JP2018534936A - 大規模細胞製造システム - Google Patents
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Abstract
大規模レベルで細胞を培養及び製造する方法を開示する。特には、アルギネートポリマー製の中空ファイバーにおいて細胞を培養及び製造するための製造システム及びデバイス並びにこれらのシステム及びデバイスを使用する方法を提供する。
【選択図】図1
【選択図】図1
Description
関連出願の相互参照
本願は、2015年11月25日に出願の米国仮特許出願第62/260109号の優先権を主張するものであり、この仮特許出願の開示は参照により全て本願に明示的に援用される。
本願は、2015年11月25日に出願の米国仮特許出願第62/260109号の優先権を主張するものであり、この仮特許出願の開示は参照により全て本願に明示的に援用される。
本開示は概して、アルギネートポリマー製の中空ハイドロゲルファイバーにおける細胞の培養及び製造に関する。より具体的には、本開示は、様々な規模、特には大規模なレベルでもって、多種多様な用途に使用可能な細胞を培養するための製造システム及びデバイスに関する。
哺乳動物の細胞には数多くの用途がある。幹細胞、例えばヒト胚性幹細胞(hESC)及びヒト人工多能性幹細胞(iPSC)及びこれらの後代細胞(すなわち、幹細胞から分化した細胞)を含めたヒト多能性幹細胞(hPSC)は、変性疾患、外傷及びがんの治療に用いることができる。また、人工組織及び臓器の作製に使用できる。加えて、幹細胞及びその後代細胞は、疾患のモデリング、薬剤のスクリーニング並びに化学物質の有効性及び毒性の試験に用いることができる。哺乳動物の細胞はまた、研究室及び産業の両方において、組み換えタンパク質及びウイルスの発現に広く用いられている。これらのタンパク質及びウイルスの多くは診療所で用いられている。これらの用途では、高品質な細胞が大量に必要となる。例えば、パーキンソン病(PD)、心筋梗塞(MI)又はI型糖尿病の患者の治療にはそれぞれ、約105個の生存ドーパミン作動性(DA)ニューロン、約109個の心筋細胞又は約109個のβ細胞が必要となる。加えて、初期にはそれよりずっと多くの細胞が必要となる。インビトロでの細胞培養収率及び続くインビボでの移植細胞の生存率は共に、通常、極めて低いからである。後者の例としては、齧歯類のモデルにおいては、移植から数ヶ月後に生き残っていたのは、移植したドーパミン作動性ニューロンの約6%又は注入した心筋細胞の約1%だけだったと報告されている。さらに、変性疾患又は臓器不全を抱えた患者人口は大きく、米国だけでも100万人を超えるPD患者、100−250万人のI型糖尿病患者及び約800万人のMI患者が含まれる。また、組織工学等の用途では多数の細胞が必要であり、例えば人工のヒトの肝臓又は心臓にはそれぞれ約1010個の肝細胞又は心筋細胞が必要となる。加えて、100万種の化合物ライブラリを1度スクリーニングするには約1010個の細胞が必要となる場合があり、またコンビナトリアルケミストリーにおける進歩、非翻訳RNA並びに複雑なシグナル伝達及び転写ネットワークについての研究は、多数のターゲットに対してスクリーニングできる大型のライブラリを生みだしてきた。多数の哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスターの卵巣細胞(CHO細胞)及びヒト胎児由来腎臓293細胞(HEK293)も治療用バイオテクノロジー製品、例えばモノクローナル抗体(mAb)、酵素及びウイルス粒子の製造に必要である。
現在、費用効率高く幹細胞及びその後代細胞並びに初代細胞を特には大規模に製造できる方法は殆どない。最も広く用いられている、二次元表面上で細胞を培養する2D細胞培養システムは、その低い収率、不均質性、スケーラビリティ及び再現性により限界がある。例えば、表面積1cm2あたり約50000個の心筋細胞しか培養できない。
上記の欠点から、製造をスケールアップするために、三次元(3D)浮遊細胞培養システム、例えばスピナーフラスコ及び撹拌槽バイオリアクタが広く研究さえている。しかしながら、浮遊培養物中の細胞スフェロイドは寄り集まって大きな細胞集塊物を形成することが多い。直径500μmを超える集塊物の中心(図10A)に位置する細胞への栄養分、酸素及び増殖因子、また細胞からの代謝廃棄物の輸送は不十分となり、緩慢な細胞増殖、アポトーシス及びコントロールできない分化につながることはよく知られている。培養物を撹拌又は振盪することで細胞の集塊は低減できるが、流体力学的応力も生じ、これは細胞生存率、増殖及び表現型に負に作用する。培養物における高い細胞密度もまた、細胞の集塊を促進する。これら全ての要因を考慮し、現行の浮遊培養研究においては、細胞を概して低密度(例えば、約3×105細胞/mL)で播種し、70〜120回転/分(rpm)で撹拌する。こういった最適化した条件下であっても、緩慢な細胞の成長、著しい細胞死、表現型の変化、ゲノム変異及び低容積収率は一般的である。例えば、hPSCは典型的には4日で4倍伸展して約2.0×106細胞/mLとなることが判明している。これらの細胞はバイオリアクタの容積の0.4%未満しか占めない。収率のこの低さは、細胞を大規模に製造するにあたっての経済的及び技術的双方の課題となる。
上記に基づき、当該分野においては、異なるタイプの細胞を様々な規模、特には大規模に費用効率高く製造できるロバストな細胞培養システムが必要とされている。このシステムは、研究施設及び産業の両方において有用となり得る。
本開示は概して、アルギネートポリマーの中空ハイドロゲルファイバーにおける哺乳動物細胞の培養及び製造を対象とする。より具体的には、本開示は、様々な規模、特には大規模なレベルでもって細胞を製造可能な培養システム及びデバイス、またアルギネートポリマー製の中空ハイドロゲルファイバーにおいて細胞を培養及び製造するためのシステム及びデバイスの使用方法を対象とする。
細胞培養システムとしての中空ハイドロゲルファイバーの使用は初期の細胞クラスタ形成を促進し、細胞への効率的な物質輸送を確実にし、細胞の流体力学的応力を取り除き、生存率が高い細胞の培養、高い細胞成長率及び高い容積収率(例えば、容積1mlあたり最高5.0×108個の細胞を製造)を可能にする。これらの利点によりバイオリアクタの容積、製造時間及びコストは劇的に減少する。したがって、この新しい培養システムには、細胞製造を一変させる可能性がある。
1つの態様において、本開示は、様々な規模でもって細胞を製造する方法を対象とし、この方法は、アルギネートハイドロゲルファイバーの中空空間に細胞を含む細胞溶液を浮遊させ、細胞のはいった中空ファイバーを細胞培養培地に浮遊させ、細胞を培養することを含む。
