WO2021206303A1 - 동물 조직 유래 생체 소재의 제조방법, 이에 따라 제조된 동물 조직 유래 생체 소재 및 이를 이용한 3차원 프린팅 방법 - Google Patents
동물 조직 유래 생체 소재의 제조방법, 이에 따라 제조된 동물 조직 유래 생체 소재 및 이를 이용한 3차원 프린팅 방법 Download PDFInfo
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- the present invention aims to provide a method for producing an animal tissue-derived biomaterial capable of reducing cytotoxicity, suppressing immune response, and improving storage stability, an animal tissue-derived biomaterial prepared accordingly, and a three-dimensional printing method using the same .
- This step is a separation step of ultra-filtering the decellularized extracellular matrix solution into a concentrate and a filtrate; a first solution preparation step of concentrating the concentrate obtained through the separation step again through ultrafiltration to prepare a first solution; a second solution preparation step of removing the acidic protease contained in the filtrate obtained through the separation step and then concentrating to prepare a second solution; and a mixing step of mixing the first solution and the second solution.
- the treatment solution obtained through the first treatment step still contains telopeptide that induces an immune response
- the biocompatibility of the animal tissue-derived biological material can be further improved by removing the telopeptide through the second treatment step.
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Abstract
조직에서 세포를 제거하는 탈세포 단계, 산성 프로테아제를 사용하여, 탈세포화된 조직의 세포외기질을 액상화시키는 액상화 단계, 상기 액상화 단계를 통해 얻어진 탈세포화된 세포외기질 용액을 여과하는 여과 단계 및 여과 단계를 통해 얻어진 혼합물을 살균하는 멸균 단계를 포함하는, 동물 조직 유래 생체 소재의 제조방법, 이에 따라 제조된 동물 조직 유래 생체 소재 및 이를 이용한 3차원 프린팅 방법에 관한 것으로, 본 발명의 동물 조직 유래 생체 소재는 생체 적합성 및 저장 안정성이 우수한 장점이 있다.
Description
본 발명은 동물 조직 유래 생체 소재의 제조방법, 이에 따라 제조된 동물 조직 유래 생체 소재 및 이를 이용한 3차원 프린팅 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 탈세포화된 세포외기질을 액상화한 뒤, 세포 독성을 나타내는 성분을 제거하기 위한 여과 단계를 수행함으로써 생체 적합성을 향상시킬 수 있는 동물 조직 유래 생체 소재의 제조방법, 이에 따라 제조된 동물 조직 유래 생체 소재 및 이를 이용한 3차원 프린팅 방법에 관한 것이다.
일반적으로 이식용 혹은 연구용 인공 조직이나 장기 또는 신약 개발을 위한 장기 모델의 제작시 생체 독성이 없으며 면역 반응을 유발하지 않는 생체적합성 소재를 이용한다. 기존에는 PLA(poly latic acid)나 PGA(poly glycolic acid)과 같은 생체적합성 고분자가 이용되었으나, 최근에는 동물 조직 유래 생체 소재가 각광받고 있다.
특히, 탈세포화된 세포외기질(decellularized extracellular matrix, dECM)을 기반으로 한 생체 소재에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 이러한 생체 소재를 이용하는 경우 세포 성분이 제거된 세포외기질 성분만이 포함되어, 바이오 잉크로 이용되는 경우에는 프린팅된 세포들에 합성 재료 기반의 바이오 잉크보다 더욱 적합한 환경을 제공하므로, 최종 조직으로의 분화를 유도하는 생물학적 기능이 월등히 뛰어나다.
그러나, 기존의 탈세포화된 세포외기질을 기반으로 한 생체 소재는 탈세포화된 세포외기질을 액상화하는 공정에서 사용되는 산성 프로테아제 성분을 포함하고 있어 세포 독성을 나타내고, 인체 이식시에 많은 부작용을 나타낼 수 있으며, 저장 안정성을 저하시키는 문제가 있다.
이에, 생체 독성을 감소시키고 면역 반응을 억제시켜 기초 연구 및 동물 실험대체를 위한 조직이나 장기 혹은 이의 유사체뿐만 아니라, 인체 이식용으로도 적용 가능한 인공 조직이나 장기로 활용될 수 있는 범용 생체 소재의 개발이 필요하다.
