CN115361977B - 动物组织来源的生物材料的制备方法、由其制备的动物组织来源的生物材料和使用该生物材料的3d打印方法 - Google Patents

动物组织来源的生物材料的制备方法、由其制备的动物组织来源的生物材料和使用该生物材料的3d打印方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种动物组织来源的生物材料的制备方法、由其制备的动物组织来源的生物材料和使用该生物材料的3D打印方法，动物组织来源的生物材料的制备方法包括：从组织中去除细胞的脱细胞步骤；液化从液化步骤获得的细胞外基质溶液的液化步骤；和对从过滤步骤中获得的混合物进行灭菌的灭菌步骤。本公开的动物组织来源的生物材料表现出优异的生物相容性和储存稳定性。

Description

动物组织来源的生物材料的制备方法、由其制备的动物组织 来源的生物材料和使用该生物材料的3D打印方法
技术领域
本公开涉及一种动物组织来源的生物材料的制备方法、由其制备的动物组织来源的生物材料和使用该生物材料的三维打印方法。更具体而言，本公开涉及一种动物组织来源的生物材料、由其制备的动物组织来源的生物材料和使用该生物材料的三维打印方法，所述生物材料能够通过液化脱细胞的细胞外基质，然后进行过滤以去除表现出细胞毒性的组分而改善生物相容性。
背景技术
通常，当制造用于移植或研究的人工组织、器官、或用于新药开发的器官模型时，使用了不具有生物毒性并且不诱导免疫应答的生物相容性材料。过去已经使用了生物相容性聚合物如PLA(聚乳酸)或PGA(聚乙醇酸)，但是近来，动物组织来源的生物材料广受关注。
特别是，正在积极地进行基于脱细胞的细胞外基质(dECM)的生物材料的研究。在使用该生物材料的情况下，仅包含了已经去除细胞组分的细胞外基质成分，并且当用作生物墨水时，与基于合成材料的生物墨水相比，生物相容性聚合物为打印细胞提供了更合适的环境。其引导分化成最终组织的生物功能显著更优。
然而，基于现有的脱细胞的细胞外基质的生物材料包含酸性蛋白酶组分，该酸性蛋白酶组分用于液化脱细胞的细胞外基质的过程中，并且因此表现出细胞毒性，并且可在人体移植期间内表现出许多副作用，并且存在储存稳定性降低的问题。
因此，有必要研发一种通用的生物材料，通过降低生物毒性和抑制免疫应答，而可用于适用于人类移植的人造组织或器官，和用于基础研究的组织、器官或其相似物和动物实验替代物。
发明内容
技术问题
本公开提供了一种动物组织来源的生物材料的制备方法、由此制备的动物组织来源的生物材料和使用该生物材料的三维打印方法，该生物材料能够降低细胞毒性、抑制免疫应答、并且改善储存稳定性。
技术方案
为了实现上述目标，根据本公开的实施方式用于制备动物组织来源的生物材料的方法包括：将组织脱细胞以从其去除细胞；使用酸性蛋白酶液化经脱细胞的组织的细胞外基质；过滤通过液化步骤获得的脱细胞的细胞外基质溶液；以及对通过过滤步骤获得的混合物进行灭菌。
过滤步骤可以包括：通过超滤将脱细胞的细胞外基质溶液分离成浓缩物和滤液；通过将经由分离步骤获得的浓缩物超滤而制备一次溶液；通过去除经由分离步骤获得的滤液中包含的酸性蛋白酶而制备二次溶液；以及混合所述一次溶液和所述二次溶液。
此外，可使用辐射、环氧乙烷和超临界二氧化碳中的至少一种进行灭菌步骤，并且在过滤步骤和灭菌步骤之间可进一步进行将经过滤的脱细胞的细胞外基质溶液干燥的步骤。
干燥步骤可通过冷冻-干燥方法进行，并且在脱细胞步骤和液化步骤之间可进一步进行通过湿法粉碎所述脱细胞的细胞外基质的粉碎步骤。
粉碎步骤可以是在脱细胞的细胞外基质与酸性水溶液溶液混合之后在溶液状态进行湿粉碎的步骤，并且在粉碎步骤中，脱细胞的细胞外基质和酸性水溶液的混合物的pH可以在1至4的范围内。
