KR20170140141A

KR20170140141A - 구슬형 연골세포 치료제의 제조방법

Info

Publication number: KR20170140141A
Application number: KR1020170168492A
Authority: KR
Inventors: 이정선; 이진연; 채병철; 손영숙; 장송선
Original assignee: 주식회사 바이오솔루션
Priority date: 2013-07-24
Filing date: 2017-12-08
Publication date: 2017-12-20
Also published as: US20160367601A1; EP3025720A4; JP2016525541A; WO2015012582A1; CN105392490B; EP3025720A1; KR101814440B1; KR20150014369A; CN105392490A; EP3025720B1; US9956251B2; JP6434014B2

Abstract

본 발명은 구슬형 연골세포 치료제의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, a) 연골세포 및/또는 연골분화능을 갖는 세포를 V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트(deep well plate)에 분주하는 단계; b) 상기 플레이트를 원심분리하는 단계; c) 상기 플레이트를 인큐베이터에서 삼차원 배양하는 단계; 및 d) 각각의 웰에서 펠렛들을 회수하는 단계를 포함함으로써, 균일한 양질의 연골조직을 쉽게 안정적으로 대량으로 제조할 수 있는 지지체 없는 구슬형 연골세포 치료제의 제조방법; 및 상기 방법으로 제조된 연골손상에 주입식으로 간편하게 이식되어 손상을 복구하는 유효성을 갖는 지지체 없는 구슬형 연골세포 치료제에 관한 것이다.

Description

구슬형 연골세포 치료제의 제조방법{METHOD FOR PREPARATION OF BEAD-TYPE CHONDROCYTE THERAPEUTIC AGENT}

본 발명은 구슬형 연골세포 치료제의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, a) 연골세포 및/또는 연골분화능을 갖는 세포를 V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트(deep well plate)에 분주하는 단계; b) 상기 플레이트를 원심분리하는 단계; c) 상기 플레이트를 인큐베이터에서 삼차원 배양하는 단계; 및 d) 각각의 웰에서 펠렛들을 회수하는 단계를 포함함으로써, 반복적으로 재현가능하고 균일한 양질의 연골조직을 쉽게 안정적으로 대량으로 만들 수 있는 지지체 없는 구슬형 연골세포 치료제의 제조방법; 및 상기 방법으로 제조된 연골손상에 주입식으로 간편하게 이식되어 손상을 복구하는 유효성을 갖는 지지체 없는 구슬형 연골세포 치료제에 관한 것이다.

연골조직은 무혈관 조직이고, 조직 내 세포의 비율이 매우 낮기 때문에 자연적 재생은 매우 제한적이다. 1994년 Brittberg 등이 환자 자신의 관절연골세포를 분리, 증식시켜 연골손상부에 이식하는 자가연골세포이식술(ACI, autologous articular chondrocyte implantation) 방법을 보고한 이후에 ACI법은 관절연골 손상 치료에 사용되어 장기관찰에서도 성공적인 결과가 보고되고 있지만, 나이 많은 환자와 큰 크기의 손상에서는 정상 관절연골의 구조적 특징 또는 구성을 재현하지는 못했다. 전통적인 ACI(1세대 ACI)의 제한점은 골막을 덮개로 하여 현탁액 상태의 세포를 손상부위에 고정하는 상당히 침습적인 이식방법, 이식 후 세포의 생존율 감소 및 연골세포의 표현형(phenotype)이 유지되지 못한다는 점, 물리적인 강도 취약 등이 그 원인으로 지목되고 있고, 이러한 제한점을 극복하기 위하여 젤, 막, 삼차원 지지체를 세포 전달 시스템으로 이용하는 2세대 ACI 기술인 조직공학적 연골이 개발되고 있다(Hutmacher 등, 2000; Adkisson 등, 2001; Ochi 등, 2001; Cancedda 등, 2003).

조직공학적 연골 제조에서 지지체는 연골세포에 삼차원 시스템을 제공하여 연골세포의 표현형을 유지하고 초자연골성 세포외기질(ECM) 생산을 촉진시킨다. 뿐만 아니라 세포를 연골손상부위로 전달하고, 이식 부위에 물리적 지지를 제공하여 부하되는 힘으로부터 세포를 보호한다. 현재 많은 합성 또는 천연성분의 재료를 이용하여 조직공학을 위한 지지체를 개발하였지만 임상에 적용하는 측면에서 보면 이종 및 동종유래 천연재료는 면역반응을 유발할 수 있고, 합성 재료의 경우 해로운 분해산물이 생기기도 하기 때문에 안전성 측면에서 자유롭지 않다. 또한 연골세포를 지지체에 접종하면 대부분 지지체의 외곽에 분포하게 되고 연골세포가 합성, 분비한 세포외기질이 지지체의 외곽에서 쉘(shell)을 형성하여 영양분, 노폐물 및 가스의 확산 및 교환을 저해하고 결과적으로 내부 세포의 사멸 등을 초래한다. 몇몇의 연구에서 지지체를 사용하여 성공적인 조직공학적 연골을 만들었지만, 세포와 생체재료와의 상호작용, 생체재료의 불규칙한 분해성, 생체적합성, 고르지 못한 세포분포, 이식 후 조직공학적 연골과 주변연골의 연결(결합) 부족 등 아직 해결해야 하는 과제가 많이 남아있다(Sittinger 등, 1996; Grande 등, 1997; Nehrer 등, 1998; Sims 등, 1998; Hutmacher 등, 2000; Ochi 등, 2001; Naumann 등, 2004; Park 등, 2006; Wolf 등, 2008).

지지체를 사용하지 않고 삼차원적 연골조직을 만드는 방법에 대한 연구는 계속 이뤄져 왔는데, 이러한 방법은 세포와 세포의 ECM 합성 능력에만 의존하여 조직을 형성하기 때문에 이식이 필요한 손상크기에 맞는 조직을 만들기가 어려워 직접 임상에 적용하는데 있어 매우 제한적이라고 보고되어 왔다(Adkisson 등, 2001; Grogan 등, 2003; Marlovits 등, 2003). 연골은 무혈관 조직이므로 저산소 및 저영양 상태에서 잘 견디지만, Jain 등(2005) 및 Rouwkema 등(2008)은 체내의 모든 세포는 혈관에서 100 내지 200 μm 이상 떨어져 있지 않기 때문에 실험실에서 이식을 위한 조직을 만들 때에도 제한된 영양성분, 노폐물 및 가스의 확산을 고려하여 그 크기를 결정해야 한다고 하였다. 게다가 연골손상의 모양과 깊이는 일정하지 않다(도 1A). 때문에 실험실에서 제조한 삼차원적 연골이 손상 부위보다 클 경우 손상의 모양에 맞추어 이식물을 다듬어야 하고, 반대로 연골 이식물이 손상 부위보다 작을 경우에는 손상모양에 맞추어 모자이크처럼 끼워 넣는 방법으로 이식하여야 한다. 현재 개발된 조직공학적 연골 제품들은 이런 방식으로 이식되지만 손상의 두께는 맞춰주지 못하고 있는데, 관절연골에서 이식물이 주변의 연골보다 높이 뛰어나오거나 함몰되면 비정상적 체중부하로 인하여 이식물 또는 주변 정상연골에 추가적 손상을 유발하게 된다(도 1B).

따라서 작은 구슬형의 연골조직을 만든다면, 배양 과정 중 관류(perfusion)의 문제로 인한 내부 세포의 사멸이 없을 것이고, 손상부위에 여러 개의 작은 구슬형 조직을 채워 넣음으로써 연골손상부위의 모양 및 두께에 상관없이 결손부위를 복구할 수 있을 것이다. 뿐만 아니라, 큰 절개 없이 작은 절개 또는 관절경을 통해 손상부위에 주입식으로 이식이 가능할 것이다(도 1C). 하지만 치료제로 개발하기 위해서는 반복적으로 재현가능하고 균일화된 연골성 조직을 만들 수 있는 기술이 필요하고, 넓은 부위 손상에 사용하기 위해서는 상당히 많은 개수의 연골성 조직을 제조할 수 있는 대량배양 시스템이 요구된다.