본 발명에서는 세포 독성을 감소시키고, 면역 반응을 억제시키며 저장 안정성을 향상시킬 수 있는 동물 조직 유래 생체 소재의 제조방법, 이에 따라 제조된 동물 조직 유래 생체 소재 및 이를 이용한 3차원 프린팅 방법을 제공하고자 한다.
상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 동물 조직 유래 생체 소재의 제조방법은, 조직에서 세포를 제거하는 탈세포 단계; 산성 프로테아제를 사용하여, 탈세포화된 조직의 세포외기질을 액상화시키는 액상화 단계; 상기 액상화 단계를 통해 얻어진 탈세포화된 세포외기질 용액을 여과하는 여과 단계; 및 여과 단계를 통해 얻어진 혼합물을 살균하는 멸균 단계;를 포함한다.
상기 상기 여과 단계는, 상기 탈세포화된 세포외기질 용액을 한외여과하여 농축액과 여과액으로 분리하는 분리 단계; 상기 분리 단계를 통해 얻어진 농축액을 한외여과를 통해 1차 용액을 제조하는 1차 용액 제조 단계; 상기 분리 단계를 통해 얻어진 여과액에 포함된 산성 프로테아제를 제거하여 2차 용액을 제조하는 2차 용액 제조 단계; 및 상기 1차 용액과 2차 용액을 혼합하는 혼합단계;를 포함항 수 있다.
또한, 상기 멸균 단계는, 방사선, 에틸렌옥사이드, 초임계 이산화탄소 중 적어도 어느 하나 이상을 이용하여 수행될 수 있으며, 상기 여과 단계와 멸균 단계 사이에 여과된 탈세포화된 세포외기질 용액을 건조하는 건조 단계;가 추가로 더 수행되는 것도 가능하다.
상기 건조 단계는 동결건조 방식으로 수행될 수 있으며, 상기 탈세포 단계와 액상화 단계 사이에, 탈세포화된 세포외기질이 습식으로 분쇄되는 분쇄 단계;가 더 수행되는 것도 가능하다.
상기 분쇄 단계는, 탈세포화된 세포외기질이 산성 수용액과 혼합된 후, 용액 상태에서 습식 분쇄되는 단계일 수 있으며, 상기 분쇄 단계에서, 탈세포화된 세포외기질과 산성 수용액이 혼합된 혼합물의 pH는 1~4일 수 있다.
상기 액상화 단계에서 사용되는 산성 프로테아제는, 펩신인 것이 바람직하고, 액상화 단계는 pH 1~5, 온도 범위 15~25℃에서 수행될 수 있다.
상기 2차 용액 제조 단계는, 이온필터를 이용하여 여과액에 포함된 산성 프로테아제를 제거하는 제1 처리 단계; 및 상기 제1 처리 단계를 통해 얻어진 처리액을 한외여과하여 농축하는 제2 처리 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예로 이러한 방법으로 제조된 동물 조직 유래 생체 소재를 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예로 이러한 동물 조직 유래 생체 소재를 이용한 3차원 프린팅 방법을 들 수 있는데, 상기 동물 조직 유래 생체 소재의 pH를 중화시키는 중화 단계; 중화된 용액을 겔화시키는 겔화 단계; 및 겔화된 용액을 이용하여 3차원 구조체를 제조하는 3차원 프린팅 단계;를 포함한다.
상기 중화 단계는, pH를 6.0~8.0로 조절하는 단계이고, 상기 겔화 단계는, 상기 3차원 구조체를 30℃ 이상으로 가열하여 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 동물 조직 유래 생체 소재의 제조방법, 조직에서 세포를 제거하는 탈세포 단계; 탈세포화된 세포외기질을 습식으로 분쇄하는 분쇄단계; 산성 프로테아제를 사용하여, 탈세포화된 조직의 세포외기질을 액상화시키는 액상화 단계; 상기 액상화 단계를 통해 얻어진 탈세포화된 세포외기질 용액을 여과하는 여과 단계; 여과된 탈세포화된 세포외기질 용액을 동결건조하는 건조 단계; 여과 단계를 통해 얻어진 혼합물을 살균하는 멸균 단계;를 포함하고. 상기 여과 단계는, 상기 탈세포화된 세포외기질 용액을 한외여과하여 농축액과 여과액으로 분리하는 분리 단계; 상기 분리 단계를 통해 얻어진 농축액을 한외여과를 통해 1차 용액을 제조하는 1차 용액 제조 단계; 상기 분리 단계를 통해 얻어진 여과액에 포함된 산성 프로테아제를 제거하여 2차 용액을 제조하는 2차 용액 제조 단계; 및 상기 1차 용액과 2차 용액을 혼합하는 혼합단계;를 포함할 수 있다..
