JP2858782B2 - 関節軟骨および骨再生用組成物および骨格組織移植組織の製造および骨格組織の再生方法 - Google Patents

関節軟骨および骨再生用組成物および骨格組織移植組織の製造および骨格組織の再生方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 生体分解可能の性質の「生体膠」を形成する、トロン
ビン、抗プロテアーゼ、ブイブリノーゲン、細胞外マト
リツクスおよび１種またはそれ以上の生長因子からなる
ビヒクルまたはゲルに包埋された表現型能を有する増殖
性軟骨細胞構造を含む材料の移植による骨および軟骨の
補修に使用する組成物は、米国特許第4,642,120号明細
書に記載されている。移植前に、細胞を組織培養におい
て生長させ、次いで収穫し、しかも軟骨細胞集団を、膠
1ml当たり100,000個〜500,000個の細胞の濃度において
生体膠に包埋する。この配合物を使用する前に、股また
は他の関節と同様に、損傷した軟骨および骨を手術によ
つて切除する。次いで、配合物の適合移植を、骨筋を用
いるかまたは用いずに空洞に挿入して容積の１部を充て
んする。細胞増殖は、系によつて生成した許容し得る環
境において続行し、一方外部の影響は制限される。軟骨
細胞および造骨細胞（骨形成細胞）は発達して既存の構
造と接合するので、ある時間後、移植された構造は周囲
の材料から事実上区別できない。
例えば股関節の、低摩擦金属−プラスチツク補綴によ
る置換に比較して関節軟骨の補修におけるこのアプロー
チから多くの利点が得られる。骨と補綴要素の間の生物
力学的性質の差は、主要な問題である。補綴の移植によ
つて筋肉制御にフイードバツクを与える関節嚢における
機械的需要器系が無能になり、摩耗が生じ、逐には置換
が必要になる。回転および摺動運動におけるように、機
械的受容器系の欠如の故に、関節に必要な運動の多重自
由度は提供できない。さらに、最良の低摩擦補綴は、介
在骨液を有する自然軟骨組織の100倍より大きい摩擦を
有し、またこの理由のために、摩耗および分解は避けら
れない。
米国特許第4,642,120号明細書の組成物は、関節軟骨
の補修について証明された可能性を有するが、またさら
に実験研究の結果として、多くの制限を有することも認
められた。必要な細胞増殖能は、胚性軟骨細胞（幼若軟
骨前駆（committed）細胞）において最も利用できる
が、ヒト用には、有効性が限定され、しかも主な問題が
免疫系反応から生じ得る。骨髄幹細胞はこの特許明細書
において、自己分化あるいは、軟骨形成要素の指示の下
に軟骨細胞への変換の可能性を有する間葉細胞と共に異
なつた可能な細胞源として挙げられているにすぎない。
これらの前駆細胞を用いる研究はなされていない。これ
以上の詳細な情報および論議は「ユース・オブ・カルチ
ユアード・チツク・エピフイジアル・コンドロサイツ・
アズ・グラフツ・フオア・デイフエクツ・イン・チツク
・アーテイキユラー・カーテイラージ（Use of Culture
d Chick Epiphyseal Chondrocytes as Grafts for Defe
cts in Chick Articular Cartilage）」と題するS.Itay
らによる論文、クリニカル・オーソピデイスク（Clinic
al Orthopedics）、284頁〜302頁、７月、1987に含まれ
ている。
前記の論文は、全体として論題に一般に関連のある多
くの論文を挙げている。これらの３件の論文は、特別に
興味がある。なぜならば、これらの論文は、軟骨細胞
を、少なくとも１部分は、適切な生体内分解性粘弾性材
料の欠如および軟骨生成が不可能のために成功が限られ
ている関節軟骨に移植する試みを明示しているからであ
る。この３件の論文は、Bentley G.らの「ホモ トラン
スプランテーシヨン・オブ・アイソレーテツド・エピフ
イジアル・アンド・アーテイキユラー・カーテイラージ
・コンドロサイツ・オントウ・ジヨイント・サーフエー
シズ・オブ・ラビツツ（Homotransplantation of isola
