CN1314801C - 一种固定化重组高温β－半乳糖苷酶的制备方法 - Google Patents

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一种固定化重组高温β-半乳糖苷酶的制备方法，属于高温β-半乳糖苷酶的固定化及其应用技术领域。本发明以壳聚糖为载体，用三羟甲基膦(THP)为交联剂，选择对高温β-半乳糖苷酶进行固定化处理，采取先用交联剂活化壳聚糖载体，然后再将酶固定在活化好的载体上的固定化顺序获得固定化重组高温β-半乳糖苷酶。以THP作交联剂时，固定化酶制备方便、简捷，酶活回收率可达90%以上，且具有良好的热稳定性和使用稳定性，70℃保温处理5小时，固定化酶活力保留80%以上；以乳糖为水解底物，70℃下使用九个循环后，固定化酶活保留60%以上。

Description

一种固定化重组高温β-半乳糖苷酶的制备方法
技术领域
一种固定化重组高温β-半乳糖苷酶的制备方法，属于高温β-半乳糖苷酶的固定化及其应用技术领域。
背景技术
β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)俗称乳糖酶，能水解β-1，4-半乳糖苷键而具有重要的工业用途。耐热β-半乳糖苷酶，或称高温乳糖酶，以其良好的热稳定性和较高温度下的水解特性使之具有常温乳糖酶无法比拟的优越性。与常温酶的固定化相比，高温酶因其在较高操作温度下使用，因此在交联剂选择、固定化参数和条件方面具有更大的难度。
β-半乳糖苷酶主要来自植物、动物脏器、细菌、酵母(胞内)、真菌或霉菌(胞外)。高温β-半乳糖苷酶一般是指最适温度在50℃以上的β-半乳糖苷酶。高温β-半乳糖苷酶主要来源于一些高温菌，如栖热菌，嗜热菌(嗜热链球菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等)。
β-半乳糖苷酶的用途主要是在食品工业中水解牛奶中乳糖生产低乳糖乳制品，牛奶中乳糖被水解成葡萄糖和半乳糖后可以为乳糖不耐症人群顺利吸收。β-半乳糖苷酶还可以用于水解干酪生产时的副产物乳清中的乳糖，有利于综合利用和环境保护。利用β-半乳糖苷酶的转糖苷作用，以牛乳或乳清中的乳糖为底物，可以生成低聚半乳糖。低聚半乳糖具有许多重要的生理功能，如抑制有害菌群、促进益生菌的生长，促进钙吸收，改善血清脂质等。
乳糖的酶解既可用固定化乳糖酶水解，也可用非固定化乳糖酶水解。对于大规模工业化生产来说，虽然游离乳糖酶水解工艺简单，但是酶在溶液中很难回收，不仅使牛乳掺入外来蛋白质，并且会影响乳制品的风味，而且成本较高；而用固定化乳糖酶进行水解，则可克服上述缺点。据报道，大多数的半乳糖苷酶都受乳糖的水解产物(D-葡萄糖，D-半乳糖)抑制，应用固定化床进行连续操作时，产物抑制可降到最低，从而大大提高了生产效率。固定化乳糖酶与非固定化乳糖酶相比，还具有以下优点：
(1)有良好的机械强度，可在搅拌或者装柱的方式下进行作用。
(2)可用于工业化生产，适应连续化、自动化生产的要求。
(3)产物纯度高、副反应少，因此产率较高。
(4)可反复使用，提高了酶的利用率，降低了低乳糖乳制品的生产成本。
(5)当酶被固定后，它的三级结构得到稳定使酶的稳定性有显著提高。
(6)固定化酶应用于生产后，产物中不含有酶，因此省去了热处理使酶失活步骡，对于提高食品的质量极为有利。
用于β-半乳糖苷酶的固定化方法有很多，如吸附法、包埋法、共价法、戊二醛交联法等。
在固定化乳糖酶的工业化应用中，应该注意固定化酶的清洗问题，以防止固定化酶被微生物污染。然而固定化高温酶时则不会遇到类似问题，固定化高温乳糖酶的工业应用目前还是空白
关于高温乳糖酶的固定化国内外也有少量报道。目前高温β-半乳糖苷酶的固定化及其应用研究正成为热点之一。与常温酶的固定化相比，高温酶因其在较高操作温度下使用，因此在交联剂选择、固定化参数和条件方面具有更大的难度。目前未见有用三羟甲基膦作为壳聚糖交联剂固定化高温酶的应用，尤其是对来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的重组高温β-半乳糖苷酶的固定化未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种以三羟甲基膦(tris(hydroxymethyl)phosphine，THP)作为交联剂，以壳聚糖为固定化载体，以重组高温β-半乳糖苷酶为固定化对象，确定固定化参数和条件，以期为高温乳糖酶的固定化方法寻找一条有效的途径。
本发明的技术方案：一种固定化重组高温β-半乳糖苷酶的制备方法，是以壳聚糖为载体，用三羟甲基膦(THP)为交联剂，选择对高温β-半乳糖苷酶进行固定化处理，采取先用交联剂活化壳聚糖载体，然后再将酶固定在活化好的载体上的固定化顺序，所述固定化工艺为：
(1)配制壳聚糖凝胶载体：称一定量的壳聚糖，用2％醋酸溶解浸泡过夜，使壳聚糖终浓度为2％，在剧烈搅拌下滴加浓度为6mol/L的NaOH溶液中和，使壳聚糖凝胶析出，以去离子水洗涤，抽干得到处理好的壳聚糖凝胶。
(2)载体活化：称取0.32g四羟甲基氯化膦(THPC)溶液，加入95mL水，在剧烈搅拌下逐滴加入等摩尔的浓度为1.0mol/L的KOH溶液1.68mL，迅速加入12g上述壳聚糖凝胶，缓慢搅动5min，抽滤、水洗三次，再抽滤，其中三羟甲基膦浓度为0.31-1.25mg/mL，活化时间5min。四羟甲基氯化膦和KOH等摩尔反应生成三羟甲基膦。