본 발명에 따르면, 탈세포화된 세포외기질을 액상화한 뒤, 세포 독성을 나타내는 성분을 제거하기 위한 여과 단계를 수행함으로써 동물 조직 유래 생체 소재의 생체 적합성을 향상시킬 수 있다.
뿐만 아니라, 기존의 동물 조직 유래 생체 소재와 달리 실온에서도 보관이 가능하여 동물 조직 유래 생체 소재의 저장 안정성이 향상될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실험예의 결과를 도시한 사진이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 상세히 설명하기에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니 되며, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 밝혀둔다.
본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
또한, 본 명에서에서의 분자량은 중량평균분자량을 의미하며 "제거한다"는 표현은 특정 물질이 일부만 혹은 완전히 제거된다는 두 가지 의미를 모두 내포한다.
이하에서는, 본 발명의 실시예를 살펴본다. 그러나 본 발명의 범주가 이하의 바람직한 실시예에 한정되는 것은 아니며, 당업자라면 본 발명의 권리범위 내에서 본 명세서에 기재된 내용의 여러 가지 변형된 형태를 실시할 수 있다.
본 발명은 탈세포화된 세포외기질을 이용한 동물 조직 유래 생체 소재의 제조방법, 이에 따라 제조된 동물 조직 유래 생체 소재 및 이를 이용한 3차원 프린팅 방법에 관한 것이다.
먼저, 본 발명에 따른 동물 조직 유래 생체 소재의 제조방법은, 조직에서 세포를 제거하는 탈세포 단계; 산성 프로테아제를 사용하여 탈세포화된 세포외기질을 액상화시켜 탈세포화된 세포외기질 용액을 제조하는 액상화 단계; 상기 액상화 단계를 통해 얻어진 탈세포화된 세포외기질 용액을 여과하는 여과 단계; 및 여과 단계를 통해 얻어진 혼합물을 살균하는 멸균 단계;를 포함한다.
이때, 상기 탈세포 단계와 액상화 단계 사이에 탈세포화된 세포외기질이 습식으로 분쇄되는 분쇄 단계가 추가로 더 수행될 수 있다.
상기 탈세포 단계는 계면활성제와 고장용액이 포함된 탈세포용액을 이용하여 조직에서 세포를 제거함으로써 탈세포화된 세포외기질(dECM)만을 획득하는 단계로, 탈세포화된 세포외기질에는 콜라겐, 엘라스틴, 라미닌, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG), 프로테오글리칸, 항균제, 화학유인물질, 사이토카인, 성장인자 등의 성분이 포함될 수 있다.
본 발명에서 탈세포화된 세포외기질(dECM)을 획득하기 위해 사용되는 조직으로 인간, 원숭이, 돼지, 소, 토끼, 개, 염소, 양, 닭, 말 등의 포유동물로부터 유래된 조직(예를 들어, 간조직, 지방조직, 방광조직, 심장조직, 근육조직 등)이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
탈세포 단계에서 계면활성제로는 트리톤 X-100(Triton X-100), Tween 80, SDS(sodium dodecyl sulfate), 소듐 데옥시콜레이트 및 트리톤 X-200(Triton X-200)를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상이, 고장용액으로는 NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2, BaCl2 및 NaHCO3을 포함하는 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 염을 포함하는 0.03 내지 1.0 M의 수용액이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이때 계면활성제로 트리톤 X-100을 사용하는 경우에는 세포외기질에 포함된 다양한 단백질과 당단백질 및 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG) 등의 손상을 최소화하면서 세포에 포함되어 있는 DNA를 효과적으로 파괴시킬 수 있으므로, 계면활성제로 트리톤 X-100을 사용하는 것이 바람직하다.
탈세포 단계를 통해 얻어진 탈세포화된 세포외기질은 분쇄 단계를 통해 분쇄된 뒤 액상화될 수 있으며, 이 단계를 통해 탈세포화된 세포외기질의 표면적이 증가하므로 이후 산성 프로테아제를 이용한 액상화 단계에서의 유용 성분 추출률이 향상될 수 있다.