在液化步骤中使用的酸性蛋白酶优选为胃蛋白酶，并且液化步骤可以在1至5的pH范围和15℃至25℃的温度范围下进行。
二次溶液的制备可包括：使用离子过滤器去除滤液中包含的酸性蛋白酶的一次处理；通过超滤和浓缩对经由一次处理获得的处理液进行二次处理。
本公开的另一实施方式可以包括由该方法制备的动物组织来源的生物材料。
本公开的另一实施方式包括使用这种动物组织来源的生物材料的三维打印方法，该方法包括：中和动物组织来源的生物材料的pH；使经中和的溶液凝胶化；以及用该凝胶状溶液三维打印以制造三维结构。
中和步骤是调节pH到6.0至8.0的范围内的步骤，并且凝胶化步骤可以通过将三维结构加热到30℃以上进行。
根据本公开的动物组织来源的生物材料的制备方法可包括：将组织脱细胞以从其去除细胞；通过湿法粉碎脱细胞的细胞外基质；使用酸性蛋白酶液化脱细胞的组织的细胞外基质；过滤通过液化步骤获得的脱细胞的细胞外基质溶液；通过冷冻干燥方法干燥经过滤的脱细胞的细胞外基质溶液；对通过过滤步骤获得的混合物进行灭菌。过滤步骤可以包括：通过超滤将脱细胞的细胞外基质溶液分离成浓缩物和滤液；通过将经由分离步骤获得的浓缩物超滤而制备一次溶液；通过去除经由分离步骤获得的滤液中包含的酸性蛋白酶而制备二次溶液；以及混合一次溶液和二次溶液。
有益效果
根据本公开，通过液化脱细胞的细胞外基质然后进行过滤以去除表现出细胞毒性的组分，可改善动物组织来源的生物材料的生物相容性。
此外，与现有的动物组织来源的生物材料不同，根据本公开的动物组织来源的生物材料可在室温下储存，从而改善了动物组织来源的生物材料的储存稳定性。
附图说明
图1是显示本公开的实验例的结果的照片。
具体实施方式
下文中，在通过本公开的优选实施方式详细描述之前，应当注意的是，本说明书和权利要求中的术语或词语不应限于通用或字典含义，而是应当解释为符合本公开技术思想的含义和概念。
贯穿本说明书，当某个部分“包含”特定组分时，除非另有说明，否则这意味着还可以包含其他组分，而不是排除其他组分。
此外，本公开的“分子量”意味着重均分子量，而表达“去除”意指特定材料被部分去除或完全去除。
下文中，将会描述本公开的实施方式。然而，本公开的范围不限于以下优选实施方式，且本领域技术人员可以实施本公开范围内所描述内容的各种修改形式。
本公开涉及一种使用脱细胞的细胞外基质制备动物组织来源的生物材料的方法，由其制备的动物组织来源的生物材料，及使用该生物材料的三维打印方法。
首先，根据本公开的动物组织来源的生物材料的制备方法包括：从组织去除细胞的脱细胞步骤；使用酸性蛋白酶液化脱细胞的细胞外基质以制备脱细胞的细胞外基质溶液的液化步骤；过滤通过液化步骤获得的脱细胞的细胞外基质溶液的过滤步骤；和对通过过滤步骤获得的混合物进行灭菌的灭菌步骤。
在这种情况下，可在脱细胞步骤和液化步骤之间进一步进行粉碎步骤，其中用湿法粉碎脱细胞的细胞外基质。
脱细胞步骤是通过使用含有表面活性剂和高渗溶液的脱细胞溶液从组织中去除细胞而仅获得脱细胞的细胞外基质(dECM)的步骤。脱细胞的细胞外基质可包括诸如胶原、弹性蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖(GAG)、蛋白聚糖、抗菌剂、化学吸引剂(chemoattractants)、细胞因子和生长因子等组分。
本公开中，用于获得脱细胞的细胞外基质(dECM)的组织是源自于哺乳动物的组织，例如可以使用人类、猴、猪、牛、兔、狗、山羊、绵羊、鸡和马(例如可使用肝组织、脂肪组织、膀胱组织、心脏组织、肌肉组织等)，但是不限于此。