지지체를 사용하지 않고 초자연골성 조직을 만드는 방법은 연골세포 또는 연골분화능을 갖는 세포의 고밀도 삼차원배양을 기본으로 하고 있고, 고밀도로 삼차원 상태를 유지하는 것은 연골세포의 표현형 발현에 있어 가장 중요한 요소이다. 발생과정에서 보면 연골전구세포(chondroprogenitor cells)의 응집(aggregation) 이후 초기 세포-세포 및 세포-기질 부착분자의 증가로 연골분화는 촉진된다(Tavella 등, 1997; Stewart 등, 2000; Anderer 등, 2002; Zhang 등, 2004).

지지체 없는 작은 연골구조물을 만든 방법 중 먼저 펠렛 배양은 비교적 적은 수의 세포를 원심분리하여 세포응집(condensation)을 이루어 삼차원 배양 시작단계에서부터 인위적으로 세포의 초고밀도 배양 시스템을 만드는 방법이다. 펠렛 형성 과정은 단순하고, 쉽게 재현 가능하며, 연골형성능력을 갖는 세포는 이 시스템 하에서 연골성 기질을 합성, 분비하여 연골성 조직을 만들게 된다(Zhang 등, 2004). 펠렛 배양법은 줄기세포의 연골분화 능력을 평가할 때에 가장 많이 쓰는 방법이고(Pittenger 등, 1999), 연골세포에 미치는 외래인자들의 영향을 평가하는 용도로도 이용되어 왔다(Croucher 등, 2000; Graff 등, 2000; Stewart 등, 2000; Larson 등, 2002). 하지만 펠렛 배양으로 만든 연골구조체의 세포치료제로의 이용가능성에 대한 평가는 이뤄지지 않았는데, 왜냐하면 펠렛 시스템은 양질의 연골성 조직을 만드는데 유용한 방법이지만, 충분한 펠렛 크기를 만들기 어렵다는 문제로 연골손상 재생에 적용하기 어렵다고 판단되어 왔다. 또한 일반적인 펠렛 배양은 뚜껑이 있는 튜브(코니컬 튜브, 저장 튜브, 마이크로원심분리 튜브 등)에 세포현탁액를 넣고 원심분리 후 삼차원 배양하여 튜브 하나 당 한 개의 펠렛을 만들 수 있는 방법을 이용하기 때문에 대량배양에는 어려움이 따른다(도 2A).

지지체 없는 작은 연골구조물을 만든 방법으로는 자연적으로 세포의 응집을 유도하는 방법이 있다. Moscona 등(1961)은 회전기술을 이용하여 “aggregation pattern(응집 패턴)”이라 명명한 세포집합체를 만들었는데 세포가 배양액에 부유된 상태로 동적 배양(dynamic culture)할 경우 세포간의 작용에 의해 자연적으로 세포집합체(aggregate) 형성이 이뤄진다고 하였다(도 2B). Landry등(1985; 1984)은 비부착성 플라스틱 표면에서 세포를 조작하여 삼차원 세포집합체를 만들어 이를 “spheroid(스페로이드)”라 이름 붙였고, Reginato 등(1994), Stewart 등(2000), Anderer 등(2000) 및 Wolf 등(2008)은 연골세포를 아가로스나 하이드로겔을 코팅한 비부착성 배양접시에 배양하여 자연적인 세포집합체 형성을 유도하였다(도 2C). 이러한 자가 스페로이드 시스템에서 세포는 삼차원적인 세포집합체를 형성하고, 자연적 초자연골의 기질과 유사한 자기 자신의 세포외기질(ECM)을 생산한다. 그런데 이 배양방법은 한 개의 세포집합체를 만드는 세포 수를 조절할 수 없고, 형성된 연골성 조직 사이의 융합(fusion)이 일어날 수 있기 때문에 각각 연골성 조직의 크기 및 연골화의 다양성이 존재할 것이므로 조직공학적/세포치료제로서 규격화할 수 없다는 단점이 있다.

또 다른 자연적으로 세포 응집을 유도하는 방법에는 부착성 배양접시를 사용하는 방법이 있다. Imabayashi 등(2003)은 연골 분화능을 갖는 세포의 고농도 현탁액을 부착성 배양접시에 점적하고 37℃ 인큐베이터에서 정치하면 수시간 내지 수일 이내에 세포들이 뭉치게 되는데, 이를 배양배지로 부유시킨 후 비부착성 배양접시 또는 동적 배양 조건에서 삼차원 배양하였다(도 2D). 마이크로매스/콘드로스피어(chondrosphere) 배양이라고 불리는 이 방법은 연골성 조직을 형성하는 세포 수를 조절할 수 있다는 장점이 있지만 자연적으로 세포집합체를 형성할 수 있는 능력은 세포의 상태에 따라 차이가 있기 때문에 균일화된 연골성 조직을 안정적으로 얻을 수 있다는 보장을 할 수 없다. 또한 ECM이 단단해지기 전에 세포집합체를 한꺼번에 배양할 경우 형성된 연골성 조직 사이의 융합이 일어날수 있다.

자연적인 세포집합체를 형성하는 세포 수를 동일하게 하기 위해 마이크로웰(microwell)을 사용하는 연구도 이뤄졌다. 간세포의 삼차원 배양에서 헤파토스피어(hepatosphere)가 클 경우 내부 중심부의 괴사가 생기기 때문에 원하는 크기로 많은 양의 균일화된 헤파토스피어를 만들 수 있는 삼차원 배양 시스템의 개발이 요구되었고, Fukuda 등(2006)은 그런 방법 중 하나로 마이크로몰딩 기술(micromolding techniques)과 같은 방법을 개발하였다. Wong 등(2011) 및 Choi 등(2010)도 얇은 폴리-디메틸실록산(PDMS) 막에 기초한 직경 300~500 μm의 오목한 마이크로몰드를 제작하였고, 간세포를 평편한 PDMS, 실린더형 또는 오목한 마이크로웰에서 배양하여 스페로이드(spheroid)를 형성시켰을 때, 오목한 마이크로웰에서 형성된 구체의 크기와 모양은 균일하였고, 크기는 오목한 마이크로웰의 직경에 의해 완벽하게 조절되었으며, 오목한 마이크로웰에서 배양한 세포는 실린더형 마이크로웰이나 평편한 표면에서 보다 빨리 구체를 형성하였고 세포를 회수하기 쉽기 때문에 안정적인 구체를 얻는데 큰 장점이 된다고 하였다(도 2E). 마이크로몰드를 이용한 마이크로-조직 제조방법은 몰드가 상품화되어 다양한 세포에서 평가되고는 있지만, 이 역시 자연적인 세포응집을 유도하는 방법이기 때문에 균일화된 연골성 조직을 안정적으로 얻을 수 있다는 보장을 할 수 없고, 만들어진 세포집합체의 크기가 너무 작기 때문에 물리적 강도가 취약하고 다루기가 어려워 삼차원 연골세포 치료제로 사용하기에는 한계가 있다.

이와 같이, 지지체를 사용하지 않고 삼차원적 연골조직을 만드는 방법으로 현재까지 알려진 방법들은 충분한 펠렛 크기를 형성하지 못하거나, 대량생산에 적합하지 않거나, 반복적으로 재현가능한 균일한 연골조직을 형성하지 못하거나, 형성된 세포집합체의 크기가 너무 작고 강도가 낮은 문제점들이 있는바, 이들 방법들은 지지체 없는 구슬형 연골세포 치료제를 생산하기에는 부적합하다.

이에, 본 발명은 지지체를 사용하지 않고 삼차원적 연골조직을 만드는 방법으로서 특히 구슬형 연골조직을 생산하기에 적합한 새로운 방법을 제공하고자 하는 것으로, 쉽게 구입 가능한 V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트를 이용하는 간단한 방법에 의해, 반복적으로 재현가능하고 균일한 양질의 연골조직을 쉽게 안정적으로 대량으로 만들 수 있는 구슬형 연골세포 치료제의 제조방법을 제공하는 것을 기술적 과제로 한다. 또한 본 발명자들은 상기 방법으로 제조한 지지체 없는 구슬형 연골세포 치료제가 실제 연골손상에 주입식으로 간편하게 이식되어 손상을 복구하는 유효성을 갖는다는 것을 확인한바, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 지지체 없는 구슬형 연골세포 치료제를 제공하는 것을 또 다른 기술적 과제로 한다.

