JP3208431B2 - 骨形成促進物質の製造法 - Google Patents
骨形成促進物質の製造法Info
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- JP3208431B2 JP3208431B2 JP22560491A JP22560491A JP3208431B2 JP 3208431 B2 JP3208431 B2 JP 3208431B2 JP 22560491 A JP22560491 A JP 22560491A JP 22560491 A JP22560491 A JP 22560491A JP 3208431 B2 JP3208431 B2 JP 3208431B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、外科，整形外科，歯科
領域における骨修復材および骨移植材として有用な骨形
成促進物質の製造法に関する。
領域における骨修復材および骨移植材として有用な骨形
成促進物質の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来より生体における骨移植術としては
患者自身の骨を用いた自家骨移植が汎用されているが、
この自家骨移植に用いる自家骨には量的限界があり、ま
た骨の採取と移植の２回の手術を要するので、患者に苦
痛を与える。この自家骨移植の欠点を補うために、同種
の哺乳動物の骨から灰分を除去した有機基質の粉末(以
下脱灰骨粉末という)を生体に移植し、自家骨の形成を
起こさせる試みがなされた[Glowacki 等、Lancet, May
1981, 959]。すなわち脱灰骨粉末中には数種類の局所性
骨形成促進物質が含まれており、脱灰骨粉末を生体に移
植すると、これらの骨形成促進物質が骨形成の各段階で
有機的に組み合わされて新しい骨が形成される。まず、
移植された脱灰骨粉末を取り囲んで、生体反応により肉
芽が形成されるが、それに続いて脱灰骨粉末中に存在す
る化学走行性因子により、生体の間葉系細胞が脱灰骨粉
末表面に引き寄せられ、脱灰骨粉末中の分化促進因子に
より軟骨細胞に分化する。さらに肉芽組織内に毛細血管
が形成されると軟骨細胞は死滅し、この細胞から放出さ
れる因子および脱灰骨粉末から放出される因子により、
間葉系細胞は骨芽細胞に分化する。骨芽細胞はその周囲
にコラーゲンを分泌し、さらにコラーゲンに石灰化が起
こってついには肉芽の内部に正常な骨が形成される。こ
のようにして形成された骨は生体自体の正常骨として代
謝回転する。しかし脱灰骨粉末が生体内で新しい骨を形
成するのは同種動物由来の脱灰骨粉末を移植した場合に
限られており、異種動物由来の脱灰骨粉末ではその中に
同時に含有される種特異的な抗原性物質などの骨形成阻
害物質により骨は形成されない。同種動物の骨を原料に
して脱灰骨粉末を調製してそれを骨移植材として用いる
ことは、特にヒトの場合では、原料に制約がある。そこ
で脱灰骨粉末に含まれる骨形成促進物質のそれぞれを抽
出・精製、そのアミノ酸配列を決定して、それを遺伝子
組み換え等の方法で合成する試みが行われている［Wan
g, E. A. 等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2220
(1990)；Bentz, H. 等、J. Biol. Chem.,264, 20805(19
89)；Luyten, F. P. 等、J. Biol. Chem., 264, 13377
(1989)；Sampath, T. K.等、Calcif. Tissue Int., 46,
Suppl. 2, A46(1990)］。しかしながら、正常な骨形成
が骨基質中に存在する多数の骨形成促進物質の有機的に
組合せられた作用によって行われているのにくらべて、
これらの単一の物質では骨形成活性はきわめて弱いか全
く無いものが多い。
患者自身の骨を用いた自家骨移植が汎用されているが、
この自家骨移植に用いる自家骨には量的限界があり、ま
た骨の採取と移植の２回の手術を要するので、患者に苦
痛を与える。この自家骨移植の欠点を補うために、同種
の哺乳動物の骨から灰分を除去した有機基質の粉末(以
下脱灰骨粉末という)を生体に移植し、自家骨の形成を