脱细胞步骤的表面活性剂可以包括选自由以下组成的组中的一种或多种：TritonX-100、Tween 80、十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠和Triton X-200。脱细胞步骤的高渗溶液可为0.03至1.0M的包含选自由以下组成的组中的任一种或多种盐的水溶液：NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、BaCl2和NaHCO3，但是不限于此。
此时，使用Triton X-100作为表面活性剂可以有效地破坏包含在细胞中的DNA，同时最小化对包含在细胞外基质中的各种蛋白质、糖蛋白和糖胺聚糖(GAG)的损伤，所以期望使用Triton X-100作为表面活性剂。
通过脱细胞步骤获得的脱细胞的细胞外基质可在通过粉碎步骤中粉碎之后液化，并且由于脱细胞的细胞外基质的表面积通过液化步骤而增加，因此可以提高使用酸性蛋白酶的液化步骤中有用成分的提取率。
该步骤中是其中通过脱细胞步骤获得的脱细胞的细胞外基质与高浓度的酸性水溶液混合然后在溶液状态下以湿态粉碎的步骤。此时，与脱细胞的细胞外基质混合的酸性水溶液为高浓度的酸性水溶液，例如可以使用HCl、CH3COOH、H3PO4、HNO3、H2SO4等。酸性水溶液和脱细胞的细胞外基质的混合物的pH为在1至4的范围内。因为在液化前首先将该混合物暴露于酸性环境中，包含在脱细胞的细胞外基质的有用组分(特别是胶原)由酸溶性胶原的形式获得，所以可以提升胶原的产量。
另一方面，通常当粉碎组织时使用干燥粉碎法，其中在冷冻-干燥之后在固体状态下进行粉碎。在干燥粉碎中，存在由于冷冻-干燥过程所需时间长使得总工作时间增加的问题，并且在冷冻-干燥过程之后，在粉碎步骤中损失了大量的粉末，因此降低了有用组分的产量。另一方面，在本公开中，而不进行单独的干燥步骤的情况下，在脱细胞步骤之后立即获得的湿样本与高浓度的酸性水溶液混合，以在溶液状态下进行粉碎过程，从而显著地减少了总工作时间，并且提高了有用组分的产量。
可以使用匀浆器进行湿粉碎法，但是也可以使用其他粉碎器，并且粉碎速度和时间可以根据待粉碎对象的量和类型进行多种调节。
液化步骤是通过液化通过脱细胞步骤获得的脱细胞的细胞外基质从而制备脱细胞的细胞外基质溶液的步骤，以在处理动物组织来源的生物材料时形成适当的粘度。
在该步骤中，通过酸性蛋白酶分解和液化脱细胞的细胞外基质，并且由于酸性蛋白酶具有根据pH和温度条件反应性变化的特性，所以优选液化步骤于在pH为1到5的范围内且温度为15℃到25℃的范围内进行，从而实现酸性蛋白酶的合适活性。
在这种情况下，胃蛋白酶可以用作为酸性蛋白酶，并且由于在粉碎步骤中添加了高浓度的酸性水溶液而使包含脱细胞的细胞外基质的溶液已经表现出pH为1至4的范围内的强酸性，所以期望的是在该步骤中添加一定量的水从而将溶液的pH调整到1至5从而活化酸性蛋白酶。
过滤步骤是过滤通过液化步骤获得的脱细胞的细胞外基质溶液以通过选择性地去除细胞毒性或免疫反应(如酸性蛋白酶或端肽)，并同时保持如促进组织再生和细胞因子等生长因子的组分，从而改善动物组织来源的生物材料的生物相容性的步骤。
过滤步骤包括：将脱细胞的细胞外基质溶液超滤成浓缩物和滤液的分离步骤；再次通过超滤将经由分离步骤所获得的浓缩物浓缩以制备一次溶液的一次溶液制备步骤；通过去除通过分离步骤获得的滤液中包含的酸性蛋白酶然后浓缩以制备二次溶液的二次溶液制备步骤；以及混合一次溶液和二次溶液的混合步骤。
首先，分离步骤是用70至100kDa的超滤膜过滤脱细胞的细胞外基质溶液，并且分离穿过膜的滤液和未能穿过膜的浓缩物，可以使用70kDa的超滤膜。
在该步骤中获得的浓缩物包含相对高分子量的组分，例如胶原、弹性蛋白和糖胺聚糖，并且在一次溶液制备步骤1中将该浓缩物通过超滤再次浓缩，并用作为一次溶液。在这种情况下，使用的超滤膜尺寸可为0.1到5kDa、优选为0.5到2kDa、更优选为1kDa。
