KR20170100634A - 골 복구에서의 골유도 분자의 전달 향상을 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

골 복구에서의 골유도 분자의 전달 향상을 위한 시스템 및 방법 Download PDF

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에릭 제이. 반더플로그
하워드 시허먼
크리스토퍼 지. 윌슨
존 우즈니
크리스토퍼 브라운
존 캠보우리스
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Abstract

생체적합성 매트릭스 물질 내에 도입될 수 있는 다공성 세라믹 과립에 골유도성 작용제가 적재되어 있는 합성 골유도성 골 이식편의 제조를 위한 시스템 및 방법이 제공된다. 일부 경우에서, 과립의 적재는 저-pH 완충제의 사용 및 예비-처리에 의해 촉진된다.

Description

골 복구에서의 골유도 분자의 전달 향상을 위한 시스템 및 방법
[관련 출원의 상호 참조]
본 출원은 (i) 2014년 12월 29일자 반데르플로에그(Vanderploeg) 등의 미국 특허 가출원 제62/097,363호, (ii) 2015년 4월 7일자 윌슨(Wilson) 등의 미국 가출원 제62/144,276호, 및 (iii) 2015년 6월 19일자 반데르플로에그 등의 미국 특허 가출원 제62/182,301호에 대하여 35 U.S.C. §119(e)하 우선권의 특혜를 주장하는 바이다. 전기 출원들 각각의 전체 개시내용은 모든 목적에 있어서 본원에 참조로써 개재된다.
[기술분야]
본 출원은 의료 장치 및 생물학적 치료법, 더 구체적으로는 골 시멘트, 골 퍼티 및 과립-바인더 복합재에 관한 것이다.
매년 대략 2백만회의 정형외과 시술에서 골 이식편이 사용되는데, 일반적으로 세 가지 형태 중 하나를 취한다. 통상적으로 환자의 일 부위에서 수확되어 동일 환자의 또 다른 부위로 이식될 골로 구성되는 자가이식편은 골 이식 재료의 기준이 되는데, 이와 같은 재료가 동시에 골전도성 (새로운 골 성장을 위한 스캐폴드로 작용함)이며, 골유도성 (골모세포의 발생을 촉진함)이고, 골원성 (새로운 골을 형성하는 골모세포를 함유함)이기 때문이다. 그러나, 자가이식편의 공급에 있어서의 한계는 시신-유래 동종이식편의 사용을 필요로 하게 하였다. 자가이식편에 비해 그것이 더 가용하기는 하지만, 동종이식편은 숙주-이식편 면역 반응을 촉발할 수 있거나 감염성 질환 또는 프리온 질환을 전파할 수 있어서, 종종 멸균되거나 세포를 제거하도록 처리됨으로써 그의 골원성이 제거된다.
인간-유래 골 이식편 재료의 단점은 통상적으로 페이스트 또는 퍼티로 제공되는 칼슘 세라믹 및/또는 시멘트를 포함하는 합성 골 이식편 재료에 대한 점증하는 관심을 야기하였다. 이와 같은 재료는 골전도성이기는 하지만, 골유도성이거나 골원성이지는 않다. 그의 효능을 향상시키기 위하여, 합성 칼슘-함유 재료에는 골유도성 물질, 구체적으로는 골 형태원성 단백질 (BMP), 예컨대 BMP-2, BMP-7, 또는 다른 성장 인자 예컨대 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 및/또는 전환 성장 인자 베타 (TGF-β)가 적재되고 있다. 그러나, 적지 않은 기술적 과제들이 합성 골 이식편 대체물에의 골유도성 물질의 효율적인 도입을 막고 있으며, 이는 다시 고-품질 골유도성 합성 골 이식편 재료의 개발을 제한하고 있다.
한 가지 과제는 한번의 짧은 폭발적인 방출보다는 오랜 시간 동안 골유도성 물질을 제공하며 새로운 골 성장을 지지하는 적절한 물리적 특징들을 가지는 이식편 매트릭스의 개발이었다. 적절한 물리적 특징들을 가지는 재료의 제조는 하기의 몇 가지 경쟁적인 요구들을 조율하는 것을 포함하는데: 이상적인 재료는 이식 동안 및 후에 이식편에 적용되는 부하를 견디기에 충분하게 강성이어야 하며; 그것은 세포 및 조직 침윤을 가능케 하는 충분한 다공성을 가져야 하고; 그것은 새로운 골에 의한 그의 대체를 가능케 하는 속도로 분해되거나 용해되어야 하며; 그것은 골 생성에 적절한 시간 및 공간적 방식으로 골유도성 물질을 용출해야한다. 이러한 설계 기준들 각각을 충족하는 최적의 이식편 매트릭스는 아직 실현되지 않고 있어서, 현재 시중에서 구입가능한 BMP-용출 합성 골 이식편은 이들 요건을 충족하지 못한다. 따라서, 이러한 경쟁적인 필요성들을 조화시키며 골유도성 물질, 특히 BMP의 최적 방출을 제공하는 합성 골 이식편 재료에 대한 필요성이 존재한다.
[발명의 개요]
본 발명은 최적의 물리적 특징들과의 조합으로써 향상된 골유도성 단백질 용출을 나타내는 합성 골 이식편 재료는 물론 그의 제조 및 사용 방법을 제공하는 것에 의해, 관련 기술분야의 중요한 비충족 요구를 해소한다. 일 측면에서, 본 발명은 칼슘 세라믹 과립, 골유도성 단백질 및 생체적합성 매트릭스를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 생체적합성 매트릭스 내에 배치되는 상기 칼슘 세라믹 과립은 적어도 하나의 거대세공 및 적어도 하나의 미세세공을 포함하며, 약 30 m2/g을 초과하는 비표면적을 가진다. 일부 경우에서, 상기 조성물은 하기 범위들 중 하나의 평균 단면 치수를 가지는 다수의 칼슘 세라믹 과립을 포함한다: 80-250 마이크로미터, 90-425 마이크로미터, 425-800 마이크로미터 및 1-2 mm. 다양한 경우에서는, 상기 적어도 하나의 거대세공이 40 내지 100 마이크로미터의 단면 치수를 가지거나, 상기 적어도 하나의 미세세공이 대략 10 마이크로미터의 단면 치수를 가지거나, 및/또는 골유도성 단백질이 적어도 하나의 미세세공 내 과립 표면에 흡착된다. 또한, 일부 경우에서는, 이식 후 7일 내지 14일의 기간 후, 골유도성 단백질 중 적어도 50 %가 적어도 하나의 칼슘 세라믹 과립 중에 유지된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 칼슘 과립 자체에 관한 것으로써, 상기 과립은 적어도 하나의 거대세공 및 적어도 하나의 미세세공을 포함하며, 약 50 내지 약 80 m2/g의 비표면적을 가진다. 상기 과립은 또한 하기의 특징들 중 하나 이상을 포함한다: 과립이 약 80 내지 약 1000 마이크로미터의 단면 치수를 가지고 적어도 하나의 거대세공이 약 20 내지 약 50 마이크로미터의 단면 치수를 가지거나, 및/또는 적어도 하나의 미세세공이 대략 10 마이크로미터의 단면 치수를 가지거나, 및/또는 골유도성 단백질이 적어도 하나의 미세세공 내 과립 표면에 흡착되고; 임의적으로 다시 이식 후 7 내지 14일의 기간 후, 골유도성 단백질 중 적어도 50 %가 과립 중에 유지됨.
또 다른 측면에서, 본 발명은 30 m2/g을 초과하는 비표면적을 가지며 과립 내부상의 적어도 하나의 표면을 한정하는 상호연결된 미세세공 네트워크를 가지는 사전형성된 칼슘 세라믹 과립, 그리고 단백질이 과립의 중심에 가까운 적어도 하나의 내부 표면 중 일부는 물론 과립 외부 부근의 내부 표면 중 일부상에 분포하도록 상기 적어도 하나의 표면과 결합되어 있는 골유도성 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 예를 들어, 일부 경우에서, 중심 부근 (즉 중심으로부터 외부 표면까지 평균 거리의 대략 20 %, 또는 일부 경우에서는 10 %인 반경 이내) 내부 표면상 골유도성 단백질의 농도는 과립의 외부 표면상에서 발견되는 단백질 농도의 적어도 33 %일 수 있다 (예를 들면 중심 부근 농도에 대한 표면상 단백질 농도의 비가 3 미만일 수 있음). 다른 실시양태에서, 중심 부근 단백질 농도는 외부 표면상 농도의 적어도 12 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % 또는 80 %이다. 약간 다르게 말하자면, 다양한 경우에서 표면상 농도 대 중심 부근 농도의 비는 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1 또는 심지어는 대략 1:1일 수 있다.