ted epiphyseal and articular cartilage chondrocyte
s onto joint surfaces of rabbits）、ネイチユア（Na
ture）（1971）、Dantley,G.らの「アイソレーテツド・
エピフイジアル・コンドロサイト・アログラフト・オン
トウ・ジヨイント・サーフエイス（Isolated Epiphysea
l chondrocyte allograft onto joint surface）−アン
・エクスペリメンタル・スタデイ・イン・ラビツツ（An
experimental study in rabbits）、 およびHelbing,G.らの「イン・ビトロ・ウンターズツ
フンゲン・アン・イゾリールテン・コンドロツイテン・
ツール・プログノーゼ・フオン・クノル ペルトランス
プラテン（In vitro Untersuchungen an isolierten Ch
ondrozyten zur Prognose von Knorpeltransplante
n）、ヘルフエテイ・シミルルギア・アクタ（Helv.Chi
r.Acta）46:21（1979）である。
米国特許第4,642,120号明細書に指摘されたように、
かつて細胞の壊死を避けるためにゲル1ml当たり約500,0
00個の細胞の軟骨細胞濃度について限界が認められるべ
きであると考えられた。また、1ml当たり僅かに５単位
〜50単位のトロンビンおよび約25mg/ml〜80mg/mlのフイ
ブリノーゲンを用いるべきであり、ゲルの硬化は50単位
/ml未満に保たれなければならないトロンビンの濃度に
よつて決定される。これらの関係およびパラメーターは
増殖速度および能力および特に大欠損において移植組織
が適当な表現型表示に熟成および変換する能力を限定す
るこれ以上の研究に見られる。従つて、関節軟骨の補修
に対するこのアプローチの拡張によつて、新しい組成物
および操作が必要である。
発明の要約 骨格組織の再生用の本発明による組成物は、軟骨形成
型表現型を示す細胞を生成する細胞培養物を用いる。こ
れらとしては、骨髄由来軟骨細胞および筋肉線維芽細胞
由来軟骨細胞および胚性軟骨細胞がある。主に10％〜20
％の血清の形の生長因子を、培地に用いて、細胞増殖が
容易になる。組成物中の生体再吸収性固定化ビヒクル
（BRIV）は、血清約15％〜30％、フイブリノーゲン100m
g/ml〜150mg/ml、トロンビン 60単位/ml〜90単位/ml、
塩化カルシウム（CaCl2）60mMおよびアプロトニン2000
単位/ml（KIU）を含む。移植組織中の細胞は、80×106
個/ml BRIV〜160×106個/ml BRIVの濃度である。得られ
た組成物は、生体内で一層高速における細胞増殖を可能
にし、一層迅速に成熟し、次いで周囲の軟骨および骨構
造と組織的一致に一層容易に変換する。
発明の詳細な説明 本発明は、軟骨および骨における欠損の補修における
移植組成として用いる組成物を指向している。組成物
は、トリプシン処理および組織の破壊による適当な細胞
の単離によつて製造される。細胞は、適当な培地上で培
養され、収穫され、次いでフイブリノーゲンをベースと
する生体再吸収性固定化ビヒクル（BRIV）と組み合され
る。包埋された細胞を有するBRIVゲル組成物は、直ちに
利用でき、低温器中で限られた時間（２日〜３日）貯蔵
でき、３年まで低温保存し、あるいは収穫された細胞
は、深冷および使用直前に解凍することによつて長時間
保存でき、次いで望まれるゲル組成物に包埋できる。移
植組織を利用する場合、損傷した軟骨および骨を手術に
より切除し、ゲルをフイブリノーゲンの溶液に浸漬し、
移植の部位にトロンビンの溶液を噴霧し、次いでゲル移
動組織を欠損または損傷された部位に圧入する。
利用する細胞は、骨髄前駆（progenital）細胞である
のが好ましいが、筋肉線維芽細胞由来の胚性細胞および
軟骨細胞または他の間葉由来の細胞も使用できる。骨髄
前駆細胞または筋肉線維芽細胞由来軟骨細胞によつて、