이 단계는, 탈세포 단계를 통해 얻어진 탈세포화된 세포외기질과 고농도의 산성 수용액이 혼합된 후, 용액 상태에서 습식으로 분쇄되는 단계이다. 이때 탈세포화된 세포외기질과 혼합되는 산성 수용액은 고농도의 산성 수용액으로, 예를 들어, HCl, CH3COOH, H3PO4, HNO3, H2SO4 등이 사용될 수 있다. 산성 수용액과 탈세포화된 세포외기질이 혼합된 혼합물의 pH는 1~4로, 액상화 이전에 먼저 산성 환경에 노출됨으로써 탈세포화된 세포외기질에 포함되어 있는 유용 성분, 특히 콜라겐이 산 용해성 콜라겐(acid soluble collagen)의 형태로 수득되므로, 콜라겐의 수득률이 향상될 수 있다.
한편, 통상적으로 조직 분쇄시에는 동결건조 후 고체상태에서 분쇄되는 건식분쇄 방법이 이용되나, 건식분쇄시에는 동결건조 과정에 소요되는 시간이 길어 총 작업 시간이 길어지는 문제가 있고, 동결건조 후 분쇄하는 단계에서 다량의 파우더가 손실되어 유용 성분의 수득률이 저하되는 문제가 있다. 반면, 본 발명에서는 별도의 건조 단계를 거치지 않고, 탈세포 단계 직후 얻어진 젖은 상태의 시료를 고농도의 산성 수용액과 혼합하여 용액 상태에서 분쇄과정을 진행하므로, 총 작업 시간이 현저히 단축되고, 유용 성분의 수득률이 향상되는 장점이 있다.
습식분쇄는 호모게나이저를 이용하여 수행될 수 있으나, 이 외의 다른 분쇄기를 이용할 수도 있고, 분쇄 속도 및 시간은 피분쇄물의 양 및 종류에 따라 다양하게 조절될 수 있다.
상기 액상화 단계는 동물 조직 유래 생체 소재의 가공시 적절한 점도를 형성하기 위해 탈세포 단계를 거쳐 얻어진 탈세포화된 세포외기질을 액상화하여 탈세포화된 세포외기질 용액을 제조하는 단계이다.
이 단계에서 탈세포화된 세포외기질은 산성 프로테아제(protease)에 의해 분해되어 액상화되는데, 산성 프로테아제는 pH 및 온도 조건에 따라 반응성이 달라지는 특징이 있어, 산성 프로테아제의 적절한 활성을 구현하기 위해 액상화 단계는 pH 1~5, 15~25℃의 온도 조건에서 수행되는 것이 바람직하다.
이때, 산성 프로테아제로는 펩신이 사용될 수 있으며, 앞서 분쇄 단계에서 고농도의 산성 수용액이 첨가되어 탈세포화된 세포외기질이 포함된 용액은 이미 pH 1~4의 강한 산성을 나타내므로, 산성 프로테아제를 활성화시키기 위해 이 단계에서 일정량의 물을 첨가하여 희석시켜 용액의 pH 농도를 1~5로 조절하는 것이 바람직하다.
상기 여과 단계는 액상화 단계를 통해 얻어진 탈세포화된 세포외기질 용액을 여과하여, 조직 재생을 촉진하는 성장인자나 사이토카인과 같은 성분은 그대로 유지하면서 동시에 산성 프로테아제나 텔로펩타이드와 같은 세포 독성 혹은 면역 반응을 유발하는 물질을 선택적으로 제거함으로써 동물 조직 유래 생체 소재의 생체 적합성을 향상시키는 단계이다.
이 단계는, 상기 탈세포화된 세포외기질 용액을 한외여과하여 농축액과 여과액으로 분리하는 분리 단계; 상기 분리 단계를 통해 얻어진 농축액을 한외여과를 통해 다시 농축하여 1차 용액을 제조하는 1차 용액 제조 단계; 상기 분리 단계를 통해 얻어진 여과액에 포함된 산성 프로테아제를 제거한 뒤 농축하여 2차 용액을 제조하는 2차 용액 제조 단계; 및 상기 1차 용액과 2차 용액을 혼합하는 혼합단계;를 포함한다.
먼저 분리 단계는, 70~100kDa의 한외여과막으로 탈세포화된 세포외기질 용액을 여과하여 막을 통과한 여과액과 막을 통과하지 못한 농축액으로 분리하는 단계로, 바람직하게는 70kDa의 한외여과막이 사용될 수 있다.
