ES2233469T3

ES2233469T3 - Formulaciones para la administracion de proteinas osteogenicas.

Info

Publication number: ES2233469T3
Application number: ES00972168T
Authority: ES
Inventors: Rebecca Li; Howard Seeherman; John Wozney
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1999-10-15
Filing date: 2000-10-13
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2020-10-13
Also published as: ATE284230T1; JP2003512097A; DE60016614D1; DE60016614T2; EP1220693B1; WO2001028603A1; AU1086601A; PT1220693E; EP1220693A1

Abstract

Composición para la administración por inyección de proteínas osteogénicas, que comprende una mezcla, aceptable desde el punto de vista farmacéutico, que comprende. a)una proteína osteogénica; b)una pasta de espuma de gelatina hemostática; y c)fosfato tricálcico.

Description

Formulaciones para la administración de proteínas osteogénicas.

Soluciones relacionadas

La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional US nº 60/159.703, presentada el 15 de octubre de 1999, y de la solicitud provisional US nº 60/185.734, presentada el 29 de febrero de 2000.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere al campo de las proteínas osteogénicas y a formulaciones farmacéuticas de las mismas. Más particularmente, la presente invención se refiere a formulaciones farmacéuticas inyectables que comprenden gelatina para la administración de proteínas osteogénicas.

Las proteínas osteogénicas son aquellas proteínas capaces de inducir, o de facilitar la inducción de, la formación de cartílago y/o hueso. En los últimos años se han aislado y caracterizado muchas de dichas proteínas osteogénicas, y algunas han sido producidas por métodos recombinantes. Por ejemplo, las denominadas proteínas morfogénicas óseas (BMP) han sido aisladas a partir de tejido óseo desmineralizado (véase, por ejemplo, Urist US 4.455.256); se han producido varias de dichas proteínas BMP mediante técnicas recombinantes (véase, por ejemplo, Wang et al. US 4.877.864 y Wang et al. US 5.013.549); se ha identificado una familia de factores de crecimiento transformantes (TGF-\alpha y TGF-\beta) que puede ser potencialmente útil en el tratamiento de osteopatías (véase, por ejemplo, Derynck et al., EP 154.434); se ha comprobado que una proteína denominada Vgr-1 se expresa en altos niveles en células osteogénicas (véase Lyons et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 4554-4558); y las proteínas denominadas OP-1, COP-5 y COP-7 han demostrado tener supuesta actividad osteoinductora (véase Oppermann, et al. US 5.001.691).

Se han desarrollado varias formulaciones diseñadas para la administración de proteínas osteogénicas al lugar en el que se desea inducir la formación de hueso. Por ejemplo, se han utilizado ciertas matrices poliméricas tales como un polímero de éster acrílico (Urist, patente US nº 4.526.909) y un polímero de ácido láctico (Urist, patente US nº 4.563.489).

Brekke et al., patentes US nº 4.186.448 y US nº 5.133.755, describen métodos de formación de materiales biodegradables muy porosos, compuestos de polímeros de ácido láctico ("OPLA").

Okada et al., patentes US nº 4.652.441, US nº 4.711.782, US nº 4.917.893 y US nº 5.061.492, y Yamamoto et al., patente US nº 4.954.298 describen una microcápsula de liberación prolongada que comprende un fármaco polipeptídico y una sustancia que retiene el fármaco, encapsulados en una capa acuosa interna rodeada por una sustancia que actúa de pared polimérica en una capa oleaginosa externa.

Yamazaki et al., Clin. Orthop. and Related Research, 234:240-249 (1988) describen la utilización de implantes que comprenden 1 mg de proteína morfogénica ósea purificada a partir de hueso y 5 mg de escayola. La patente US nº 4.645.503 describe materiales compuestos de hidroxiapatito y escayola, como materiales para implantes óseos.

También se han utilizado matrices de colágeno como vehículos para la administración de proteínas osteogénicas (véase, por ejemplo, Jeffries, patente US nº 4.394.370).