患者自体は、適当な早期に供与体となることができ、自
己免疫応答の機会が一層少ない利点が得られる。
プラスチツク上の細胞の培養によつて、細胞増殖およ
び望まれる細胞型の選択に適当な生長環境が与えられ
る。培地はウシ胎児血清10％〜20％を含有し、細胞の増
殖を容易にすることが判明するIGFI、FGFII、TGFB、PDG
Fなどの生長因子または任意の他の生長因子を任意に含
有してもよい。細胞は、純粋な線維芽細胞様細胞集団が
得られるまで継代培養される。純粋な線維芽細胞様細胞
集団をトリプシン処理し、次いで３×106個/ml培地〜８
×106個/ml培地の密度で懸濁培養し、次にウシ胎児血清
（F.C.S.）10％およびアスコルビン酸ナトリウム50μg/
mlを有するＦ−12培地（Sigma Co.）中の軟質寒天上で
培養する。数日後、線維芽細胞は30個〜60個の細胞の集
塊にある。
あるいは、細胞をトリプシン処理し、次いで単細胞懸
濁液を２×105個/ml〜４×105個/mlの密度で軟質寒天の
Ham F−10培地（Sigma Co.）上で培養する。アスコルビ
ン酸ナトリウム 30μg/cc〜50μg/ccを培地に毎日添加
する。
移植組織に用いられる細胞を生体再吸収性固定化ビヒ
クル（BRIV）、粘弾性、生体内分解性、生体親和性、再
吸収性マトリツクスに、濃度80×106個/ml、BRIV〜160
×106個/ml BRIVにおいて包埋する。BRIV組成物は、栄
養液および栄養剤の良好な密着性および選択的浸透性を
与える。また、BRIVゲルは、細胞移動を機械的に防止す
る。さらに欠損部位における軟骨細胞固着の他に、BRIV
は、線維芽細胞浸透および増殖を防止しながら軟骨細胞
の生長および分化状態を維持して、適切な細胞外環境と
しても有効に働く。
BRIVの組成は、血清約15％〜30％、フイブリノーゲン
100mg/ml〜150mg/ml、トロンビン 60単位/ml〜90単位/
ml、塩化カルシウム（CaCl2）60mM、およびアプロトニ
ンのような抗プロテアーゼを含む。BRIV移植組成物は、
ウシ胎児血清20％、フイブリノーゲン150mg/ml、CaCl2
60mM中のトロンビン 90単位/mlおよびアプロトニン200
0単位/ml（KIU）を含むのが好ましい。
BRIVに利用する血清はウシ胎児血清、第２三か月期か
らの臍帯血清、または馬血清であり得るが、ウシ胎児血
清が好ましい。一般にマトリツクスの迅速溶解を防止す
るために天然非血漿プロテアーゼ阻害剤を用いる。多糖
阻害剤と、血漿プロテアーゼ阻害剤および（または）合
成プロテアーゼ阻害剤の組み合わせを使用できる。適当
なプロテアーゼ阻害剤は、約200mg/mlゲル〜400mg/mlゲ
ルの量で用いられるε−アミノカプロン酸および約200m
g/mlゲル〜400mg/mlゲルの量で用いられるトラネキサム
酸（tranexemic acid）のような化学阻害剤である。多
糖阻害剤も使用できる。また、抗トリプシン（鶏卵白、
Sigma、III型）のような天然非血漿プオテアーゼ阻害剤
または適当な合成プロテアーゼ阻害剤を使用してもよ
い。また血漿プロテアーゼ阻害剤を利用してもよい。
本発明の生体移植組織は、種々の方法で利用できる。
新たに調製された移植組織（包埋された細胞を含有する
BRIV組成物）は、損傷部位または欠損に直接適用でき
る。さらに、包埋された細胞を有するBRIV組成物は、Ｆ
−12培地（Sigma Company）およびウシ胎児血清10％を
もつて被覆し、次いでCO2定温器中で約37℃において２
日〜３日間貯蔵する。さらに、移植組織は、解凍し、次
いでBRIV中に包埋された液体窒素中の低温保存細胞（ウ
シ胎児血清90％およびDMSO 10％）、（３年まで低温保
存）から製造できる。好ましい選択として、細胞は遠心
分離によつて採取でき、しかもBRIVに包埋された細胞を
有する完全移植組織は、一層長期間液体窒素中に低温保
存できる（ウシ胎児血清90％およびジメチルスルホキシ
ド（DMSO）10％）。この場合の移植組織を、手術室にお
いて解凍し、次いで直ちに移植する。移植組織は容積の