이 단계에서 얻어진 농축액에는 콜라겐, 엘라스틴, 글리코사미노글리칸과 같은 상대적으로 분자량이 큰 성분들이 포함되어 있으며, 이 농축액은 1차 용액 제조 단계에서 추가로 한외여과를 통해 다시 농축되어 1차 용액으로 이용된다. 이때 사용되는 한외여과막의 크기는 0.1~5kDa일 수 있으며, 바람직하게는 0.5~2kDa, 더욱 바람직하게는 1kDa일 수 있다.
한편, 상기 분리 단계에서 얻어진 여과액에는 성장인자, 사이토카인, 산성 프로테아제 및 기타 저분자량의 탈세포화된 세포외기질 성분이 포함되어 있다.
상기 여과액에 포함되어 있는 산성 프로테아제는 탈세포화된 세포외기질을 액상화하기 위해 사용된 것이나, 그 자체로 세포 독성을 나타내고, 효소로써 인체 부작용을 유발할 수 있기 때문에 산성 프로테아제를 포함한 동물 조직 유래 생체 소재를 이용하여 제조된 인공 장기나 조직은 인체에 이식이 곤란하여 그 용도가 연구용으로만 한정되는 문제가 있다. 뿐만 아니라, 15~25℃에서 활성을 나타내기 때문에 산성 프로테아제를 포함하는 동물 조직 유래 생체 소재는 실온 보관이 불가능한 문제가 있었다.
본 발명에서는 분리 단계에서 얻어진 여과액에 존재하는 산성 프로테아제를 제거함으로써 동물 조직 유래 생체 소재의 세포 독성, 면역 반응 유발, 인체 부작용 유발 등의 문제를 방지 혹은 억제할 수 있고, 실온 저장을 가능하게 할 수 있다.
구체적으로, 2차 용액 제조 단계는, 이온필터를 이용하여 여과액에 포함된 산성 프로테아제를 제거하는 제1 처리 단계; 및 상기 제1 처리 단계를 통해 얻어진 처리액을 한외여과하여 농축하는 제2 처리 단계;를 포함하여, 제1 처리 단계에서 산성 프로테아제가 제거되고, 제2 처리 단계에서 면역 반응을 유발하는 텔로펩타이드가 제거될 수 있다.
제1 처리 단계는 산성 프로테아제의 등전점을 이용하여 산성 프로테아제만을 선택적으로 제거하는 단계이다. 산성 프로테아제로는 펩신이 사용될 수 있으며, 펩신의 등전점은 약 pH 1이기 때문에 펩신이 포함된 용액의 pH가 1보다 높은 경우에는 펩신이 음이온으로 대전된다. 따라서, 양이온으로 대전된 이온필터에 앞서 희석을 통해 pH가 1보다 높아진 여과액을 통과시키면, 정전기적인력에 의해 산성 프로테아제는 이온필터에 흡착 혹은 이온교환되어 제거되고, 산성 프로테아제를 제외한 나머지 성분은 이온필터를 통과하여 배출된다. 이러한 이온필터로 예를 들어, Sartobind® Q타입 필터가 사용될 수 있다.
제1 처리 단계를 거쳐 얻어진 처리액에는 여전히 면역 반응을 유발하는 텔로펩타이드가 포함되어 있으므로, 제2 처리 단계를 통해 텔로펩타이드를 제거하여 동물 조직 유래 생체 소재의 생체 적합성을 보다 향상시킬 수 있다.
제2 처리 단계는, 상기 처리액을 한외여과하여 농축하는 단계로, 1~10kDa의 한외여과막, 바람직하게는 4~6kDa의 한외여과막, 더욱 바람직하게는 5kDa의 한외여과막을 이용하여 처리액을 여과시킨 뒤 농축물을 획득하는 단계일 수 있다.
앞서 액상화 단계에서 텔로펩타이드는 산성 프로테아제에 의해 콜라겐으로부터 분리되며, 분리된 텔로펩타이드는 약 0.5~4.5kDa의 낮은 분자량을 갖는다. 반면, 처리액에 포함되어 있는 성장인자, 사이토카인 등의 유용 성분은 약 5kDa 이상의 분자량을 가지므로, 제2 처리 단계에서 위와 같은 크기의 한외여과막을 이용하여 처리액을 농축하면, 텔로펩타이드는 물과 함께 여과액으로 분리되고, 한외여과막에 의해 분리된 성장인자, 사이토카인 및 기타 저분자량의 탈세포화된 세포외기질 성분만이 농축액으로 분리될 수 있다.