Sumario de la invención

La presente invención proporciona formulaciones inyectables que permiten la administración percutánea de proteínas osteogénicas. En una realización, la invención comprende composiciones que constan de una mezcla, aceptable desde el punto de vista farmacéutico, de una proteína osteogénica junto con una formulación de espuma de gelatina hemostática. Las formulaciones inyectables de la invención permiten el tratamiento de fracturas cerradas sin reducción quirúrgica abierta, como es necesaria en los dispositivos implantables. La espuma de gelatina hemostática mantiene una red de poros macroscópicos interconectados que permite la infiltración celular y la angiogénesis. También absorbe sangre y puede concentrar una población enriquecida de células osteoprogenitoras en el lugar del traumatismo, en el que está presente rhBMP-2 para actuar en las células. La formulación inyectable comprende proteína osteogénica, formulación de pasta inyectable de espuma de gelatina hemostática, junto con fosfato tricálcico.

Las pastas inyectables de Gelfoam o TCP/Gelfoam mejoran la consolidación de los defectos. La retención de rhBMP-2 (y quizá de otras proteínas osteoinductoras) en el lugar aumenta cuando se administra en pasta de Gelfoam o TCP/Gelfoam, en comparación con la administración en tampón. La adición de TCP aumenta la retención de rhBMP-2 en el lugar de aplicación.

Los métodos y composiciones de la presente invención son útiles para la preparación de formulaciones de proteínas osteoinductoras que pueden emplearse, entre otras utilizaciones, para fomentar la formación de cartílago y/o hueso, para reparar lesiones de tejido y fracturas. La invención proporciona, además, métodos para el tratamiento de pacientes que necesitan reparación y/o crecimiento del cartílago y/o del hueso.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 presenta el efecto de 6 ml de Gelfoam en MFR00842+200 \mul de BMP (marcada + no marcada).

Las Figuras 2 y 3 comparan la retención de I^{125}-rhBMP-2 tras la inyección en el modelo de osteotomía de conejo, en comparación con la rhBMP-2 administrada en tampón.

Las Figuras 4, 5, 6 y 7 presentan los resultados de la evaluación biomecánica y del área del callo en los estudios de osteotomía de conejo.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona composiciones inyectables para la administración de proteínas osteogénicas. Las composiciones comprenden proteína osteogénica, una formulación inyectable que comprende espuma de gelatina hemostática, y fosfato tricálcico. La invención proporciona, además, un método para preparar la espuma de gelatina inyectable, y la invención incluye la composición preparada por esta composición de espuma de gelatina inyectable.

Las formulaciones de Gelfoam de la invención presentan las ventajas siguientes: (1) procedimiento de preparación simple, (2) facilidad de inyección con agujas de calibre 18 g y 20 g, (3) sin materiales reticulantes adicionales, (4) larga experiencia en medicina como material de implantes, (5) coste relativamente bajo, y (6) sin límite de tiempo de trabajo (que puede ser una limitación en otros materiales que se reticulan o se "endurecen"). Una importante ventaja adicional es que la pasta de Gelfoam puede formularse y conservarse como un producto unitario.

Las proteínas osteogénicas útiles con las esponjas fusionadas preparadas con arreglo a la presente invención son bien conocidas por los expertos en la materia e incluyen las examinadas anteriormente. Las proteínas osteogénicas preferidas para su utilización en la presente memoria son aquellas de la clase BMP, identificadas como BMP-1 a BMP-12 en los documentos US nº 4.877.864; US nº 5.013.649; WO 90/11366, publicado el 4 de octubre de 1990; WO 91/18098, publicado el 28 de noviembre de 1991; WO 93/00432, publicado el 7 de enero de 1993; las patentes US nº 08/247.908 y nº 08/247.904, presentadas ambas el 20 de mayo de 1994; y la patente US nº 08/217.780, presentada el 25 de marzo de 1994. La más preferida es la BMP-2, cuya secuencia completa de ADNc se describe en detalle en la patente US nº 5.013.649. Naturalmente, pueden utilizarse combinaciones de dos o más de dichas proteínas osteogénicas, así como fragmentos de dichas proteínas que presentan también actividad osteogénica. Se sabe que dichas proteínas osteogénicas son homodiméricas, pero también presentan actividad como heterodímeros mixtos. También pueden utilizarse las formas heterodiméricas de las proteínas osteogénicas en la práctica de la presente invención. Heterodímeros de BMP se describen en el documento WO 93/09229, cuya descripción se incorpora en la presente memoria a título de referencia. Las proteínas recombinantes son preferibles a las proteínas aisladas naturales. La cantidad de proteína osteogénica útil en la presente memoria es aquella cantidad eficaz para estimular el incremento de la actividad osteogénica de las células progenitoras infiltrantes, y dependerá del tamaño y naturaleza del defecto tratado, así como del vehículo empleado.