１部を充てんする骨節または代用骨を任意に含有しても
よい。
移植組織を利用する場合、損傷部位または欠損にトロ
ンビン溶液を噴霧し、次いで細胞を含有するBRIV基質
を、フイブリノーゲンおよび抗プロテアーゼを含有する
溶液に浸漬する。欠損を充てんするように移植組織を損
傷部位または欠損に圧入する。トロンビン溶液は、CaCl
2 60mM中にトロンビン 90単位/mlを含む。
移植後48時間以内に、軟骨細胞増殖が見られる。２週
間後、硝子質軟骨マトリツクスがこれらの細胞を囲む。
８週間以内に、欠損は、界面に繊維質組織を形成せずに
隣接軟骨と円滑に一体化する硝子質軟骨で完全に充てん
する。補修組織における細胞含量およびプロテオグリカ
ン合成速度は４か月間高く、次いで周囲軟骨の水準まで
徐々に減退する。移植６か月後、骨化前線以下の水準に
おける軟骨性補修組織は、脈管要素および軟骨の骨変換
による浸透を示す。移植18か月後、骨化前線下の全移植
組織を骨質要素に変換し、一方、移植組織の関節部分
は、元の軟骨の全性質をもつて軟骨性である。移植組織
の免疫源拒絶反応または変性変化の徴候は認められな
い。逆に、移植された部分の関節表面は元の表面よりも
若く見える。
本発明の組成物により、生体内で一層高速における細
胞増殖が可能になる。移植組織の細胞は一層迅速に成熟
し、次いで周囲の軟骨および骨組織と組織学的同一に一
層容易に変換する。移植の２か月以内に、欠損は、活性
増殖細胞で適切に充てんされ、次いで縁において、線維
軟骨または他の軟組織とは良く一体化しない。２か月〜
６か月において、骨軟骨連結下の全移植組織は、骨に変
換し、一方関節軟骨はその軟骨性を保つ。移植組織の生
体内分解性BRIVは再吸収された。
最良態様を含む下記の特別の例は本発明をさらに具体
的に説明するために使用できる。例は記載のように製造
および試験された。
例１ 骨髄由来軟骨細胞を含有する移植組織 自己または相同性骨髄は、腸骨稜または脚管から骨生
検針を用いる吸引によつて得られる。吸引された細胞
は、トリプシン0.25％を含有するリン酸緩衝生理食塩水
（PBS）に注入し、次いで逐次17ゲージ、18ゲージおよ
び20ゲージの針を通して注入して、単細胞懸濁液を得
る。一層高ゲージの針は若干の細胞破壊を誘発すること
が分かる。細胞を15％F.C.S.を有するBGJb培地（GIBC
O）を供給した100mlの組織培養皿上に密度50×106個〜1
00×106個において平板培養する。培地は毎日、または
細胞の増殖速度により必要に応じて取り替える。培地
は、細胞の増殖を容易にすることが分かるIGFI、IG
FII、TGFB、PDGFのような生長因子または任意の他の生
長因子によつて補足される。細胞は、毎週継代培養さ
れ、５回〜６回継代培養後に、ほぼ純粋な線維芽細胞ス
トローマ細胞集団が得られる。この細胞集団を、次いで
トリプシン処理し、次に密度３×106個/ml培地〜８×10
6個/ml培地において懸濁液培養物に入れ、次に毎日培地
に加えるF.C.S.10％およびアスコルビン酸ナトリウム
50μg/mlを有するＦ−12培地（Sigma Co.）中の軟質寒
天上で培養する。線維芽細胞ストローマ細胞は直ちに集
合を開始し、しかも３日〜７日後に、細胞はほとんど30
〜60個の集塊にある。全集塊は分析用組織化学および免
疫組織化学プローブを用いて求められる軟骨原性表現型
を示す。
骨髄由来軟骨細胞はこの例において好ましいが、自己
または相同性源の軟骨細胞または造骨細胞あるいは相同
軟骨前駆（commitled）細胞または間葉源の任意の他の
前駆（progenital）細胞を使用し得る。この初期の配合
物は、軟骨形成または骨形成表現型を示す集団の精製、
増殖および操作を含むことが分かる。さらにとりわけ、
増殖細胞は骨髄ストローマ細胞、胚性軟骨前駆細胞およ
び任意の未分化間葉細胞を含む類からのものである。
細胞を生体内分解性粘弾性マトリツクスに混入するた
めに、細胞の得られたペレツトをフイブリノーゲン（15
0mg/ml）およびウシ胎児血清20％および商標「Trasylo