起こさせる試みがなされた[Glowacki 等、Lancet, May
1981, 959]。すなわち脱灰骨粉末中には数種類の局所性
骨形成促進物質が含まれており、脱灰骨粉末を生体に移
植すると、これらの骨形成促進物質が骨形成の各段階で
有機的に組み合わされて新しい骨が形成される。まず、
移植された脱灰骨粉末を取り囲んで、生体反応により肉
芽が形成されるが、それに続いて脱灰骨粉末中に存在す
る化学走行性因子により、生体の間葉系細胞が脱灰骨粉
末表面に引き寄せられ、脱灰骨粉末中の分化促進因子に
より軟骨細胞に分化する。さらに肉芽組織内に毛細血管
が形成されると軟骨細胞は死滅し、この細胞から放出さ
れる因子および脱灰骨粉末から放出される因子により、
間葉系細胞は骨芽細胞に分化する。骨芽細胞はその周囲
にコラーゲンを分泌し、さらにコラーゲンに石灰化が起
こってついには肉芽の内部に正常な骨が形成される。こ
のようにして形成された骨は生体自体の正常骨として代
謝回転する。しかし脱灰骨粉末が生体内で新しい骨を形
成するのは同種動物由来の脱灰骨粉末を移植した場合に
限られており、異種動物由来の脱灰骨粉末ではその中に
同時に含有される種特異的な抗原性物質などの骨形成阻
害物質により骨は形成されない。同種動物の骨を原料に
して脱灰骨粉末を調製してそれを骨移植材として用いる
ことは、特にヒトの場合では、原料に制約がある。そこ
で脱灰骨粉末に含まれる骨形成促進物質のそれぞれを抽
出・精製、そのアミノ酸配列を決定して、それを遺伝子
組み換え等の方法で合成する試みが行われている［Wan
g, E. A. 等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2220
(1990)；Bentz, H. 等、J. Biol. Chem.,264, 20805(19
89)；Luyten, F. P. 等、J. Biol. Chem., 264, 13377
(1989)；Sampath, T. K.等、Calcif. Tissue Int., 46,
Suppl. 2, A46(1990)］。しかしながら、正常な骨形成
が骨基質中に存在する多数の骨形成促進物質の有機的に
組合せられた作用によって行われているのにくらべて、
これらの単一の物質では骨形成活性はきわめて弱いか全
く無いものが多い。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、動物の脱灰
骨粉末に含有される多数の骨形成促進物質をそのまま抽
出するとともに、同時に抽出される種に特異的な骨形成
阻害物質を分離する、簡便かつ収率のよい骨形成促進物
質の調製方法を提供しようとするものである。
骨粉末に含有される多数の骨形成促進物質をそのまま抽
出するとともに、同時に抽出される種に特異的な骨形成
阻害物質を分離する、簡便かつ収率のよい骨形成促進物
質の調製方法を提供しようとするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、脱灰骨粉末を
カオトロピック試薬で抽出し、抽出液を限外ろ過に付し
分子量１,０００〜１００,０００の物質を含む画分を採
取し、採取した画分を透析し、透析液から水不溶性画分
を採取することを特徴とする、骨形成促進物質の製造法
を提供するものである。脱灰骨粉末を調製する際原料と
なる骨は、移植される宿主と同種動物から得られる骨が
好ましいが、宿主がヒトの場合、ウサギ，ブタ，ヒツ
ジ，ウマ，ウシなどの哺乳動物、ことに新生仔牛の長骨
骨幹部が好ましい。
カオトロピック試薬で抽出し、抽出液を限外ろ過に付し
分子量１,０００〜１００,０００の物質を含む画分を採
取し、採取した画分を透析し、透析液から水不溶性画分
を採取することを特徴とする、骨形成促進物質の製造法
を提供するものである。脱灰骨粉末を調製する際原料と
なる骨は、移植される宿主と同種動物から得られる骨が
好ましいが、宿主がヒトの場合、ウサギ，ブタ，ヒツ
ジ，ウマ，ウシなどの哺乳動物、ことに新生仔牛の長骨
骨幹部が好ましい。
【０００５】上記脱灰骨粉末の調製方法の具体例として
は、原料骨を切断、粉砕し、付着する軟組織を除去、水
洗した後有機溶媒例えばエタノール及びエーテル等で反
復洗浄し、脱水、脱脂する。得られた骨片をさらに粉砕