이후 이어지는 혼합단계에서 상기 1차 용액과 2차 용액을 혼합하면 최종적으로 펩신과 같은 산성 프로테아제 및 텔로펩타이드가 제거되어 세포독성, 면역반응유도 등의 부작용이 제거된 동물 조직 유래 생체 소재가 얻어질 수 있다.
여과 단계가 완료된 이후 동물 조직 유래 생체 소재를 살균하는 멸균 단계가 수행되며, 멸균 방식으로는 방사선, 에틸렌옥사이드, 초임계 이산화탄소 중 적어도 어느 하나 이상을 이용한 멸균 방식이 이용될 수 있다.
이와 같이 멸균이 완료된 동물 조직 유래 생체 소재는 멸균 완료후의 상(phase) 그대로 이용되거나 저장될 수 있으나, 필요에 따라 추가적인 건조 단계가 수행되어 건조된 분말 상태로 저장될 수도 있으며, 이 경우에는 동결 건조 방식이 이용되는 것이 바람직하다.
한편, 본 발명은 상기와 같은 방법을 통해 제조된 동물 조직 유래 생체 소재 및 이러한 동물 조직 유래 생체 소재를 이용하여 3차원 구조체를 제조하는 3차원 프린팅 방법을 포함한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 동물 조직 유래 생체 소재를 이용한 3차원 프린팅 방법은, 상기 동물 조직 유래 생체 소재의 pH를 중화시키는 중화 단계; 중화된 용액을 겔화시키는 겔화 단계; 및 겔화된 용액을 이용하여 3차원 구조체를 제조하는 3차원 프린팅 단계;를 포함한다.
앞서 제조된 동물 조직 유래 생체 소재가 건조 단계를 거치지 않고 용액 상태로 존재하는 경우에는 3차원 프린팅시 중화 단계가 바로 수행되나, 건조 단계를 거쳐 분말화된 경우에는 중화 단계 이전에 분말형의 동물 조직 유래 생체 소재를 다시 액상화하는 용해 단계가 추가로 더 수행될 수 있다.
상기 용해 단계는 분말상의 동물 조직 유래 생체 소재를 물 또는 식염수나 완충용액과 같은 수용액과 혼합하여 가용화시키는 단계일 수 있다.
상기 중화 단계는 액상의 동물 조직 유래 생체 소재의 pH를 중성 영역으로 중화시키는 단계로, 이 단계에서 pH는 6.0~8.0로 조절될 수 있으며, 중화시에는 염기 또는 등장성 버퍼와 혼합되어 중화될 수 있다. 이때 사용될 수 있는 염기로는 예를 들어, NaOH, KOH 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다음으로, 중화된 용액을 겔화하는 겔화 단계가 수행된다. 중화 단계를 통해 얻어진 동물 조직 유래 생체 소재는 30℃ 이상, 바람직하게는 37℃ 이상의 온도 조건에서 겔화될 수 있으므로, 겔화 단계에서 중화된 용액을 30℃ 이상으로 승온시켜 겔화시킴으로써 동물 조직 유래 생체 소재의 점도를 높여 3차원으로 프린팅 된 형상을 유지시킬 수 있다.
다음으로, 중화 단계에서 중화된 용액을 이용하여 3차원 구조체를 제조하는 3차원 프린팅 단계가 수행될 수 있다.
한편, 본 발명의 동물 조직 유래 생체 소재는 상기와 같은 3차원 프린팅 방식뿐만 아니라, 상기 용해 단계와 중화 단계를 거쳐 얻어진 중화된 용액을 환자에게 투여한 후 환자에게 투여된 용액이 체온 또는 다른 열원에 의해 30℃ 이상으로 가열되어 겔화되는 방식으로도 3차원 구조체를 형성할 수 있다.
상술한 바와 같이 본 명세서 내에서는 동물 조직 유래 생체 소재를 이용한 3차원 프린팅 방법을 예로 제시하였으나, 동물 조직 유래 생체 소재의 가공 방법이 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 동물 조직 유래 생체 소재가 그대로, 혹은 3차원 프린팅 외에 다른 방식으로 가공되어 의료용 소재, 의료기기, 재생의료제품 등 다양한 분야에 적용될 수 있음은 당업자에게 자명한 것이다.
이하, 본 발명의 일 실시예를 통해 본 발명의 구체적인 작용과 효과를 설명하고자 한다. 다만, 이는 본 발명의 바람직한 예시로서 제시된 것으로, 실시예에 따라 본 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니다.