另一方面，分离步骤中获得的滤液包含生长因子、细胞因子、酸性蛋白酶，和其他低分子量的脱细胞的细胞外基质组分。
包含在滤液中的酸性蛋白酶用于液化脱细胞的细胞外基质，但是酸性蛋白酶表现出细胞毒性，并且可以在人体中作为酶引起副作用，因此使用包含酸性蛋白酶的动物组织来源的生物材料制造的人造器官或组织难以移植到人体中，所以存在其用途仅限于研究目的的问题。此外，由于该动物组织来源的生物材料在15℃至25℃的温度范围内显示出活性，因此存在这样的问题：包含酸性蛋白酶的动物组织来源的生物材料不能在室温下存储。
在本公开中，通过去除在分离步骤中获得的滤液中存在的酸性蛋白酶，可以防止和抑制诸如动物组织来源的生物材料的细胞毒性、诱导免疫应答和引起人体副作用的问题，并且可在室温中存储。
具体而言，二次溶液制备步骤包括使用离子过滤器去除滤液中包含的酸性蛋白酶的一次处理步骤；以及通过超滤浓缩经由一次处理步骤获得的处理液的二次处理步骤；其中可在一次处理步骤中去除酸性蛋白酶，并且可在二次处理步骤中去除诱导免疫应答的端肽。
一次处理步骤是通过使用酸性蛋白酶的等电点选择性地仅去除酸性蛋白酶的步骤。胃蛋白酶可用作为酸性蛋白酶，并且由于胃蛋白酶的等电点为约pH1，因此当包含胃蛋白酶的溶液的pH高于1时，胃蛋白酶带负电。因此，当通过稀释使其高于pH为1的滤液通过带有阳离子电荷的离子过滤器时，酸性蛋白酶通过静电力被离子过滤器吸附或离子交换而被去除，并且除了酸性蛋白酶之外的剩余组分通过离子过滤器排出。可以使用这样的离子过滤器，例如
Figure BDA0003866641250000061
Q型过滤器。
由于通过一次处理步骤获得的处理液还包含诱导免疫应答的端肽，所以动物组织来源的生物材料的生物相容性可以通过经由二次处理步骤去除端肽而进一步改善。
二次处理步骤是通过超滤浓缩处理液的步骤，并且可以是在使用1至10kDa的超滤膜、优选4至6kDa的超滤膜、更优选为5kDa的超滤膜过滤处理液后获得浓缩物的步骤。
在此前的液化步骤中，端肽通过酸性蛋白酶与胶原分离，并且分离的端粒具有约0.5到4.5kDa的低分子量。另一方面，由于包含在处理液中的有用组分如生长因子和细胞因子的分子量为约5kDa以上，因此当在二次处理步骤中使用相同尺寸的超滤膜浓缩处理液时，端肽和水一起分离到滤液中，并且可通过超滤膜仅将生长因子、细胞因子和其他低分子量的脱细胞的细胞外基质的组分分离到浓缩物中。
当在随后的混合步骤中混合一次溶液和二次溶液时，最后去除了酸性蛋白酶，例如胃蛋白酶和端肽，所以可获得去除副作用(如细胞毒性和免疫应答的诱导)的动物组织来源的生物材料。
在完成过滤步骤之后，进行对动物组织来源的生物材料灭菌的灭菌步骤，并且作为灭菌方法，可以使用利用辐射、环氧乙烷和超临界二氧化碳的至少一种的灭菌方法。
如上所述，灭菌的动物组织来源的生物材料可在灭菌完成后的阶段原样使用或贮存，但是如果需要，可进行额外的干燥步骤并将其以干燥粉末的状态贮存。在这种情况下，优选使用冷冻-干燥方法。
同时，本公开包括通过上述方法制备的动物组织来源的生物材料，和使用该动物组织来源的生物材料制造三维打印结构的三维打印方法。
具体而言，根据本公开使用动物组织来源的生物材料的三维打印方法包括：中和动物组织来源的生物材料的pH的中和步骤；使中和溶液凝胶化的凝胶化步骤；和使用凝胶化溶液制造三维打印结构的三维打印步骤。
当先前制备的动物组织来源的生物材料以溶液状态存在而不经过干燥步骤时，三维打印期间立即进行中和步骤，但是当该动物组织来源的生物材料通过干燥步骤被粉末化时，可在中和步骤前进一步进行再次液化粉末状的动物组织来源的生物材料的溶解步骤。
溶解步骤可以是用水或水溶液(如盐水或缓冲液)溶解粉末状的动物组织来源的生物材料的步骤。