Las formulaciones pueden inyectarse, por ejemplo, en tendones, ligamentos y/o sus lugares de unión al hueso. Las formulaciones inyectables también pueden aplicarse a otros sitios óseos, tales como quistes óseos y fracturas cerradas.

La pauta de dosificación se determinará con arreglo a la indicación clínica que se va a tratar, así como a diversas variables del paciente (por ejemplo, peso, edad, sexo) y a la presentación clínica (por ejemplo, extensión de la lesión, lugar de la lesión, etc.). En general, la dosis de la proteína osteogénica se encontrará en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 4 mg/ml.

La proteína osteogénica inyectable puede proporcionarse en la práctica clínica como formulación única, o la formulación puede proporcionarse en forma de kit de múltiples componentes en el que, por ejemplo, la proteína osteogénica se proporciona en un vial y la esponja fusionada con el material polimérico particulado se proporciona por separado.

Las formulaciones de la presente invención permiten la administración de cantidades terapéuticamente eficaces de proteína osteoinductora al lugar de la lesión en el que se desea la formación de cartílago y/o hueso. Las formulaciones pueden utilizarse como sustituto del injerto de hueso autólogo en fracturas recientes y en las que no se da unión, fusiones de la espina dorsal, y reparación de defectos óseos en el ámbito ortopédico; en reconstrucciones craneo/maxilofaciales; para la integración de prótesis, especialmente como recubrimiento superficial para mejorar la fijación de los implantes de prótesis tales como las prótesis recubiertas de hidroxiapatito; para la regeneración ósea en la osteomielitis; y en odontología, para el aumento del borde alveolar y de los defectos periodontales y alvéolos para exodoncia. Los métodos y formulaciones de la presente invención pueden ser útiles en el tratamiento y/o la prevención de la osteoporosis, o en el tratamiento del hueso osteoporótico u osteopénico. En otra realización, las formulaciones de la presente invención pueden utilizarse en el procedimiento conocido como distracción osteogénica. Cuando se utilizan para el tratamiento de la osteomielitis o para la reparación ósea con infección mínima, la proteína osteogénica puede utilizarse en combinación con micropartículas porosas y antibióticos, con la adición de agentes secuestrantes de proteínas tales como alginato, derivados celulósicos, especialmente carboximetilcelulosa, diluidos utilizando glicerol acuoso. El antibiótico se selecciona debido a su capacidad de disminuir la infección presentando al mismo tiempo efectos adversos mínimos en la osteogénesis. Los antibióticos preferidos para su utilización en los dispositivos de la presente invención incluyen vancomicina y gentamicina. El antibiótico puede estar en cualquier forma aceptable desde el punto de vista farmacéutico, tal como vancomicina HCl o sulfato de gentamicina. El antibiótico está presente preferiblemente a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 10,0 mg/ml. La preparación tradicional de formulaciones en forma aceptable desde el punto de vista farmacéutico (es decir, exentas de pirógenos, con pH e isotonicidad apropiadas, estériles, etc.) está claramente al alcance de los expertos en la materia y es aplicable a las formulaciones de la invención.

Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la presente invención y de ningún modo son limitantes. Se prevén modificaciones, variaciones y pequeñas mejoras, que se encuentran dentro del alcance de la presente invención.