(3)固定化酶：取一定量β-半乳糖苷酶溶解于pH6.5-7.2、0.05-0.15mol/L的磷酸钠缓冲液至浓度为40-100U/mL，按酶液与壳聚糖v/w为1∶5的比例混合，室温轻微震荡10min，去离子水洗涤，然后用浓度为1mol/L的NaCL洗涤三次，抽干得到固定化重组高温β-半乳糖苷酶。
固定化酶的最优条件：以三羟甲基膦为交联剂，其浓度为0.625mg/mL，固定化缓冲液选择0.1mol/L、pH6.8的磷酸钠缓冲液，在室温下交联固定10min，制备得到的固定化酶的活力回收率可达到90％以上。
本发明的有益效果：高温β-半乳糖苷酶的固定化及其应用目前正成为研究热点。与常温酶的固定化相比，高温酶因其在较高操作温度下使用，因此在交联剂选择、固定化参数和条件方面具有更大的难度。目前未见有用三羟甲基膦作为壳聚糖交联剂固定化高温半乳糖苷酶的应用，尤其是对来源于重组菌表达的高温β-半乳糖苷酶的固定化未见报道。以THP作交联剂时，固定化酶制备方便、简捷，酶活回收率达90％以上，且具有良好的热稳定性和使用稳定性，70℃保温处理5小时，固定化酶活力保留80％以上；以乳糖为水解底物，70℃下使用九个循环后，固定化酶活保留60％以上。
附图说明
图1THP作交联剂制备固定化酶的热稳定性。
图2戊二醛作交联剂制备固定化酶的热稳定性。
图3固定化β-半乳糖苷酶使用稳定性(70℃)。
具体实施方式
实施例1
按照说明书上述的条件配制壳聚糖载体、用THP进行载体活化，选用来源于编码嗜热脂肪芽孢杆菌β-半乳糖苷酶基因的重组枯草芽孢杆菌WB600/pMA5-bgaB(该菌株见“工业微生物”杂志2004年第34卷第1期)生产的高温β-半乳糖苷酶，进行固定化酶处理。
影响固定化酶活回收率的因素有交联剂浓度、活化时间、固定化缓冲液pH、离子强度、交联温度、固定化时间、顺序等。由单因素试验得到固定化酶较优的参数条件是：THP浓度0.625mg/mL，活化时间5-10min，固定化缓冲液pH6.5-7.2，离子强度0.1-0.2mol/L，交联温度20-30℃，固定化时间5-10min。并且THP浓度、固定化缓冲液pH、离子强度是主要影响因素，为此再安排正交试验L9(33)，从而得出最优的固定化条件。
        表1正交试验因素和水平的选取
  水平   因素
  A(THP浓度)   B(pH)   C(离子强度)
  1   0.3125   6.5   0.05
  2   0.625   6.8   0.1
  3   1.25   7.2   0.15
          表2正交试验方案和结果
  试验号   因素   活力回收率(％)
  A   B   C
  1   1   1   1   65.65
  2   1   2   2   75.06
  3   1   3   3   55.59
  4   2   1   2   80.88
  5   2   2   3   89.42
  6   2   3   1   80.29
  7   3   1   3   73.53
  8   3   2   1   83.52
  9   3   3   2   76.18
从极差分析可以知道，影响因素的主次顺序为THP浓度(A)、缓冲液pH值(B)、缓冲液离子强度(C)。由此确定最佳的固定化条件为A2B2C2，按此最佳固定化条件得到的固定化酶活力回收率为92.6％。
交联剂浓度影响最显著，THP浓度过高，会造成多点交联，影响酶活性部位的构象，从而使活力回收率降低；固定化缓冲液pH值的变化会影响到酶蛋白氨基酸残基侧链基团的解离状态，进而影响底物的结合和进一步的催化反应，使酶活力受到影响；离子强度影响说明盐键不是维持酶蛋白构象的主要的次级键。因此得到THP为交联剂固定化酶最优条件为：THP浓度0.625mg/mL，pH6.8，0.1mol/L的磷酸盐缓冲液固定化10min，制备得到的固定化酶的活力回收率可达到90％以上。
以THP作交联剂制备得到的固定化酶，与以戊二醛作交联剂制备得到的固定化酶相比，THP交联制备的固定化酶具有更好的热稳定性，在70℃下保温处理5小时后，THP固定化酶仍保留80％左右的活力(图1)，而戊二醛交联制备的固定化酶70℃保温处理1小时，酶活还不到原来的20％，2h后基本无活力保留(图2)。
对乳糖的分批水解试验结果表明，THP固定化酶具有较好的使用稳定性，在使用九个循环后，THP固定化酶保留60％以上的酶活，而戊二醛固定化酶仅有40％左右(图3)。
实施例2
以实施例1中的固定化参数条件为参照，对重组大肠杆菌(Escherichia coliMV1184)表达的栖热菌(Thermus sp.A4)β-半乳糖苷酶(以质粒pUC118/119为载体，该菌株及质粒见“Bioscience Biotechnology & Biochemistry”杂志1998年62卷第8期1539-1545页)进行酶固定化。因该酶最适温度为85℃，因此也是高温β-半乳糖苷酶。该高温重组酶的最优固定化条件为：THP浓度为0.625mg/mL，固定化缓冲液pH值6.8，浓度为0.1mol/L，交联温度为室温，固定化时间为10min。按此条件制备得到的固定化酶的活力回收率为92％，最适温度为85℃，70℃下保温处理5小时酶活几乎没有损失，对乳糖水解循环使用十次后酶活仍保留80％。