し、適当な粒径の粉末を得る。骨粉末は塩酸又はエチレ
ンジアミン４酢酸等で脱灰後水洗し、有機溶媒で反復洗
浄した後乾燥して、脱灰骨粉末を得る等が挙げられる。
原料骨が上記新生仔牛の場合、骨は牛を屠殺後直ちに採
取、凍結保存し、骨幹部を切断、粗砕する。付着する軟
組織を除去、水洗した後、エタノール及びエーテルで反
復洗浄し、脱水、脱脂する。得られた骨片を冷却条件下
に短時間で粉砕し、適当な粒径の粉末を得る。骨粉末は
塩酸で脱灰後水洗し、さらにエタノール及びエーテルで
反復洗浄、乾燥する等が挙げられる。上記粉末は粒子径
７５〜４５０μm程度に調製されることが好ましい。得
られた脱灰骨粉末はカオトロピック試薬で抽出される。
カオトロピック試薬は蛋白質間の結合を弱める物質であ
り、尿素，グアニジン塩酸塩、特にグアニジン塩酸塩が
有利に用いられる。グアニジン塩酸塩を用いる抽出は、
脱灰骨粉末１kgあたり、１０〜５０リットル程度の１〜
５Ｍグアニジン塩酸塩水溶液を加え、０〜１０℃で１〜
３日間程度撹拌することにより行われる。この際、Ｎ−
エチルマレイミドなどのプロテアーゼ阻害剤を加えても
よい。抽出後、ろ過により骨粉末を除去する。
は、原料骨を切断、粉砕し、付着する軟組織を除去、水
洗した後有機溶媒例えばエタノール及びエーテル等で反
復洗浄し、脱水、脱脂する。得られた骨片をさらに粉砕
し、適当な粒径の粉末を得る。骨粉末は塩酸又はエチレ
ンジアミン４酢酸等で脱灰後水洗し、有機溶媒で反復洗
浄した後乾燥して、脱灰骨粉末を得る等が挙げられる。
原料骨が上記新生仔牛の場合、骨は牛を屠殺後直ちに採
取、凍結保存し、骨幹部を切断、粗砕する。付着する軟
組織を除去、水洗した後、エタノール及びエーテルで反
復洗浄し、脱水、脱脂する。得られた骨片を冷却条件下
に短時間で粉砕し、適当な粒径の粉末を得る。骨粉末は
塩酸で脱灰後水洗し、さらにエタノール及びエーテルで
反復洗浄、乾燥する等が挙げられる。上記粉末は粒子径
７５〜４５０μm程度に調製されることが好ましい。得
られた脱灰骨粉末はカオトロピック試薬で抽出される。
カオトロピック試薬は蛋白質間の結合を弱める物質であ
り、尿素，グアニジン塩酸塩、特にグアニジン塩酸塩が
有利に用いられる。グアニジン塩酸塩を用いる抽出は、
脱灰骨粉末１kgあたり、１０〜５０リットル程度の１〜
５Ｍグアニジン塩酸塩水溶液を加え、０〜１０℃で１〜
３日間程度撹拌することにより行われる。この際、Ｎ−
エチルマレイミドなどのプロテアーゼ阻害剤を加えても
よい。抽出後、ろ過により骨粉末を除去する。
【０００６】得られた抽出液は、１,０００ダルトン以
上の分子を阻止する限外ろ過装置および１００,０００
ダルトンを超える分子を阻止する限外ろ過装置を用いる
限外ろ過に付される。即ちこの限外ろ過操作では、(１)
１,０００ダルトン未満の分子量画分が除かれ、ついで
(２)１００,０００ダルトンを越える分子量画分が除か
れる。１,０００ダルトン未満の物質を除去するための
限外ろ過には、ポリスルホン系の中空繊維限外ろ過膜を
用いることが好ましい。骨形成促進物質の大部分は１
０,０００〜１００,０００ダルトン程度であること、お
よび分画分子量１０,０００の限外ろ過装置(たとえばア
ミコン社ホローファイバーカートリッジＰ１０)を用い
て濃縮する際に１,４００ダルトンの物質の相当量(３０
〜４０％程度）は濃縮液中に残存することから、分画分
子量１０,０００ダルトン程度の限外ろ過装置を用いる
こともできる。ポリスルホン系の中空繊維限外ろ過膜を
用いる限外ろ過は、通常０.５〜１.５kg／cm2の圧力で
行われ、５〜１０倍程度濃縮される。得られた濃縮液は
次に１００,０００ダルトンを超える分子を阻止する限
外ろ過に付される。１００,０００ダルトンを超える物
質を除去するための限外ろ過には、分画分子量が１０
０,０００ダルトン程度であるセルロース系の限外ろ過
膜を用いることが好ましい。セルロース系の限外ろ過膜
を用いる限外ろ過は、通常３.０〜４.０kg／cm2の圧力
で行われ、ろ液が採取される。なお、分子量１００,０
００を超える画分には骨形成を阻止する免疫原や骨形成
抑制物質が存在するうえ、分子量１００,０００を超え
る画分は透析の際、透析チューブ内でゲル化する。得ら
れたろ液(１,０００〜１００,０００ダルトンの物質を