Ejemplo 1 Estudio ectópico en ratas A. Preparación de matriz de espuma de gelatina hemostática

La pasta de Gelfoam® se formuló el día del implante hidratando un paquete (1 g) de polvo de Gelfoam (Pharmacia/Upjohn) con 5 ml de tampón MFR00842. El tampón se añadió directamente al frasco de polvo de Gelfoam estéril con ayuda de una pipeta, utilizando técnica aséptica en una campana de bioseguridad. El polvo hidratado resultante se mezcló a continuación con una espátula estéril durante aproximadamente dos minutos hasta obtener una consistencia de la pasta como una masa espesa homogénea. El volumen de la pasta tras la hidratación y el mezclado fue aproximadamente 6 ml. La formulación de pasta que contenía 0,1 mg/ml de rhBMP-2 se realizó añadiendo 142 \mul de líquido a granel de rhBMP-2 por medio de una pipeta estéril de modo uniforme sobre la pasta. La pasta volvió a mezclarse después para distribuir la proteína de forma homogénea en todo el volumen. La concentración final de rhBMP-2 en la pasta fue 0,1 mg/ml.

Para las muestras inyectables que contenían FN liofilizada, se disolvieron 5 mg de FN liofilizada en 0,5 ml del diluyente administrado. Después se añadió el volumen de 0,5 ml que contenía FN a la pasta de Gelfoam (volumen total de 6 ml) y se mezcló con una espátula estéril antes de distribuirla en partes alícuotas en jeringas. La concentración final de rhFN fue 770 \mug/ml.

La pasta de Gelfoam se insertó en el extremo posterior de una jeringa de 10 ml utilizando una espátula estéril. Después se acopló un conector Luer estéril a la jeringa de 10 ml para facilitar el llenado de tres jeringas de 1 ml con cierre Luer (Becton Dickinson).

B. Evaluación de la reproducibilidad de la carga de rhBMP-2 en partes alícuotas inyectables

La uniformidad de la carga de rhBMP-2 en partes alícuotas de pasta de Gelfoam (preparada como se ha descrito anteriormente) se analizó utilizando I^{125}-rhBMP-2 marcada radiactivamente. Para esta evaluación, se mezclaron 40 ml de I^{125}-rhBMP-2 (0,5 mCi/ml) con 300 ml de líquido a granel de rhBMP-2 (proteína no marcada). Después se añadieron 200 ml de esta solución de proteínas (rhBMP-2 marcada y no marcada) de modo uniforme a 6 ml de pasta de Gelfoam. La pasta se colocó a continuación en una jeringa de 10 ml y se distribuyó en partes alícuotas en cinco jeringas de 1 ml (marcadas #1-5). Esta evaluación simula una dilución de 30 veces de la solución de rhBMP-2 en pasta de Gelfoam, así como la mezcla subsiguiente y el procedimiento de distribución en partes alícuotas.

Para simular un procedimiento de inyección típico, se inyectaron cuatro muestras sucesivas de 100 ml de cada una de las cinco jeringas (agujas de calibre 18 g) en tubos Eppendorf individuales. Después se colocaron los tubos en un contador gamma (contador gamma automático Wallac 1470 Wizard) para medir las cuentas por minuto (CPM) de I^{125}. Los datos se analizaron para comprobar la reproducibilidad de los procedimientos de mezclado y de distribución en partes alícuotas.

C. Procedimiento quirúrgico

Se analizó la eficacia de la pasta de Gelfoam en el modelo de inducción ósea ectópica en ratas. Para este estudio se utilizaron ratas Long Evans, machos, de 4 a 5 semanas de edad. Se siguieron protocolos estándar para el cuidado de los animales, la introducción de implantes y el análisis de explantes. Una vez afeitados, etiquetados y pesados, los animales se anestesiaron por inhalación de isoflurano en una campana de gases.