[제조예]
먼저, 돼지의 간을 1mm 크기로 잘라 여러 개의 절편으로 준비한 뒤, 상기 절편들을 증류수에 투입하여 상온에서 2시간 동안 세척하고, 0.5%의 트리톤 X-100, 0.5M의 NaCl 수용액을 포함한 탈세포용액을 사용하여 10℃에서 8시간 동안 탈세포 시켰으며, 탈세포 용액은 매 3시간마다 새 용액으로 교환하였다. 이후, 증류수를 이용하여 탈세포된 절편들을 세척하고, PBS버퍼, 0.1% 과초산(Peracetic acid)이 포함된 소독액으로 상온에서 1시간 동안 소독한 뒤, 다시 증류수를 이용하여 1시간 동안 세척하여 탈세포된 조직 절편들을 제조하였다.
다음으로, 탈세포된 조직 절편 40g을 10N의 HCl 용액 160mL와 혼합하여 교반한 뒤 호모게나이저를 이용하여 1분씩 20회 반복 분쇄하였다. 이어서, 분쇄된 혼합물에 물 1,440ml와 0.8g의 펩신을 혼합하고 20℃의 온도에서 72시간 동안 교반하여 액상화하였다.
다음으로 70kDa의 한외여과막을 이용하여 상기 액상화된 용액을 여과하고, 여과막을 통과하여 나온 용액인 여과액을 일부 취하여 비교예의 샘플로 이용하고, 나머지 여과액은 Sartobind® Q타입 이온필터를 이용하여 여과시키고, 이온필터에서 배출된 여과액 중 일부를 실시예의 샘플로 이용하였다.
[실험예]
웨스턴블랏 분석법을 이용하여 비교예와 실시예의 샘플에 포함되어 있는 펩신의 발현양을 조사하여 그 결과를 도 1에 도시하였다. 이때 펩신 검출을 위해 펩신에 특이적으로 발현하는 항체인 ab181878(Abcam, goat pAb to pepsin)을 이용하였다.
도 1의 실험 결과를 참조하면, 실시예의 샘플은 비교예의 샘플보다 펩신의 발현양이 현저하게 감소한 것으로 나타나, 이온필터를 이용한 여과 공정이 펩신 제거에 효과적임을 확인할 수 있었다.
본 발명은 상술한 특정의 실시예 및 설명에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형 실시가 가능하며, 그와 같은 변형은 본 발명의 보호 범위 내에 있게 된다.
본 발명은 세포 독성을 감소시키고, 면역 반응을 억제시키며 저장 안정성을 향상시킬 수 있는 동물 조직 유래 생체 소재의 제조방법, 이에 따라 제조된 동물 조직 유래 생체 소재 및 이를 이용한 3차원 프린팅 방법을 제공하기 위한 것으로, 탈세포화된 세포외기질을 액상화한 뒤, 세포 독성을 나타내는 성분을 제거하기 위한 여과 단계를 수행함으로써 동물 조직 유래 생체 소재의 생체 적합성을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 기존의 동물 조직 유래 생체 소재와 달리 실온에서도 보관이 가능하여 동물 조직 유래 생체 소재의 저장 안정성이 향상될 수 있으므로, 산업상 이용가능성이 존재한다.
Claims (16)
- 조직에서 세포를 제거하는 탈세포 단계;산성 프로테아제를 사용하여, 탈세포화된 조직의 세포외기질을 액상화시키는 액상화 단계;상기 액상화 단계를 통해 얻어진 탈세포화된 세포외기질 용액을 여과하는 여과 단계; 및여과 단계를 통해 얻어진 혼합물을 살균하는 멸균 단계;를 포함하고.상기 여과 단계는,상기 탈세포화된 세포외기질 용액을 한외여과하여 농축액과 여과액으로 분리하는 분리 단계;상기 분리 단계를 통해 얻어진 농축액을 한외여과를 통해 1차 용액을 제조하는 1차 용액 제조 단계;상기 분리 단계를 통해 얻어진 여과액에 포함된 산성 프로테아제를 제거하여 2차 용액을 제조하는 2차 용액 제조 단계; 및상기 1차 용액과 2차 용액을 혼합하는 혼합단계;를 포함하는, 동물 조직 유래 생체 소재의 제조방법.