別の態様において、本開示は、様々な規模でもって細胞を製造する方法を対象とし、この方法は、細胞溶液及びアルギネート溶液を細胞適合性溶液内へと押し出し、この細胞適合性溶液はアルギネートポリマーをアルギネートポリマー溶液内で架橋して中空アルギネートハイドロゲルファイバーを形成し;細胞がはいった中空ファイバーを細胞培養培地又は細胞適合性バッファに浮遊させ、細胞を培養することを含む。
別の態様において、本開示は、細胞を培養するためのシステムを対象とする。このシステムは、第1インレット、第2インレット、コアチャネル、シェルチャネル及びアウトレットを備えたハウジングであって、第1インレットは細胞溶液をコアチャネルへと導入し、第2インレットはアルギネート溶液をシェルチャネルへと導入し、シェルチャネルはコアチャネルと流体的に接触しており、細胞溶液とアルギネート溶液との接触を可能にするハウジングと、アウトレットでハウジングと流体接触している細胞培養槽とを含み、細胞培養槽は細胞適合性バッファを含む。
本開示において、本方法は、驚くべきことに、多種多様な細胞を大規模なレベルでもって培養できると判明している。本明細書において、「大きい」又は「大規模な」とは約107〜約1015個の細胞、約107〜約1012個の細胞を含めた約107〜約1030個の細胞生産量を指す。本開示の方法及び製造システムは再生医療に大きな影響を与えるが、これは高品質で手頃な価格の細胞を十分供給できるからである。さらに、本発明のシステム及び方法は、組み換えタンパク質及びウイルスを製造するためのより手頃な方法を提供することでバイオ医薬品産業に有利な影響をもたらす。
以下の詳細な説明を考慮すると本開示がより理解でき、上記のもの以外の特徴、態様及び利点が明らかとなる。そのような詳細な説明では以下の図面を参照する。
開示は多様な改変及び代替形態をとり得て、図ではその具体的な実施形態を例として示し、本明細書において以下、詳細に説明している。しかしながら、具体的な実施形態の説明が開示内容を限定することを目的としたものではなく、添付の請求項により定義される開示の趣旨及び範囲内に入る全ての改変、等価物及び代替物をその範囲に含むものと理解すべきである。
特に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術的及び科学的な用語は、本開示が属する分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様の又は等価であるいかなる方法及び材料も本開示の実施又は試験に使用できるものの、好ましい方法及び材料は後述する通りである。
本開示では、本方法は、驚くべきことに細胞を大規模レベルで培養及び製造することができると判明している。特に、本開示は、アルギネートポリマーの中空ファイバーにおいて細胞を培養及び製造するための製造システム及びデバイス、またこれらのシステム及びデバイスを使用する方法を提供する。
細胞の製造/培養方法
本開示の方法は、様々な規模で細胞を培養及び製造するのに使用し得る。本方法は、慣用の細胞培養方法と比較して、少なくとも以下の利点を有する:(1)大規模細胞培養ができる、(2)高密度細胞培養により細胞培養に必要な空間、手間及び材料を削減できる、(3)様々なタイプの細胞を培養することができる、(4)より安価且つ効率的なやり方で細胞を製造できる。本明細書に記載の方法及びシステムを使用して培養及び製造できるそのような細胞の非限定的な例には哺乳動物の細胞、インサート細胞(例えば、ドロソフィラS2細胞)、植物細胞、酵母細胞及び細菌細胞が含まれる。哺乳動物、特にはヒト多能性幹細胞を使用してより詳しく説明するが、本明細書に記載の方法及びシステムは、本開示の範囲から逸脱することなく上記のタイプの細胞のいずれでも使用できることを認識すべきである。
本開示の方法は、様々な規模で細胞を培養及び製造するのに使用し得る。本方法は、慣用の細胞培養方法と比較して、少なくとも以下の利点を有する:(1)大規模細胞培養ができる、(2)高密度細胞培養により細胞培養に必要な空間、手間及び材料を削減できる、(3)様々なタイプの細胞を培養することができる、(4)より安価且つ効率的なやり方で細胞を製造できる。本明細書に記載の方法及びシステムを使用して培養及び製造できるそのような細胞の非限定的な例には哺乳動物の細胞、インサート細胞(例えば、ドロソフィラS2細胞)、植物細胞、酵母細胞及び細菌細胞が含まれる。哺乳動物、特にはヒト多能性幹細胞を使用してより詳しく説明するが、本明細書に記載の方法及びシステムは、本開示の範囲から逸脱することなく上記のタイプの細胞のいずれでも使用できることを認識すべきである。
本明細書において、「哺乳動物細胞」とはヒト及び動物由来の両方の細胞のことである。本開示の方法及びシステムで使用するのに特に適した哺乳動物の細胞には、哺乳動物胚性幹細胞、哺乳動物人工多能性幹細胞、哺乳動物ナイーブ多能性幹細胞、哺乳動物胚性幹細胞、哺乳動物人工多能性幹細胞及び哺乳動物ナイーブ多能性幹細胞から分化した細胞、他の細胞タイプ(例えば、ヒト線維芽細胞を再プログラムしたヒトニューロン)を再プログラムした哺乳動物細胞、哺乳動物初代細胞(例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞、がん細胞、T細胞)、哺乳動物組織幹細胞(例えば、間葉系幹細胞、胎性神経幹細胞)、哺乳動物細胞株(例えば、ヒト胚性腎臓(HEK293)細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞)が含まれる。
概して、本開示の方法は、中空ハイドロゲルファイバー内の液状培地を充填した空間内に細胞を浮遊させ、細胞培養培地内で中空ファイバーを浮遊させることで細胞を伸展及び/又は分化させ、細胞を回収することを含む。
細胞を細胞培養培地又は細胞適合性バッファ内に浮遊させることで細胞溶液を調製する。細胞培養培地は細胞タイプに依存する。適切には、細胞は、1ml3あたり1〜数10億個の細胞の濃度で培地に浮遊させる。
中空ファイバーはアルギネートポリマー材料から作製する。ファイバーの作製に使用するのに適したアルギネートポリマー材料には全ての市販の又は自家精製アルギネートポリマー、例えばSigma(+W201502)のアルギネート酸又はアルギン酸ナトリウム、修飾アルギネートポリマー、例えばメタクリレート修飾アルギネート及びこれらの組み合わせが含まれる。本明細書において、「これらの組み合わせ」とは、ポリマー混合物及びポリマーブレンドのことである。さらに、一部の実施形態においては、ヒアルロン酸等の他のポリマーをアルギネートポリマーにブレンド又は組み入れることでアルギネートハイドロゲルをドープできる。ファイバーを作製するためには、アルギネートポリマーをまず水又は細胞適合性バッファに溶解させることで約0.01%(w/v)〜約20%(w/v)のアルギネートを含むアルギネート溶液を調製する。特に適切な態様においては、次にファイバーを作製し、エクストルーダを使用して細胞を充填する。押出条件は、特定の細胞生存率及び成長に適した、当該分野で公知のものになる。