l」（2000 KIU/ml）の下に入手し得るアプロトニンまた
は他の抗プロテアーゼを含有する少容量のリン酸塩緩衝
生理食塩水に再懸濁する。溶液は、細胞（濃度80×106
個/ml〜160×106個/mlの範囲）、フイブリノーゲン、血
清15％〜30％および抗プロテアーゼを含有し、しかも溶
液Ａと呼び得る。この例においては、とりわけBRIV 120
×106個/ml、ウシ胎児血清20％、フイブリノーゲン150m
g/ml、60mM CaCl2中のトロンビン90単位/mlおよびアプ
ロトニン2,000単位を用いる。溶液Ｂと呼ぶ第２溶液は
トロンビン（60mM CaCl2中90単位/ml）を含む。これら
の溶液を混合して、溶液Ａ対Ｂの比を3:1（v/v）に保
つ。移植組織をF.C.S.10％を含有するＦ−12培地に浸漬
し、次いで直ちに使用し得る。あるいは、移植組織は、
F.C.S.90％およびDMSO 10％（または任意の他の低温保
存方式）中で低温保存してもよい（例えばLN2中）。移
植において、欠損にトロンビン溶液を噴霧し、次いで、
移植組織を欠損に圧力ばめする。
数種（鳥類および哺乳類）の骨髄由来軟骨細胞および
胚由来軟骨細胞を用いる肉眼観察、組織学的切片および
生化学試験による実験において集めたデータから、２か
月以内の移植部位において欠損は関節表面において完全
な合同および界面における線維軟骨または他の軟組織と
は完全に一体化せずに適切に充てんされる。２か月〜６
か月において、関節軟骨はその軟骨性を保ちながら、骨
軟骨連結下の全移植組織は骨に変換される。長期追跡期
間後に、変性変化または免疫拒絶反応は認められない。
この例において、血清は、ウシ胎児血清が優先的であ
るが、第２三か月期からの臍帯血清または馬血清あるい
はこれらの任意の組み合せを使用できる。細胞外マトリ
ツクスの使用は必要ない。
例２ 軟骨補修用組成物の製造 出発材料として、長骨の骨端（脛骨、大腿骨、上腕
骨）を用いた。胚性軟骨の単離操作は、骨端のトリプシ
ン処理（１％豚トリプシン）、37℃における60分温置、
各10分間隔の２分渦巻を起こさせ、その後テフロンの流
路をつけたホモジナイザーによる緩やかな機械的解砕を
含む。トリプシン活性は抗たん白分解酵素物質を含有す
る血清によつて求められる。得られた単細胞懸濁液は、
次いで密度２×105個/ml〜４×105個/mlにおいて軟質寒
天（Ham F−12中のBactoagar0.5％）で被覆された平板
上のHam F−12培地（Sigma Co.）中で数日間（４日〜７
日）接種する。アスコルビン酸ナトリウム50μｇの量を
毎日培地に加える。この生長期中に、線維芽細胞はほと
んど死滅し、しかも軟骨細胞強化が起こる。細胞は、遠
心分離によつて捕集し、次いで新グラフトとしてBRIVに
直接使用する。あるいは、完全グラフトを、低温保存す
るか、または細胞を液体窒素中において一層長期間低温
保存（ウシ胎児血清（F.C.S.）10％およびジメチルスル
ホキシド（DMOS））、次いで後にBRIV中に包埋してもよ
い。細胞を採取し、次いで濃度80×106個/ml 例１と同
じ粘弾性生体内分解性マトリツクス〜160×106個/ml
例１と同じ粘弾性生体内分解性マトリツクスにおいて包
埋した。得られた結果は例１のものと同等である。
例３ 筋肉線維芽細胞由来軟骨細胞含有移動組織 自己または相同筋肉を、局部麻酔下に開放生検によつ
て得る。この筋肉を組織の微小片に細断し、次いで時折
渦巻を起こさせながら、P.B.S.中トリプシン0.5％およ
びエチレン ジアミン四酢酸（E.D.T.A.）中でトリプシ
ン処理する。このトリプシン処理された細胞を、次いで
53ミクロンNitexフイルターでろ過する。次にトリプシ
ン処理を、F.C.S.15％を含有するM.E.M.（最小必須）培
地（GIBCO Co.）によつて停止する。遠心分離後、細胞
のペレツトをF.C.S.15％を含有する最小必須培地で洗浄
する。次いで細胞を組織培養皿100mm当たり５×106個〜
100×106個で平板培養し、次にF.C.S.15％を有するM.E.
