CN115252905A - 一种具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料及构建方法 - Google Patents

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Abstract

一种具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料及构建方法。本发明涉及医学材料，属于抗菌材料领域。一种具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料，包括基底A和涂覆层B，基底A表面为与蝉翼表面高度类似的纳米柱状结构，表现为顶端直径小于底端直径的圆台形状，涂覆层B涂覆于基底A的柱状结构表面，为光敏粒子涂层。该表面密集的纳米柱状结构对于粘附于表面的细菌的物理撕裂作用，并表现出在纳米柱状结构作用下，55℃的温度条件即可实现杀死细菌的热效应；且纳米柱状结构可以调控具有炎症反应效应的巨噬细胞由M1促炎型向M2抑炎型转化，实现调控巨噬细胞向M2型标志物的高表达和减少炎症细胞因子的分泌行为，能够有效降低机体对整形假体材料的免疫排斥效应，为可移植医疗器械的表面改性提供了一个崭新方法。

Description

一种具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料及构建方法
技术领域
本发明涉及医学材料，尤其涉及一种具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料及构建方法。
背景技术
医用硅橡胶是一种化学性质比较稳定的材料，核心成分为二甲基硅氧烷，是当前各类医院、美容院开展鼻整形最常用的一种假体材料(以下简称硅胶假体)。硅胶假体外形较固定，化学性质稳定、不变形、不吸收、不变质、富有弹性、质地柔韧、耐高温、耐生物老化性、手感好。然而，硅胶假体隆鼻也存在一定的风险，易发生感染、假体外露、假体移位等并发症。
硅胶假体隆鼻所产生并发症的一大主要原因就是包膜挛缩。硅胶假体植入后，巨噬细胞的异物反应将导致硅胶假体周边的纤维组织增生，从而形成囊性包膜，该囊性包膜对假体产生的挤压力和对周围组织的牵拉作用，从而导致假体外形显露、鼻畸形、假体移位等不良后果。对于包膜挛缩的发病机制，主要有以下几种：
1、炎症免疫机制。目前尚缺乏免疫细胞具体的作用机制研究证据，研究认为可能与巨噬细胞、多核细胞、肥大细胞等多种免疫细胞刺激生成白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子等多种细胞因子介导的免疫应答有关。
2、感染是导致硅胶隆鼻后包膜挛缩的一大主要原因。手术时带入细菌，手术未严格遵守无菌操作原则，手术时间过长导致术后组织坏死感染等因素。感染后病原菌及其毒素激活由淋巴细胞介导的免疫应答。感染后的生物膜中多种炎症细胞、细胞因子、及肌成纤维细胞导致大量纤维包膜形成。同时感染导致的炎症反应可导致软骨组织吸收，原本薄弱的软骨结构遭到破坏。在软骨结构被破坏的情况下，包膜挛缩就可以表现为严重鼻部外形的畸形改变。细菌感染不仅是硅胶假体植入的并发症之一，还可诱导引起包膜挛缩，导致更多严重后果。将植入体取出进行清创处理，是治疗严重细菌感染的主要方式。
3、创伤，血肿。多次鼻部手术史、反复的假体置入，导致局部组织反复创伤，局部组织反复发生急性慢性炎症反应、产生大量成纤维细胞、肌成纤维细胞、巨噬细胞及细胞因子导致组织反复纤维化，瘢痕组织大量形成致假体周围包膜形成。
因此，对植入体材料表面进行改性，使其在抑制免疫排斥反应的发生的同时防止细菌感染，具有良好的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料及构建方法，解决现在整形类植入材料表面易发生细菌感染和炎症反应的缺陷。
技术方案
一种具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料，包括基底A和涂覆层B，基底A表面为与蝉翼表面高度类似的纳米柱状结构，表现为顶端直径小于底端直径的圆台形状，涂覆层B涂覆于基底A的柱状结构表面，为光敏粒子涂层。该表面密集的纳米柱状结构对于粘附于表面的细菌的物理撕裂作用，使得具有纳米柱状结构的蝉翼表面具有良好的杀菌效应；其次，在无化学物质修饰下仅依靠表面结构诱导巨噬细胞的形貌变化，纳米柱状结构能够实现调控巨噬细胞向M2型标志物的高表达和减少炎症细胞因子的分泌行为；进一步，纳米柱状结构作用下，使得55℃的温度条件即可实现杀死细菌的热效应，物理结构与近红外光热效应协同杀菌，相互促进，对细菌的杀灭快速、高效，并且广谱。
进一步，所述顶端直径为50～100nm，高度为200～400nm，柱中心距L为100～300nm；所述涂覆层B厚度为10～60nm。
进一步，所述基底A的材料选自医用硅橡胶、高密度聚乙烯；所述光敏粒子涂层选自功能聚合物、无机纳米粒子；