中和步骤是中和液态的动物组织来源的生物材料的pH到中性范围的步骤，并且在该步骤中，可将pH调整至6.0至8.0，并且在中和期间，可以将动物组织来源的生物材料与碱或各向同性缓冲液混合并中和。在这种情况下，可以使用的碱包括如NaOH、KOH等，但是不限于此。
接下来，进行使中和溶液凝胶化的凝胶化步骤。因为通过中和步骤获得的动物组织来源的生物材料可于30℃以上、优选37℃以上的温度条件下进行凝胶化，所以将凝胶化步骤中的中和溶液加热到30℃以上以进行凝胶化，从而增加动物组织来源生物材料的粘性并保持三维打印形状。
接下来，可进行使用中和步骤中使用的中和溶液制造三维结构的三维打印步骤。
另一方面，在本公开的动物组织来源的生物材料中，不仅可由上述三维打印方法形成三维结构，也可通过向患者施用经由溶解步骤和中和步骤获得的中和溶液，然后通过其他热源加热到30℃以上，从而形成三维结构。
如上所述，在本说明书中，以使用动物组织来源的生物材料的三维打印方法作为实例，但是动物组织来源的生物材料的处理方法不限于此。对于本领域技术人员显而易见的是，本公开的动物组织来源的生物材料可以原样处理，或者以不同于3D打印的方法处理，从而应用于多种领域例如医用材料、医疗器械和可再生医疗产品。
下文中将通过本公开的实施方式描述本公开的具体作用和效果。然而其以本公开的优选实施例提出，并且本公开的范围不限于这些实施方式。
[制备例]
首先，将猪肝切割成1mm尺寸，并制备成若干切片，然后将切片放入蒸馏水中，并在室温下洗涤2小时。使用含有0.5％Triton X-100和0.5M NaCl水溶液的脱细胞溶液在10℃下进行脱细胞化8小时，并且每3小时用新的溶液更换脱细胞溶液。之后用蒸馏水洗涤脱细胞的切片，用含有PBS缓冲液和0.1％过乙酸的消毒液于室温下消毒1小时，然后由蒸馏水再次洗涤1小时以制备脱细胞的组织切片。
接下来，将40g脱细胞的组织切片与160ml的10N HCl混合，搅拌，然后用匀浆器将其粉碎20次1min。然后将1440ml水和0.8g胃蛋白酶与粉末混合物混合，并且在20℃的温度下搅拌72小时以液化。
接下来，使用70kDa的超滤膜过滤液化溶液，并且将一部分滤液(其是通过过滤膜的溶液)用作比较例。使用
Figure BDA0003866641250000081
Q型离子过滤器过滤剩余滤液，并且将由离子过滤器流出的一些滤液作为实施方式的样本。
[实验例]
使用蛋白质印迹分析研究包含在比较例和实施例的样本中的胃蛋白酶的表达水平，结果如图1所示。在这种情况下，使用对胃蛋白酶特异性表达的抗体ab181878(Abcam，抗胃蛋白酶的山羊pAb)以检测胃蛋白酶。
参考图1的实验结果，与比较例的样本相比，实施例的样本显示胃蛋白酶的表达降低地更为明显，从而确定了用离子过滤器的过滤过程在去除胃蛋白酶的方面是有效的。
本公开不限于上述具体实施方式和描述，并且在不偏离权利要求要求保护的本公开的要旨的情况下，本公开所属领域的普通技术人员可做不同修改，并且这些修改都将落入本公开的保护范围内。
工业实用性
本公开的目的是提供一种制备动物组织来源的生物材料的方法，由该方法制备的动物组织来源的生物材料，以及使用该生物材料的三维打印方法，该生物材料能够降低细胞毒性、抑制免疫应答并改善储存稳定性。通过液化脱细胞的细胞外基质然后进行过滤步骤以去除细胞毒性组分，可以改善动物组织来源的生物材料的生物相容性，并且因为该动物组织来源的生物材料可以于室温下储存，所以与现有的动物组织来源的生物材料不同，该动物组织来源的生物材料的储存稳定性可以得以改善，并且因此具有工业实用性。

Claims (16)

1.一种动物组织来源的生物材料的制备方法，所述方法包括：
将组织脱细胞以从所述组织中去除细胞；
使用酸性蛋白酶液化经脱细胞的组织的细胞外基质；