상기한 기술적 과제를 해결하고자 본 발명은, a) 연골세포 및/또는 연골분화능을 갖는 세포를 V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트(deep well plate)에 분주하는 단계; b) 상기 플레이트를 원심분리하는 단계; c) 상기 플레이트를 인큐베이터에서 삼차원 배양하는 단계; 및 d) 각각의 웰에서 펠렛들을 회수하는 단계를 포함하는 구슬형 연골세포 치료제의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은, 상기 방법으로 제조된 연골손상에 주입식으로 간편하게 이식되어 손상을 복구하는 유효성을 갖는 지지체 없는 구슬형 연골세포 치료제를 제공한다.

또한 본 발명은, 상기 구슬형 연골세포 치료제; 및 뼈 및/또는 뼈 대체제를 포함하는 골연골손상 치료용 연골-뼈 이중 구조물을 제공한다.

본 발명은 지지체 없이 삼차원적 연골조직을 제조하는데 있어 V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트를 사용함으로써, 기존의 배양방법과 비교하여 반복적으로 재현가능하고 균일한 양질의 구슬형 연골조직을 쉽게 안정적으로 대량으로 만들 수 있고, 자동화가 가능하며, 실제 환자의 연골손상에 주입식으로 간편하게 이식되어 손상을 복구하는 유효성을 갖는 구슬형 연골세포 치료제를 만들 수 있다.

도 1은 구슬형 연골조직 이식물의 필요성을 개략적으로 나타낸 도면으로, A는 연골 손상의 불규칙한 모양 및 다양한 무릎 연골 두께를 나타내고 있고, B는 단일 규격(두께)의 이식물일 경우 연골 두께에 따라 연골면에서 튀어나오거나 함몰되는 형태로 이식되어 이식물 또는 주변 정상연골에 비정상적 체중부하가 걸리는 현상을 나타내고 있으며, C는 작은 구슬형의 이식물일 경우 주입식으로 연골손상의 모양/두께에 상관없이 이식 가능함을 나타내고 있다.
도 2는 연골세포 또는 줄기세포에서 지지체 없는 삼차원 연골조직을 만드는 다양한 제조방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3a는 96-웰 딥웰 플레이트와 일반적인 96-웰 플레이트의 웰의 깊이(높이) 차이를 보여주는 사진이다.
도 3b는 다양한 형태의 V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트와 각각의 웰에서 구슬형 연골조직(펠렛)의 형성 모식도이다.
도 4a는 V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 플레이트(300 μL 웰 용량)에서 삼차원 펠렛 배양한 연골세포의 조직학적 염색(GAG 염색) 결과를 보여주는 사진이다
도 4b는 평편한 바닥을 갖는 96-웰 플레이트(300 μL 웰 용량)에서 삼차원 펠렛 배양한 연골세포의 사진이다.
도 4c는 오목한 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트에서 삼차원 펠렛 배양한 연골세포의 사진이다.
도 4d는 V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트에서 삼차원 펠렛 배양한 연골세포의 사진이다.
도 5a 내지 5h는 토끼 연골세포를 V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트에서 삼차원 펠렛 배양하여 만든 구슬형 연골조직(펠렛)의 초기 접종 세포 수 및 배양시간에 따른 특성을 평가한 결과이다.
도 6a 내지 6f는 토끼 연골세포를 V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트에서 웰 당 1.0 x 10⁵개로 10일 동안 삼차원 펠렛 배양하여 만든 구슬형 연골조직(펠렛)의 특성을 분석한 결과이다.
도 7a 내지 7f는 사람 연골세포를 V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트에서 웰 당 1.0 x 10⁵개로 10일 동안 삼차원 펠렛 배양하여 만든 구슬형 연골조직(펠렛)의 특성을 분석한 결과이다.
도 8a 및 도 8b는 96-웰 딥웰 플레이트의 각 웰에 동시에 세포를 접종하고 배지를 교환할 수 있는 장치 및 응용 가능한 자동화 시스템을 나타낸 것이다.
도 8c는 휴대용 펠렛 수집장치의 모식도이다.
도 9a 내지 9d는 도 7의 사람 연골세포로부터 만든 펠렛을 누드마우스 피하에 이식하여 4주, 8주, 16주 및 20주 에 관찰한 결과의 사진이다.
도 10a 내지 10c는 상기 도 6의 토끼 연골세포로부터 만든 펠렛을 토끼 무릎연골 손상부에 이식하여 6주, 12주, 24주째에 이식부위 재생조직을 관찰한 결과이다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명의 구슬형 연골세포 치료제의 제조방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

a) 연골세포 및/또는 연골분화능을 갖는 세포를 V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트에 분주하는 단계;

b) 상기 플레이트를 원심분리하는 단계;

c) 상기 플레이트를 인큐베이터에서 삼차원 배양하는 단계; 및

d) 각각의 웰에서 펠렛들을 회수하는 단계.

일 측면에서, 본 발명의 구슬형 연골세포 치료제의 제조방법은 하기 단계를 포함할 수 있다.

b) 상기 플레이트를 원심분리하는 단계;

c) 상기 플레이트를 인큐베이터에서 삼차원 배양하는 단계;

c-1) 배지를 교환하는 단계; 및

d) 각각의 웰에서 펠렛들을 회수하는 단계.

놀랍게도, 본 발명자들은 상업적으로 이용가능한 V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트를 이용하는 간단한 방법에 의해, 반복적으로 재현가능하고 균일한 양질의 구슬형 연골조직을 쉽게 안정적으로 대량으로 만들 수 있음을 발견하였다.

본 발명의 제조방법의 첫 번째 단계는 연골세포 및/또는 연골분화능을 갖는 세포를 V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트에 분주하는 것이다. 본 발명의 제조방법에 사용되는 V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트는 상업적으로 이용가능한 것이라면 어느 것이라도 상관없지만, 400 μL 이상의 배지를 첨가하는데 적합하도록 웰 용량(well volume)이 500 μL 이상인 것이 바람직하다. 하기 실시예에서는 Axygen 사(Corning Life Science, 미국)에서 제조되는 V자 모양 바닥을 갖는 웰 용량이 600 μL인 96-웰 딥웰 플레이트를 사용하였으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 제조방법에 있어서, V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트의 각 웰에 동시에 세포를 접종할 수 있는 장치는 이미 상업적으로 이용가능하다. 그 한 예로, 도 8a 및 도 8b에 96-웰 딥웰 플레이트의 각 웰에 동시에 세포를 접종하고 배지를 교환할 수 있는 장치 및 응용 가능한 자동화 시스템이 도시되어 있다. 바람직하게는, 멀티-채널 피펫(multi-channel pipette), 멀티-피펫, 마이크로플레이트 워셔(washer) 및 마이크로플레이트 디스펜서(dispenser)로 구성된 그룹 중에서 선택되는 장비를 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명에 있어서, 연골세포 또는 연골분화능을 갖는 세포는 포유동물로부터 유래된 것을 사용한다. 예로써, 사람, 소, 돼지, 말, 개, 염소, 토끼, 쥐 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 사람, 토끼 또는 염소로부터 분리한 연골세포 및/또는 연골분화능을 갖는 세포를 사용한다.

본 발명에 있어서, 용어 “연골세포(chondrocyte)”는 이미 연골세포로 분화 방향이 결정된 세포인 연골전구세포(chondroblast)까지도 포함하는 개념이다. 용어 “연골분화능을 갖는 세포”는 적절한 배양조건에서 연골세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 지칭한다. 바람직하게, 연골분화능을 갖는 세포는 중간엽줄기세포, 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포로 구성된 그룹 중에서 선택되며, 상기 중간엽줄기세포는 지방유래, 골수유래, 제대유래, 제대혈유래, 태반유래, 활액막 유래, 골막유래 또는 연골막유래 세포인 것을 특징으로 한다.