进一步，所述功能聚合物包括聚吡咯、聚苯胺、聚多巴胺，所述无机纳米粒子包括金属硫化物(CuS、Cu2S、Bi2S3、Ru2S3、MoS2、WS2)、金属硒化物和碲化物(CuSe、Bi2Se3、MoSe3、WSe3和CuTe)、金属氧化物(氧化铁、锰氧化物、氧化钨、氧化钼)以及其它具有近红外光热效应的无机纳米粒子。
一种具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料的构建方法，步骤包括：
步骤I.制备的阴性模板；
步骤II.将主体材料填充于阴性模板后，固化；
步骤III.将固化后的主体材料脱模，获得柱状纳米结构；
步骤IV.在柱状纳米结构表面涂覆具有光热转化性能的光热涂层分子。
进一步，步骤I制备阴性模板的步骤包括：采用分子束外延、磁控溅射、化学气相沉积、有机金属气相外延、电子束蒸发和热蒸发等技术，制备AAO模板，所述AAO模板表面形成凹陷柱状纳米点阵列，纳米点阵列尺寸为：凹陷柱区域顶端直径50～100nm，高度200～400nm，柱中心距L为100～300nm。
进一步，所述主体材料选自医用硅橡胶、多孔高密度聚乙烯中的一种。
进一步，步骤II包括，预填充-固化法、压塑法，所述预填充-固化法步骤包括，将主体材料的预聚合溶液滴加在阴模板上，室温放置10-20min后，放入真空烘箱中真空保持1-2h，以去除溶液和模板孔隙中的气体，然后取出样品放入80℃干燥箱中固化10-12h；所述压塑法步骤包括，在材料A上表面涂覆脱模剂，然后将固化后的主体材料的平正面覆盖在AAO模板表面，向主体材料和AAO模板表面之间施加压力的状态下，于100℃干燥箱中放置10-12h。
进一步，步骤III包括，先后使用氢氧化钠溶液、CuCl2溶液将大部分AAO铝模板去除，获得的纳米结构基底再次放入氢氧化钠溶液以除去残存的氧化铝，冷冻干燥10-12h。
进一步，步骤IV包括，将步骤III得到的样品浸泡在具有光热效应的纳米粒子溶液，取出样品用超纯水冲洗，重复上述步骤2-9次，获得具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料。
有益效果
本发明所制备具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料，具有以下有益效果：
首先，该表面密集的纳米柱状结构对于粘附于表面的细菌的物理撕裂作用，使得具有纳米柱状结构的蝉翼表面具有良好的杀菌效应；
其次，在无化学物质修饰下仅依靠表面结构就能诱导巨噬细胞的形貌变化，纳米柱状结构可以调控具有炎症反应效应的巨噬细胞由M1促炎型向M2抑炎型转化，实现调控巨噬细胞向M2型标志物的高表达和减少炎症细胞因子的分泌行为，能够有效降低机体对整形假体材料的免疫排斥效应，促进植入体与机体之间的结合。由此降低了硅胶假体植入后，巨噬细胞的异物反应将导致硅胶假体周边的纤维组织增生，从而形成囊性包膜，该囊性包膜对假体产生的挤压力和对周围组织的牵拉作用，从而导致假体外形显露、鼻畸形、假体移位等不良后果；
第三，纳米柱状结构作用下，55℃的温度条件即可实现杀死细菌的热效应，物理结构与近红外光热效应协同杀菌，相互促进，对细菌的杀灭快速、高效，并且广谱。并且，近红外光恰好可以穿透人体浅表层皮肤，可到达鼻植入假体部位，这样的设计更加贴近于实际应用，为可移植医疗器械的表面改性提供了一个崭新方法。
附图说明
图1为本发明所制备具有物理杀菌和免疫细胞调节仿生材料的制备与结构示意图；
图2为本发明实施例不同样品表面形貌SEM图；其中：(A)为PDMS结构表面不同TA/Fe涂覆次数以后表面形貌俯视图，a1-a4)涂层次数分别为0、3、6和9次；(B)为PDMS结构表面不同TA/Fe涂覆次数以后表面形貌45°侧视图，b1-b4)涂层次数分别为0、3、6和9次；
图3为本发明实施例NIR激光照射不同时间后样品表面热成像图片；
图4为本发明实施例NIR激光照射不同时间后不同样品表面温度散点图；
图5为本发明实施例PDMS9表面光热转化可循环性能测试图；
图6为本发明实施例NIR激光照射3min后不同样品表面剩余绿脓杆菌平板菌落数照片；
图7为本发明实施例NIR激光照射3min后不同样品表面剩余金黄色葡萄球菌平板菌落数照片；
图8为本发明实施例巨噬细胞在不同表面形貌刺激后一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶(arginase-1)的表达水平。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图1～8，进一步阐述本发明。
实施例1制备具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料
选择结构制备的阴性模板：以多孔AAO模板作为结构制备的阴性模板。
主体材料A的填充和固化：将聚二甲基硅氧烷(PDMS)(实验中代替医用硅橡胶)溶液2g滴加在AAO阴模板上。样品室温放置10min后，放入真空烘箱中真空保持2h，以去除溶液和AAO模板孔隙中的气体。取出样品放入80℃干燥箱中固化10h。