Se realizaron inyecciones subcutáneas en la reacción torácica ventral o escapular. Se realizaron inyecciones IM en el cuádriceps/músculo de la pantorrilla, y se repitieron en la pata contralateral. En todas las inyecciones se utilizó una aguja de calibre 18 g, de 1½ pulgadas. Al finalizar el estudio (14 días), los animales fueron sacrificados por inhalación de CO_{2}. Se extrajeron los dispositivos de los cadáveres, se pesaron y se examinó su consistencia (dureza), forma, presencia de líquidos, y vascularidad. Después se colocaron los dispositivos en casetes de tejido etiquetadas y se sumergieron en etanol al 70%.

D. Preparación histológica y evaluaciones

Las muestras se recibieron en etanol al 70%, se catalogaron y prepararon para el análisis histológico de tejido no calcificado (Schenk, et al.). Brevemente, las muestras se deshidrataron con gradientes de alcohol y se lavaron en xileno utilizando un aparato de preparación de tejidos Sakura VIP. Las muestras se infiltraron y se incluyeron en metacrilato de metilo, y se dejaron polimerizar durante 3 a 5 días a temperatura ambiente. Una vez completada la polimerización, se seccionaron bloques de 5 micrómetros, utilizando un aparato Riechert-Jung Polycut o Lecia 2065 Supercut. Todos los cortes microscópicos fueron teñidos con una modificación de la técnica tricrómica de Goldner (Schenk et al.). Los resultados de la tinción son: núcleos: morado-negro, citoplasma y osteoides: rojo, hueso mineralizado y colágeno: verde, eritrocitos: naranja.

El tamaño del explante y el porcentaje de hueso y de matriz residual fueron calculados utilizando técnicas de histomorfometría. También se registró la respuesta celular, si estaba presente, así como el tipo de respuesta y la presencia y ausencia de inflamación.

Cada corte microscópico se puntuó de modo similar en lo referente al porcentaje de hueso y de matriz residual. El porcentaje de hueso y de matriz se calculó y puntuó con el microscopio utilizando la siguiente escala.

% de hueso	Puntuación
0 (no observado)	0
<10	0,5
10-20	1
20-40	2
40-60	3
60-80	4
80-100	5

E. Reproducibilidad de la formulación de pasta de Gelfoam con rhBMP-2

Se calcularon los parámetros estándar de estadística descriptiva para todas las variables principales. El efecto del tratamiento con rhBMP-2 y de la adición de FN en la formación de hueso ectópico se comparó utilizando una prueba de la t para datos no emparejados. Las pruebas fueron bilaterales y las diferencias se consideraron significativas a un valor de p <0,05. La evaluación de la media global de las 20 partes alícuotas (5 jeringas), demostró una desviación típica de \pm 13%. Las CPM por cada parte alícuota se muestran en la Figura 1. No se observó tendencia aparente en función del número de parte alícuota.

G. Evaluación histológica

Grupos testigo (sin rhBMP-2): Las observaciones histológicas demostraron que la matriz se resorbe en el plazo de dos semanas solamente cuando está presente la rhBMP-2. Las características histológicas típicas del implante testigo ectópico de Gelfoam después de 14 días fueron una estructura particulada, circundada de células gigantes y células fusiformes. Se observan vasos sanguíneos fácilmente en los implantes, que están generalmente bien vascularizados. Las características histológicas parecieron similares en todos los testigos, incluidos aquellos con Gelfoam solo, con fibronectina, y con implantes subcutáneos (SC) o intramusculares (IM).

Grupos con rhBMP-2: El hueso inducido por Gelfoam/rhBMP-2 pareció estar formado principalmente por la ruta de osificación osteocondral, ya que se observaron de modo uniforme condrocitos y matriz cartilaginosa en el frente de formación de hueso, en el que el hueso y la matriz que actuaba de vehículo se separaban. Se observaron algunas zonas de hueso formado a través del mecanismo directo. La formación de hueso con Gelfoam se inició desde la periferia y se extendió hacia el centro del implante ectópico. Por consiguiente, se formó una cáscara ósea en la fase temprana de la formación de hueso.