含む画分)は透析チューブ内に入れられ、水または薄い
緩衝液に対して透析される。透析チューブに用いられる
半透膜は分画分子量１,０００〜８,０００ダルトン程度
であるものが好ましい。透析外液としては脱イオン水が
好ましいが、低濃度(０〜１０mＭ)の重炭酸アンモニウ
ム水，トリス緩衝液を用いてもよい。次に、水溶性画分
には骨形成を抑制する物質が存在するため、水不溶性画
分を採取する。水不溶性画分は通常透析チューブ内に析
出するため、透析後透析内液から遠心分離などの通常の
分離手段によって容易に採取することができる。得られ
た水不溶性画分は凍結乾燥に付し、精製品を粉末として
得ることができる。
上の分子を阻止する限外ろ過装置および１００,０００
ダルトンを超える分子を阻止する限外ろ過装置を用いる
限外ろ過に付される。即ちこの限外ろ過操作では、(１)
１,０００ダルトン未満の分子量画分が除かれ、ついで
(２)１００,０００ダルトンを越える分子量画分が除か
れる。１,０００ダルトン未満の物質を除去するための
限外ろ過には、ポリスルホン系の中空繊維限外ろ過膜を
用いることが好ましい。骨形成促進物質の大部分は１
０,０００〜１００,０００ダルトン程度であること、お
よび分画分子量１０,０００の限外ろ過装置(たとえばア
ミコン社ホローファイバーカートリッジＰ１０)を用い
て濃縮する際に１,４００ダルトンの物質の相当量(３０
〜４０％程度）は濃縮液中に残存することから、分画分
子量１０,０００ダルトン程度の限外ろ過装置を用いる
こともできる。ポリスルホン系の中空繊維限外ろ過膜を
用いる限外ろ過は、通常０.５〜１.５kg／cm2の圧力で
行われ、５〜１０倍程度濃縮される。得られた濃縮液は
次に１００,０００ダルトンを超える分子を阻止する限
外ろ過に付される。１００,０００ダルトンを超える物
質を除去するための限外ろ過には、分画分子量が１０
０,０００ダルトン程度であるセルロース系の限外ろ過
膜を用いることが好ましい。セルロース系の限外ろ過膜
を用いる限外ろ過は、通常３.０〜４.０kg／cm2の圧力
で行われ、ろ液が採取される。なお、分子量１００,０
００を超える画分には骨形成を阻止する免疫原や骨形成
抑制物質が存在するうえ、分子量１００,０００を超え
る画分は透析の際、透析チューブ内でゲル化する。得ら
れたろ液(１,０００〜１００,０００ダルトンの物質を
含む画分)は透析チューブ内に入れられ、水または薄い
緩衝液に対して透析される。透析チューブに用いられる
半透膜は分画分子量１,０００〜８,０００ダルトン程度
であるものが好ましい。透析外液としては脱イオン水が
好ましいが、低濃度(０〜１０mＭ)の重炭酸アンモニウ
ム水，トリス緩衝液を用いてもよい。次に、水溶性画分
には骨形成を抑制する物質が存在するため、水不溶性画
分を採取する。水不溶性画分は通常透析チューブ内に析
出するため、透析後透析内液から遠心分離などの通常の
分離手段によって容易に採取することができる。得られ
た水不溶性画分は凍結乾燥に付し、精製品を粉末として
得ることができる。
【０００７】
【発明の効果】本発明によれば、操作が簡便であるうえ
に、脱灰骨粉末から骨形成促進物質を短時間で収率よく
調製することができる。本発明により得られた骨形成促
進物質は骨形成阻止物質が含まれていないことから、骨
修復材および骨移植材として有利に用いることができ
る。たとえば、骨形成促進物質は、金属，セラミックあ
るいは高分子を材料とする人工骨に付着または含有させ
て用いることができる。この付着または含有は、人工骨
が意図する骨欠損部に補填(移植)された際、その場にお
いて、骨形成促進物質に含有される骨修復調節因子が、
欠損部の生体組織に放出されうるようになされる。例え
ば人工骨は、上記のごとき付着または含有に適した表面
性状・表面構造を有するのが好ましい。この構成例とし
て例えば、表面をポーラスにすることが挙げられる。こ
のポーラスに形成する方法には、公知の方法、例えば同
質の材料よりなる顆粒を２層結合させて顆粒間に空隙を
作る方法、連続した金属繊維を２層に不規則に結合させ
る方法等を用いることができる。
に、脱灰骨粉末から骨形成促進物質を短時間で収率よく
調製することができる。本発明により得られた骨形成促
進物質は骨形成阻止物質が含まれていないことから、骨
修復材および骨移植材として有利に用いることができ