脱模，制得柱状纳米结构：用镊子轻轻将固化后的PDMS在AAO模板上揭下。
在柱状结构表面涂覆具有光热转化性能的光热涂层分子：分别配置3.2mg/mL单宁酸(TA)的Tris-HCl溶液(pH＝7)和1.6mg/mL FeCl3的Tris-HCl溶液(pH＝7)，将两种溶液等体积混合后得到TA/Fe3+络合溶液。将具有纳米结构的样品浸泡在TA/Fe3+的溶液中震荡2min，取出样品用超纯水冲洗。将上述步骤分别进行0-9次，获得的样品分别记作PDMS0-PDMS9，得到具有物理结构和光热涂层的仿生材料。
实施例2制备具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料
选择结构制备的阴性模板：以多孔AAO模板作为结构制备的阴性模板。
可固化溶液的填充和固化：将固化后的主体材料A覆盖在AAO模板表面，然后在材料A上表面涂覆脱模剂，将具有一定重量的砝码放置在材料A的上表面之后在100℃干燥箱中放置10-12h。
脱模，制得柱状纳米结构：将固化后的样品放入10wt％的氢氧化钠溶液中浸泡30min，用大量超纯水冲洗，然后放入15wt％的CuCl2溶液中浸泡4h。大部分铝模板去除以后，将获得的纳米结构基底再次放入10wt％的氢氧化钠溶液中浸泡1h，以除去残存的氧化铝。获得的基底用大量超纯水冲洗后，冷冻干燥10h。
在柱状结构表面涂覆具有光热转化性能的光热涂层分子：分别配置3.2mg/mL单宁酸(TA)的Tris-HCl溶液(pH＝7)和1.6mg/mL FeCl3的Tris-HCl溶液(pH＝7)，将两种溶液等体积混合后得到TA/Fe3+络合溶液。将具有纳米结构的样品浸泡在TA/Fe3+的溶液中震荡2min，取出样品用超纯水冲洗。将上述步骤分别进行0-9次，获得的样品分别记作A0-A9，得到具有物理结构和光热涂层的仿生材料。
实施例3样品的性能测试
1、表面光热转化效率测试：利用808nm的NIR激光分别照射PDMS0、PDMS3、PDMS6、PDMS9，照射0s、10s、20s、30s、40s、50s、60s时记录不同样品所达到的温度，绘制样品表面热成像图(附图3)与样品表面温度散点图(附图4)。可以看到，样品表面可达到的最高温度与样品表面涂覆光热涂层的次数、照射时间有关。PDMS9表面在经60s照射后可达57.3℃，超过了细菌死亡所需要的温度55℃。
2、PDMS9表面光热转化可循环性能测试：为测试样品是否具有光热可循环性能，以PDMS9作为目标样开展表面可循环热性能测试。以“光照-黑暗”作为一个循环，每次光照或黑暗持续的时间为1min，通过连续5个循环的测试进行表征(附图5)。从测试结果中可以看到，在5个循环测试过程中样品表面的光热转化性能几乎没有衰减趋势。这表明以NIR为TA/Fe3+络合物的光热激发源，不会对纳米粒子的光热转化性能有任何副作用。
3、样品表面杀菌性能测试：分别选取铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作为革兰氏阴性菌(G-)和革兰氏阳性菌(G+)的代表，测试不同样品表面对不同种细菌的杀灭能力。在样品表面滴加20μL菌液，37℃黑暗条件下孵化30min后用808nm的NIR激光照射3min，然后对剩余细菌铺板培养。铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的培养结果分别见附图6和附图7。
铺板结果显示，经过NIR激光照射后，两种细菌存活率都随光热涂层次数的增加而降低，涂层次数为9次的PDMS9样品表面几乎已经没有存活的细菌。这表明在物理机械结构与光热协同杀菌的条件下，仿生复合纳米结构对绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果均可达到99％以上。
4、一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶(arginase-1)表达水平的测定：为了探究巨噬细胞在不同表面形貌刺激后的极化状态，我们测定了一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶(arginase-1)的表达水平。iNOS为促炎因子，由M1型巨噬细胞所表达；arginase-1为抗炎因子，由M2型巨噬细胞所表达。因此，测定的一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶(arginase-1)的表达水平分别代表了巨噬细胞极化为M1型和M2型的数量(附图8)。
将巨噬细胞分别在无纳米图案(平面)、100nm和400nm高度的纳米柱模型上培养24h，之后检测一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶(arginase-1)的表达水平。我们发现，400nm高的纳米柱精氨酸酶的表达水平最高，而与平面组相比，两组实验组的一氧化氮合酶表达程度都有降低。这说明我们的纳米结构可诱导巨噬细胞向抗炎的M2表型极化.