例えば、図1及び2に示すように、細胞を含む細胞溶液を第1インレット100から供給し、アルギネート溶液を少なくとも第2インレット(図1においてはインレット102、104として示す)から供給する。細胞溶液を含む第1流れとアルギネート溶液を含む第2流れの両方を、アルギネートポリマーをアルギネート溶液内で架橋できるカルシウムイオン又は他のイオン若しくは化学物質、例えばバリウムイオンを含有する細胞適合性溶液へと押し出す。細胞適合溶液はアルギネートポリマーを一瞬で架橋することができ、アルギネート溶液はゲル化して中空ファイバーが形成される。典型的には、ファイバーは約1〜30分で十分に架橋される。
典型的には、形成時、中空ファイバーを特定の細胞及び所望の細胞伸展量に合わせてサイズ調節する。ファイバーは、典型的にはミリメートルからメートルの範囲の長さを有し得る。加えて、中空ハイドロゲルファイバーの外径及び内径はマイクロメートルからミリメートルになり得る。
一旦十分な架橋が行われて中空ファイバーが形成されたならば、細胞適合性溶液を除去し、細胞培養培地を培養物に添加して、現在は架橋された中空アルギネートハイドロゲルファイバー内にある細胞を培養する。幾つかの態様においては、細胞を含むファイバーを、細胞培養槽又はバイオリアクタ内の細胞培養培地に浮遊させる。細胞培養培地は、細胞の生存、成長及び分化の支援に適した、細胞培養分野で公知の任意の培地になり得る。典型的には、細胞培養培地は、以下に限定するものではないが、炭素源、窒素源及び成長因子を含む。架橋中空アルギネートハイドロゲルファイバー内での細胞の培養に使用するための具体的な細胞培養培地は、培養する細胞タイプに左右される。
細胞培養条件は、細胞タイプ、細胞伸展量及び所望する細胞数に左右される。一旦十分な細胞伸展及び所望の細胞数に達したら、細胞を継代し、続く成長及び伸展のために新しい架橋中空アルギネートハイドロゲルファイバー内に播種する。あるいは、伸展させた細胞を、中空空間内で最終的な所望の細胞タイプに分化させることができる。
最後に、ファイバーを化学的又は物理的に溶解させることで細胞をファイバーの中空空間から解放する。一態様において、ファイバーは、化学的溶剤、例えばエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、エチレングリコール四酢酸(EGTA)又はアルギネートリアーゼ溶液(Sigma−Aldrichから入手可能)を使用して溶解させる。別の態様において、ファイバーは機械的な力を用いて溶解させる。中空ファイバー内での細胞の持続時間は典型的には数日から数ヶ月である。
細胞は、研究所及び産業の両方で有用である。小規模及び大規模の細胞を、実験及び産業用途向けにそれぞれシステムで製造できる。細胞は、変性疾患及び外傷治療、薬剤スクリーニング、タンパク質の発現等で使用するために、サイズ及び数において効率的且つ効果的に用意できる。加えて、細胞はタンパク質及びワクチンの製造に使用できる。さらに別の態様において、細胞は組織工学に使用できる。
アルギネート中空ファイバーを加工するためのシステム/デバイス
別の態様において、本開示は、中空空間に細胞を浮遊させたアルギネートポリマーの中空ファイバーを加工するためのデバイスを対象とする。概して、図1を参照するが、デバイス1はハウジング2を含み、ハウジング2はその中心を下に通るコアチャネル106を含む。コアチャネルは、細胞をハウジング2に導入するための第1インレット100につながる。デバイス1のハウジング2はさらに、第2インレット104、102を介して導入されたアルギネート溶液をハウジング2に流すためのシェルチャネル108、110をさらに含む。2本のシェルチャネルを図示しているが、ハウジングはより少ない又は多いシェルチャネル、例えば1本のシェルチャネル又は3、4、5若しくはそれ以上の本数のシェルチャネルを、本開示の範囲から逸脱することなく含み得ることを理解すべきである。幾つかの特に適切な実施形態において、インレット100、102、104には、細胞及びアルギネート溶液の流れをデバイス1のハウジング2内に押し出すためのポンプ(図示せず)が含まれる。
別の態様において、本開示は、中空空間に細胞を浮遊させたアルギネートポリマーの中空ファイバーを加工するためのデバイスを対象とする。概して、図1を参照するが、デバイス1はハウジング2を含み、ハウジング2はその中心を下に通るコアチャネル106を含む。コアチャネルは、細胞をハウジング2に導入するための第1インレット100につながる。デバイス1のハウジング2はさらに、第2インレット104、102を介して導入されたアルギネート溶液をハウジング2に流すためのシェルチャネル108、110をさらに含む。2本のシェルチャネルを図示しているが、ハウジングはより少ない又は多いシェルチャネル、例えば1本のシェルチャネル又は3、4、5若しくはそれ以上の本数のシェルチャネルを、本開示の範囲から逸脱することなく含み得ることを理解すべきである。幾つかの特に適切な実施形態において、インレット100、102、104には、細胞及びアルギネート溶液の流れをデバイス1のハウジング2内に押し出すためのポンプ(図示せず)が含まれる。
デバイス1のチャネル106のアウトレットは細胞適合性バッファが入った細胞培養槽又はバイオリアクタ112と接触し、ハウジング2及び細胞培養槽又はバイオリアクタ112を含むシステムを構成している。槽112は、上述したようにアルギネートポリマーをアルギネート溶液内で架橋して溶液をゲル化させてファイバーを形成させることができるカルシウムイオン又は他のイオン又は他の化学物質を含むバッファ114を含む。
開示は、以下の非限定的な実施例を考察することでより完全に理解できる。
特段の定めがない限り、中空ファイバーは上述した通りに作製した。
実施例1
本実施例において、中空ファイバーにおけるヒト胚性幹細胞(hESC)及びヒト人工多能性幹細胞(ヒトiPSC)を含めたヒト多能性幹細胞の伸展及び成長を8日間にわたって分析した。
本実施例において、中空ファイバーにおけるヒト胚性幹細胞(hESC)及びヒト人工多能性幹細胞(ヒトiPSC)を含めたヒト多能性幹細胞の伸展及び成長を8日間にわたって分析した。