본 발명의 이와 같은 측면에 따른 조성물은 상기 과립을 4.5 미만의 pH를 가지며 골유도성 단백질 및 2.3 내지 4.5의 pKa를 가지는 완충제를 포함하는 제1 용액과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다. 일부 경우에서, 상기 제1 용액은 약 4의 pH를 가지며, 본질적으로 골유도성 단백질, 5 mM의 글루탐산, 0.15 중량%의 글리신, 1 중량%의 수크로스 및 멸균 주사용수로 이루어진다. 다른 경우에서, 제1 용액은 약 3.5의 pH를 가지며, 본질적으로 골유도성 단백질, 25 mM의 글루탐산, 0.75 중량%의 글리신, 1 중량%의 수크로스 및 멸균 주사용수로 이루어진다. 또 다른 경우에서, 제1 용액은 약 4의 pH를 가지며, 본질적으로 골유도성 단백질, 25 mM의 글루탐산, 2 중량%의 글리신, 1 중량%의 수크로스 및 멸균 주사용수로 이루어진다. 더 일반적으로, 상기 완충제는 글리신, 락트산, 아세트산, 포름산, 말산, 말론산, 글루탐산, 아스파르트산, 시트르산, 타르타르산, 인산, 푸마르산 및 숙신산 중 1종 이상일 수 있다. 일부 경우에서, 제1 용액과 접촉시키기 전에, 상기 과립은 7 미만의 pH를 가진다. 상기 방법은 상기한 과립의 내부 및 외부 표면을 따른 골유도성 단백질의 분포를 촉진한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 환자의 골 조직을 (a) 30 m2/g을 초과하는 비표면적을 가지며, 과립 내부상의 적어도 하나의 표면을 한정하는 상호연결된 미세세공 네트워크를 가지는 칼슘 세라믹 과립, 및 (b) 상기 적어도 하나의 내부 표면과 결합되어 있으며 과립 중심 부근의 내부 표면 중 일부 및 과립 외부 부근의 내부 표면상에 분포하는 골유도성 단백질을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 환자의 치료 방법에 관한 것이다. 상기 골 조직은 임의적으로 골 및/또는 척추골의 외상성 손상 부위이다. 상기 조성물은 생체적합성 매트릭스 (임의적으로 콜라겐을 함유함)를 포함할 수 있으며, 이와 같은 경우 세라믹 과립은 매트릭스 내에 배치된다. 바람직한 경우에서 (모든 경우에서 반드시 그러한 것은 아님), 중심 부근 골유도성 단백질의 농도는 과립의 외부 표면상에서 발견되는 단백질 농도의 적어도 33 %이다 (예를 들면 중심 부근 농도에 대한 표면상 단백질 농도의 비가 3 미만일 수 있음). 다른 실시양태에서, 중심 부근 단백질 농도는 외부 표면상 농도의 적어도 12 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % 또는 80 %이다. 약간 다르게 말하자면, 다양한 경우에서 표면상 농도 대 중심 부근 농도의 비는 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1 또는 심지어는 대략 1:1일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다공성 중합체 매트릭스 (임의적으로 콜라겐을 포함함), 다공성 중합체 매트릭스와 접촉 (예컨대 그의 표면에 삽입, 부분적으로 삽입 및/또는 적용)되며 30 m2/g을 초과하는 비표면적을 가지고 과립 내부상의 적어도 하나의 표면을 한정하는 상호연결된 미세세공 네트워크를 가지는 칼슘 세라믹 과립, 그리고 골유도성 단백질의 농도가 과립 중심 부근의 내부 표면과 과립 외부 부근 내부 표면상에서 실질적으로 동일하도록 상기 적어도 하나의 내부 표면과 결합되어 있는 골유도성 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 경우에서, 상기 매트릭스는 약 150 내지 약 300 마이크로미터의 평균 직경을 가지는 다수의 세공을 가지는 스펀지이다. 대안적으로 또는 더하여, 상기 골유도성 단백질은 상기 과립을 골유도성 단백질 및 2.3 내지 4.5의 pKa를 가지는 완충제를 포함하며 4.5 미만의 pH를 가지는 제1 용액과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 과립의 적어도 하나의 내부 표면과 결합된다. 바람직한 경우에서 (모든 경우에서 반드시 그러한 것은 아님), 중심 부근 골유도성 단백질의 농도는 과립의 외부 표면상에서 발견되는 단백질 농도의 적어도 33 %이다 (예를 들면 중심 부근 농도에 대한 표면상 단백질 농도의 비가 3 미만일 수 있음). 다른 실시양태에서, 중심 부근 단백질 농도는 외부 표면상 농도의 적어도 12 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % 또는 80 %이다. 약간 다르게 말하자면, 다양한 경우에서 표면상 농도 대 중심 부근 농도의 비는 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1 또는 심지어는 대략 1:1일 수 있다.
첨부 도면으로써 본 발명의 소정 실시양태들을 예시한다. 도면이 반드시 축적에 맞는 것은 아니라는 것, 그리고 본 발명의 이해에 필요하지 않거나 다른 세부사항을 인지하기 어렵게 하는 세부사항이 생략될 수 있다는 것은 알고 있을 것이다. 본 발명이 반드시 본원에서 예시되는 특정 실시양태로 제한되지는 않는다는 것은 알고 있을 것이다.
도 1은 토끼 척골 절골술 모델에서의, 흡수성 콜라겐 스펀지 (ACS)상에, 그리고 완충제 (0.7 mg/mL) 중으로 전달된 0.2 mg/mL의 rhBMP-2와 비교한, rhBMP-2/칼슘 포스페이트 매트릭스 (CPM, 0.7 및 4.2 mg/mL)로 주사된 후의 rhBMP-2 (개시 투여량 중 %, 평균±SD)의 계내 체류 대 시간 (일)을 나타낸다.
도 2A 내지 2D는 8주에 과립화 칼슘 포스페이트 매트릭스 (CPM) 중으로 전달된 BMP-2를 사용한 처리와 비교한, 흡수성 콜라겐 스펀지 (ACS) 중으로 전달된 BMP-2를 사용한 처리에 반응하는 비인간 영장류 비골 절골술 모델에서의 가골 형성의 비교를 나타낸다. 패널 A 및 B에 나타낸 BMP-2/ACS-처리된 절골술은 ACS 담체 내보다는 미세다공성 ACS 담체 외부에서의 골 형성에 기인하는 중공 가골 구조를 가진다. 반면, 패널 C 및 D에 나타낸 BMP-2/CPM-처리 복구는 더 느린 BMP-2 방출 프로파일에 기인하는 훨씬 더 균일한 가골 구조를 가진다.
도 3은 낮은 비표면적을 가지는 2종의 BCP 과립과 비교한, 고도의 비표면적을 가지는 칼슘 결핍 히드록시아파타이트 과립 (CDHA)상으로 전달된 BMP-2의 시험관내 적재/체류 프로파일 (온/오프 속도)을 나타낸다. BMP는 24시간의 기간에 걸쳐 BMP 완충제 용액 중에서 CaP 과립상으로 적재하였다. 다음에, 생체 내에서의 혈청 단백질에 대한 노출을 모방하기 위하여, 20 % 소 혈청을 함유하는 용액 중에서 BMP-적재 CaP 과립을 인큐베이팅하였다. 고도 비표면적의 CDHA 과립은 낮은 비표면적의 BCP 과립에 비해 더 효율적으로 BMP-2를 적재하였다. 또한, 후속 13-일의 기간 동안 70 %를 초과하는 적재된 BMP-2가 과립에 결합되어 유지되었다. 반면, 낮은 비표면적의 BCP 과립 양자는 처음 24시간 이내에 상당량의 BMP-2를 빠르게 방출하였으며, 13일차에 처음 적재된 BMP-2 중 20 % 미만을 유지하였다.
도 4는 일수로 나타낸 시간의 함수로서의, 흡수성 콜라겐 스펀지 (ACS)와 비교한, CDHA 다공성 고도 SSA (비표면적) 과립, CDHA 비-다공성 고도 SSA 과립, 거대다공성 칼슘 포스페이트 시멘트 (CaP), 60:40 HA/TCP 다공성 과립, 15:85 HA/TCP 다공성 과립 중으로 전달된 BMP-2의 시험관내 체류 프로파일 (개시값 중의 %)을 나타낸다. 다공성이 있고 없는 고도 비표면적 CDHA 과립 및 CaP 시멘트가 단독이거나 콜라겐 스펀지 내에 함유된 것 중 어느 하나인 ACS 및 저 SSA 과립에 비해 탁월한 BMP 시험관내 체류를 나타내었다.