M.培地をもつて毎日維持する。細胞をF.C.S.15％を有す
るM.E.M.培地上で毎週継代培養し、３回継代培養後、純
粋な線繊芽細胞様集団が得られる。次いで、この細胞集
団をトリプシン処理し、次に濃度３×106個/ml培地〜
（×106個/ml培地で懸濁培養し、次いで培地に毎日添加
するF.C.S.10％およびアスコルビン酸ナトリウム 50μ
g/mlを有するＦ−12培地（Sigma Co.）中の軟質寒天上
で培養する。線維芽細胞は直ちに集合を開始し、３日〜
７日後に、細胞はほとんど30個〜60個の集塊にある。全
集塊は分析用組織化学および免疫組織化学プローブを用
いて、求められる軟骨形成表現型を示す。
筋肉由来軟骨細胞は、この例において好ましいが、骨
髄由来軟骨細胞または始動軟骨細胞も使用できる。細胞
を、遠心分離によつて採取し、次いで濃度80×106個/ml
例１におけると同じ粘弾性生体内分解性マトリツクス
（BRIV）〜160×106個/ml 例１におけると同じ粘弾弾
性生体内分解性マトリツクス（BRIV）で直接に包埋す
る。あるいは、細胞を液体窒素中で長期間低温保存（F.
C.S.90％およびDMSO10％中）し、使用前に解凍し、濃度
80×106個/ml〜160×106個/mlでBRIV中に包埋し、次
いで用いる。これ以上の別法として、全移植組織をF.C.
S.90％およびDMSO 10％中に低温保存して、細胞をBRIV
に包埋し、次いで手術室中において使用前に解凍でき
る。得られた結果は例１のものと同等である。
例４ 骨補修用組成物の製造 骨欠損を再生するために、３法の１つを用いてもよ
い。
4A. 長さ2cm〜4cmの小欠損には、例１、例２または例
３に提案された移植組織を用いる。
4B. 大きい欠損には、天然骨のものに近い生物力学的
性質を有する支持マトリツクスとして用いられる代用骨
の組成物グラフトを用いる。細胞は生体内分解性フイブ
リノーゲンをベースとする接着剤を介してこのマトリツ
クスと結合する。
4C. 骨髄ストローマ細胞は生体外で誘導して造骨細胞
表現型を示し、しかも4Aまたは4Bにおけるように直接使
用して骨欠損を修正できる。（これは骨髄が骨欠損の患
者由来の自己群にのみ使用できる。） 方法 骨または関節軟骨の外傷（骨折）または病原（腫瘍）
あるいは変性疾患欠損を清浄にし、次いで幾何学形状
（立方形または円筒形）に付形する。関節表面の場合、
全操作は、関節鏡によつて実施できる。
損傷された部分を製造した後、同一形状の冷凍移植組
織（例１、例２または例３において詳述されたように製
造）を、37℃において５分〜10分生理食塩水に入れるこ
とによつて迅速に解凍する。
次いで、この移植組織をフイブリノーゲンの溶液に入
れ、次いで移植部位にトロンビン溶液を噴霧する。この
移植組織を、ここで欠損に圧力ばめする。関節欠損にお
いて連続受動運動は直ちに開始する。
大欠損の場合、適当な形状の代用骨材料中に（上に）
包埋された、生体移植組織の複合グラフトを使用でき
る。この移植組織は、特注または商業標準型である。
種々の代替および修正は前記に提案されたが、本発明
はこれに限定されず、添付特許請求の範囲によるすべて
の形態および変形を含むと理解される。

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】移植による関節軟骨および骨の再生用組成
    物であって、 自己または相同物源の骨髄由来軟骨細胞または造骨細
    胞、 相同軟骨前駆細胞、 自己または相同筋線維芽細胞由来の軟骨細胞、または間
    葉由来のその他の前駆細胞、ならびにフィブリノーゲ
    ン、トロンビン、CaCl2、プロテアーゼ阻害剤および血
    清約10−30％からなる生体分解性、生体和合性、生体再
    吸収性固定化ベヒクル（BRIV）接着性膠からなり、 80−160×106細胞/ml BRIVを含有することを特徴とする
    上記再生用組成物。
  2. 【請求項２】前記血清が、第２三か月期からの臍帯血清
    またはウシ胎児血清あるいは馬血清またはこのような血
    清の任意の組み合わせから選択される血清15−30％を含