V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트에 분주되는 연골세포 또는 연골분화능을 갖는 세포의 양은 0.1 x 10⁵ 개/웰 내지 5.0 x 10⁵ 개/웰의 범위이며, 바람직하게는 0.5 x 10⁵ 개/웰 내지 2.0 x 10⁵ 개/웰의 범위이다. 이때 배양 배지의 양은 300 μL/웰 내지 2,000 μL/웰의 범위이며, 바람직하게는 400 μL/웰 내지 600 μL/웰의 범위이다. 하기 실시예에서는 세포를 각각 0.5 x 10⁵ 개/400 μL/웰, 1.0 x 10⁵ 개/400 μL/웰 또는 2.0 x 10⁵ 개/400 μL/웰로 분주한 후 펠렛 배양하여 28일 간 평가하였고, 그 결과 구슬형 펠렛을 형성함에 있어서 모두 만족할만한 결과를 나타내었다. 다만 펠렛의 크기가 접종된 세포 수에 정비례하여 계속해서 증가하는 것은 아니었고, 특히 2.0 x 10⁵ 개/400 μL/웰은 1.0 x 10⁵ 개/400 μL/웰과 비교하여 접종 세포 수는 2배이나 형성된 펠렛의 크기는 어느 시점에 이르러(예를 들어, 28 일째) 별로 차이가 없거나 이차원적인 면적도 약 1.1 내지 1.3 배 정도에 머물렀다.

본 발명의 제조방법의 두 번째 단계는 세포를 분주한 상기 96-웰 딥웰 플레이트를 원심분리하는 것이다. 원심분리는 200 내지 3000rpm에서 5 내지 15분간 수행할 수 있으며, 바람직하게는 500 내지 2000 rpm으로 5분 내지 10분 간 수행한다. 원심분리 조건의 구체적인 예시로는, 500rpm에서 15분간, 1000rpm에서 10분간, 1000rpm에서 5분간, 1500rpm에서 5분간, 2000rpm에서 5분간 원심분리하는 방법 등이 있으나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 1200rpm에서 5분간 원심분리하는 것이 좋다.

본 발명의 제조방법의 세 번째 단계는 원심분리한 96-웰 딥웰 플레이트를 인큐베이터에서 삼차원 배양하는 것이다. 인큐베이터에서의 삼차원 배양 조건은 이 기술분야에서 통상적으로 사용하는 조건을 그대로 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 세포를 삼차원 배양할 수 있다. 배지의 종류에는 제한이 없으나, 다만 무혈청 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 일 구체예에서, 상기 배지는 연골분화용 배지이다.

본 발명에 있어서, 삼차원 배양은 적어도 3일 이상 수행하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 3일 내지 30일 간, 가장 바람직하게는 3일 내지 20일 간 수행하는 것이 좋다. 3일 미만으로 배양할 경우, 충분한 크기의 펠렛을 수득할 수도 없을 뿐만 아니라 펠렛이 단단히 뭉쳐져 있지 않고 풀어져버리는 특성을 나타낸다. 또한 30일을 초과하여 배양할 경우, 사멸세포 및 비대연골세포의 과다 출현으로 양질의 연골조직을 수득하는데 바람직하지 못하다.

일 측면에서, 본 발명의 제조방법은 이 단계에서 배지를 교환하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게, 3 내지 4일 간격으로 배지를 교환하면서 세포를 삼차원 배양할 수 있다. 이러한 배지 교환에는, 앞서 첫 번째 단계에서 96-웰 딥웰 플레이트의 각 웰에 동시에 세포를 접종하는데 사용했던 장치를 그대로 사용할 수 있으며, 이들 장치는 이미 상업적으로 이용가능하다. 배지를 교환할 수 있는 장치 및 응용 가능한 자동화 시스템의 예가 도 8a 및 도 8b에 도시되어 있다. 바람직하게는, 멀티-채널 피펫(multi-channel pipette), 멀티-피펫, 마이크로플레이트 워셔(washer) 및 마이크로플레이트 디스펜서(dispenser)로 구성된 그룹 중에서 선택되는 장비를 이용하여 수행할 수 있다.

배양이 완료되면 본 발명의 제조방법의 마지막 단계에 따라 각각의 웰에서 펠렛들을 회수한다. 펠렛을 회수하는 방법에는 특별한 제한이 없으며 이 기술분야에서 통상적으로 사용하는 진공흡입펌프를 이용한 방법을 사용할 수 있다. 그러한 한 예로, 도 8c에 도시한 바와 같은 휴대용 펠렛 수집장치를 사용할 수 있다.

하기 실시예에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 따라 만들어진 구조체는 삼차원 배양 3일부터 초자연골과 같이 표면이 매끈하고 하얀, 반투명의 성상을 나타냈다.

크기에 있어서, 0.5 x 10⁵ 개/웰의 경우 3일째에는 직경이 약 0.5 mm 였고 배양기간이 증가함에 따라 그 크기가 서서히 증가하여 28일째에는 직경이 약 1 mm 였다. 1.0 x 10⁵ 개/웰의 경우 3일째에는 직경 약 1 mm의 구체를 형성하였고 배양기간이 증가함에 따라 그 크기가 서서히 증가하여 28일째에는 직경이 약 1.5 mm로 삼차원배양 전반에 걸쳐 0.5 x 10⁵ 개/웰과 비교하여 약 2배 크기의 구체를 형성하였다. 하지만 2.0 x 10⁵ 개/웰로 만들어진 삼차원 구조체는 경우 3일째에는 직경 약 1 mm의 구체를 형성하였고 배양기간이 증가함에 따라 그 크기가 서서히 증가하여 28일째에는 직경이 약 1.5 mm였지만, 1.0 x 10⁵ 개/웰로 만들어진 삼차원 구조체와 크기의 차이는 관찰되지 않았다.

현미경상의 사진으로 측정한 이차원적 면적에 있어서, 0.5 x 10⁵ 개/웰에서는 삼차원배양 3일째 약 0.28 mm² 였고, 7일, 14일, 21일 및 28일째에는 각각 0.71, 0.92, 1.25, 및 1.12 mm² 로 배양 기간이 증가함에 따라 서서히 증가하다가 21일째와 비교하여 28일째에는 약 10% 면적이 감소하였다. 1.0 x 10⁵ 개/웰에서는 삼차원배양 3일째 약 1.06 mm² 였고, 7일, 14일, 21일 및 28일째에는 각각 1.43, 1.66, 1.91 및 1.74 mm² 로 배양 기간이 증가함에 따라 서서히 증가하다가 21일째와 비교하여 28일째에는 약 10% 면적이 감소하였다. 1.0 x 10⁵ 개/웰에서는 0.5 x 10⁵ 개/웰에서 만들어진 삼차원 조직과 비교하여 배양 14일 까지는 약 2 내지 3.8 배 크기의 구조체를 형성했고 그 이후에는 약 1.5 배 크기였다. 2.0 x 10⁵ 개/웰 에서는 삼차원배양 3일, 7일, 14일, 21일 및 28일째 각각 1.25, 1.68, 2.01, 2.13 및 2.33 mm² 로 배양 기간이 증가함에 따라 그 크기가 서서히 했지만, 1.0 x 10⁵ 개/웰이 비교하여 접종 세포 수는 2배였지만 구조체의 크기는 1.1 내지 1.3 배였다.

또한 토끼 늑연골세포를 1.0 x 10⁵ 개/400 μL/웰로 분주하여10일간 펠렛 배양한 결과 육안적으로 하얗고 매끈한 표면의 반투명한 직경 1.0 내지 1.5 mm의 구슬 모양의 삼차원적 조직이 관찰되었고, 그 평면 크기는 1.6 mm² ± 20% 범위로 세포 공급 개체에 상관없이 96-웰 딥웰 플레이트 각각의 웰에서 균일한 펠렛 형성이 관찰되었다.