単一ヒト胚性幹細胞(H9、WiCell)(図5A)又はヒト間葉系幹細胞(MSC−iPSC)(図5B)又はヒト皮膚線維芽細胞(Fib−iPSC)(図5C)から再プログラムした人工ヒト多能性幹細胞を、密度1×106細胞/mlで、0.5%(w/v)のヒアルロン酸(Lifecore Biomedical)を含有するEssential 8培地(Life Technology)に浮遊させた。アルギン酸ナトリウムを、1.2%(w/v)アルギネートの濃度に達するまで0.9%(w/v)生理食塩水に溶解させ、オートクレーブにかけた。エクストルーダ(例えば、図1及び2を参照のこと)でもって、10mlの細胞溶液及び10mlのアルギネート溶液を、100mM CaCl2を含有する室温の100mlの滅菌バッファ内へと押し出すことで、細胞を中空空間内に浮遊させたアルギネート中空ファイバーを形成した。ファイバーをCaCl2溶液内で5分間にわたって室温で架橋させた。CaCl2溶液を除去し、Essential 8培地と置き換えた。細胞を、37℃、5%CO2、空気95%、1気圧の標準的な細胞培養インキュベータにおいて、培地に浮遊させた中空ファイバー内で8日間にわたって培養した。単細胞は細胞凝集体へと成長した。細胞を回収するために、Essential 8培地を除去し、100mM EDTA(Sigma)又は40mg/mlアルギネートリアーゼ(Sigma)を含有する37℃のPBSと10分間にわたって置き替えた。アルギネートハイドロゲルファイバーを溶解させ、細胞を回収した。これらの細胞凝集体を、37℃のAccutase(Life Technology)で10分間にわたって処理することで単細胞に分離した。細胞は、2回目の伸展のためにアルギネート中空ファイバー内へと加工することができる。図5A〜5Cに示すように、細胞は、中空ファイバーを使用することで単細胞から大きな凝集体へと効果的に成長した。
実施例2
この実施例においては、実施例1で作製したようなヒトiPSCを含む中空アルギネートファイバーを、ファイバー内で皮質ニューロン及びドーパミン作動性ニューロンへと分化させた。
この実施例においては、実施例1で作製したようなヒトiPSCを含む中空アルギネートファイバーを、ファイバー内で皮質ニューロン及びドーパミン作動性ニューロンへと分化させた。
ヒトMSC−iPSCを、中空ファイバー内で5日間にわたって伸展させた。次に、Essential 8培地を自家製及び科学的に定義されたニューロン分化培地と置き換え、次に皮質ニューロン及びドーパミン作動性ニューロンへとアルギネート中空ファイバー内で30日間にわたって分化させた。結果を図6A〜6Fに示す。図6C及び6Fに示すように、30日目の免疫染色は、ヒトiPSCの大半が対応するニューロンへと分化したことを示した。
実施例3
この実施例においては、ヒトグリオブラストーマ幹細胞を中空ファイバー内で培養した。
この実施例においては、ヒトグリオブラストーマ幹細胞を中空ファイバー内で培養した。
ヒトグリオブラストーマから単離した3つのがん幹細胞株L0、L1及びL2を中空ファイバー内で培養した。単細胞を、密度0.5×106細胞/mlで、0.8%(w/v)ヒアルロン酸(Lifecore Biomedical)を含有するNeuroCult培地(Stem Cell Technology)に浮遊させた。アルギン酸ナトリウムを、1.5%(w/v)アルギネートの濃度に達するまで0.9%(w/v)生理食塩水に溶解させ、オートクレーブにかけた。エクストルーダ(例えば、図1及び2を参照のこと)でもって、10mlの細胞溶液及び10mlのアルギネート溶液を、100mM CaCl2を含有する室温の100mlの滅菌バッファ内へと押し出すことで、細胞を中空空間内に浮遊させたアルギネート中空ファイバーを形成した。ファイバーをCaCl2溶液内で10分間にわたって室温で架橋させた。CaCl2溶液を除去し、NeuroCult培地と置き換えた。細胞を、37℃、5%CO2、空気95%、1気圧の標準的な細胞培養インキュベータにおいて培地に浮遊させた中空ファイバー内で7日間にわたって培養した。単細胞は細胞凝集体へと成長した。細胞を回収するために、NeuroCult培地を除去し、40mg/mlアルギネートリアーゼ(Sigma−Aldrich)を含有する37℃のPBSと10分間にわたって置き替えた。アルギネートファイバーを溶解させ、細胞凝集体を回収した。これらの凝集体は、37℃の0.05%トリプシン(Life Technology)で10分間にわたって処理することで単細胞に分離できる。細胞は、2回目の伸展のためにアルギネート中空ファイバー内へと加工することができる。細胞は、単細胞から大きな凝集体へと成長した(図7A〜7Cを参照のこと)。
実施例4
この実施例においては、Wnt3Aタンパク質を発現するように操作したマウスL細胞を、中空ファイバー内で組み換えタンパク質を製造するために培養した。
この実施例においては、Wnt3Aタンパク質を発現するように操作したマウスL細胞を、中空ファイバー内で組み換えタンパク質を製造するために培養した。
Wnt3Aタンパク質(ATCC(登録商標)CRL−2647)を安定して発現しているマウスL細胞を中空ファイバー内で20日間にわたって培養した。単細胞を、密度1×106細胞/mlで、0.8%(w/v)ヒアルロン酸(Lifecore Biomedical)を含有するDMEM培地(Stem Cell Technology)に浮遊させた。アルギン酸ナトリウムを、1.2%(w/v)アルギネートの濃度に達するまで0.9%(w/v)生理食塩水に溶解させ、オートクレーブにかけた。エクストルーダ(例えば、図1及び2を参照のこと)でもって、20mlの細胞溶液及び20mlのアルギネート溶液を、100mM CaCl2を含有する室温の200mlの滅菌バッファ内へと押し出すことで、細胞を中空空間内に浮遊させたアルギネート中空ファイバーを形成した。ファイバーをCaCl2溶液内で5分間にわたって室温で架橋させた。CaCl2溶液を除去し、10%FBS(Atlant Biologicals)を含有するDMEM培地と置き換えた。細胞を、37℃、5%CO2、空気95%、1気圧の標準的な細胞培養インキュベータにおいて培地に浮遊させた中空ファイバー内で20日間にわたって培養した。細胞は、6日目までに高密度凝集体へと成長した(図8を参照のこと)。
実施例5
この実施例においては、様々な細胞を中空アルギネートハイドロゲルファイバーに浮遊させ、そこで成長させた(細胞培養システム又は培養システムとも称する)。
この実施例においては、様々な細胞を中空アルギネートハイドロゲルファイバーに浮遊させ、そこで成長させた(細胞培養システム又は培養システムとも称する)。
材料及び方法