る。たとえば、骨形成促進物質は、金属，セラミックあ
るいは高分子を材料とする人工骨に付着または含有させ
て用いることができる。この付着または含有は、人工骨
が意図する骨欠損部に補填(移植)された際、その場にお
いて、骨形成促進物質に含有される骨修復調節因子が、
欠損部の生体組織に放出されうるようになされる。例え
ば人工骨は、上記のごとき付着または含有に適した表面
性状・表面構造を有するのが好ましい。この構成例とし
て例えば、表面をポーラスにすることが挙げられる。こ
のポーラスに形成する方法には、公知の方法、例えば同
質の材料よりなる顆粒を２層結合させて顆粒間に空隙を
作る方法、連続した金属繊維を２層に不規則に結合させ
る方法等を用いることができる。
【０００８】このような人工骨に対して、骨形成促進物
質は、通常適当な分散剤、結合剤、希釈剤等(例えばコ
ラーゲン、生理食塩水、クエン酸溶液、酢酸溶液、ハイ
ドロキシアパタイト、フィブリンまたはこれら混合液
等)に分散させ、これを人工骨に塗布または含浸し、乾
燥させることによって付着または含有させることができ
る。この場合、有効成分である骨形成促進物質の有効量
を人工骨に供給するに足る濃度で調製される。上記付着
または含有は、人工骨の、骨欠損部の生体組織に充分強
固に固定されるに足る部位になされるのが好ましい。こ
の部位の例として、移植において宿主の自然骨と接する
部分等が挙げられる。また上記付着または含有におい
て、前記骨形成促進物質は、宿主の骨欠損部に移植され
る人工骨を、その欠損部に充分強固に固定するに足る有
効量で用いられる。この有効量としては例えば、上記付
着または含有される部位の単位面積当り、０.１〜１.５
g／cm2程度、好ましくは０.３〜０.５g／cm2程度であ
る。また、得られた骨形成促進物質は人工骨固定化剤と
して用いることもできる。人工骨固定化剤は、骨形成促
進物質を有効物質とし、生理的に受容な分散剤、結合剤
または希釈剤中に含有させて調製される。これらの調製
は、それ自体公知の方法で行うことができる。また人工
骨固定化剤には、骨再生に有効な他の成分(例えばカル
シウム)を添加してもよい。人工骨固定化剤は、これを
人工骨に付着ま たは含有させることなく、宿主の骨欠
損部に移植される人工骨とその骨欠損部との間隙に充填
するよう用いることもできる。この場合も上記のごとき
有効量で用いられる。
質は、通常適当な分散剤、結合剤、希釈剤等(例えばコ
ラーゲン、生理食塩水、クエン酸溶液、酢酸溶液、ハイ
ドロキシアパタイト、フィブリンまたはこれら混合液
等)に分散させ、これを人工骨に塗布または含浸し、乾
燥させることによって付着または含有させることができ
る。この場合、有効成分である骨形成促進物質の有効量
を人工骨に供給するに足る濃度で調製される。上記付着
または含有は、人工骨の、骨欠損部の生体組織に充分強
固に固定されるに足る部位になされるのが好ましい。こ
の部位の例として、移植において宿主の自然骨と接する
部分等が挙げられる。また上記付着または含有におい
て、前記骨形成促進物質は、宿主の骨欠損部に移植され
る人工骨を、その欠損部に充分強固に固定するに足る有
効量で用いられる。この有効量としては例えば、上記付
着または含有される部位の単位面積当り、０.１〜１.５
g／cm2程度、好ましくは０.３〜０.５g／cm2程度であ
る。また、得られた骨形成促進物質は人工骨固定化剤と
して用いることもできる。人工骨固定化剤は、骨形成促
進物質を有効物質とし、生理的に受容な分散剤、結合剤
または希釈剤中に含有させて調製される。これらの調製
は、それ自体公知の方法で行うことができる。また人工
骨固定化剤には、骨再生に有効な他の成分(例えばカル
シウム)を添加してもよい。人工骨固定化剤は、これを
人工骨に付着ま たは含有させることなく、宿主の骨欠
損部に移植される人工骨とその骨欠損部との間隙に充填
するよう用いることもできる。この場合も上記のごとき
有効量で用いられる。
【０００９】
【実施例】以下に実施例、参考例および実験例を示して
さらに詳しく本発明を説明するが、本発明はこれらに限
定されるべきものではない。 実施例１ 脱灰骨粉末はグロワッキらの方法(Glowacki. J. 等：Cl
inics in Plastic Surgery 12：233, 1985)によって調