또한 사람 늑연골세포를 1.0 x 10⁵ 개/400 μL/웰로 분주하여 10일간 펠렛 배양한 결과 직경 1.0 내지 1.5 mm의 표면이 매끈하고 하얀, 반투명의 작은 구슬형태의 구조물을 얻을 수 있었고, 랏트 당 30개 구슬의 크기를 측정한 결과 일정한 크기를 갖는다는 것을 알 수 있었다.

한편, 본 발명은 상기의 제조방법으로 제조된 지지체 없는 구슬형 연골세포 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 구슬형 연골세포 치료제는 상기의 제조방법으로 제조된 펠렛을 유효성분으로 포함하며, 필요에 따라 이 기술분야에 공지된 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 구슬형 연골세포 치료제를 손상부위에 채워 넣음으로써 연골손상부위의 모양 및 두께에 상관없이 결손부위를 복구할 수 있으며, 큰 절개 없이 작은 절개 또는 관절경을 통해 손상부위에 주입식으로 이식이 가능하다. 따라서 본 발명의 구슬형 연골세포 치료제는 연골손상에 주입식으로 간편하게 이식되어 손상을 복구하는 유효성을 나타낸다.

일 구체예에서, 본 발명의 구슬형 연골세포 치료제를 연골손상부위에 주입하기 전 이들 펠렛들 사이의 접착을 위해 피브린접착제 또는 혈액에서 원심분리하여 얻은 자가 혈소판풍부혈장(Platelet Rich Plasma, PRP) 등을 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 구슬형 연골세포 치료제; 및 뼈 및/또는 뼈 대체제를 포함하는 골연골손상 치료용 연골-뼈 이중 구조물에 관한 것이다. 하이드록시아파타이트는 치아나 뼈 등의 생체내 석회화된 조직을 구성하는 무기물질로서, 칼슘인산화합물 중 가장 높은 결정성을 가지고 있으며, 따라서 분해되는 속도도 그만큼 느리나, 생체내에 존재하는 물질이므로 생체친화성이 높고 여러 뼈 대체제들 중에서 가장 뛰어난 뼈 재생효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 따라서 바람직한 뼈 대체제는 HA-TCP(하이드록시 아파타이트-트리칼슘 포스페이트)이나 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 복수개의 펠렛과 피브린접착제를 섞어 연골부분을 만들고, 그 아래 HA-TCP(하이드록시 아파타이트-트리칼슘 포스페이트)와 골수유래 중간엽줄기세포(BMSCs)를 섞어 만든 뼈 부분을 위치시켜, 뼈와 재생연골 사이의 연결을 평가할 수 있도록 샌드위치 형태의 연골-뼈 이중 구조물을 제작할 수 있다. 이러한 연골-뼈 이중 구조물은 특히 골연골손상의 복구에 적합하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이로써 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1

연골세포 분리 및 증식

늑연골조직을 항생제가 포함된 인산완충생리식염수(PBS)로 3∼5회 세척하여 혈액과 오염물들을 제거하고, 연골을 1∼2 mm³ 정도의 크기로 잘게 자른 후, 0.5% 프로나제(pronase) 및 0.2% 타입 II 콜라게나제(collagenase) 처리로 세포외기질을 소화시키고 세포를 분리하였다. 분리한 세포는 2∼4 x 10⁴ 개/cm²의 밀도로 배양접시에 접종하고 세포증식용 배지 (1 ng/mL의 FGF-2가 포함된 중간엽줄기세포배양배지(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium, MSCGM))를 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 세포가 과밀해질 때까지 배양하였다. 트립신-EDTA 용액으로 배양접시에서 탈착시킨 세포를 1∼2 x 10⁴ 개/cm²의 밀도로 배양접시에 접종하여 6~8 계대까지 계대배양 하였다.

다양한 종류의 96-웰 플레이트 또는 96-웰 딥웰 플레이트에서 연골세포의 삼차원 펠렛 배양

증식이 완료된 계대 6 내지 8의 세포는 연골분화용 배지(DMEM, 50 μg/mL 젠타마이신, 10 ng/mL TGF-beta3, 1% ITS+3, 100 nM 덱사메타손, 50 μg/mL 아스코르브산, 40 μg/mL L-프롤린)에 현탁하여, (1) V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 플레이트(300 μL 웰 용량)에 웰 당 1.0 x 10⁵ 세포/200 μL/웰이 되도록 분주하고, (2) 평편한 바닥을 갖는 96-웰 플레이트(300 μL 웰 용량)에 웰 당 1.0 x 10⁵ 세포/200 μL/웰이 되도록 분주하고, (3) 오목한 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트(600 μL웰 용량)에 웰 당 1.0 x 10⁵ 세포/400 μL/웰이 되도록 분주하고, (4) V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트(600 μL웰 용량)에 웰 당 1.0 x 10⁵ 세포/400 μL/웰이 되도록 분주한 후, 플레이트를 1200 rpm으로 5분간 원심분리한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 3 내지 4일 간격으로 배지를 교환하면서 28일 간 삼차원 배양하였다.

결과

V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 플레이트(300 μL 웰 용량)에서는 구체 형성은 잘되었으나, 후술하는 실시예 2의 (4) 조직학적 특성 및 면역염색의 사프라닌 오(Safranin O) GAG 염색방법에 따라 평가한 결과, 세포모양과 연골성 기질 발현 여부를 바탕으로 연골분화가 이뤄지지 않았음을 확인할 수 있었다(도 4a). 평편한 바닥을 갖는 96-웰 플레이트(300 μL 웰 용량)를 이용한 삼차원 배양에서는 안정적으로 온전한 모양의 구체가 형성되지 못하였다(도 4b). 96-웰 딥웰 플레이트(600 μL웰 용량)를 이용한 삼차원 배양에서 웰의 바닥 모양이 오목한 경우에는 원심분리 과정에도 불구하고 안정적으로 온전한 모양의 구체가 형성되지 못하였으나(도 4c), 웰의 바닥 모양이 V자 모양인 경우에는 안정적으로 일정한 크기를 갖는 구체가 웰 당 하나씩 관찰되었고, 삼차원 배양 3일째에는 어느 정도 단단한 구조를 형성하였다(도 4d).

실시예 2

구슬형 삼차원 연골조직의 제조

세포증식용 배지에서 계대 6 내지 8까지 배양한 토끼 연골세포를 V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트에 0.5 x 10⁵ 개/400 μL/웰, 1.0 x 10⁵ 개/400 μL/웰 또는 2.0 x 10⁵ 개/400 μL/웰로 펠렛 배양하여 28일 간 평가하였다.

구슬형 삼차원 연골조직의 특성 평가방법

(1) 외관 및 크기

삼차원배양 과정 중 각각의 웰에서 펠렛을 수집하여 그 특성을 평가하였다. 먼저 육안 관찰을 통해 외관을 평가하고, 슬라이드글라스 위에 펠렛을 올려놓고 40배 비율로 현미경에 장착된 디지털 카메라로 사진을 찍은 후 그 면적을 측정하였다.

(2) DNA 양

펠렛 중의 DNA 양은 펠렛에 125 μg/mL 파파인(papain)을 첨가하여 균질화(homogenization) 시키고 65℃로 밤새 처리 후 샘플을 준비하여 DNA Quantitation 키트(Bio-Rad Laboratories)의 Hoechst 33258 dye와 섞은 후 흡광도를 측정하였고, 송아지 흉선(Calf thymus) DNA를 스탠다드(20 ng∼10 μg)로 하여 정량적으로 계산하였다.

(3) 글리코스아미노글라이칸(glycosaminoglycan, GAG) 양

펠렛 중의 GAG 양을 측정하기 위해, 펠렛을 파파인 용액(125 μg/mL)으로 65℃에서 밤새 처리하여 GAG 성분을 추출하였고, 원심분리 후 상층액을 취하여 시험샘플을 준비하였다. 여기에 Blyscan 염료(dye reagent)(Biocolor, 영국)를 첨가하여 황산(sulfated) GAG 성분과 염료가 결합하도록 반응시킨 후 원심분리하여 상층액을 제거하였고, 남은 GAG-염료 덩어리를 염료분리시약(dye dissociation reagent)으로 녹인 후 656 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이렇게 측정한 흡광도는 스탠다드(콘드로이친 설페이트, 1.0∼5.0 μg)를 기준으로 정량화 하였다.