材料:Fib−iPSC(ヒト皮膚線維芽細胞から再プログラムしたiPSC)及びMSC−iPSC(ヒト間葉系幹細胞から再プログラムしたiPSC)をGeorge Q.Daley研究室(Children’s Hospital Boston,ボストン)から入手した。H9 hESCをWiCell Research Instituteから購入した。L Wnt−3A細胞(ATCC(登録商標)CRL−2647(商標))をATCCから得た。試薬及びその供給業者:E8培地(E8)、Accutase及び生細胞/死細胞生存能染色キット:Life Technologies;Y−27632:Selleckchem;マトリゲル:D Biosciences;ヒアルロン酸ナトリウム(HA 700K−1):Lifecore Biomedical。アルギン酸ナトリウム(500〜600cp;300〜400cp及び80〜120cp):Wako Chemicals。アルギン酸ナトリウム(A2033−100G):Sigma。Vybrant細胞標識溶液:Molecular Probes,Inc.。DMEM:GE Healthcare Life Sciences;FBS:Atlanta biologicals;G418:Sigma。抗体及びその供給業者:Oct4(Santa Cruz Biotechnology;1:100);FOXA2(Santa Cruz Biotechnology;1:200);α−SMA(Abcam;1:200);ネスチン(Millipore;1:200)。Nanog(10mg/mL)、Oct4(10mg/mL)、SSEA−4(10mg/mL)及びアルカリ性ホスファターゼ(10mg/mL)及びブラキュリ(10mg/mL)(R&D systems,Inc.)。シリンジポンプ(New Era Pump System,Inc.);使い捨てシリンジ(Henke sass wolf);透明アクリル矩形棒、鋼管及びプラスチック管(McMaster);塩化カルシウム(Acros Orcanics);塩化ナトリウム(Fisher scientific)。メカニカルステージ及びコントローラ(CESCO);ベローズボトル(Spectrum Chemical Mfg.Corp.);ルシフェラーゼアッセイキット(Biovision,K801−200)。
材料:Fib−iPSC(ヒト皮膚線維芽細胞から再プログラムしたiPSC)及びMSC−iPSC(ヒト間葉系幹細胞から再プログラムしたiPSC)をGeorge Q.Daley研究室(Children’s Hospital Boston,ボストン)から入手した。H9 hESCをWiCell Research Instituteから購入した。L Wnt−3A細胞(ATCC(登録商標)CRL−2647(商標))をATCCから得た。試薬及びその供給業者:E8培地(E8)、Accutase及び生細胞/死細胞生存能染色キット:Life Technologies;Y−27632:Selleckchem;マトリゲル:D Biosciences;ヒアルロン酸ナトリウム(HA 700K−1):Lifecore Biomedical。アルギン酸ナトリウム(500〜600cp;300〜400cp及び80〜120cp):Wako Chemicals。アルギン酸ナトリウム(A2033−100G):Sigma。Vybrant細胞標識溶液:Molecular Probes,Inc.。DMEM:GE Healthcare Life Sciences;FBS:Atlanta biologicals;G418:Sigma。抗体及びその供給業者:Oct4(Santa Cruz Biotechnology;1:100);FOXA2(Santa Cruz Biotechnology;1:200);α−SMA(Abcam;1:200);ネスチン(Millipore;1:200)。Nanog(10mg/mL)、Oct4(10mg/mL)、SSEA−4(10mg/mL)及びアルカリ性ホスファターゼ(10mg/mL)及びブラキュリ(10mg/mL)(R&D systems,Inc.)。シリンジポンプ(New Era Pump System,Inc.);使い捨てシリンジ(Henke sass wolf);透明アクリル矩形棒、鋼管及びプラスチック管(McMaster);塩化カルシウム(Acros Orcanics);塩化ナトリウム(Fisher scientific)。メカニカルステージ及びコントローラ(CESCO);ベローズボトル(Spectrum Chemical Mfg.Corp.);ルシフェラーゼアッセイキット(Biovision,K801−200)。
アルギネート中空ファイバーの加工:自家製マイクロエクストルーダを使用してアルギネート中空ファイバーを加工した。単細胞及びアルギネート溶液を含有するヒアルロン酸(HA)溶液を、自家製マイクロエクストルーダの中央及び側方チャネル内へとそれぞれポンプ輸送し、CaCl2バッファ(100mM)内へと押し出すことで中空ファイバーを形成した。続いて、CaCl2バッファを細胞培養培地と置き換えた。
中空アルギネートハイドロゲルファイバー内でのhPSCの培養:典型的な細胞培地の場合、アルギネート中空ファイバー内の20μLの細胞溶液を、6ウェルプレート内の2mLのE8培地に浮遊させ、5%CO2、21%O2、37℃のインキュベータにおいて培養した。培地は毎日交換した。細胞を継代するために、培地を除去し、アルギネートハイドロゲルを0.5mM EDTAに5分間にわたって溶解させた。細胞塊を100gで5分間にわたって遠心分離することで回収し、37℃のAccutaseで12分間にわたって処理し、続く培養のために単細胞に分離した。
中空アルギネートハイドロゲルファイバーにおけるL−Wnt3A細胞の培養:典型的な細胞培養の場合、アルギネート中空ファイバー内の20μLの細胞溶液を、6ウェルプレート内の2mLのDMEM培地+10%FBS及び0.4mg/mLのG418に浮遊させ、5%CO2、21%O2、37℃のインキュベータ内で培養した。培地は毎日交換し、Wnt3Aタンパク質の定量化のために回収した。Wnt3Aタンパク質を定量化するために、正準Wntシグナル伝達のために、MDA−468細胞(ATCC(登録商標)HTB−132(商標))に安定的にルシフェラーゼレポーターをトランスフェクトした(Addgene、#24308)。これらのMDA−468−TFP細胞を96ウェルプレート(5000細胞/ウェル/200mL培地)にプレーティングした。24時間後、150mLの新鮮なDMEM+10%FBS及び50mLのL−Wnt3A−細胞条件培地を添加し、さらに18時間にわたってインキュベートした。次に、培地を除去し、細胞をPBSで1回洗浄してから200mLの細胞溶解バッファを添加し、10分間にわたって室温でインキュベートした。ルシフェラーゼアッセイキットの50mLの細胞ライセート、50mLの基質A及び50mLの基質Bを混合し、速やかに光信号をルミノメータで読んだ。Wnt3aタンパク質の量を標準曲線で計算した。
中空アルギネートハイドロゲルファイバー内のhPSCのバイオリアクタでの培養:中空ファイバー内の2.0mLの細胞溶液を自家製バイオリアクタに浮遊させた。細胞を、5%CO2、21%O2、37℃のインキュベータにおいて10日間にわたって培養した。バイオリアクタ1の場合、培地をフラスコ内に入れ、バイオリアクタ内へと連続的に潅流させた。バイオリアクタ2の場合、培地をベローに保存し、ベローを定期的に押すことで培地をコンテナ内へと流した又はベローを開放して培地をコンテナから抜いた。