도 5는 내부 세공 구조가 없는 고도 SSA CDHA 과립 및 다공성 구조를 가지는 저 SSA 60:40 HA:TCP 과립과 비교한, 미세다공성 및 거대다공성 구조를 가지는 고도 SSA CDHA 과립의 래트에서의 근육내 이식 모델을 사용한 생체내 BMP-2 체류 프로파일을 나타낸다. 저 SSA 과립은 가장 낮은 BMP-2 체류를 나타내었으며, 다공성 구조가 없는 고도 SSA 과립은 약간만 향상된 BMP-2 체류 프로파일을 나타내었다. 그러나, 다공성 구조를 가지는 고도 SSA 과립은 처음 단백질 중 50 %가 적어도 12일 동안 여전히 유지됨으로써, 탁월한 BMP-2 체류를 나타내었다. 다공성 구조를 가지는 고도 SSA 과립의 BMP-2 체류 프로파일은 BMP가 시멘트 매트릭스 내에 포획되는 CaP 시멘트의 것과 뚜렷하게 유사하였다.
도 6은 일수로 나타낸 시간의 함수로서의, 거대다공성 내부 구조만을 가지는 고도 SSA CDHA 과립 및 내부 구조가 없는 고도 SSA CDHA 과립과 비교한, 미세다공성 및 거대다공성 내부 구조를 가지는 고도 비표면적 (SSA) 칼슘 결핍 히드록시아파타이트 (CDHA) 과립 중으로 전달된 BMP-2의 시험관내 체류 프로파일을 나타낸다. 미세다공성 및 거대다공성 내부 구조 모두를 가지는 고도 SSA CDHA 과립이 최고 백분율의 가용한 BMP를 적재하였다. 거대다공성 내부 구조를 가지는 고도 SSA CDHA 과립은 중간 백분율의 가용성 BMP를 적재하였다. 내부 구조가 없는 고도 SSA CDHA 과립은 최소 백분율의 가용한 BMP를 적재하였다. 이후의 체류 프로파일은 3종 과립 유형 모두에서 유사하였다.
도 7A 및 7B는 본 발명의 소정 실시양태에 따른 적재 완충제가 없고 (A) 있는 (B) BMP-기재 골유도성 단백질이 적재된 과립의 현미경사진을 나타낸다. 7A는 형광 표지된 BMP가 약하게 완충된 용액 중으로 전달될 경우, 단백질이 세라믹 과립의 표면으로 제한된다는 것을 나타낸다. 반면, 형광 표지된 BMP가 충분히 완충된 저 pH 용액 중으로 전달될 경우, 단백질은 세라믹 과립의 내부 표면으로 침투하여 거기에 국소화될 수 있다.
도 8A 내지 8F는 다양한 완충제 조성물 중으로 형광 표지된 BMP가 적재된 미처리 (A-C) 및 산 예비-처리된 ("에칭된") (D-F) 과립의 현미경사진을 나타낸다. 첫 번째 컬럼 (A 및 D)에서는, 낮은 완충 용량의 pH 4.0인 완충제 ("BVB-001 완충제"; 조성은 표 2 참조) 중으로 단백질을 과립에 적재하였다. 두 번째 컬럼 (B 및 E)에서는, 중간 완충 용량의 pH 3.5인 완충제 ("BVB-005 완충제") 중으로 단백질을 과립에 적재하였다. 세 번째 컬럼에서는, 높은 완충 용량의 pH 3.0인 완충제 ("BVB-010 완충제") 중으로 단백질을 과립에 적재하였다. 단백질의 분포는 A 및 D에서 과립 표면에 집중되던 것에서 완충 용량이 증가하고 pH가 감소하면서 더 균일한 분포로 이동하였다 (즉 단백질이 과립의 중심 부근 세공 표면 및 외부 표면 부근을 따라 분포됨). 에칭된 과립과 BVB-010 완충제의 조합은 가장 균일한 단백질 분포를 제공하였다.
도 9A 및 9B는 형광-표지된 BMP 단백질이 적재된 과립의 형광 현미경사진을 나타낸다. 도 9C 및 9D는 약한 완충제 (BVB-001 완충제) 또는 강한 완충제 (1 M 아세트산) 중으로 전달되었을 때의 과립 전체에 걸친 형광 표지 BMP 단백질로부터의 신호의 정량을 나타낸다. 도 9A 및 C는 약하게 완충된 시스템에서는 거의 대부분의 BMP가 과립의 외부 부근에 제한되는 반면, 강하게 완충된 시스템에서는 BMP가 중심과 외부 양자 사이로 더 균일하게 분포된다는 것을 입증하고 있다. 주변 대 중심 형광의 비는 총 신호 중 적어도 30 %가 중심에서 발견됨으로써, 강한 완충제에서 더 낮았다 (예컨대 1:1에 더 가까움). 도 9D는 이것이 적어도 부분적으로는 과립 중심에서의 신호의 증가로 인한 것이라는 것을 입증하고 있다.
도 10은 가변적인 완충제 조성에서의 처리되지 않거나 에칭된 과립과의 BMP의 인큐베이션 후의 식염수 세척과 구아니딘 HCl 추출 사이의 단백질 분배를 도시한다. 식염수 세척의 단백질은 과립에 느슨하게 결합된 것으로 간주되는 반면, 구아니딘 HCl 추출의 단백질은 과립에 견고하게 결합된 것으로 간주된다. 처리되지 않는 과립에서, 느슨하게 결합된 BMP의 양은 완충 용량이 증가하고 pH가 감소하면서 (즉 "BVB-001"로부터 "BVB-010" 완충제 조건으로) 감소한다. 에칭된 과립의 경우, 높은 완충 용량의 pH 3인 완충제 (BVB-010) 중으로 BMP가 적재될 때까지 유사한 패턴이 관찰되었는데, 이 경우에서는 느슨하게 결합된 단백질의 분율이 BVB-001 및 BVB-005 조건에서의 것에 비해 급격하게 증가하였다.
도 11은 알칼리성 과립 (예컨대 pH 8.5)에서, BMP가 응집되는 경향이 있으며 (높은 A320 값), 응집 정도는 일반적으로 완충제의 강도가 증가하면서 감소한다 (BVB-001→BVB-012→BVB-010 완충제)는 것을 나타낸다. 또한, 저 pH 과립 (예컨대 pH 5.2)에서는, BMP가 전체적으로 덜 응집됨으로써, 과립 내부로의 전달을 더 잘 가능케 하는 경향이 있다.
도 12A 내지 12D는 복잡한 내부 구조를 가지는 CDHA 과립의 연마된 표면의 SEM 사진을 나타낸다. 과립은 대략 10 um 크기의 고도로 상호연결된 세공들을 함유한다. 최고 배율에서는, CDHA 과립의 고도 비표면적 특징을 발생시키는 세공 내의 개별 CaP 결정 침상체를 관찰할 수 있다. 최적의 생체내 BMP 체류는 BMP 용액이 미세다공성 구조를 침투함으로써 내부 CaP 표면에 BMP가 결합하고 거기에서 그것이 파골세포와 같은 침습성 세포 군집으로부터 보호되는 것을 가능케 하는 것에 기인할 가능성이 있다.
도 13A 내지 13D는 본 발명 과립의 물리적 및 화학적 특징을 도시하는 것으로써, 이들 특징이 잘 조절되는 속도로 생체 내에서 BMP를 전달하는 능력을 가능케 한다는 것을 입증하고 있다. 도 13A-B는 본 발명 과립의 구조를 나타내는 것으로써, 내부 구조 (A) 및 개방된 표면 구조 (B)의 SEM을 통하여, 상호연결된 세공 구조를 입증하고 있다. 도 13C는 충분히 완충된 pH 4의 용액 중으로 전달될 경우의 과립의 내부 구조로 침투하는 형광-표지된 BMP를 도시한다. 도 13D는 반응 동안 BMP가 전체적으로 시멘트 내에 포획되는 칼슘 포스페이트 시멘트에서의 BMP 체류와 비교한, 본 발명의 사전형성된 CaP 과립의 BMP 체류 프로파일을 나타낸다. 이러한 데이터는 본 발명이 본원에서 기술되는 중요한 설계 특징들을 실시하는 것에 의해 CaP 시멘트의 BMP 체류 프로파일을 모방할 수 있다는 것을 입증하고 있다.