(4) 조직학적 특성 및 면역염색

조직학적 평가를 위해 펠렛을 취하여 포르말린으로 고정하고, 탈수, 파라핀 포매 과정을 거쳐 박절기로 4 내지 6 μm 두께로 박절하여 헤마톡실린(hematoxylin)으로 핵 염색 실시 후 사프라닌 오(Safranin O) 염색약을 이용하여 GAG를 염색하였다. 대조염색으로는 패스트 그린(Fast green)을 사용하여 GAG 발현 및 세포의 형태학적 평가를 실시하였다.

삼차원 배양 과정 중 연골의 특성을 평가하기 위하여 펠렛 초박절편(ultrathin-section)을 0.2% 트리톤 X-100으로 투과화하고 히알루로니다제(hyaluronidase)를 처리한 후 항-타입 I 콜라겐 항체, 항-타입 II 콜라겐 항체 또는 항-타입 X 콜라겐 항체를 적용시키고, 2차 항체 및 스트렙타비딘-퍼옥시다제를 처리하였다. DAB으로 발색을 유도하였고, 핵 염색을 위해 패스트 레드(fast red)를 사용하였다.

형광염색에는 펠렛을 통째로 또는 펠렛 초박절편을 0.2% 트리톤 X-100으로 투과화하고 20% 정상 염소 혈청을 처리하여 비특이적 반응을 차단하고 항-아그레칸 항체 또는 항-타입 II 콜라겐 항체를 1차 항체로 사용하고 FITC 표식된 2차 항체를 사용한 후 초박절편의 경우 DAPI로 핵 염색을 하여 형광 현미경(Olympus Optical Co., 일본) 하에서 관찰하였다.

(5) 세포 사멸(apoptosis)

삼차원 배양 과정에서 펠렛 중 세포의 사멸을 평가하기 위하여 4 μm 두께의 절편에서 TUNEL 아세이(Roche, 독일)를 실시하였고, DAPI로 핵을 염색하여 형광현미경하에서 사멸세포의 존재를 평가하였다.

(6) 콜라겐 양

펠렛 중의 콜라겐 양은 펠렛을 취하여 펩신 용액 처리를 통해 콜라겐 성분을 추출하였고, 이 샘플 용액에 Sircol 키트(Biocolor)의 염료 용액을 첨가하고 상온에서 진탕하며 반응시키고 원심분리하여 색소와 결합한 콜라겐을 침전시켰다. 상층액을 완전히 제거하고 1 N NaOH 용액을 침전물에 넣어 녹인 후, 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 콜라겐 함량을 스탠다드(0∼50 μg) 커브를 얻어 위의 방법으로 측정한 흡광도를 기준으로 정량화 하였다.

펠렛 중의 새로 합성된 콜라겐 프로-C-펩티드의 정량적 측정을 위해, 프로-콜라겐 타입 Ⅰ C-펩티드(PIP) EIA 키트(Takara Bio, Inc., 일본)를 사용하였다. 펠렛을 취하여 펩신 용액 처리를 통해 콜라겐 성분을 추출하였고, 나머지 과정은 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 측정된 펩티드 양을 0∼640 ng PIP/mL 범위에서 표준곡선을 기준으로 정량화 하였다.

(7) 유전학적 특성

세포의 유전학적 특성을 평가하기 위해, 펠렛에서 RNA를 추출해 역전사시켜 cDNA를 합성하고, 합성된 cDNA에 대하여 하기 표 1에 나타낸 유전자의 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하였고, PCR 산물을 에티디움 브로마이드(EtBr)가 포함된 아가로즈 젤에서 전기영동한 후 UV 하에서 각 증폭산물의 크기에 해당하는 밴드를 확인하여 평가하였다.

결과

(1) 외관 및 크기

만들어진 구조체는 삼차원 배양 3일부터 초자연골과 같이 표면이 매끈하고 하얀, 반투명의 성상을 나타냈고, 그 크기는 0.5 x 10⁵ 개/웰의 경우 3일째에는 직경이 약 0.5 mm 였고 배양기간이 증가함에 따라 그 크기가 서서히 증가하여 28일째에는 직경이 약 1 mm 였다. 1.0 x 10⁵ 개/웰의 경우 3일째에는 직경 약 1 mm의 구체를 형성하였고 배양기간이 증가함에 따라 그 크기가 서서히 증가하여 28일째에는 직경이 약 1.5 mm로 삼차원배양 전반에 걸쳐 0.5 x 10⁵ 개/웰과 비교하여 약 2배 크기의 구체를 형성하였다. 하지만 2.0 x 10⁵ 개/웰로 만들어진 삼차원 구조체는 경우 3일째에는 직경 약 1 mm의 구체를 형성하였고 배양기간이 증가함에 따라 그 크기가 서서히 증가하여 28일째에는 직경이 약 1.5 mm였지만, 1.0 x 10⁵ 개/웰로 만들어진 삼차원 구조체와 크기의 차이는 관찰되지 않았다(도 5a 및 5b).

28일 간의 삼차원 배양기간 동안 연골세포가 형성한 지지체 없는 삼차원 구조체의 현미경상의 사진으로 측정한 이차원적 면적은 0.5 x 10⁵ 개/웰에서는 삼차원배양 3일째 약 0.28 mm² 였고, 7일, 14일, 21일 및 28일째에는 각각 0.71, 0.92, 1.25, 및 1.12 mm² 로 배양 기간이 증가함에 따라 서서히 증가하다가 21일째와 비교하여 28일째에는 약 10% 면적이 감소하였다. 1.0 x 10⁵ 개/웰에서는 삼차원배양 3일째 약 1.06 mm² 였고, 7일, 14일, 21일 및 28일째에는 각각 1.43, 1.66, 1.91 및 1.74 mm² 로 배양 기간이 증가함에 따라 서서히 증가하다가 21일째와 비교하여 28일째에는 약 10% 면적이 감소하였다. 1.0 x 10⁵ 개/웰에서는 0.5 x 10⁵ 개/웰에서 만들어진 삼차원 조직과 비교하여 배양 14일 까지는 약 2 내지 3.8 배 크기의 구조체를 형성했고 그 이후에는 약 1.5 배 크기였다. 2.0 x 10⁵ 개/웰 에서는 삼차원배양 3일, 7일, 14일, 21일 및 28일째 각각 1.25, 1.68, 2.01, 2.13 및 2.33 mm² 로 배양 기간이 증가함에 따라 그 크기가 서서히 했지만, 1.0 x 10⁵ 개/웰이 비교하여 접종 세포 수는 2배였지만 구조체의 크기는 1.1 내지 1.3 배였다(도 5c).

(2) DNA 양

삼차원 배양기간 중 펠렛 중의 세포 수를 DNA 함량으로 평가한 결과, 배양기간 동안 0.5 x 10⁵ 개/웰에서는 약 80 ng, 1.0 x 10⁵ 개/웰에서는 약 170 ng, 2.0 x 10⁵ 개/웰 에서는 약 200 ng으로 배양기간 내내 일정하게 유지하였고, 접종 세포수는 각각 2배였지만 DNA 함량은 2배 및 1.2배였다(도 5d).

(3) GAG 양

초자연골 특이적 세포외기질인 GAG 성분은 배양기간이 증가함에 따라 증가하였고, 1.0 x 10⁵ 개/웰에서는 0.5 x 10⁵ 개/웰과 비교하여 약 2배의 양이었지만, 2.0 x 10⁵ 개/웰에서는 1.0 x 10⁵ 개/웰과 비슷한 GAG 함량을 보였다(도 5e).