Se encontraron diferencias significativas entre los explantes SC e IM en todas las caracterizaciones histológicas. Se observó muy poca formación de hueso en los explantes SC, mientras que se encontró una formación de hueso sustancial en los explantes IM. En general, las muestras IM parecieron presentar una mejor respuesta global, un mayor grado de resorción de la matriz y de formación de hueso, en comparación con las muestras subcutáneas. La resorción ósea está presente tanto en las muestras IM como subcutáneas. Las muestras IM presentan una cantidad significativamente mayor de hueso maduro y médula, y menos matriz restante. Se observó degradación muscular mínima. La infiltración celular del vehículo en las muestras IM fue mayor que la de las muestras subcutáneas, y constaba de numerosos linfocitos y células gigantes.

Las muestras subcutáneas presentaron infiltración celular de la matriz, que constaba predominantemente de linfocitos. Las células gigantes eran abundantes en la periferia del material, y se observaron algunas hacia el centro. La matriz no parecía estar completamente resorbida en muchas áreas en las se dio la formación de hueso SC. El hueso se forma en la zona adyacente al vehículo.

No se encontraron diferencias significativas entre implantes formulados con Gelfoam solo y con fibronectina, con la salvedad de que el Gelfoam solo presenta una puntuación ósea ligeramente mayor. Ambas formulaciones dieron malos resultados en la zona subcutánea pero muy buenos resultados en la zona intramuscular.

Estas observaciones se reflejan en las siguientes puntuaciones óseas promedio (Tabla 1).

TABLA 1 Puntuaciones óseas histológicas promedio

1

La pasta de Gelfoam inyectable con rhBMP-2 indujo la formación de hueso maduro en el plazo de dos semanas tanto en las zonas IM como subcutáneas. La respuesta en la zona intramuscular fue mucho más robusta que la de la zona subcutánea. Se extrajeron explantes óseos grandes, bien vascularizados, de la zona intramuscular. Las puntuaciones óseas promedio fueron 3,4 \pm 0,7 para los explantes IM, y 1,3 \pm 1 para los explantes SC que contenían rhBMP-2. La pasta de Gelfoam sola no indujo la formación de hueso, ni resorción significativa, en las dos semanas del período del implante. Éste no es un resultado inesperado, ya que la resorción completa en 4 a 6 semanas en los tejidos blandos, y la licuación en 2 a 5 días con abundante hemorragia es normalmente lo esperable con Gelfoam.

La adición de FN a Gelfoam no mejoró la velocidad de migración celular, la adhesión o la proliferación significativamente como para mejorar la formación de hueso. Es posible que la concentración de FN utilizada en este experimento (770 mg/ml) no sea adecuada, o que no esté dispersa de modo uniforme en la pasta. Una alternativa puede ser la utilización de péptidos RGD para aumentar la adhesividad celular y la migración de las células a la matriz. Una hipótesis alternativa es que el efecto de rhBMP-2 a esta dosis en el modelo ectópico de rata sobrepasa cualquier efecto de FN que pueda detectarse en un modelo menos reactivo.

El estudio evaluó asimismo la reproducibilidad de la dosis del procedimiento actual de formulación. Los resultados con la proteína marcada indican que el procedimiento es adecuado para distribuir rhBMP-2 uniformemente en la masa de pasta. En general, la rhBMP-2 administrada en una pasta de Gelfoam inyectable fue eficaz en la inducción ósea tanto en las zonas IM como subcutáneas en este modelo.

Ejemplo 2 Estudio de osteotomía del cúbito de conejo A. Preparación de matriz hemostática de espuma de gelatina

Se preparó una pasta de Gelfoam al 16,7% en peso que contenía rhBMP-2 hidratando polvo de Gelfoam (Pharmacia/Upjohn) con tampón de ácido glutámico (pH=4,5; 400 mg de rhBMP-2) como se ha descrito anteriormente en el estudio ectópico de rata. En realizaciones que comprenden TCP, se preparó TCP/Gelfoam (relación 70:30 en peso) que contenía rhBMP-2 hidratando pasta compuesta; el TCP (tamizado hasta un tamaño de partículas de 45 a 125 micrómetros de polvo de Gelfoam con tampón de ácido glutámico) se dispersó de modo uniforme en la pasta. Se comprobó que estas formulaciones eran adecuadas para la inyección a través de una aguja de calibre 18, permitiendo al mismo tiempo a la pasta la consistencia cohesiva necesaria para su localización en la zona del defecto. Además, se incorporó a la pasta una cantidad mínima de I^{125}-rhBMP-2 para permitir la determinación del perfil de retención local utilizando técnicas de gammagrafía.