골유도성 조성물
본 발명의 조성물을 이용한 합성 골 이식편 (호환가능하게 "이식물" 또는 "구성체"로도 지칭됨)은 일반적으로 하기 3종의 구성요소를 포함한다: 골전도성 물질, 예컨대 칼슘 세라믹 또는 다른 고체 무기질체, 골유도성 물질 예컨대 골 형태원성 단백질, 및 생체적합성 매트릭스 예컨대 콜라겐 스펀지. 본원에서 사용될 때, 골전도성 물질은 골모세포, 전구-골모세포, 골전구 세포, 중간엽 줄기 세포, 및 골격 조직을 합성하고/거나 유지하는 세포로 분화될 수 있거나 또는 그의 발생을 달리 촉진할 수 있는 기타 세포를 포함한 골모세포성 세포들의 내성장(ingrowth) 또는 표면성장(ongrowth)을 촉진하는 임의의 물질을 지칭한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 골전도성 물질은 과립상에 적재되는 골유도성 물질의 지속적인 방출을 제공하도록 적합화된 골전도성 칼슘 포스페이트 세라믹을 포함하는 과립이다. 일부 경우에서, 상기 과립은 상호연결된 복잡한 다공성 구조를 포함한다. 본 발명자들이 본 발명의 구성체, 시스템 및 방법에 사용하기에 최적인 BMP 결합 및 용출 특성을 나타낸다는 것을 발견한 대표적인 과립에 대해서는 보흐너(Bohner) 등의 국제 특허 출원 제PCT/CH2014/000085 및 PCT/CH2015/000092호에 기술되어 있다. 이들 출원 양자의 전체 개시내용은 모든 목적에 있어서 본원에 개재된다.
상기 과립은 일반적으로 본 발명의 이식물이 계내에서 유지되면서 골의 형성 및 치유에 최적인 시간 기간 (예컨대 수주 또는 수개월) 동안 골유도성 물질을 방출하는 것을 가능케 하는 데에 적절한 조성 및 구조를 가지는 임의의 적합한 골전도성 물질로 제조된다. 이러한 특징들이 적용분야마다 달라질 수 있기는 하지만, 상기 과립은 일반적으로 모노칼슘 포스페이트 일수화물, 디칼슘 포스페이트, 디칼슘 포스페이트 데히드레이트(dehydrate), 옥토칼슘 포스페이트, 침전 히드록시아파타이트, 침전 비정질 칼슘 포스페이트, 모노칼슘 포스페이트, 알파-트리칼슘 포스페이트 (α-TCP), 베타-트리칼슘 포스페이트 (β-TCP), 소결 히드록시아파타이트, 옥시아파타이트, 테트라칼슘 포스페이트, 히드록시아파타이트, 칼슘-결핍 히드록시아파타이트 및 이들의 조합을 포함하나, 비제한적이다.
골유도성 물질은 일반적으로 전구 세포의 군집으로부터의 골모세포의 생성을 자극하는 펩티드 및 비-펩티드 성장 인자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 골유도성 물질은 전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 상과의 구성원, 예컨대 BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-9, 또는 그의 전체 개시내용이 모든 목적에 있어서 의거 참조로써 개재되는 베라시(Berasi) 등의 발명의 명칭이 "Designer Osteogenic Proteins"인 U.S. 특허 제8,952,131호에 기술되어 있는 변조(designer) BMP 예컨대 BMP-GER 또는 BMP-GER-NR 키메라 BMP이다. 다른 실시양태에서, 골유도성 물질은 섬유모세포 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 소형 분자, 뉴클레오티드, 지질, 또는 본원에서 열거되는 인자들 중 하나 이상의 조합이다.
본 발명에 따른 이식물 (본원에서는 "구성체"로도 지칭됨)의 세 번째 구성요소는 생체적합성 매트릭스로써, (a) 과립과 함께 사용될 경우, 이식시 거기에 가해지는 부하를 견디기에 충분한 강성 및/또는 컬럼 강도(column strength)를 나타내며, (b) 과도한 염증 (즉 새로운 골의 형성 또는 부러진 골의 치유를 억제하거나 막기에 충분한 염증)을 야기하거나, 골모세포의 증식을 억제하거나, 달리 과립 및/또는 골유도성 물질의 활성을 방해하지 않고, (c) 한정된 영역 내에서의 새로운 골의 침착을 가능케 하도록 적절한 기간 동안 충분한 응집력(cohesion)을 가지는 임의의 적합한 생체적합성 물질일 수 있다. 또한, 생체적합성 매트릭스는 임의적으로 분해가능하고/거나 골전도성이다. 다양한 실시양태에서, 생체적합성 매트릭스는 히아루론산 (HA) 및 그의 관능화되거나 변형된 버전, 동물의 것인지 재조합 인간의 것인지에 관계없는 콜라겐, 젤라틴 (동물 또는 재조합 인간), 피브린, 키토산, 알기네이트, 아가로스, 자가-조립 펩티드, 전혈, 혈소판-풍부 혈장, 골수 흡인물, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 그의 유도체, 폴리(락티드-co-글리콜리드), 폴리(카프로락톤), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴록사머 및 관련 기술분야에 알려져 있는 기타 열민감성 또는 역-열민감성 중합체를 포함한 관능화되어 있거나 달리 가교-결합가능한 합성 생체적합성 중합체, 및 전기 중 임의의 하나 이상의 공중합체 또는 혼합물이다.
이식물 설계의 기술적 고려사항
상기한 바와 같이 골유도성 물질, 과립 및 생체적합성 매트릭스를 포함하는 본 발명의 이식물은 일반적으로 골 성장 및 치유의 촉진에 맞추어 설계되었으며 현재 가용한 합성 골 이식 재료는 나타내지 않는 특징들을 가진다. 본원에서 기술되는 이식물의 한 가지 중요한 구별되는 특징은 그것이 인간에서 골 형성을 유도하기에 충분한 기간 동안 골유도성 물질을 보유하고 방출한다는 것이다.
BMP는 주로 골의 복구 부위 또는 주변 연조직 중 어느 하나에 존재하는 골모세포 전구체의 분화를 자극하는 것에 의해 골 형성을 유도한다. 생리학적 골 복구는 골의 무기 상에 저장되어 있는 피코그램/펨토그램 양의 BMP 방출, 및 복구 부위의 골 전구 세포에 의해 분비되는 새로 합성된 BMP에 의해 자극된다. 음성 조절인자와 함께, 이러한 두 가지 공급원은 복구 부위에서의 BMP 농도를 성공적인 골 복구를 유도하는 데에 적절한 시간량 동안 생리학적 수준으로 유지한다.
외인성 BMP는 이상적으로는 생리학적 BMP 반응을 모방하는 양 및 기간으로 BMP를 용출하는 구성체 중으로 전달된다. 그러나, 일반적으로 세포 수준에서 생리학적 BMP 농도를 달성하고 적절한 시간량 동안 생리학적 농도를 유지하는 데에는, 훨씬 더 큰 약학적 BMP 농도의 투여가 요구된다는 것을 알아야 한다. 이는 완전히 알려져 있지 않은 인자들의 조합에 기인한다. 어떠한 이론에 의해서도 얽매이고자 하는 것은 아니나, 이러한 구성체에서의 생리학-초과 BMP 농도에 대한 필요성을 야기하는 한 가지 인자는 골로부터의 내인성 BMP 및 세포로부터의 새롭게 형성되는 내인성 BMP의 생리학적 국소 방출의 효능을 모방하는 외인성 BMP의 능력부재일 수 있다. 또한, rhBMP는 일반적으로 생리학적 pH에서 불용성이어서, (역시 어떠한 이론에 의해서도 얽매이고자 하는 것은 아니나) 많은 외인성으로 전달되는 BMP가 생물학적으로는 가용하지 않을 수 있다.
골 복구를 자극하는 데에 요구되는 외인성 rhBMP의 양은 종 의존성인 것으로 보인다. 경험적 데이터는 개, 양 및 염소를 포함한 더 큰 동물에 비해 설치류 및 토끼와 같은 소형 동물에서 골 형성을 자극하는 데에 더 낮은 외인성 rhBMP 농도가 요구된다는 것을 암시하고 있다. 비인간 영장류 및 인간은 골 복구를 자극하는 데에 최고의 외인성 rhBMP 농도를 필요로 하는 것으로 보인다. 예를 들어, 개에서의 골 복구를 위하여 흡수성 콜라겐 스펀지 (ACS) 중으로 전달되는 rhBMP-2의 FDA 승인 농도는 0.2 mg/mL로써, 사람에서의 1.5 mg/mL와 비교된다. 요구되는 외인성 rhBMP 농도에 있어서의 이와 같은 차이에 기여하는 인자들 역시 분명하게 알려져 있지 않으나, 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 동물 모델에서의 발견을 인간 환자에 대한 그의 적용가능성에 대하여 평가하는 데에 있어서, 종-간 차이가 고려되어야 한다는 것이 이해될 것이다.