(4) 조직학적 특성

삼차원 배양과정 중 초자연골성 조직의 형성여부를 사프라닌 오(Safranin O) 염색으로 GAG의 발현을 평가한 결과, V자 모양 바닥의 웰에서 0.5 x 10⁵ 개/웰 및 1.0 x 10⁵ 개/웰 세포가 형성한 삼차원 구조체는 배양 3일째부터 구조체 전반에 걸쳐 강한 Safranin O염색이 관찰되었다. 2.0 x 10⁵ 개/웰에서는 3일 및 7일째 Safranin O염색에 음성인 부분이 구조체 중심부에서 관찰되었고, 그 후에는 구조체 전반에 걸쳐 강한 Safranin O염색이 관찰되었다. 삼차원배양 3일째 펠렛에서 세포는 빽빽하게 밀집되어 있었고, 둥근 모양이었지만 소강(라큐네, lacunae)의 형태는 관찰되지 않았다. 7일째 1.0 x 10⁵ 개/웰의 펠렛에서 세포는 뚜렷한 소강 내에 존재하였다. 14일 이후에는 모든 세포 수의 펠렛에서 소강에 에워싸인 세포가 관찰되었고, 시간이 지남에 따라 성숙한 초자연골의 형태를 나타냈다(도 5f).

(5) 세포 사멸(apoptosis)

삼차원 배양과정 중 세포의 사멸여부를 TUNEL 아세이로 평가한 결과 2.0 x 10⁵ 개/웰에서는 3일째부터 배양 종료 시까지 펠렛의 중심부 및 외곽에서 사멸된 세포가 다수 관찰되었다. 0.5 x 10⁵ 개/웰 및 1.0 x 10⁵ 개/웰에서는 28일째에만 사멸된 세포가 관찰되었다(도 5g).

(6) 면역염색

1.0 x 10⁵ 개/웰의 펠렛에서 삼차원 배양기간 동안 타입 I 콜라겐, 타입 II 콜라겐 및 타입 X 콜라겐의 발현을 면역염색으로 평가한 결과, 타입 I 콜라겐은 배양 28일째 표면의 외곽에서만 발현하였고, 타입 II 콜라겐은 28일째 외곽을 제외한 펠렛 전체에서 강하게 염색되었다. 비대연골세포(hypertrophic chondrocyte)의 마커인 타입 X 콜라겐은 14일째 발현 세포가 관찰되었고 시간이 지남에 따라 발현 비율이 증가하였다(도 5h).

실시예 3

세포증식용 배지에서 계대 6 내지 8까지 배양한 토끼 늑연골세포를 분화용 배지에 현탁하여 V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트에 웰 당 1.0 x 10⁵ 개/400 μL씩 분주하였다. 이후 플레이트를 1200 rpm으로 5분간 원심분리한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 3 내지 4일 간격으로 배지를 교환하면서 10일간 펠렛 배양하여 관절연골손상에 이식하기 위한 지지체 없는 구슬형 연골조직을 제조하였다. 배양을 마친 구슬형 연골조직을 휴대용 펠렛 수집장치를 이용하여 수집하여(도 8c), 실시예 2에 기재된 방법에 따라 그 특성을 평가하였다.

그 결과 육안적으로 하얗고 매끈한 표면의 반투명한 직경 1.0 내지 1.5 mm의 구슬 모양의 삼차원적 조직이 관찰되었고(도 6a), 그 평면 크기는 1.6 mm² ± 20% 범위로 세포 공급 개체에 상관없이 96-웰 딥웰 플레이트 각각의 웰에서 균일한 펠렛 형성이 관찰되었다(도 6b). 세포는 소강 내에 존재하며 펠렛 전체적으로 강한 GAG 발현이 관찰되었다(도 6c). 면역형광염색 결과 아그레칸은 펠렛 전체적으로 강하게 염색되었으나 타입 II 콜라겐은 펠렛 전반에 걸쳐 약하게 염색되었고, 타입 X 콜라겐의 발현은 거의 관찰되지 않았다(도 6d). RT-PCR로 타입 II 콜라겐에 대한 유전자 발현을 평가한 결과 3 랏트(lot)에서 모두 발현하는 것이 관찰되었다(도 6e). 펠렛 중의 세포생존율은 95% 이상이었고, GAG 함량은 15 내지 30 μg/pellet이었다(도 6f).

실시예 4

세포증식용 배지에서 계대 6 내지 8까지 배양한 사람 늑연골세포를 분화용 배지에 현탁하여 V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트에 웰 당 1.0 x 10⁵ 개/400 μL씩 분주하였다. 이후 플레이트를 1200 rpm으로 5분간 원심분리한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 3 내지 4일 간격으로 배지를 교환하면서 10일간 펠렛 배양하여 관절연골손상에 이식하기 위한 지지체 없는 구슬형 연골조직을 제조하였다. 배양을 마친 구슬형 연골조직을 휴대용 펠렛 수집장치를 이용하여 수집하여(도 8c), 실시예 2에 기재된 방법에 따라 그 특성을 평가하였다.

그 결과 직경 1.0 내지 1.5 mm의 표면이 매끈하고 하얀, 반투명의 작은 구슬형태의 구조물을 얻을 수 있었고, 랏트 당 30개 구슬의 크기를 측정한 결과 일정한 크기를 갖는다는 것을 알 수 있었다(도 7a). 조직학적으로 세포는 GAG를 강하게 발현하는 기질에 에워싸여 있었고, 세포는 높은 밀도로 존재하며 미성숙 연골세포의 모양을 나타냈다(도 7b). 삼차원배양을 추가적으로 17일 까지 진행한 결과 GAG 및 콜라겐 함량은 계속 증가하였지만, 프로-콜라겐 타입 Ⅰ C-펩티드(PIP)의 양은 10일 이후 감소하였다(도 7c). 형광염색으로 초자연골세포 특이 마커인 타입 II 콜라겐과 아그레칸의 발현을 평가한 결과 비록 약한 발현이었지만 펠렛 전체에 걸친 타입 II 콜라겐의 발현이 관찰되었고 아그레칸은 펠렛 전체적으로 강하게 발현되었다(도 7d). 펠렛의 박절편(thin-section)에서 초자연골세포 특이 마커인 타입 II 콜라겐과 아그레칸, 미성숙연골세포의 마커인 타입 I 콜라겐, 비대연골세포의 특이 마커인 타입 X 콜라겐의 발현을 평가한 결과 각각 약 54%, 99%, 81% 및 0%의 발현비율을 나타냈다(도 7e). RT-PCR로 유전자발현을 평가한 결과 연골세포 특이 마커인 타입 II 콜라겐, 타입 IX 콜라겐 및 아그레칸의 강한 발현이 관찰되었고, 연골세포 전사인자인 sox-9의 발현도 관찰되었다. 뿐만 아니라, 미성숙연골세포의 마커인 타입 I 콜라겐의 발현과 비대연골세포의 특이 마커인 타입 X 콜라겐의 약한 발현도 관찰되었다(도 7f).

실시예 5

구슬형 연골조직의 동물이식 평가: 누드마우스 피하 이식

사람 늑연골세포를 계대 6 내지 8까지 증식 후 V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트에 웰 당 세포 1.0 x 10⁵ 개/400 μL씩 분주한 후 원심분리하고 연골분화용 배지에서 10일 동안 펠렛 배양하였다. 펠렛 40개와 펠렛들 고정을 위해 피브린접착제(그린플라스트, 녹십자)를 섞어 연골부분을 만들고, 그 아래 HA-TCP(하이드록시 아파타이트-트리칼슘 포스페이트; PURUGO, 한국)와 골수유래 중간엽줄기세포(BMSCs)를 섞어 만든 뼈 부분을 위치시켜, 뼈와 재생연골 사이의 연결을 평가할 수 있도록 샌드위치 형태의 연골-뼈 이중 구조물을 제작하였다(도 9a).