B. Modelo de osteotomía del cúbito de conejo

Se crearon, mediante osteotomía, defectos bilaterales de 1 mm en el cúbito medio de 8 conejos adultos, machos, de la raza New Zealand White. Una de las extremidades en cada uno de los conejos recibió una inyección de rhBMP-2 en pasta de Gelfoam; la extremidad contralateral sirvió como testigo de la intervención quirúrgica. La pasta de Gelfoam (0,2 ml, que contenían 400 \mug de rhBMP-2) se inyectó por medio de una jeringa en la zona del defecto y sus alrededores utilizando una aguja de calibre 18. Tras 4 semanas, se sacrificaron los conejos y se cortaron las extremidades. Se determinó la formación de callos utilizando tomografía computarizada periférica cuantitativa (pQCT). El análisis de las características biomecánicas se llevó a cabo tras la inclusión de las extremidades, y se realizaron pruebas de fractura por torsión utilizando un sistema servohidráulico de análisis de materiales (Modelo 8500, Instron, Corp.). El análisis histológico se realizó en muestras representativos y cortes teñidos con la técnica tricrómica de
Goldner.

Para el estudio con Gelfoam/TCP se crearon, mediante osteotomía, defectos bilaterales de 1 mm en el cúbito medio de 24 conejos adultos, machos, de la raza New Zealand White (8 conejos por grupo). Una de las extremidades de cada uno de los conejos recibió una inyección de rhBMP-2/vehículo; la extremidad contralateral sirvió como testigo de la intervención quirúrgica. Cada vehículo o tampón (0,15 ml, que contenían 100 \mug de rhBMP-2) se inyectó por medio de una jeringa en el defecto y en la zona circundante. La biodistribución in vivo de I^{125}-rhBMP-2 se cuantificó utilizando gammagrafía. Después de cuatro semanas se analizó la biodistribución in vivo y la eficacia como se ha descrito anteriormente.

C. Retención de I^{125}-rhBMP-2 en el modelo de osteotomía de conejo

La retención de I^{125}-rhBMP-2 tras la inyección en la zona del defecto (Fig. 2) se comparó con la de la rhBMP-2 administrada a 3 conejos en un vehículo a base de tampón. La media del tiempo de permanencia (MRT) fue 4,43 días y 1,72 días para la rhBMP-2 administrada en Gelfoam y en tampón, respectivamente. De este modo, la semivida de la rhBMP-2 (t1/2) fue 3,44 días y 1,11 días para Gelfoam y tampón, respectivamente. Tras 7 días, la rhBMP-2 administrada en tampón no era ya detectable; sin embargo, la rhBMP-2 administrada en Gelfoam era detectable a los 14 días tras la inyección.

La retención de I^{125}-rhBMP-2 en pastas de Gelfoam y TCP/Gelfoam tras la inyección en la zona del defecto (Fig. 3), se comparó con la de la rhBMP-2 administrada en el vehículo a base de tampón a 3 conejos por grupo. La media del tiempo de permanencia (MRT) fue 4,4 días, 5,9 días y 1,7 días para la rhBMP-2 administrada en Gelfoam, en TCP/Gelfoam y en tampón, respectivamente. De este modo, la semivida de la rhBMP-2 (t1/2) fue 3,4 días, 4,1 días y 1,1 días para Gelfoam, TCP/Gelfoam y tampón, respectivamente. Tras 7 días, la rhBMP-2 administrada en tampón no era ya detectable en la zona; sin embargo, la rhBMP-2 administrada en pasta de Gelfoam o TCP/Gelfoam era detectable a los 13 a 14 días tras la inyección.