製した。即ち、ウシの中手骨および中足骨の骨幹部を切
断、粗砕し、付着する軟組織および骨髄を除去した後、
冷却脱イオン水で反復洗浄し、さらにエタノールおよび
ジエチルエーテルで反復洗浄した。この骨粗砕片を、凍
結粉砕機で粉砕した後篩にかけ、粒子径７５〜４５０μ
mの骨粉末を得た。骨粉末は、０.５Ｍ塩酸に３時間浸漬
して脱灰した後、脱イオン水、エタノール、ジエチルエ
ーテルで反復洗浄し、凍結乾燥して、脱灰骨粉末を得
た。このウシ脱灰骨粉末は、ラットに異種移植しても拒
絶反応により新生骨を誘導しなかった。上記脱灰骨粉末
から骨形成促進物質群の部分精製画分の調製は、次のよ
うにして行なった。脱灰骨粉末を１kgあたり３０リット
ルの４Ｍグアニジン塩酸塩、１０mＭエチレンジアミン
四酢酸（ＥＤＴＡ）、pＨ６.８、１０mＭ Ｎ−エチルマ
レイド（ＮＥＭ）と、４８時間，４℃で撹拌して抽出し
た。抽出液をろ紙でろ過した後、ろ液を分画分子量１
０,０００ダルトンの中空繊維カートリッジ(アミコン社
ホローファイバーカートリッジＰ１０)を用いる限外ろ
過(圧力：１.０kg／cm2)に付し約１０倍に濃縮した。濃
縮液を分画分子量１００,０００ダルトンのメンブレン
フィルター(アミコン社、米国、ダイアフローメンブレ
ンＹＭ１００)を用いる限外ろ過(圧力：３.８kg／cm2)
に付しろ液を得た。ろ液を透析チューブ(スペクトラム
社スペクトラポアＮo.３，分画分子量３,５００ダルト
ン)に入れ冷却脱イオン水に対して、９〜１０回透析外
液を交換しながら透析(４℃，９６時間)した。透析後
４,７００×gで１０分間遠心(日立製高速冷却遠心機２
０ＰＲ−５ ２Ｄ，ＲＰＲ９−２ローター)し、透析内液
を水溶性画分と水不溶性画分に分離 し、各々の画分を
凍結乾燥し、粉末を調製した。
さらに詳しく本発明を説明するが、本発明はこれらに限
定されるべきものではない。 実施例１ 脱灰骨粉末はグロワッキらの方法(Glowacki. J. 等：Cl
inics in Plastic Surgery 12：233, 1985)によって調
製した。即ち、ウシの中手骨および中足骨の骨幹部を切
断、粗砕し、付着する軟組織および骨髄を除去した後、
冷却脱イオン水で反復洗浄し、さらにエタノールおよび
ジエチルエーテルで反復洗浄した。この骨粗砕片を、凍
結粉砕機で粉砕した後篩にかけ、粒子径７５〜４５０μ
mの骨粉末を得た。骨粉末は、０.５Ｍ塩酸に３時間浸漬
して脱灰した後、脱イオン水、エタノール、ジエチルエ
ーテルで反復洗浄し、凍結乾燥して、脱灰骨粉末を得
た。このウシ脱灰骨粉末は、ラットに異種移植しても拒
絶反応により新生骨を誘導しなかった。上記脱灰骨粉末
から骨形成促進物質群の部分精製画分の調製は、次のよ
うにして行なった。脱灰骨粉末を１kgあたり３０リット
ルの４Ｍグアニジン塩酸塩、１０mＭエチレンジアミン
四酢酸（ＥＤＴＡ）、pＨ６.８、１０mＭ Ｎ−エチルマ
レイド（ＮＥＭ）と、４８時間，４℃で撹拌して抽出し
た。抽出液をろ紙でろ過した後、ろ液を分画分子量１
０,０００ダルトンの中空繊維カートリッジ(アミコン社
ホローファイバーカートリッジＰ１０)を用いる限外ろ
過(圧力：１.０kg／cm2)に付し約１０倍に濃縮した。濃
縮液を分画分子量１００,０００ダルトンのメンブレン
フィルター(アミコン社、米国、ダイアフローメンブレ
ンＹＭ１００)を用いる限外ろ過(圧力：３.８kg／cm2)
に付しろ液を得た。ろ液を透析チューブ(スペクトラム
社スペクトラポアＮo.３，分画分子量３,５００ダルト
ン)に入れ冷却脱イオン水に対して、９〜１０回透析外
液を交換しながら透析(４℃，９６時間)した。透析後
４,７００×gで１０分間遠心(日立製高速冷却遠心機２
０ＰＲ−５ ２Ｄ，ＲＰＲ９−２ローター)し、透析内液
を水溶性画分と水不溶性画分に分離 し、各々の画分を
凍結乾燥し、粉末を調製した。
【００１０】参考例１ 実施例１の調製において、透析後、水溶性画分と水不溶
性画分を合わせて凍結乾燥し、粉末を調製した。
性画分を合わせて凍結乾燥し、粉末を調製した。
【００１１】参考例２ 実施例１において、抽出後のろ液を分画分子量５,００
０ダルトンのメンブレンフィルター(アミコン社ダイア
フローメンブレンＹＭ５)を用いる限外ろ過(圧力：３.