过滤通过液化步骤获得的脱细胞的细胞外基质溶液；和
对通过过滤步骤获得的所得混合物进行灭菌，其中
所述过滤步骤包括：
通过超滤将脱细胞的细胞外基质溶液分离成浓缩物和滤液；
通过将经由所述分离步骤获得的浓缩物超滤而制备一次溶液；
通过去除经由所述分离步骤获得的滤液中包含的酸性蛋白酶而制备二次溶液；和
混合所述一次溶液和所述二次溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中使用辐射、环氧乙烷和超临界二氧化碳中的至少一种来进行所述灭菌步骤。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在所述过滤步骤和所述灭菌步骤之间进一步进行将经过滤的脱细胞的细胞外基质溶液干燥的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述干燥步骤通过冷冻干燥方法进行。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在所述脱细胞步骤和所述液化步骤之间进一步进行在湿状态下粉碎所述脱细胞的细胞外基质。
6.根据权利要求5所述的方法，其中在所述粉碎步骤中，将所述脱细胞的细胞外基质与酸性水溶液混合，然后在溶液状态下进行湿粉碎。
7.根据权利要求6所述的方法，其中在所述粉碎步骤中，所述脱细胞的细胞外基质和所述酸性水溶液的混合物的pH在1至4的范围内。
8.根据权利要求1所述的方法，其中在所述液化步骤中使用的酸性蛋白酶是胃蛋白酶。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述液化步骤在1至5的pH范围和15℃至25℃的温度范围下进行。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述制备二次溶液的步骤包括：
使用离子过滤器处理所述滤液以去除所述滤液中包含的酸性蛋白酶的一次处理步骤；和
将通过所述一次处理获得的处理液超滤和浓缩的二次处理步骤。
11.一种动物组织来源的生物材料，其通过权利要求1至10中任一项所述的方法制备。
12.一种使用动物组织来源的生物材料的三维打印方法，所述方法包括：
中和权利要求11所述的动物组织来源的生物材料的pH；
使经中和的溶液凝胶化；和
使用凝胶化溶液制造三维结构。
13.根据权利要求12所述的方法，其中在所述中和步骤中，将所述pH调节为在6.0至8.0的范围内。
14.根据权利要求12所述的方法，其中在所述凝胶化步骤中，将经中和的溶液的温度升高至30℃以上。
15.一种动物组织来源的生物材料的制备方法，所述方法包括：
将组织脱细胞以从所述组织中去除细胞；
通过湿法粉碎脱细胞的细胞外基质；
使用酸性蛋白酶液化经脱细胞的组织的细胞外基质；
过滤通过所述液化获得的脱细胞的细胞外基质溶液；
通过冷冻干燥方法干燥经过滤的脱细胞的细胞外基质溶液；
对通过所述过滤步骤获得的所得混合物进行灭菌，其中
所述过滤步骤包括：
通过超滤将脱细胞的细胞外基质溶液分离成浓缩物和滤液；
通过将经由所述分离步骤获得的浓缩物超滤而制备一次溶液；
通过去除经由所述分离步骤获得的滤液中包含的酸性蛋白酶而制备二次溶液；和
混合所述一次溶液和所述二次溶液。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述二次溶液的制备包括：
使用离子过滤器处理所述滤液以去除所述滤液中包含的酸性蛋白酶的一次处理步骤；和
将通过一次处理步骤获得的处理液超滤和浓缩的二次处理步骤。
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