染色及び画像化:二次元表面上で培養した細胞を、室温の4%パラホルムアルデヒド(PFA)で15分間にわたって固定し、0.25%Triton X−100で15分間にわたって透過処理し、5%ロバ血清で1時間にわたってブロックした。次に、細胞を一次抗体と4℃で一晩インキュベートした。十分に洗浄後、二次抗体及び4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール、ジヒドロクロリド(DAPI)を添加し、さらに1時間にわたって室温でインキュベートした。細胞をPBSで3回洗浄してからZeiss Axio Observer蛍光顕微鏡で画像化した。細胞の多能性を評価するために、hPSCをマトリゲル被覆プレート上に一晩プレーティングしてから固定及び染色した。Oct4+又はNanog+核の割合をImage Jソフトウェアで定量化した。少なくとも1000個の核を分析した。3D円筒形細胞塊を染色するために、細胞塊を回収し、室温の4%PFAで30分間にわたって固定し、次にPBS+0.25%Triton X−100+5%ヤギ血清+一次抗体と4℃で48時間にわたってインキュベートした。十分に洗浄後、2%BSA中の二次抗体を添加し、4℃で24時間にわたってインキュベートした。細胞をPBSで3回洗浄してからNikon A1共焦点顕微鏡で画像化した。LIVE/DEAD(登録商標)細胞生存能染色を用いて生細胞及び死細胞を製品マニュアルにしたがって評価した。
胚様体(EB)分化:中空アルギネートハイドロゲルファイバーから解放したhPSCを、低接着プレート内のDMEM+20%FBS+10μMβ−メルカプトエタノールに6日間にわたって浮遊させた。次に、細胞塊を、0.1%ゼラチンをコーティングしたプレートに移し、同じ培地でさらに6日間にわたって培養し、続いて上述したように固定及び染色した。
in vivoでのテラトーマ形成:全ての動物プロトコルは、ネブラスカ−リンカーン大学の動物実験委員会により認可されている。動物を含めた全ての実験手順は、ネブラスカ−リンカーン大学の動物実験委員会のガイドラインに沿って行った。2×106個のhPSCを25μLのPBS+25μLのマトリゲルに浮遊させ、NOD−SCIDマウス(Charles River Laboratory)の背中に皮下注射した。腫瘍を6〜12週間後に摘出した。腫瘍を4%PFAで48時間にわたって固定し、連続的に70%、95%及び100%のエタノールで脱水し、キシレンで2時間にわたって脱脂してからパラフィンに包埋した。次に、厚さ10μmの切片を切断し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。
核型:核型分析をWiCell Research Instituteで行った。
中胚葉誘導:中空ファイバー内のH9細胞をE8培地で7日間、次に1%B27(インスリン除外)及び12mM CHIR99021を加えたDMEM/F12培地において24時間にわたって培養してから固定及び染色した。
内胚葉誘導:中空ファイバー内のH9細胞をE8培地で7日間、次に1%GlutaMAX、1%B27(インスリン除外)、4mM CHIR99021を加えたRPMI 1640培地で24時間、また1%GlutaMAX、1%B27(インスリン除外)を加えたRPMI 1640培地でさらに24時間にわたって培養してから固定及び染色した。
心筋細胞の分化:中空ファイバー内のH9細胞をE8培地で7日間、次に1%B27(インスリン除外)を加えたDMEM/F12で6日間、1%B27を加えたDMEM/F12で9日間にわたって培養した。以下の小分子を分化中に添加した:12mM CHIR99021を0〜1日目;5mM IWR1を3〜4日目。細胞塊を11日目にゼラチン被覆プレート上に解放した。拍動する心筋細胞を15日目に撮影した。幾つかのサンプルを11日目にcTNT免疫染色のために固定した。
統計解析:統計解析を、統計パッケージInstat(GraphPad Software、ラホヤ、カリフォルニア州)を使用して行った。
結果
アルギネートハイドロゲルから中空ファイバーを加工するためにマイクロエクストルーダを作製した(図9A及び9B)。エクストルーダは、1本又は複数の中空ファイバーを同時に加工するための1つ又は複数のノズルを有し得る(図9A〜9F)。細胞溶液及びアルギネート溶液の粘度は、無欠陥の中空ファイバーを加工するためには近いものであるべきことが判明した。この目的には、ヒアルロン酸(HA)及びメチルセルロース(MC)の両方の溶液を使用して細胞を浮遊させることができる。HA又はMCなしでは、非対称のシェル又はビーズの中空ファイバーが形成されることが多い(図9G)。これらの欠陥は両方とも、細胞培養の失敗につながり得る。浮遊培養物中のhPSCと同様に(図10A及び10B)、中空ファイバー細胞培養システム内のhPSCは初期クラスタ形成フェーズから続く細胞伸展フェーズを通して成長し(図9H及び9I)、ROCK阻害剤Y−27632が分離したhPSCの初期生存に必要であった(図9J)。
アルギネートハイドロゲルから中空ファイバーを加工するためにマイクロエクストルーダを作製した(図9A及び9B)。エクストルーダは、1本又は複数の中空ファイバーを同時に加工するための1つ又は複数のノズルを有し得る(図9A〜9F)。細胞溶液及びアルギネート溶液の粘度は、無欠陥の中空ファイバーを加工するためには近いものであるべきことが判明した。この目的には、ヒアルロン酸(HA)及びメチルセルロース(MC)の両方の溶液を使用して細胞を浮遊させることができる。HA又はMCなしでは、非対称のシェル又はビーズの中空ファイバーが形成されることが多い(図9G)。これらの欠陥は両方とも、細胞培養の失敗につながり得る。浮遊培養物中のhPSCと同様に(図10A及び10B)、中空ファイバー細胞培養システム内のhPSCは初期クラスタ形成フェーズから続く細胞伸展フェーズを通して成長し(図9H及び9I)、ROCK阻害剤Y−27632が分離したhPSCの初期生存に必要であった(図9J)。