마찬가지로, 조직에 BMP가 전달되어야 하는 기간은 종에 따라 달라지는 바: 설치류 및 토끼에서의 복구를 위한 BMP 체류 시간은 그의 빠른 고유 골 형성 속도로 인하여 수일만큼 짧을 수 있는 반면, 비인간 영장류 및 인간 환자는 일반적으로 수주의 BMP 체류 시간을 필요로 한다. 어떠한 이론에 의해서도 얽매이고자 하는 것은 아니나, 영장류 및 인간에서 관찰되는 더 긴 기간은 치유 과정이 수술 또는 외상에 의해 야기되는 처음의 이화성 염증 단계로부터 골모세포 전구체, 및 융합/복구 과정을 지지하는 연관되어 있는 새로운 혈관 단위의 이동 및 분화를 포함하는 동화 단계로 전이되는 시간량과 관련되어 있는 것으로 보인다. 설치류에 최적인 짧은 BMP 체류 시간은 더 느린 골 형성 속도를 가지는 동물에서는 골 복구를 자극하기에 충분한 시간량 동안 생리학적 BMP 수준을 유지하지 못할 수 있다. 반대로, 빠른 고유 골 형성 속도를 가지는 동물에서, 더 긴 체류 프로파일을 가지는 담체로부터는 최적의 골 형성을 자극하기에 충분한 양으로 BMP가 방출되지 못할 수 있다.
일 예로서, 완충제 용액 중에서 복구 부위로 국소적으로 전달되는 BMP의 체류 시간은 극히 짧아서, 상대적으로 다량의 BMP가 용액 중으로 전달되는 경우에도, 적정한 골 반응은 설치류 모델에서만 자극된다. 비-인간 영장류 및 인간 환자에서의 적용의 경우, 수주의 기간 동안 치료 부위에 BMP를 국소화하기 위하여, 연장-방출 담체가 바람직하게 사용된다.
연장된 국소 BMP 방출을 제공하기 위한 한 가지 전략은 내인성 세포외 매트릭스에 대한 BMP의 결합을 모방한 담체를 이용하는 것이다. 일 예로서, 콜라겐성 담체는 내인성 콜라겐을 포함한 세포외 매트릭스 성분에 대한 BMP의 고유한 결합 특성으로 인하여 (어떠한 이론에도 얽매이고자 하는 것은 아님) BMP 용액에 비해 더 긴 BMP 체류 시간을 나타낸다. 칼슘 포스페이트 매트릭스 (CPM)을 포함한 세라믹 담체는 매트릭스로부터 BMP가 방출되는 기간을 더 연장할 수 있다. 세라믹 담체로부터의 BMP의 방출은 골로부터의 BMP 방출에서 관찰되는 것과 동일한 파골성 흡수(osteoclastic resorption)를 필요로 할 수 있다. 이와 같은 독특한 특성으로 인하여, 본 발명에서 사용되는 바와 같은 복합재 담체 내에 삽입된 세라믹 성분을 포함하는 이식물은 다른 자연 발생 및 합성 생체재료에 비해 탁월한 BMP 전달용 비히클이 될 수 있다.
효능 고려사항 이외에, 담체로부터의 BMP 방출을 조절하는 것 역시 환자의 안전성에 중요하다. 지주골 흡수(trabecular bone resorption)의 회피와 관련하여, 종판으로 침투되는 체간 융합과 연관되어 있는 중간골(metaphyseal bone) 내 또는 지주골로의 BMP의 빠른 방출은 상당수의 파골세포 전구체 세포도 존재하는 위치에서의 골모세포 전구체 세포의 빠른 상향조절을 초래한다. 이러한 두 가지 세포 유형 사이의 정상적인 상호 신호의 결과로서, 충분한 성숙한 파골세포들이 생성됨으로써, 골 형성 전에 지주골의 일시적인 흡수를 야기한다. 이와 같은 현상은 부분적으로 체간 융합 및 중간골 복구에 BMP가 사용되는 경우에 종종 관찰되는 골용해의 원인이 될 수 있다.
최적의 BMP 전달을 위한 과립의 설계
칼슘 포스페이트 시멘트를 사용한 이전의 경험은 시멘트 자체 내의 BMP의 도입이 분절 복구, 골간 복구 및 골중간 복구를 포함한 다양한 징후에서 최적의 골 형성을 위한 적절한 BMP 체류 (도 1)를 제공한다는 것을 입증하고 있다. 그러나, 칼슘 시멘트 경화는 경화시 존재하는 조건에 따라 크게 달라지며, 다공성 등과 같은 경화되는 시멘트의 물리적 특성이 개별 적용분야에 따라 상당히 가변적일 수 있다. 이와 같은 가변성은 사전형성된 칼슘 세라믹 과립과 같은 다른 더 신뢰성 있는 담체 물질에 대한 조사를 촉발하였다.
이론에 의해 얽매이고자 하는 것은 아니나, 본 발명의 과립 또는 다른 담체를 사용하여 관찰되는 최적의 BMP 체류 프로파일 (도 4 및 도 5)은 부분적으로 담체 물질 자체 내에 도입된 BMP의 세포-기반 파골세포 흡수의 결과이다. 담체가 시멘트인 경우, BMP는 시멘트 분말 전구체를 수화하는 BMP 용액을 사용하는 것에 의해 시멘트 내에 도입된다. 교착 반응 동안, BMP는 고도의 친화성으로 빠르게 형성되는 저조하게 결정질인 히드록시아파타이트의 표면에 결합하여, 시멘트 내는 물론 시멘트 표면상에 포획된다. 이후, BMP는 시멘트 흡수 과정 동안 파골세포에 의해 생성되는 낮은 pH 환경에 의해 아마도 가용성인 형태로 점차적으로 방출된다. 파골세포가 함유되어 있는 모든 BMP를 방출하기 위해서는 시멘트를 완전히 흡수해야 한다.
반면, 교착 반응이 발생한 후 BMP가 현재 가용한 사전형성 칼슘 포스페이트 시멘트 입자에 첨가되는 경우, 그것은 해당 입자의 외부 표면상에 농축되는 경향이 있다. 결과적으로, 상당한 과립 흡수에 대한 필요도 없이 파골세포가 빠르게 접근하여 거의 모든 BMP를 방출할 수 있기 때문에, BMP 체류가 상당히 감소된다 (즉 방출이 훨씬 더 빠른 경향이 있음).
이와 관련하여, BMP가 칼슘 시멘트 내로 도입되는 경우, 그것은 현재 가용한 CaP 과립에 BMP가 첨가되는 경우에 관찰되는 것에 비해 더 예상가능하고 일관성 있게 방출된다. 어떠한 이론에 의해서도 얽매이고자 하는 것은 아니나, 역시 CaP 시멘트로부터의 방출의 일관성은 부분적으로 방출 과정에서의 파골세포-매개 흡수의 연관에 기인하는 것으로 여겨진다. 또한 마찬가지로, CaP 시멘트에서 관찰되는 일관성 있는 방출 프로파일은 사전형성된 과립을 사용하여서는 용이하게 재현되지 않는다.
이전에 논의된 칼슘 포스페이트 매트릭스 (CPM) 중으로 전달되는 rhBMP-2를 평가하는 이전의 연구로 볼 때, 사람에서의 사전형성된 CaP 과립을 이용하는 BMP의 목표 BMP 체류 프로파일은 최소한의 처음 24시간의 폭발적인 방출, 대략 1주의 반감기, 및 대략 2주의 평균 체류 시간을 필요로 한다. 최적의 BMP 체류 프로파일을 나타내는 사전형성된 CaP 과립 복합재 담체의 능력은 과립 고유의 수많은 파라미터들에 따라 달라진다. CaP 과립의 BMP 결합 친화성은 BMP 결합 및 시험관내/생체내 체류의 속도를 결정한다. BMP 결합 친화성은 다시 과립의 표면 화학 및 비표면적 (나노규모 조도)에 따라 달라진다. 이들 파라미터는 BMP가 과립의 표면과 결합되는 정도를 정하는 것을 돕지만, 시멘트에서 관찰되는 BMP 체류 및 방출 동역학을 모방하기에는 충분하지 않아서; 과립은 또한 적절한 내부 구조도 가져야 한다. 이상적인 과립 구조는 (a) 시멘트에서 달성가능한 것과 유사한 양으로 BMP를 과립에 적재하기에 충분한 내부 표면적을 제공하는 동시에, (b) 용액 중 BMP가 과립의 내부 세공 표면에 접근하는 것을 가능케 하는 과립의 유체 침윤을 허용하고, (c) 과립의 압축 강도를 그의 생체 내에서의 사용에 필요한 임계치 미만으로 감소시키지 않는 방식으로 거대세공 (40 내지 100 마이크로미터 정도의 직경 또는 단면 치수를 가지는 세공) 및 미세세공 (단면이 대략 10 마이크로미터인 세공) 모두를 포함한다. 현재 가용한 과립은 이들 기준을 충족하지 못하는 반면, 이러한 요건들을 충족하는 CaP 과립 (하기하는 바와 같음)에서는, BMP 방출 프로파일이 CaP 시멘트에서 관찰되는 것과 일치하는데, 내부 세공 표면과 결합되어 있는 BMP가 파골세포에게 있어서는 용이하게 접근가능하지 않기 때문에, 그와 같은 과립으로부터의 BMP의 방출은 파골세포 흡수에 따라 달라지는 것으로 생각된다 (이론에 의해 얽매이고자 하는 것은 아님).