８kg／cm2)に付し、得られる濃縮液を透析後、水溶性画
分と水不溶性画分を合わせて凍結乾燥し、粉末を調製し
た。
０ダルトンのメンブレンフィルター(アミコン社ダイア
フローメンブレンＹＭ５)を用いる限外ろ過(圧力：３.
８kg／cm2)に付し、得られる濃縮液を透析後、水溶性画
分と水不溶性画分を合わせて凍結乾燥し、粉末を調製し
た。
【００１２】実験例１ 参考例１および２で調製した凍結乾燥品を、０.１％(v/
v)トリフルオロ酢酸に溶解し、担体として低免疫原性の
溶液状アテロコラーゲン(例えば Cellmatrix LA.、新田
ゼラチン(株))を適当量添加し、４℃で１〜２時間混合
後、溶液を０.１Ｎ ＮaＯＨで中和し、凍結乾燥して、
適当な大きさに圧縮整形することによりペレット状にし
た。このペレットを４週齡雄性ラットの胸部皮下に移植
した。移植してから３週間後に、同ラットから移植片を
採取し、移植片の軟Ｘ線写真像および組織切片の観察か
ら新生骨の形成を確認し、灰化した移植片のカルシウム
含量を測定することにより新生骨の形成の程度を評価し
た。結果を〔表１〕に示す。
v)トリフルオロ酢酸に溶解し、担体として低免疫原性の
溶液状アテロコラーゲン(例えば Cellmatrix LA.、新田
ゼラチン(株))を適当量添加し、４℃で１〜２時間混合
後、溶液を０.１Ｎ ＮaＯＨで中和し、凍結乾燥して、
適当な大きさに圧縮整形することによりペレット状にし
た。このペレットを４週齡雄性ラットの胸部皮下に移植
した。移植してから３週間後に、同ラットから移植片を
採取し、移植片の軟Ｘ線写真像および組織切片の観察か
ら新生骨の形成を確認し、灰化した移植片のカルシウム
含量を測定することにより新生骨の形成の程度を評価し
た。結果を〔表１〕に示す。
【表１】 平均値±標準誤差 ｎ：使用動物数 表１に示すように、参考例１で調製した凍結乾燥品は、
移植する蛋白量が１mgから２０mgの範囲で、用量に依存
した移植片のカルシウム含量の増加を引き起こし、１０
０,０００ダルトン以上の分子量の蛋白を限外ろ過で除
去していない参考例２の凍結乾燥品に比べ、移植する蛋
白量が５mg以上で、明らかな高値を示した。また、後者
の画分による新生骨誘導の発現率が、移植した蛋白量が
２mg以上で、４７／６４であったのに対し、前者の画分
は、同じく蛋白量が２mg以上で４８／４８であり、組織
学的な検索においても、拒絶反応は見られずに、骨細胞
を含む石灰化骨、骨芽細胞により産生された類骨組織お
よび骨髄組織から成る正常な骨組織像が観察された。限
外ろ過で除去した１００,０００ダルトン以上の分子量
の蛋白を含む画分は活性がなく、参考例１で調製した凍
結乾燥品に添加して同様に移植することにより、添加し
た用量に依存して、移植片のカルシウム含量の増加を抑
制した〔表２〕。
移植する蛋白量が１mgから２０mgの範囲で、用量に依存
した移植片のカルシウム含量の増加を引き起こし、１０
０,０００ダルトン以上の分子量の蛋白を限外ろ過で除
去していない参考例２の凍結乾燥品に比べ、移植する蛋
白量が５mg以上で、明らかな高値を示した。また、後者
の画分による新生骨誘導の発現率が、移植した蛋白量が
２mg以上で、４７／６４であったのに対し、前者の画分
は、同じく蛋白量が２mg以上で４８／４８であり、組織
学的な検索においても、拒絶反応は見られずに、骨細胞
を含む石灰化骨、骨芽細胞により産生された類骨組織お
よび骨髄組織から成る正常な骨組織像が観察された。限
外ろ過で除去した１００,０００ダルトン以上の分子量
の蛋白を含む画分は活性がなく、参考例１で調製した凍
結乾燥品に添加して同様に移植することにより、添加し
た用量に依存して、移植片のカルシウム含量の増加を抑
制した〔表２〕。
【表２】 A：参考例１の凍結乾燥品 B：限外ろ過で分離した１００,０００ダルトン以上の分
子量の蛋白を含む画分 n：使用動物数
子量の蛋白を含む画分 n：使用動物数
【００１３】実験例２ 実施例１で調製した水溶性画分の凍結乾燥品と水不溶性
画分の凍結乾燥品の新生骨誘導能を実験例１と同様に測
定した。結果を〔表３〕に示す。
画分の凍結乾燥品の新生骨誘導能を実験例１と同様に測
定した。結果を〔表３〕に示す。
【表３】 A：参考例１の凍結乾燥品 B：実施例１で調製した水不溶性画分の凍結乾燥品 C：実施例１で調製した水溶性画分の凍結乾燥品 n：使用動物数 〔表３〕に示すように、移植する蛋白量が５mgで実施例
１で調製した水不溶性画分が参考例１で調製した水不溶
性画分と水溶性画分の混合物に比べ、さらに強い活性を
示した。水溶性画分は活性がなく、５mgの水不溶性画分
に同用量添加することにより、５mgの参考例１の凍結乾
燥品を移植した時のレベルまで移植片のカルシウム含量
を低下させた。
１で調製した水不溶性画分が参考例１で調製した水不溶
性画分と水溶性画分の混合物に比べ、さらに強い活性を