Claims (2)

1.一种固定化重组高温β-半乳糖苷酶的制备方法，其特征是以壳聚糖为载体，用三羟甲基膦为交联剂，对高温β-半乳糖苷酶进行固定化处理，采取先用交联剂活化壳聚糖载体，然后再将酶固定在活化好的载体上的固定化顺序，所述固定化工艺为：
(1)配制壳聚糖凝胶载体：称一定量的壳聚糖，用2％醋酸溶解浸泡过夜，使壳聚糖终浓度为2％，在剧烈搅拌下滴加浓度为6mol/L的NaOH溶液中和，使壳聚糖凝胶析出，以去离子水洗涤，抽干得到处理好的壳聚糖凝胶；
(2)载体活化：称取0.32g四羟甲基氯化膦溶液，加入95mL水，在剧烈搅拌下逐滴加入等摩尔的浓度为1.0mol/L的KOH溶液1.68mL，迅速加入12g上述壳聚糖凝胶，缓慢搅动活化5min，抽滤、水洗三次，再抽滤；
(3)固定化酶：取一定量β-半乳糖苷酶溶解于pH6.5-7.2、0.05-0.15mol/L的磷酸钠缓冲液至浓度为40-100U/mL，按酶液与壳聚糖v/w为1∶5的比例混合，室温轻微震荡10min，去离子水洗涤，然后用1mol/L的NaCL洗涤三次，抽干得到固定化重组高温β-半乳糖苷酶。
2.根据权利要求1所述的固定化重组高温β-半乳糖苷酶的制备方法，其特征是固定化工芝中，以三羟甲基膦为交联剂，其浓度为0.625mg/mL，固定化缓冲液为pH6.8、0.1mol/L的磷酸钠缓冲液，在室温下交联固定10min，制备得到的固定化酶的活力回收率达到90％以上。
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Immobilization ofbeta-fructofuranosidasefrom Aspergillusjaponicus onchitosanusing tris(hydroxymethyl)phosphine orglutaradehydeas acouplingagent. Cheng TC,et al,Biotechnol Lett.,Vol.27 No.5 2005 *
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