50-80 m2/g 범위의 비표면적 (SSA)을 가지는 CaP 과립은 최적의 시험관내 BMP 결합을 나타내는 것으로 보인다 (도 3-6). 고도의 비표면적은 CaP에 대한 BMP의 결합에 가용한 표면적을 증가시키는 것에 의해 결합을 증가시킬 가능성이 있다. 고도 비표면적의 CDHA 과립은 낮은 비표면적의 BCP 과립에 비해 BMP-2를 더 빠르게 적재하여, 더 높은 백분율의 가용 BMP-2를 적재한다 (도 3). 또한, 80 %를 초과하는 적재 BMP-2가 차후 12-일의 기간 동안 과립에 결합되어 유지된다 (도 3). 반면, 낮은 비표면적의 BCP 과립 양자는 처음 24시간 이내에 상당량의 BMP-2를 빠르게 방출하였으며, 13일차에 처음에 적재되었던 BMP-2 중 20 % 미만을 유지하였다. 광범위한 비표면적을 가지는 많은 수의 시중 과립들의 평가가 이와 같은 결과를 확인해 주었다.
흥미롭게도, 내부 과립 구조의 부가 (예를 들면 미세세공의 도입을 통함)는 또한 BMP-2 결합 속도, 그리고 특히 고도의 비표면적을 가지는 더 대형인 CDHA 과립에 결합되는 BMP-2의 양을 추가적으로 증가시키는 것으로 보인다 (도 4-6). 이와 같은 현상에 대한 설명은 결합에 가용한 추가적인 내부 표면, 및 내부 구조를 가지는 과립의 BMP 함유 유체를 과립으로 전달하는 능력과 관련될 수 있다. 이는 내부 구조가 없는 과립의 외부 표면이 BMP로 포화되거나 외부 표면상의 우선적인 BMP 결합 부위들이 포화될 경우에 중요할 수 있다. 내부 구조가 없는 과립에 대비한 미세다공성 구조 내 표면으로부터의 BMP-2의 확산 제한은 BMP 체류 프로파일을 증가시키는 데에 역할을 할 수도 있다.
또한, 내부 구조는 CaP 과립에서의 최적의 생체내 BMP 체류에 필요한 것으로 보인다 (도 5). BMP가 과립 내부로 침투하는 것을 가능케 하기에 충분한 내부 구조를 가지는 고도 SSA의 과립은 내부 구조가 없는 고도 SSA 과립에 비해 탁월한 생체내 BMP 체류를 나타낸다. 최적의 생체내 BMP 체류는 BMP 용액을 과립 내부로 전달하여 BMP가 과립의 내부 표면에 결합하는 것은 가능케 하는 반면 파골세포가 진입하는 것은 방지하는 과립 내부 구조의 고유한 치수에 기인할 가능성이 있다. 결과적으로, 파골세포는 대부분의 과립을 외부로부터 흡수하여 내부에 결합된 BMP를 방출해야 한다. 이와 같은 현상은 CaP 시멘트로부터의 최적의 파골세포 매개 점진 BMP 방출을 모방한다.
본 발명 칼슘 세라믹 과립의 내부 구조는 많은 경우에 미세세공에 의해 정해진다. 미세세공 치수는 일반적으로 입자 자체의 크기에 따라 달라지나, 일반적인 문제로서, 본 발명 칼슘 세라믹 과립의 미세세공은 유체가 과립 표면과 조우하기 전에 입자로 깊게 유동하거나 이동하는 것을 가능케 하도록 크기조정된다. 따라서, 이러한 과립이 BMP-함유 용액중에서 인큐베이팅될 경우, BMP는 과립 내부 내의 깊은 표면으로 침투하여 거기에 부착될 수 있다.
최적의 BMP 체류를 가능케 하는 데에 필요한 내부 과립 구조의 형상구조 설계 기준은 복잡하다. 용액 중 BMP가 과립 외부상의 CaP 표면에 직접 접촉하지 않고 과립으로 침투하는 것을 가능케 하는 데에는, 2-10 um 수준의 미세세공이 필요하다. 이는 특히 고도의 비표면적을 가지는 CaP에 대한 BMP의 높은 결합 친화성의 결과로서 요구된다. 이러한 유형의 표면은 BMP에 결합하는 극히 높은 보유 능력을 가진다. 이론에 의해 얽매이고자 하는 것은 아니나, 적절한 미세다공성 없이는 과립의 외부 표면이 모든 가용한 용액 중 BMP를 여과 제거함으로써, 과립 내부 표면으로의 BMP 침투를 막게 될 것으로 생각된다. 미세세공의 이와 같은 크기 범위는 또한 다핵화된 파골세포가 과립 내부로 침투하는 것을 방지하기에 충분하게 작다. 약 200 um를 초과하는 직경을 가지는 과립의 경우, BMP 용액을 추가적으로 과립 내부로 더 전달하는 데에 20-50 um 수준의 더 큰 이차적인 거대세공이 요구된다. 바람직한 실시양태에서는, 거대세공과 미세세공이 유체가 과립으로 침투할 수 있는 상호연결된 통로들의 네트워크를 형성한다. 그러나, 낮은 비표면적을 가지는 과립의 최적 BMP 체류에 내부 구조로써 충분한 것은 아님에 유의해야 한다.
과립의 단백질 적재를 위한 용액 및 키트
본 발명의 구성체에서, BMP는 주로 구성체 내에 삽입된 세라믹 과립에 의해 보유된다. 그러나, 상기에서 논의된 바와 같이, BMP를 사용한 현재의 과립 적재 방법은 상기한 과립의 고도로 다공성인 구조를 침투하기 보다는 과립의 외부 표면상에 BMP 축적을 초래함으로써 단백질 "림(rim)"을 생성시킨다. 상기 단백질 림은 구성체 이식 후의 폭발적인 BMP 방출에 기여할 수 있는 반면, 과립으로의 BMP의 침투는 과립의 내부 표면과 결합되어 있는 BMP가 방출로부터 차폐되어 있는 한, 예를 들면 이식 부위에서의 파골세포 활성으로 인하여 이식된 과립이 분해될 때까지 연장된 방출 프로파일에 기여할 수 있다. 어떠한 이론에 의해서도 얽매이고자 하는 것은 아니나, 일반적으로 BMP는 저 pH, 저-이온 강도의 완충제 중에서 고도로 가용성인데; 이러한 특징을 가지는 현행 기술의 BMP 완충제들은 일반적으로 낮은 완충 용량을 가지고 있는 것으로 여겨진다. 반면, CaP 과립은 일반적으로 알칼리성인데; 이와 같은 차이가 현재의 방법을 사용한 과립으로의 BMP의 상대적으로 제한된 침윤에 기여할 수 있다.
본 발명자들은 과립의 내부 세공 구조로의 BMP의 침투를 촉진하는 하기 두 가지 인자들을 발견하였는데: 먼저, 본 발명자들은 BMP-함유 용액과의 과립 (단독 또는 구성체에 도입된 것 중 어느 하나)의 인큐베이션 ("단백질 적재" 단계로 지칭됨) 전의 과립을 "에칭(etching)"하는 것으로도 지칭되는 산 용액 (예를 들면 50 mM 염산 (HCl), 또는 더욱 바람직하게는 500 mM 아세트산)을 사용한 과립의 예비-처리가 과립의 내부 세공 구조로의 BMP의 수송을 돕는다는 것을 발견하였다. 유사한 결과를 달성하는 대안적인 전략은 과립의 최종 pH가 pH 7 미만, 더욱 바람직하게는 pH 6 이하로 유지되도록 하는 방식으로 과립을 제조하는 것이다. 두 번째로, 본 발명자들은 일반적으로 비교적 더 높은 완충 용량을 가지는 것들을 포함한 소정의 조성물들 역시 과립 내부 세공으로의 BMP의 수송을 촉진한다는 것을 발견하였다. 이들 인자 각각은 하기에서 다시 논의한다:
단백질 적재 전의 과립의 에칭과 관련하여, 본 발명자들은 칼슘-결핍 히드록시아파타이트 (CDHA) 과립 그램 중량 당 10 mL 비에서의 산성 용액, 바람직하게는 500 mM 아세트산 중에서의 15분-4시간 인큐베이션에 의한 과립의 예비-처리가 과립으로의 BMP의 침윤을 향상시킨다는 것을 발견하였다. 산을 사용한 과립의 처리는 과립의 pH를 pH 5.5-6.0으로 낮춘다. 과립의 pH는 0.25 그램의 과립이 1 % NaCl을 포함하는 용액 12.5 mL와 혼합된 다음 생성되는 슬러리로부터 pH 측정이 이루어지는 표준 프로토콜에 따라 측정된다.