ファイバー内のhPSCの増殖及び多能性はアルギネートハイドロゲルの組成に著しく影響されることが判明した。例えば、Sigma(#A2033−100G)及びWako Chemicals(500〜600cp;300〜400cp及び80〜120cp)からの2%アルギネートから加工した中空ファイバーで9日間にわたって培養した場合、hPSCは27、51、51及び49倍に伸展して2.7×、5.1×、5.1×及び4.9×108細胞/mLが得られ、それぞれ最終細胞の47%、76%、80%及び89%が多能性マーカーOct4を発現した(図11A〜11F)。生細胞/死細胞染色により、全ての培養物について細胞死が殆どなかったことが判明した(図11B)。アルギネートのタイプと比較して、1.0〜2.0%の範囲のアルギネート濃度の影響はずっと少なかった。例えば、1.0%、1.5%及び2.0%のWako Chemicals(80〜120cp)のアルギネート(図12A〜12E)を加工した中空ファイバーで9日間にわたって培養したhPSCについて、細胞の増殖及び多能性に有意な差異はなかった(図12A〜12E)。1.5%のWako Chemicals(80〜120cp)アルギネートハイドロゲルは、中空アルギネートハイドロゲルファイバー細胞培養システムにおいてhPSCを培養するのに適当であると結論づけられた。
ファイバー形状もまた、細胞培養システムにおけるhPSC培養に影響した。所与のファイバー外径では、細胞溶液及びアルギネート溶液の流量の比を変化させることでハイドロゲルシェル厚さを制御でき、また図13A及び13Bに記載の等式で予測できる。ファイバー外径はエクストルーダノズルの内径に大体等しい。30、40、70及び90μmシェルの中空ファイバーで9日間にわたって培養した場合、最終細胞の94%、92%、85%及び80%が多能性マーカーOct4を保持した。異なる条件間で細胞生存率及び伸展に有意な差はなかった(図13C〜13E)。内径400μm、250μm及び120μmの中空ファイバー内で9日間にわたって培養した場合、細胞の95%がOct4マーカーを保持した(図14〜14E)。シェル厚さ<70μm及び内径<400μmの中空ファイバーは、中空アルギネートハイドロゲルファイバー細胞培養システムにおいてhPSCを培養するのに適当であると結論づけられた。
研究は、細胞外マトリックスタンパク質、例えばフィブロネクチン及びラミニンの添加が浮遊培養物におけるhPSC培養効率を高めると示した。本実施例の結果は、試験した濃度のこれらのタンパク質は細胞生存率、成長速度及び多能性を改善せず、またこの細胞培養システムでは不要であることを示した(図15A〜15F)。HA及びMCの両方を細胞に使用し得たため、これらが細胞培養に差別的に影響したか否かをさらに分析した。結果は、1%HA、2%HA及び3%MCが同様の細胞生存率、伸展及び多能性をもたらすことを示した(図15A〜15F)。アルギネート中空ファイバー内でhPSCを培養することの主な懸念は、培地中の大きなタンパク質因子(例えば、bFGF、インスリン及びトランスフェリン)はハイドロゲルシェル及び細胞塊内を効率的に移動して細胞に届かない可能性があることである。bFGFを含有し徐々に放出するポリ乳酸・ポリグリコール酸共重合体(PLGA)ミクロスフィア(StemBeads)を中空ファイバーのリキッドコアに添加した場合、細胞生存率、伸展及び多能性は改善されず、これは新規な培養システムにおけるタンパク質の輸送が効率的且つ十分であることを示している(図15A〜15F)。
細胞培養システムにおいて細胞播種密度がhPSC培養に及ぼす影響も調査した。1.0×106、2.0×106、5.0×106、10.0×106細胞/mLで播種した場合、hPSCは9日目にそれぞれ433、196、104及び46倍まで伸展し、約5.0×108細胞/mLが得られた(図16B)。全ての条件に関して、細胞は上述の2つのフェーズを通して成長した(図16A)。24時間の時点で、細胞クラスタサイズは高播種密度でより大きく、ただし体積あたりの細胞クラスタ数は播種密度に有意に影響されなかった(図16A、1日目、インサート)。これらの結果は、hPSCが低播種密度でより速く成長したことを示した。しかしながら、播種密度は多能性には影響しなかった(図16D及び16E)。超低密度で播種したhPSCもまた、細胞生存率及び多能性を犠牲にすることなく成長したことは実に興味深いことであった。1.0×、3.0×及び5.0×105細胞/mLで播種した場合、hPSCは4000、1666及び1000倍に伸展し、それぞれ約4.2×、5.1×、4.8×108細胞/mLが14、12及び10日目に得られた(図17D)。
最適化後、複数のhPSC株を長期にわたって培養することについて細胞培養システムを評価した。全てのhPSCは細胞培養システムでよく成長し、細胞の形態、生存率、成長速度及び多能性においてhPSC株間で有意な差はなかった(図18A〜18D)。細胞培養システムにおける10継代培養中、1.0×107細胞/mLで播種した場合、hPSCは、1継代あたり5日毎に一貫して約15倍伸展し、>95%の細胞がOct4を発現した(図19G)。細胞培養システムにおける長期培養は、継代1でのhPSCと同様の形態、生存率、成長速度及び多能性により示されるように、細胞の表現型を変化させなかった(図18A〜18D及び図19A〜19G)。インビトロでの胚様体(EB)分化及びin vivoでのテラトーマ形成により、長期培養後のその多能性が確認された。全てのhPSCは成功裡にFOXA2+内胚葉、α−SMA+中胚葉及びネスチン+外胚葉細胞へとEBアッセイにおいて分化した(図20A及び21A及び21B)。全てのhPSCは、免疫不全マウスに移植した場合、内胚葉、中胚葉及び外胚葉組織を含むテラトーマを形成した(図20B及び21C及び21D)。加えて、長期培養後、全てのhPSCは正常な核型(図20C及び21E及び21F)を保持し、凍結保存又はマトリゲル被覆2D面でさらに培養し得た(図22)。中胚葉又は内胚葉又は心筋細胞分化培地での伸展及びさらなる培養後、中空ファイバーにおいてhPSCは対応する中胚葉細胞又は内胚葉細胞又は心筋細胞へと高効率で分化でき、これは細胞培養システムがhPSC分化を支援したことを示す(図23D〜23F)。
培養システムは、hPSC以外の細胞の培養にも使用し得る。例えば、Wnt3aタンパク質を発現するように操作されたマウスL細胞は注目すべき細胞死なく効率的に培養でき、約6.0×108細胞/mLが得られた。重要なことには、これらの細胞は、16日間にわたる培養中、Wnt3aタンパク質を一貫して、2Dディッシュで培養したL細胞が発現したものと同様のレベルで発現した(図24A〜24E)。この結果は、細胞の培養に一般的に適用可能なシステムとしての中空ハイドロゲルファイバーの可能性を実証した。
2つのプロトタイプバイオリアクタを、本発明の細胞培養システム用に設計及び作製した。細胞のはいった中空ファイバーを円筒形コンテナ内に入れた。バイオリアクタ1においては、フラスコに入れた培地を連続的にコンテナ内へと潅流させた(図25A〜25C)。バイオリアクタ2においては、培地をプラスチック製ベローに入れた。ベローを押して培地をコンテナ内へと流し、あるいはベローを開放して培地をコンテナから引き抜くことがそれぞれできる(図23A〜23F)。両方のバイオリアクタ内のhPSCは良く成長し、約5.0×108細胞/mLが10日目に得られた。>95%の細胞が多能性マーカーを発現した。これらのプロトタイプバイオリアクタは、将来的にはスケールアップし得る。中空アルギネートハイドロゲルファイバーの加工をスケールアップするために、エクストルーダもまた、30分以内に1リットルの中空ファイバーを処理できるように100ノズルのものにした(図25D及び25E)。