D. Evaluación biomecánica y del área del callo

Se evaluaron el área del callo y la resistencia biomecánica (par máximo) de 16 extremidades (8 testigos y 8 tratadas con rhBMP-2). Una prueba de la t para datos emparejados indicó que tanto el área del callo como la resistencia biomecánica fueron mayores en las extremidades tratadas con rhBMP-2 que en las extremidades testigo (Figs. 4, 5). La media del porcentaje de la diferencia entre los grupos tratados y testigo fue 51% y 84% para el área del callo y para el par máximo, respectivamente.

En el estudio con Gelfoam/TCP, una prueba de la t para datos emparejados indicó que tanto el área del callo como la resistencia biomecánica fueron significativamente superiores en las extremidades tratadas con rhBMP-2 que en las extremidades testigo en el caso de la pasta de Gelfoam y de la pasta de TCP/Gelfoam (p < 0,05).

Sin embargo, en el caso de la rhBMP-2 administrada en vehículo a base de tampón, las extremidades tratadas no dieron resultados significativamente distintos de los de las extremidades del grupo testigo. Se calculó la media del porcentaje de aumento por encima del testigo para el área del callo y para el par máximo (Figs. 6 a 7). Los porcentajes de aumento en el área del callo y en el par máximo fueron máximos en el grupo con TCP/Gelfoam y mínimos en el caso de la administración de rhBMP-2 en tampón.

E. Evaluación histológica

La evaluación histológica de 3 pares representativos de extremidades en el estudio con Gelfoam demostró que el defecto aparecía soldado al 100% con callo óseo en el momento del sacrificio (4 semanas) en el caso de las extremidades tratadas con rhBMP-2, mientras que el defecto aparecía sólo parcialmente soldado en el caso de las extremidades testigo, no tratadas. Esta observación se confirmó con radiografías realizadas a las 4 semanas.

La evaluación histológica de extremidades representativas en el estudio con Gelfoam/TCP demostró que el defecto aparecía soldado al 100% con callo en el caso de las extremidades tratadas con rhBMP-2 en Gelfoam y en TCP/Gelfoam, mientras que el defecto aparecía sólo parcialmente soldado en el caso de las extremidades testigo y las tratadas con tampón.

Las descripciones anteriores exponen en detalle las realizaciones de la presente invención preferidas actualmente. Se espera que los expertos en la materia conciban, tras la lectura de dichas descripciones, numerosas modificaciones y variaciones en la práctica de la presente invención. Dichas modificaciones se consideran englobadas en el alcance de las reivindicaciones que se adjuntan.

Claims

1. Composición para la administración por inyección de proteínas osteogénicas, que comprende una mezcla, aceptable desde el punto de vista farmacéutico, que comprende.

a) una proteína osteogénica;

b) una pasta de espuma de gelatina hemostática; y

c) fosfato tricálcico.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que la proteína osteogénica se selecciona de entre el grupo formado por miembros de la familia BMP.

3. Composición según la reivindicación 2, en la que la proteína osteogénica es BMP-2.

4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende micropartículas porosas y uno o más antibióticos.

5. Composición según la reivindicación 4, que comprende un agente secuestrador de proteínas seleccionado de entre alginato y derivados celulósicos.

6. Composición según la reivindicación 1, en la que la proteína osteogénica es OP-1.

7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su utilización como medicamento.

8. Utilización de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una zona lesionada en la que se desea la formación de cartílago y/o hueso.

9. Utilización de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de uno o más trastornos seleccionados de entre el grupo formado por fracturas recientes y en las que no se da unión, fusiones de la espina dorsal, defectos óseos en el ámbito ortopédico, osteomielitis, huesos osteoporóticos u osteopénicos, defectos periodontales, alvéolos para exodoncia y distracción osteogénica.

10. Utilización de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento destinado a las reconstrucciones cráneo/maxilofaciales y/o a la integración de prótesis.