    む、特許請求の範囲第１項に記載の組成物。
  3. 【請求項３】細胞が、培養中において誘発されて増殖で
    き、そして変換されて軟骨形成または骨形成表現型を示
    し得る、濃度120×106個細胞/ml BRIVの骨髄由来軟骨細
    胞のものである、特許請求の範囲第１項に記載の組成
    物。
  4. 【請求項４】細胞が、培養中において誘発されて増殖で
    き、そして変換されて軟骨形成または骨形成表現型を示
    し得る、濃度120×106個細胞/ml BRIVの筋線維芽細胞由
    来の軟骨細胞のものである、特許請求の範囲第１項に記
    載の組成物。
  5. 【請求項５】プロテアーゼ阻害剤が多糖類阻害剤、血漿
    プロテアーゼ阻害剤、合成および天然非血漿プロテアー
    ゼ阻害剤からなる群から選ばれる、特許請求の範囲第１
    項の組成物。
  6. 【請求項６】特許請求の範囲第１項の組成物からなる骨
    格組織移植組織の製造方法であって、 （ａ） 特定の軟骨形成または骨形成表現型を示す細胞
    集団の精製、増殖および操作；および （ｂ） 細胞を、血清少なくとも10％、望ましくは15％
    〜30％を含む生体再吸収性固定化ベヒクル（BRIV）に、
    細胞濃度が80×106〜160×106細胞/ml BRIVとなるよう
    に、包埋する、工程からなる ことを特徴とする、骨格組織移植組織の製造方法。
  7. 【請求項７】増殖細胞が、骨髄ストローマ細胞、胚性軟
    骨前駆細胞または筋線維芽細胞由来軟骨細胞および任意
    の未分化間葉細胞からなる群から選ばれる、特許請求の
    範囲第６項に記載の方法。
  8. 【請求項８】BRIVが100−150mg/mlフィブリノーゲンお
    よび60−90単位/mlトロンビンを含み、かつBRIVがさら
    に約2,000単位/mlアプロチニンを含む特許請求の範囲第
    ６項または第７項のいずれか一つに記載の方法。
  9. 【請求項９】細胞が適当に付形された代用骨中のBRIVに
    包埋されている、前記特許請求の範囲第６項〜第８項の
    いずれか一つに記載の方法。
  10. 【請求項１０】（ａ） 自己骨髄ストローマ細胞または
    自己筋線維芽細胞由来の軟骨細胞を含む増殖細胞集団を
    培養し、 （ｂ） ２×106個細胞/ml培地より高い濃度で軟質寒天
    上の懸濁液中においてこれらを少なくとも５日間操作
    し、 （ｃ） 細胞を収穫し、 （ｄ） 細胞を、80×106個細胞/ml BRIV（血清10％よ
    り過剰、フィブリノーゲン100mg/mlおよびCaCl2 40mMよ
    り過剰中のトロンビン60単位/mlおよびアプロチニン2,0
    00単位を含む）より高い濃度において包埋する工程から
    なることを特徴とする、特許請求の範囲第６項〜第９項
    のいずれか一つに記載の方法。
  11. 【請求項１１】BRIVが血清15％〜30％およびCaCl2 60mM
    より過剰中のトロンビン60単位/mlを含む、特許請求の
    範囲第10項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】生体移植組織を、ウシ胎児血清90％およ
    びDMSO 10％を含有し、かつ血清約20％が存在する、保
    存培地をもって調製後、低温条件下に貯蔵する、特許請
    求の範囲第10項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】収穫された細胞を、ウシ胎児血清90％お
    よびDMSO 10％を含有する保存培地をもって調製後、低
    温条件下に貯蔵し、次いで後日BRIVに包埋する、特許請
    求の範囲第10項〜第12項のいずれか一つに記載の方法。
  14. 【請求項１４】血清が、第２三か月期からの臍帯血清、
    ウシ胎児血清および馬血清から選ばれる、特許請求の範
    囲第10項に記載の方法。
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