これらの結果は、本開示の方法及びデバイスを使用して中空アルギネートハイドロゲルファイバーにおいて細胞を培養及び製造できることを実証した。本方法は、研究所及び産業の両方において、疾患及び外傷治療、薬剤のスクリーニングライブラリ、またタンパク質及びワクチンの製造にとって十分且つ高品質な細胞を作製するのに有用であると考えられる。
Claims (20)
- アルギネートハイドロゲルファイバーの中空空間に細胞を含む細胞溶液を浮遊させるステップと、
前記細胞を含む前記ファイバーを細胞培養培地に浮遊させるステップと、
前記細胞を培養するステップとを含む、様々な規模で細胞を製造する方法。 - 前記アルギネートハイドロゲルファイバーが、アルギネート酸ポリマー、アルギン酸ナトリウムポリマー、修飾アルギネートポリマー及びこれらの組み合わせから成る群から選択されるアルギネートポリマーを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、哺乳動物胚性幹細胞、哺乳動物人工多能性幹細胞、哺乳動物ナイーブ多能性幹細胞、哺乳動物胚性幹細胞、哺乳動物人工多能性幹細胞及び哺乳動物ナイーブ多能性幹細胞から分化した細胞、他の細胞タイプを再プログラムした哺乳動物細胞、哺乳動物初代細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞、がん細胞、T細胞、哺乳動物組織幹細胞、哺乳動物細胞株、インサート細胞、植物細胞、酵母及び細菌細胞から成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記アルギネートハイドロゲルファイバーの中空空間から前記培養した細胞を解放するステップをさらに含み、前記解放するステップが前記アルギネートハイドロゲルファイバーを溶解させるステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記アルギネートハイドロゲルファイバーを溶解させるステップが、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、エチレングリコール四酢酸(EGTA)及びアルギネートリアーゼ溶液から成る群から選択される化学的溶剤を使用して前記ファイバーを化学的に溶解させることを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記アルギネートハイドロゲルファイバーを溶解させるステップが、機械的な力を用いて前記ファイバーを物理的に溶解させることを含む、請求項4に記載の方法。
- 細胞溶液及びアルギネート溶液を細胞適合性溶液内へと押し出し、前記細胞適合性溶液がアルギネートポリマーをアルギネートポリマー溶液内で架橋して中空アルギネートハイドロゲルファイバーを形成するステップと、
細胞を含む前記ファイバーを細胞培養培地又は細胞適合性バッファに浮遊させるステップと、
前記細胞を培養するステップとを含む、様々な規模で細胞を製造する方法。 - 前記アルギネート溶液を、アルギネートポリマーを約0.01〜約20重量/体積%アルギネートポリマーの濃度で溶液に浮遊させることで調製する、請求項7に記載の方法。
- 前記細胞適合性溶液がカルシウムイオン及びバリウムイオンの1つ以上を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記アルギネートハイドロゲルファイバーから前記培養した細胞を解放するステップをさらに含み、前記解放するステップが前記アルギネートハイドロゲルファイバーを溶解させるステップを含む、請求項7に記載の方法。
- 前記アルギネートハイドロゲルファイバーを溶解させるステップが、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、エチレングリコール四酢酸(EGTA)及びアルギネートリアーゼ溶液から成る群から選択される化学的溶剤を使用して前記アルギネートハイドロゲルファイバーを化学的に溶解させることを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記アルギネートハイドロゲルファイバーを溶解させるステップが、機械的な力を用いて前記アルギネートハイドロゲルファイバーを物理的に溶解させることを含む、請求項10に記載の方法。
- 第1インレット、第2インレット、コアチャネル、シェルチャネル及びアウトレットを備えたハウジングであって、前記第1インレットは細胞溶液を前記コアチャネルへと導入し、前記第2インレットはアルギネート溶液を前記シェルチャネルへと導入し、前記シェルチャネルは前記コアチャネルと流体的に接触しており、前記細胞溶液と前記アルギネート溶液との接触を可能にするハウジングと、
前記アウトレットで前記ハウジングと流体接触している細胞培養槽とを含み、前記細胞培養槽は細胞適合性バッファを含む、細胞を培養するためのシステム。 - 前記ハウジングが、前記アルギネート溶液を第2シェルチャネルに導入する第3インレットをさらに備える、請求項13に記載のシステム。
- 前記細胞溶液が、哺乳動物胚性幹細胞、哺乳動物人工多能性幹細胞、哺乳動物ナイーブ多能性幹細胞、哺乳動物胚性幹細胞、哺乳動物人工多能性幹細胞及び哺乳動物ナイーブ多能性幹細胞から分化した細胞、他の細胞タイプを再プログラムした哺乳動物細胞、哺乳動物初代細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞、がん細胞、T細胞、哺乳動物組織幹細胞、哺乳動物細胞株、インサート細胞、植物細胞、酵母及び細菌細胞から成る群から選択される細胞を含む、請求項13に記載のシステム。
- 前記アルギネート溶液が、アルギネート酸ポリマー、アルギン酸ナトリウムポリマー、修飾アルギネートポリマー及びこれらの組み合わせから成る群から選択されるアルギネートポリマー材料を含む、請求項13に記載のシステム。
- 前記アルギネート溶液が、約0.01%(w/v)〜約20%(w/v)のアルギネートを含む、請求項13に記載のシステム。
- 前記細胞適合性バッファがカルシウムイオン及びバリウムイオンの少なくとも一方を含む、請求項13に記載のシステム。
- 前記細胞適合性バッファが、CaCl2及びBaCl2の少なくとも一方を含む、請求項18に記載のシステム。
- 前記第1インレット及び第2インレットの一方と流体連結している少なくとも1つのポンプをさらに含む、請求項13に記載のシステム。
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