示した。水溶性画分は活性がなく、５mgの水不溶性画分
に同用量添加することにより、５mgの参考例１の凍結乾
燥品を移植した時のレベルまで移植片のカルシウム含量
を低下させた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 35/32
Claims (1)
- 【請求項１】脱灰骨粉末をカオトロピック試薬で抽出
し、抽出液を限外ろ過に付し分子量１,０００〜１００,
０００の物質を含む画分を採取し、採取した画分を透析
し、透析液から水不溶性画分を採取することを特徴とす
る、骨形成促進物質の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22560491A JP3208431B2 (ja) | 1990-09-06 | 1991-09-05 | 骨形成促進物質の製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23842490 | 1990-09-06 | ||
| JP2-238424 | 1990-09-06 | ||
| JP22560491A JP3208431B2 (ja) | 1990-09-06 | 1991-09-05 | 骨形成促進物質の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0585939A JPH0585939A (ja) | 1993-04-06 |
| JP3208431B2 true JP3208431B2 (ja) | 2001-09-10 |
Family
ID=26526728
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22560491A Expired - Fee Related JP3208431B2 (ja) | 1990-09-06 | 1991-09-05 | 骨形成促進物質の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3208431B2 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE29913200U1 (de) * | 1999-07-28 | 1999-09-23 | Tutogen Medical Gmbh | Implantat aus Knochenmaterial |
| KR100331608B1 (ko) * | 1999-11-25 | 2002-04-09 | 김정근 | 동물 뼈를 이용한 골이식 대체재 및 그 제조 방법 |
| US8415302B2 (en) | 2004-01-28 | 2013-04-09 | The Regents Of The University Of California | Surgical applications for BMP binding protein |
| US8188219B2 (en) | 2004-01-28 | 2012-05-29 | The Regents Of The University Of California | Bone morphogenic protein binding peptide |
| US8193312B2 (en) | 2004-01-28 | 2012-06-05 | The Regents Of The University Of California | Bone morphogenic protein binding peptide |
| CA2589930C (en) * | 2004-11-29 | 2016-10-11 | The Regents Of The University Of California | Activating extraction of demineralized bone matrix |
| EP2445512B1 (en) | 2009-06-23 | 2018-08-29 | The Regents of The University of California | Enhancement of bmp retention |
| KR101229436B1 (ko) * | 2010-07-26 | 2013-02-05 | 한스바이오메드 주식회사 | 골재생재 및 그 제조방법 |
-
1991
- 1991-09-05 JP JP22560491A patent/JP3208431B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0585939A (ja) | 1993-04-06 |
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