완충제가 충분히 높은 완충 용량 및 충분히 낮은 pH의 것인 소정의 경우에서, 에칭은 또한 예컨대 과립의 세척 동안의 용액으로의 BMP의 방출 증가를 초래할 수 있다. 통상의 기술자라면, 일부 경우에서 제조되어진 그대로의 해당 상태에서 원래부터 낮은 (예컨대 7.0 미만) pH를 가지는 과립을 이용하는 것에 의해, 과립의 에칭에 의해 수득되는 것과 유사한 단백질 적재 및 용출 결과가 수득될 수 있다는 것 또한 알고 있을 것이다.
새로운 BMP 완충제와 관련하여, 본 발명자들은 몇 가지 완충제 성분 및/또는 조성물이 과립 내부 세공으로의 BMP 침윤의 향상을 초래할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명에 따른 완충제의 비-제한적인 목록 (또한, 비교 목적으로 임상적으로 사용된 rhBMP-2 완충제)을 하기 표 2에 나타내었다:
<표 2>
대표적인 완충제 조성물
Figure pct00001
Figure pct00002
본 발명자들은 BVB-005 ("5X") 및 BVB-010 ("10X") 완충제 제제가 이전에 사용되었던 BMP-2 완충제 또는 상대적으로 약한 완충제인 BVB-001 ("1X")에 비해 과립으로의 BMP 침윤을 향상시킨다는 것을 발견하였다. 더 일반적으로, 어떠한 이론에 의해서도 얽매이고자 하는 것은 아니나, 과립과 함께 인큐베이팅되었을 때 낮은 pH (예컨대 5.0 미만)를 유지하기에 충분한 완충 용량을 가지는 약하게 산성인 완충제 용액이 본 발명의 다양한 실시양태에서 바람직하다. 구체적으로, 표 2에 제시된 용액들이 글루탐산 및/또는 글리신에 의해 완충되기는 하지만, 락트산, 아세트산, 포름산, 말산, 말론산, 아스파르트산, 시트르산, 타르타르산, 인산, 푸마르산 및/또는 숙신산을 포함한 다양한 다른 완충제들이 본 발명의 단백질 적재 용액에 유용하다. 바람직한 경우에서, 완충 작용제는 약 2.3 내지 4.5의 pKa를 가지는 반면, 전체로서의 완충제는 바람직하게는 3.5 내지 4.0의 pH를 가진다.
완충제 이외에, 본 발명의 용액은 비제한적으로 0.01 %- 0.1 % (w/v)의 폴리소르베이트-80, 0.5 %- 5 % (w/v)의 수크로스, 0.5 %- 5 % (w/v)의 트레할로스, 0.5 %- 5 % (w/v)의 소르비톨 또는 0.5 %- 5 % (w/v)의 만니톨을 포함한 1종 이상의 첨가제를 임의적으로 포함할 수 있다.
예를 들자면 (비제한적으로), 본 발명에 따른 한 가지 완충제 용액은 4.0의 pH와 함께, 5 mM의 글루탐산, 0.15 % (w/v)의 글리신, 1 %의 수크로스 및 물의 조성을 가진다 (즉 본질적으로 이들로 이루어짐). 또 다른 완충제 용액은 염산을 사용하여 3.0으로 조정된 pH를 가지는 50 mM의 글루탐산, 1.5 % (w/v) 글리신, 1 % 수크로스 및 물이며, 또 다른 적합한 완충제는 3.5의 pH를 가지는 50 mM의 글루탐산, 0.75 % (w/v) 글리신, 1 % 수크로스 및 물이다. 또 다른 완충제 용액은 HCl을 사용하여 3.5으로 조정된 pH를 가지는 25 mM의 글루탐산, 0.75 % (w/v) 글리신, 1 % 수크로스 및 물이며, 또 다른 것은 3.7의 pH를 가지는 25 mM의 글루탐산, 0.75 % (w/v) 글리신, 1 % 수크로스 및 물이고, 또 다른 완충제 용액은 4.0의 pH를 가지는 25 mM의 글루탐산, 2 % (w/v) 글리신, 1 % 수크로스 및 물이다. 또 다른 적합한 완충제 용액은 3.7의 pH를 가지는 50 mM의 글루탐산, 1.5 % (w/v) 글리신, 1 % 수크로스 및 물이다. 다른 완충제 용액들은 추가적이거나 변형된 성분이 포함된 유사한 조성을 가질 수 있다.
도 8은 단백질 적재 단계 동안 다양한 pH 및 완충 용량을 가지는 완충제로 처리된 미접촉 과립 (패널 A, B, C) 및 에칭된 과립 (패널 E, F, G)의 몇 가지 형광 현미경사진을 포함하고 있다. 미접촉 과립에서는, 모든 조건에서 단백질 림을 볼 수 있었으며, 미접촉 및 에칭된 과립 모두에서, 완충제 용액의 완충 용량 및 산성도가 증가하면서 과립의 침윤이 향상되었다. 중요한 것은 중간 완충 용량의 완충제가 사용된 경우에는 에칭에 의해 과립으로의 BMP 침윤이 향상되었으나 (패널 B 및 E), 고도-완충 용량을 가지는 완충제에 적재된 미접촉 과립에서도 우수한 침윤이 관찰되었다는 것이다. 이러한 결과는 과립으로의 우수한 BMP 침윤을 달성하는 데에 있어서 고도-완충 용량의 저 pH 단백질 적재 완충제를 과립 에칭과 쌍을 이루게 하는 것이 반드시 필요하지는 않다는 것을 표시하고 있는데; 그에 따라 본 발명의 다양한 실시양태는 에칭 및/또는 향상된 단백질 적재 완충제를 이용한다. 역시, 통상의 기술자라면, 일부 경우에 그의 제조된 그대로의 상태에서 원래 낮은 (예컨대 7.0 미만) pH를 가지는 과립을 이용하는 것에 의해, 과립의 에칭에 의해 수득되는 것과 유사한 단백질 분포 결과가 수득될 수 있다는 것 또한 알고 있을 것이다.
그러나, 본 발명자들은 BMP 적재 과립의 식염수 세척에서 용출되는 BMP의 분율에 의해 입증되는 바와 같이, 과립 pH (예컨대 에칭 처리)와 완충 용액의 서로 다른 조합들이 서로 다른 과립과 BMP 사이의 겉보기 결합도를 초래할 수 있다는 것도 발견하였다. 도 10은 식염수 세척 (짙은 막대) 및 이후의 구아니디늄 클로라이드 단백질 추출 (옅은 막대)에서 용출된 BMP 분율들을 도시한다. BVB-010 완충제가 적재된 에칭된 과립에서 BMP 중 거의 40 %가 세척 동안 용출되기는 하였지만, 일반적으로 BMP 중 약 20 % 이하가 식염수 세척 동안 용출되는 반면, BVB-005 완충제로 적재된 에칭된 과립은 세척 동안 그의 BMP 중 10 % 미만을 방출하였다. 어떠한 이론에 의해서도 얽매이고자 하는 것은 아니나, 이러한 차이가 이식된 구성체에 의한 BMP 방출의 차이와 상관될 수 있는 것으로 여겨지므로, 본 발명은 BMP 적재 완충제 및/또는 과립의 pH (에칭)를 변화시키는 것에 의해 조정될 수 있는 BMP 방출 동역학을 가지는 구성체를 포괄한다.
사용시, 본 발명 조성물 및 방법의 사용을 통하여 생성되는 단백질-적재 과립은 환자를 치료하는 데에 사용하기 위한 다부분 구성체의 일부분을 형성한다. 상기한 바와 같이, 이러한 구성체는 일반적으로 바람직하게는 복잡하고 상호연결된 가변 크기의 미세세공 네트워크를 가지는 과립과 결합되어 있으며 그로부터 용출되는 골유도성 단백질을 포함하며, 상기 과립은 다시 세포 및 혈관 침윤을 촉진하기 위한 거대세공 구조를 가지는 중합체 매트릭스에 매립되거나, 삽입되거나 또는 달리 그와 접촉되고, 수주 수준의 체류 시간 (유리하게는 상기에서 더 구체적으로 기술된 바와 같은 골유도성 단백질의 연장된 전달을 가능케 함), 그리고 이식되었을 때 구성체가 무손상으로 유지되면서 새로운 골 성장을 위한 구조적 지지를 제공하는 것을 가능케 하기에 충분한 강성 및 압축 내성을 특징으로 한다. 이러한 구성체는 통상적으로 바람직하게는 콜라겐을 포함하나, 임의적으로는 다른 자연-발생 또는 합성 중합체를 포함하는 다공성 중합체 매트릭스를 포함하게 된다.