동물의 마취는 자일라진 및 케타민으로 유도하고, 수술 부위는 알코올과 포비돈-요오드로 준비하였다. 준비된 누드마우스 견갑골 아래 피부 중앙부를 약 1 cm 절개하고 좌, 우측으로 둔성분리하여 이식 공간을 만든 후 좌우의 피하에 이중 구조물을 각각 한 개씩 이식하였다. 이식 후 4 주, 8 주, 16 주 및 20 주에 동물을 안락사하고, 등 및 어깨부위 피부를 절개한 후 이식물을 육안으로 관찰하였다. 또한 포셉으로 뼈 부분과 연골부분을 당겨 이들의 연결 정도를 평가하고, 이식물을 10% 중성완충포르말린 용액에 고정하였다가 탈회 후 파라핀에 포매하여 6 μm의 두께로 삭정하였다. 슬라이드에 부착한 절편은 헤마톡실린/에오신 염색을 실시하여 조직학적인 평가 및 타입 II 콜라겐 및 아그레칸에 대한 면역 염색을 실시하였다. 또한 조직의 종말분화 여부를 평가하기 위하여 비대연골세포 마커인 타입 X 콜라겐에 대한 면역염색을 실시하였다.

그 결과, 이식 구조물은 두 개의 층이 강하게 연결되어 있었고, 연골 층은 육안적으로 초자연골처럼 표면이 매끈하고 하얀, 반투명하였고 혈관의 침투는 확인되지 않았다. 반면 뼈 층에는 혈관의 유입이 관찰되었다(도 9b). 조직학적으로 펠렛들은 서로 잘 연결되었고, 뼈 기질과의 연결도 관찰되었다(도 9c). 초자연골의 특이 마커인 타입 II 콜라겐은 이식 후 4주부터 20주까지 강하게 발현되었고, 아그레칸 발현은 감소하였다가 다시 증가하는 경향을 나타냈다. 비대연골세포의 마커인 타입 X 콜라겐의 발현은 이식 후 20주까지 관찰되지 않았다(도 9d).

실시예 6

구슬형 연골조직의 동물이식 평가: 토끼 무릎 연골손상부 이식

토끼 늑연골세포를 계대 6 내지 8까지 증식 후 V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트에 웰 당 세포 1.0 x 10⁵ 개/400 μL씩 분주한 후 원심분리하고 연골분화용 배지에서 10일 동안 펠렛 배양하였다. 토끼 무릎의 슬개골 내측을 절개하여 슬개골와을 노출시키고 직경 5 mm, 깊이 약 2 mm의 연골손상을 치과용 마이크로 드릴을 사용하여 만들었다. 손상부를 차가운 생리식염수로 강하게 세척하여 떨어진 단편들을 제거한 후, 펠렛 18 내지 20개를 피브리노겐과 희석한 트롬빈(약 10 IU)과 고루 섞은 후 즉시 무릎손상 홈 부위에 채워 넣었다. 그 위를 고농도의 트롬빈을 포함한 피브린 글루(fibrin glue)로 도포하였다. 대조 결함에는 피브린접착제(그린플라스트, 녹십자, 대한민국) 만을 사용하였고, 충분히 굳은 후 슬개골을 다시 원위치시키고 관절 캡슐과 피부를 봉합하였다. 이식 6 주, 12주 및 24 주 후, 수술한 무릎을 절개하여 관절낭과 무릎 연골을 육안적으로 관찰한 후에 대퇴골의 원위 골두를 적출하여 10% 중성완충포르말린 용액에 고정하였다가 탈회 후 파라핀에 포매하여 6 μm의 두께로 삭정하여 Safranin O 염색 및 타입 I 콜라겐 또는 타입 II 콜라겐에 대한 면역 염색을 실시하였다. 그 결과, 손상부위를 초자연골성 연골층으로 복구하는 것을 육안, 조직학적 및 면역화학적으로 확인할 수 있었다(도 10).

실시예 7

구슬형 연골조직의 동물이식 평가: 염소 무릎 연골손상부 이식

염소 늑연골세포를 계대 6 내지 8까지 증식 후 V자 모양 바닥을 갖는 96-웰 딥웰 플레이트에 웰 당 세포 1.0 x 10⁵ 개/400 μL씩 분주한 후 원심분리하고 연골분화용 배지에서 10일 동안 펠렛 배양하였다. 염소 무릎의 슬개골 내측을 절개하여 슬개골와(patellar groove)와 내측 대퇴골과(medial femoral condyle)는 노출시키고 각각 직경 8 mm, 깊이 약 2 mm의 연골손상을 치과용 마이크로 드릴을 사용하여 만들었다. 손상부를 차가운 생리식염수로 강하게 세척하여 떨어진 단편들을 제거한 후, 펠렛 약 48개를 피브린접착제(트롬빈 약 10 IU) 또는 혈액에서 원심분리하여 얻은 자가 혈소판풍부혈장(Platelet Rich Plasma, PRP)과 트롬빈(약 10 IU)을 사용하여 손상부에 고정하였다. 그리고 그 표면을 고농도의 트롬빈을 포함한 피브린접착제 또는 자가 PRP를 도포하였다. 충분히 굳은 후 슬개골을 다시 원위치시키고 관절 캡슐과 피부를 봉합하였다. 세포 이식 후 결손부위에서의 세포 고정을 확인하기 위하여 수술 후 2 주째 염소 양측 무릎에 대하여 MRI(Magnus 2.1 for Magnum 3.0T MRI system; Medinus, Korea) 평가를 실시하였고, 이식 직후와 이식 12주 및 24 주 후 재생조직의 물리학적 특성을 평가하기 위하여 만능물성계측기 JTM(H5K-T, H.T.E, Salfords, 영국)를 이용하여 압입시험(indentation test)을 실시하였다. 재생조직을 포함한 무릎 부위를 톱으로 자른 후 재생조직의 중심부를 5 N 로드 세포(load cell)와 직경 3 mm의 압입자 프로브(indenter probe)를 사용하여 0.1 S-1 속도로 400 μm 깊이까지 압입하면서 강성도(stiffness) 및 탄성계수(elastic modulus)를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 이식 직후에도 정상연골의 약 1/8 정도의 강도를 보였고, 이식 후 12주 및 24주에 재생조직의 강성도 및 탄성계수는 각각 정상연골의 약 1/2 및 비슷한 수준이었다.

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Claims

a) 연골세포를 V자 모양 바닥을 갖고 웰 용량이 500 μL 이상인 96-웰 딥웰 플레이트(deep well plate)에 0.5 x 10⁵개 내지 1.5 x 10⁵개/400 내지 600 μL/웰로 분주하는 단계;
b) 상기 플레이트를 원심분리하는 단계;
c) 상기 플레이트를 인큐베이터에서 삼차원 배양하는 단계; 및
d) 각각의 웰에서 펠렛들을 회수하는 단계를 포함하는 구슬형 연골세포 치료제의 제조방법.
제1항에 있어서, a) 단계에서 세포를 0.5 x 10⁵개 내지 1.0 x 10⁵개/400 μL/웰로 분주하는 것을 특징으로 하는 구슬형 연골세포 치료제의 제조방법.
제1항에 있어서, a) 단계에서 멀티-채널 피펫(multi-channel pipette), 멀티-피펫, 마이크로플레이트 워셔(washer) 및 마이크로플레이트 디스펜서(dispenser)로 구성된 그룹 중에서 선택되는 장비를 이용하여 세포를 분주하는 것을 특징으로 하는 구슬형 연골세포 치료제의 제조방법.
제1항에 있어서, b) 단계에서 500 내지 2000 rpm으로 5분 내지 10분 간 원심분리하는 것을 특징으로 하는 구슬형 연골세포 치료제의 제조방법.
제1항에 있어서, c) 단계에서 무혈청 배지에서 삼차원 배양하는 것을 특징으로 하는 구슬형 연골세포 치료제의 제조방법.
제1항에 있어서, c) 단계에서 3일 내지 30일 간 삼차원 배양하는 것을 특징으로 하는 구슬형 연골세포 치료제의 제조방법.
제1항에 있어서, c) 단계에서 배지를 교환하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 구슬형 연골세포 치료제의 제조방법.
제7항에 있어서, 멀티-채널 피펫(multi-channel pipette), 멀티-피펫, 마이크로플레이트 워셔(washer) 및 마이크로플레이트 디스펜서(dispenser)로 구성된 그룹 중에서 선택되는 장비를 이용하여 배지를 교환하는 것을 특징으로 하는 구슬형 연골세포 치료제의 제조방법.