala | Medium and matrix for long-term proliferation of cells |
WO1994008599A1 (en) * | 1992-10-14 | 1994-04-28 | The Regents Of The University Of Colorado | Ion-pairing of drugs for improved efficacy and delivery |
DE4242919A1 (de) * | 1992-12-18 | 1994-06-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur Herstellung von lagerstabilen wässrigen pharmazeutischen Zubereitungen von G-CSF |
US5789543A (en) * | 1993-12-30 | 1998-08-04 | President And Fellows Of Harvard College | Vertebrate embryonic pattern-inducing proteins and uses related thereto |
US5614794A (en) * | 1995-04-24 | 1997-03-25 | Shamrock Technology Company Limited | Horizontal deflection circuit for a multisync monitor |
US5866165A (en) * | 1997-01-15 | 1999-02-02 | Orquest, Inc. | Collagen-polysaccharide matrix for bone and cartilage repair |
AU757497B2 (en) * | 1997-12-03 | 2003-02-20 | Biogen, Inc. | Hydrophobically-modified protein compositions and methods |
EP0947201B1 (en) * | 1998-02-04 | 2006-06-28 | Curis, Inc. | Pharmaceutical composition of hedgehog proteins and use thereof |
EP0953576B1 (en) * | 1998-04-30 | 2005-11-02 | Curis, Inc. | Active hedgehog protein conjugate, process for its production and use |
EP0978285B1 (en) * | 1998-08-07 | 2005-11-23 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Stable pharmaceutical composition of hedgehog proteins and use thereof. |
-
1999
- 1999-02-04 EP EP99101643A patent/EP1025861A1/de not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-02-03 CA CA002361832A patent/CA2361832A1/en not_active Abandoned
- 2000-02-03 PT PT00902654T patent/PT1150716E/pt unknown
- 2000-02-03 JP JP2000596967A patent/JP2002536343A/ja active Pending
- 2000-02-03 ES ES00902654T patent/ES2219299T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-03 DE DE60010230T patent/DE60010230T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2000-02-03 AT AT00902654T patent/ATE265234T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-02-03 WO PCT/EP2000/000847 patent/WO2000045848A1/en active IP Right Grant
- 2000-02-03 AU AU24412/00A patent/AU777729B2/en not_active Ceased
- 2000-02-03 EP EP00902654A patent/EP1150716B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-11-14 US US11/273,724 patent/US20060128621A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2002536343A (ja) | 2002-10-29 |
EP1025861A1 (de) | 2000-08-09 |
WO2000045848A1 (en) | 2000-08-10 |
CA2361832A1 (en) | 2000-08-10 |
EP1150716A1 (en) | 2001-11-07 |
DE60010230T2 (de) | 2005-04-14 |
ATE265234T1 (de) | 2004-05-15 |
EP1150716B1 (en) | 2004-04-28 |
AU777729B2 (en) | 2004-10-28 |
PT1150716E (pt) | 2004-08-31 |
US20060128621A1 (en) | 2006-06-15 |
DE60010230D1 (de) | 2004-06-03 |
AU2441200A (en) | 2000-08-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2253851T3 (es) | Composicion farmaceutica estable de proteinas hedgehog y uso de la misma. | |
ES2258830T3 (es) | Proteina hedgehog hidrosoluble en complejo ionico y uso farmaceutico de la misma. | |
ES2219299T3 (es) | Composicion farmaceutica de proteinas hedgehog modificadas hidrofobicamento y su uso. | |
CA2260423C (en) | Pharmaceutical composition of hedgehog proteins and use thereof | |
EP0947201B1 (en) | Pharmaceutical composition of hedgehog proteins and use thereof | |
HRP990036A2 (en) | Pharmaceutical composition of hedgehog proteins and the use thereof | |
KR20000017144A (ko) | 헤지호그 단백질의 약제학적 조성물 및 이의 용도 | |
CZ274699A3 (cs) | Prostředek obsahující "hedgehog" protein | |
MXPA99008037A (es) | Composicion farmaceutica soluble en agua en un complejo ionico y el uso de la misma |