과립 (단독 또는 구성체로 통합된 것)은 하나 이상의 BMP 적재 용액, 과립 또는 과립-함유 구성체 또는 조성물에 적재 용액을 적용하기 위한 적용장치 및/또는 환자의 신체에 구성체를 위치시키기 위한 적용장치, 그리고 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트 또는 그의 구성요소의 사용에 대해 기술하는 지침물을 포함할 수 있는 키트로 포장될 수 있다. 대표적인 키트가 본원에서 기술되는 하지만, 통상의 기술자라면 본 개시에 비추어 다른 유용한 키트의 내용물을 알 수 있을 것이다. 이러한 키트들 각각은 본 발명에 포함된다.
본 발명은 그를 필요로 하는 환자에서 골 질량의 손실을 방지하고/거나 그것을 증가시키는 치료용 키트를 포함한다. 상기 키트는 동결건조 또는 다른 건조 형태로, 또는 더욱 바람직하게는 상기한 완충제 중 용액 중에 존재할 수 있는 골유도성 단백질과 함께, 상기한 바와 같은 과립을 포함하는 조성물을 포함한다. 단백질이 동결건조되어 있거나, 또는 달리 용액 중이 아닌 경우, 키트는 바람직하게는 상기한 바와 같은 희석제 또는 적재 완충제도 포함한다. 키트는 또한 비제한적으로 단백질 용기에 유체를 첨가하고/거나 과립-함유 조성물을 습윤화하기 위한 주사기, 또는 골유도성 단백질이 적재된 과립을 포함하는 조성물을 환자의 신체에 위치시키기 위한 전달 장치를 포함한 적용장치를 포함한다. 또한, 키트는 임의적으로 환자에서 골 손실을 치료 또는 예방하거나, 골절의 유합 또는 접합을 촉진하거나, 및/또는 달리 골 질량을 증가시키거나 골 이상을 치료하는 데에 있어서의 키트의 사용에 대한 관련 정보를 제시하는 지침물을 포함할 수 있다.
결론
본 출원 전체에 걸쳐, "거대세공", "미세세공", 그리고 거대- 및 미세다공성에 대한 언급이 이루어졌다. 일반적으로, 거대세공은 100 마이크로미터를 초과하는 단면 치수를 가지는 반면, 미세세공은 100 nm 내지 100 마이크로미터이다. 100 nm 미만의 세공은 나노세공으로 지칭된다.
본원에서 사용될 때의 "및/또는"이라는 구는 그와 같이 연계되는 요소들 "중 어느 하나 또는 모두", 다시 말하자면 일부 경우에는 공동으로 존재하며 다른 경우에는 분리되어 존재하는 요소들을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 분명하게 반대로 표시되지 않는 한, 구체적으로 식별된 요소들과 관련되는지 또는 관련되지 않는지에 관계없이, "및/또는"이라는 문구에 의해 구체적으로 식별된 요소들이 아닌 다른 요소들이 임의적으로 존재할 수도 있다. 따라서, 비-제한적인 예로서, "포함하는"과 같은 개방-종료형 언어와 함께 사용될 경우의 "A 및/또는 B"라는 언급은 일 실시양태에서는 B가 없는 A (임의적으로 B가 아닌 다른 요소는 포함)를; 또 다른 실시양태에서는 A가 없는 B (임의적으로 A가 아닌 다른 요소는 포함)를; 또 다른 실시양태에서는, A와 B 모두 (임의적으로 다른 요소 포함)를 지칭할 수 있는 등이다.
"본질적으로 ~로 이루어진다"라는 용어는 본원에서 달리 정의되지 않는 한 기능에 기여하는 다른 물질은 배제하는 것을 의미한다. 그럼에도 불구하고, 일부 경우에는 집합적 또는 개별적으로 2 % 이하 또는 그 이상의 미량으로 그와 같은 다른 물질이 존재할 수도 있다.
본 명세서에서 사용될 때, "실질적으로" 또는 "대략"이라는 용어는 더하기 또는 빼기 10 % (예컨대 중량 또는 부피 기준), 일부 실시양태에서는 더하기 또는 빼기 5 %를 의미한다. 본 명세서 전체에 걸쳐, "일 예", "예", "일 실시양태" 또는 "실시양태"라는 언급은 예와 연계되어 기술되는 구체적인 특징, 구조 또는 특성이 본 발명 기술의 적어도 하나의 예에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서의 "일 예에서", "예에서", "일 실시양태" 또는 "실시양태"라는 구의 출현이 반드시 모두 동일한 예를 언급하는 것은 아니다. 또한, 구체적인 특징, 구조, 루틴, 단계 또는 특성들은 본 발명 기술의 하나 이상 예에서 어떠한 적합한 방식으로도 조합될 수 있다. 본원에서 제공되는 소제목들은 단지 편의성을 위한 것으로써, 청구 기술의 영역 또는 의미를 제한하거나 해석하고자 하는 것은 아니다.
상기에서는 본 발명의 소정 실시양태들을 기술하였다. 그러나, 본 발명이 해당 실시양태들로 제한되는 것은 아니며, 그보다는 본 발명은 본원에서 명시적으로 기술된 것에 대한 추가 및 변형도 발명의 영역 내에 포함되는 것이라는 것을 확실히 알아야 한다. 또한, 본원에서 기술된 다양한 실시양태의 특징들이 상호 배제되는 것은 아니어서, 본원에서 해당 조합 또는 순열이 표현되지 않았다 할지라도, 본 발명의 기술사상 및 영역에서 벗어나지 않고도 다양한 조합 및 순열로 존재할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 실제로, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게라면, 본 발명의 기술사상 및 영역에서 벗어나지 않고도 본원에서 기술된 것의 변이, 변형 및 기타 구현들이 떠오르게 될 것이다. 따라서, 본 발명이 앞의 예시적인 설명으로만 한정되어서는 아니 된다.

Claims (9)

  1. 30 m2/g을 초과하는 비표면적을 가지며 과립 내부상의 적어도 하나의 표면을 한정하는 상호연결된 미세세공 네트워크를 가지는 사전형성된 칼슘 세라믹 과립, 및
    적어도 하나의 내부 표면과 결합되어 있으며, 과립 중심 부근의 내부 표면 중 일부 및 과립 외부 부근의 내부 표면상에 분포하는 골유도성 단백질
    을 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 과립의 중심 부근 골유도성 단백질의 농도가 과립의 외부 표면상 골유도성 단백질 농도의 약 33 % 이상인 조성물.
  3. 과립을, 골유도성 단백질 및 2.3 내지 4.5의 pKa를 갖는 완충제를 포함하며 4.5 미만의 pH를 갖는 제1 용액과 접촉시키는 단계
    를 포함하는, 제1항 또는 제2항에 따른 조성물의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서, 제1 용액이 약 4의 pH를 가지며, 본질적으로 하기로 이루어진 것인 방법:
    골유도성 단백질;
    5 mM의 글루탐산;
    0.15 중량%의 글리신;
    1 중량%의 수크로스; 및
    물.
  5. 제3항에 있어서, 제1 용액이 약 3.5의 pH를 가지며, 본질적으로 하기로 이루어진 것인 방법:
    골유도성 단백질;
    25 mM의 글루탐산;
    0.75 중량%의 글리신;
    1 중량%의 수크로스; 및
    물.
  6. 제3항에 있어서, 제1 용액이 약 3의 pH를 가지며, 본질적으로 하기로 이루어진 것인 방법:
    골유도성 단백질;
    50 mM의 글루탐산;
    1.5 중량%의 글리신;
    1 중량%의 수크로스; 및
    물.
  7. 제3항에 있어서, 제1 용액이 약 4의 pH를 가지며, 본질적으로 하기로 이루어진 것인 방법:
    골유도성 단백질;
    25 mM의 글루탐산;
    2 중량%의 글리신;
    1 중량%의 수크로스; 및
    물.
  8. 제3항에 있어서, 완충제가 글리신, 락트산, 아세트산, 포름산, 말산, 말론산, 글루탐산, 아스파르트산, 시트르산, 타르타르산, 인산, 푸마르산 및 숙신산으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  9. 제3항에 있어서, 제1 용액과 접촉하기 전에, 과립이 7 미만의 pH를 갖는 것인 방법.
KR1020177020944A 2014-12-29 2015-12-29 골 복구에서의 골유도 분자의 전달 향상을 위한 시스템 및 방법 KR20170100634A (ko)

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