结果讨论：
本发明所制备具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料，经过上述实施例和参数表征可以看出，该表面密集的纳米柱状结构对于粘附于表面的细菌的物理撕裂作用，使得具有纳米柱状结构的蝉翼表面具有良好的杀菌效应。
在无化学物质修饰下仅依靠表面结构就能诱导巨噬细胞的形貌变化，纳米柱状结构可以调控具有炎症反应效应的巨噬细胞由M1促炎型向M2抑炎型转化，实现调控巨噬细胞向M2型标志物的高表达和减少炎症细胞因子的分泌行为，能够有效降低机体对整形假体材料的免疫排斥效应，促进植入体与机体之间的结合。由此降低了硅胶假体植入后，巨噬细胞的异物反应将导致硅胶假体周边的纤维组织增生，从而形成囊性包膜，该囊性包膜对假体产生的挤压力和对周围组织的牵拉作用，从而导致假体外形显露、鼻畸形、假体移位等不良后果。
纳米柱状结构作用下，55℃的温度条件即可实现杀死细菌的热效应，物理结构与近红外光热效应协同杀菌，相互促进，对细菌的杀灭快速、高效，并且广谱。并且，近红外光恰好可以穿透人体浅表层皮肤，可到达鼻植入假体部位，这样的设计更加贴近于实际应用，为可移植医疗器械的表面改性提供了一个崭新方法。

Claims (10)

1.一种具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料，其特征在于，包括基底A和涂覆层B，基底A表面为与蝉翼表面高度类似的纳米柱状结构，表现为顶端直径小于底端直径的圆台形状，涂覆层B涂覆于基底A的柱状结构表面，为光敏粒子涂层。
2.如权利要求1所述的具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料，其特征在于，所述顶端直径为50～100nm，高度为200～400nm，柱中心距L为100～300nm；所述涂覆层B厚度为10～60nm。
3.如权利要求1所述的具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料，其特征在于，所述基底A的材料选自医用硅橡胶、高密度聚乙烯；所述光敏粒子涂层选自功能聚合物、无机纳米粒子。
4.如权利要求3所述的具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料，其特征在于，所述功能聚合物包括聚吡咯、聚苯胺、聚多巴胺，所述无机纳米粒子包括金属硫化物、金属硒化物和碲化物、金属氧化物。
5.一种具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料的构建方法，其特征在于，步骤包括：
步骤I.制备的阴性模板；
步骤II.将主体材料填充于阴性模板后，固化；
步骤III.将固化后的主体材料脱模，获得柱状纳米结构；
步骤IV.在柱状纳米结构表面涂覆具有光热转化性能的光热涂层分子。
6.如权利要求5所述的具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料的构建方法，其特征在于，步骤I制备阴性模板的步骤包括：采用分子束外延、磁控溅射、化学气相沉积、有机金属气相外延、电子束蒸发和热蒸发等技术，制备AAO模板，所述AAO模板表面形成凹陷柱状纳米点阵列，纳米点阵列尺寸为：凹陷柱区域顶端直径50～100nm，高度200～400nm，柱中心距L为100～300nm。
7.如权利要求5所述的具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料的构建方法，其特征在于，所述主体材料选自医用硅橡胶、多孔高密度聚乙烯中的一种。
8.如权利要求5所述的具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料的构建方法，其特征在于，步骤II包括，预填充-固化法、压塑法，所述预填充-固化法步骤包括，将主体材料的预聚合溶液滴加在阴模板上，室温放置10-20min后，放入真空烘箱中真空保持1-2h，以去除溶液和模板孔隙中的气体，然后取出样品放入80℃干燥箱中固化10-12h；所述压塑法步骤包括，在材料A上表面涂覆脱模剂，然后将固化后的主体材料的平正面覆盖在AAO模板表面，向主体材料和AAO模板表面之间施加压力的状态下，于100℃干燥箱中放置10-12h。
9.如权利要求5所述的具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料的构建方法，其特征在于，步骤III包括，先后使用氢氧化钠溶液、CuCl2溶液将大部分AAO铝模板去除，获得的纳米结构基底再次放入氢氧化钠溶液以除去残存的氧化铝，冷冻干燥10-12h。
10.如权利要求5所述的具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料的构建方法，其特征在于，步骤IV包括，将步骤III得到的样品浸泡在具有光热效应的纳米粒子溶液B，取出样品用超纯水冲洗，重复上述步骤2-9次，获得具有物理杀菌和免疫细胞调节的仿生材料。
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