- 제1항에 있어서,상기 멸균 단계는, 방사선, 에틸렌옥사이드, 초임계 이산화탄소 중 적어도 어느 하나 이상을 이용하여 수행되는, 동물 조직 유래 생체 소재의 제조방법.
- 제1항에 있어서,상기 여과 단계와 멸균 단계 사이에, 여과된 탈세포화된 세포외기질 용액을 건조하는 건조 단계;가 더 수행되는, 동물 조직 유래 생체 소재의 제조방법.
- 제3항에 있어서,상기 건조 단계는, 동결건조 방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 동물 조직 유래 생체 소재의 제조방법.
- 제1항에 있어서,상기 탈세포 단계와 액상화 단계 사이에, 탈세포화된 세포외기질이 습식으로 분쇄되는 분쇄 단계;가 더 수행되는, 동물 조직 유래 생체 소재의 제조방법.
- 제5항에 있어서,상기 분쇄 단계는, 탈세포화된 세포외기질이 산성 수용액과 혼합된 후, 용액 상태에서 습식 분쇄되는 단계인 것을 특징으로 하는, 동물 조직 유래 생체 소재의 제조방법.
- 제6항에 있어서,상기 분쇄 단계에서, 탈세포화된 세포외기질과 산성 수용액이 혼합된 혼합물의 pH는 1~4인 것을 특징으로 하는, 동물 조직 유래 생체 소재의 제조방법.
- 제1항에 있어서,상기 액상화 단계에서 사용되는 산성 프로테아제는, 펩신인 것을 특징으로 하는, 동물 조직 유래 생체 소재의 제조방법.
- 제8항에 있어서,상기 액상화 단계는 pH 1~5, 온도 범위 15~25℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 동물 조직 유래 생체 소재의 제조방법.
- 제1항에 있어서,상기 2차 용액 제조 단계는, 이온필터를 이용하여 여과액에 포함된 산성 프로테아제를 제거하는 제1 처리 단계; 및상기 제1 처리 단계를 통해 얻어진 처리액을 한외여과하여 농축하는 제2 처리 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 동물 조직 유래 생체 소재의 제조방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 동물 조직 유래 생체 소재.
- 제11항의 동물 조직 유래 생체 소재의 pH를 중화시키는 중화 단계;중화된 용액을 겔화시키는 겔화 단계; 및겔화된 용액을 이용하여 3차원 구조체를 제조하는 3차원 프린팅 단계;를 포함하는 동물 조직 유래 생체 소재를 이용한 3차원 프린팅 방법.
- 제12항에 있어서,상기 중화 단계는, pH를 6.0~8.0로 조절하는 단계인 것을 특징으로 하는, 동물 조직 유래 생체 소재를 이용한 3차원 프린팅 방법.
- 제12항에 있어서,상기 겔화 단계는, 중화된 용액의 온도를 30℃ 이상으로 승온시키는 것을 특징으로 하는, 동물 조직 유래 생체 소재를 이용한 3차원 프린팅 방법.
- 조직에서 세포를 제거하는 탈세포 단계;탈세포화된 세포외기질을 습식으로 분쇄하는 분쇄단계;산성 프로테아제를 사용하여, 탈세포화된 조직의 세포외기질을 액상화시키는 액상화 단계;상기 액상화 단계를 통해 얻어진 탈세포화된 세포외기질 용액을 여과하는 여과 단계;여과된 탈세포화된 세포외기질 용액을 동결건조하는 건조 단계;여과 단계를 통해 얻어진 혼합물을 살균하는 멸균 단계;를 포함하고.상기 여과 단계는,상기 탈세포화된 세포외기질 용액을 한외여과하여 농축액과 여과액으로 분리하는 분리 단계;상기 분리 단계를 통해 얻어진 농축액을 한외여과를 통해 1차 용액을 제조하는 1차 용액 제조 단계;상기 분리 단계를 통해 얻어진 여과액에 포함된 산성 프로테아제를 제거하여 2차 용액을 제조하는 2차 용액 제조 단계; 및상기 1차 용액과 2차 용액을 혼합하는 혼합단계;를 포함하는, 동물 조직 유래 생체 소재의 제조방법.
- 제15항에 있어서, 상기 2차 용액 제조 단계는,이온필터를 이용하여 여과액에 포함된 산성 프로테아제를 제거하는 제1 처리 단계; 및상기 제1 처리 단계를 통해 얻어진 처리액을 한외여과하여 농축하는 제2 처리 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 동물 조직 유래 생체 소재의 제조방법.
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