CN101664111B

CN101664111B - 包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子及其制备方法

Info

Publication number: CN101664111B
Application number: CN2009103077019A
Authority: CN
Inventors: 许尧兴; 柳永; 李艳丽; 许少春; 孙燕
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2009-09-25
Filing date: 2009-09-25
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2029-09-25
Also published as: CN101664111A

Abstract

一种饲用酶制剂技术领域的包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子的制备方法，包括：配置壳聚糖原液；向壳聚糖原液中加入等体积的α-半乳糖苷酶粗酶液，采用磁力搅拌法混合均匀，制成α-半乳糖苷酶混合液；向α-半乳糖苷酶混合液中逐滴加入三聚磷酸钠水溶液，在室温环境下磁力搅拌，制成包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子。本发明制备操作简单，以壳聚糖/α-半乳糖苷酶/三聚磷酸钠简单混合即可获得包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子，粒子无粘连，成球性好，表面圆整，在与猪胃和肠酸碱度一致的酸或碱条件下可以快速释放酶制剂，有利于饲用α-半乳糖苷酶更好的发挥功效。

Description

包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子及其制备方法

技术领域

本发明涉及的是一种饲料添加剂技术领域的壳聚糖纳米粒子及其制备方法，具体是一种包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子及其制备方法。

背景技术

α-半乳糖苷酶(α-D-galactoside galactohydrolases E.C.3.2.1.22)是我国批准的饲用酶制剂之一。α-半乳糖苷酶来源广泛，具有多种酶基因序列，其活性可分为外切酶活性和内切酶活性两类。α-半乳糖苷酶对热不稳定，同时对重金属离子敏感，在贮藏和饲料制粒过程中容易失活。如对α-半乳糖苷酶进行适当的包埋，可有效提高其热稳定性、贮藏期。我国饲用酶制剂的生产正逐渐由固体发酵生产固体酶粉向液态发酵生产液态酶方向发展。以往的干粉饲用酶微丸化技术不能很好的用于液态酶包埋生产。实现液态酶的包埋需要在水相中，包埋材料能够特异性的包埋溶解状态的酶分子。

壳聚糖(chitosan，CS)由甲壳素脱乙酰基后形成，溶于稀醋酸，可以与三聚磷酸钠、硫酸镁、戊二醛等交联形成纳米颗粒。壳聚糖本身是具有多种生理功能的生物大分子，应用于禽、畜、水产养殖业中表现出良好的促生长性能，有望成为非常理想的绿色饲料添加剂。同时，由于壳聚糖具有良好的生物相容性、无毒且生物可降解等特性，被认为是蛋白类药物的潜在优良载体。壳聚糖在酸性条件下带正电荷，多数酶分子在弱酸性条件下带负电荷。借助正负电荷之间的相互吸引，疏水性的壳聚糖可以包被到亲水的酶分子表面，在交联剂的作用下形成稳定的疏水纳米颗粒。

经过对现有技术的检索发现，现有技术主要以壳聚糖或其该性产物作为药物载体，进行载药微球制备和应用等，粒径范围在纳米级或微米级不等。药物释放特征为缓慢释放或者程序性缓慢释放。以壳聚糖作为载体包埋α-半乳糖苷酶制备复合纳米粒子未见报道，该复合纳米粒子在偏酸性(如pH4.0)或偏碱性(如pH10.0)条件下快速释放α-半乳糖苷酶的特性也未见报道。同时，常用饲用α-半乳糖苷酶的剂型为酶粉或液态酶剂型，具有α-半乳糖苷酶易失活，不耐热，不耐贮存等问题。如果能对其进行适当包被，在不影响酶活条件下，有效保护α-半乳糖苷酶，提高其耐热性、延长储藏期，则会对α-半乳糖苷酶的生产应用大有帮助。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子及其制备方法，有效提高了α-半乳糖苷酶的耐热性，制备所得的包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子在pH＞8或pH＜4下快速释放。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子包括：α-半乳糖苷酶分子和壳聚糖纳米粒子，其中：α-半乳糖苷酶分子被壳聚糖纳米粒子包被于外部，α-半乳糖苷酶分子与壳聚糖纳米粒子相互交联形成壳聚糖笼型结构。

所述的壳聚糖纳米粒子的粒径分布为10～1000nm。

所述的壳聚糖纳米粒子的包封率为：63％～92.8％。

本发明涉及上述包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

第一步、将壳聚糖溶解于醋酸水溶液中，配置成壳聚糖原液。

所述的醋酸水溶液的体积百分比浓度为1％；

所述的壳聚糖原液中壳聚糖的浓度为1～20mg/mL，pH为4.0～6.0，该壳聚糖原液的粘均分子量为50～1800kD(千达尔顿)。

第二步、向壳聚糖原液中加入等体积的α-半乳糖苷酶粗酶液，采用磁力搅拌法混合均匀，制成α-半乳糖苷酶混合液。

所述的α-半乳糖苷酶粗酶液是指：液态或固态发酵生产的含有α-半乳糖苷酶的粗酶液或含有α-半乳糖苷酶的酶粉，经蒸馏水浸提及浓缩后获得的α-半乳糖苷酶粗酶液。

所述的α-半乳糖苷酶粗酶液中总蛋白的浓度为0.1～5mg/mL，其中α-半乳糖苷酶活力为100～5000IU(国际单位)/mL。

第三步、向α-半乳糖苷酶混合液中逐滴加入三聚磷酸钠水溶液，在室温环境下磁力搅拌，制成包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子。

所述的三聚磷酸钠水溶液的用量为α-半乳糖苷酶混合液体积的0.25～2.5倍，该三聚磷酸钠水溶液的浓度为1mg/mL；

所述的室温环境下磁力搅拌时间为30分钟。

本发明通过调节壳聚糖的粘均分子量、pH和投料比来控制包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子的粒径分布、包封率大小，以满足多种需求。例如，可以通过增加壳聚糖粘均分子量得到粒径较大的包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子；通过降低壳聚糖的粘均分子量可以得到粒径较小的包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子；增大α-半乳糖苷酶投料浓度可以提高α-半乳糖苷酶包裹量，但包封率下降；在相同投料比情况下，在pH5.5下制备包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子可以获得较高的包封率，在pH5.0或6.0下获得的包封率较低；包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子在pH3.0或pH10.0可以快速释放α-半乳糖苷酶，10分钟内释放率不低于90％，在中性条件下(pH7.0)10分钟内释放率低于50％。

本发明制备操作简单，以壳聚糖/α-半乳糖苷酶/三聚磷酸钠简单混合即可获得包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子，粒子无粘连，成球性好，表面圆整，在与猪胃和肠酸碱度一致的酸或碱条件下可以快速释放酶制剂，有利于饲用α-半乳糖苷酶更好的发挥功效。

附图说明

图1为实施例1透射电镜照片。

图2为实施例2透射电镜照片。

图3为实施例4透射电镜照片。

图4为实施例1粒径分布图。

图5为实施例2粒径分布图。

图6为实施例4粒径分布图。

图7为实施例包封率的比较示意图。

图8为实施例突释效率的比较示意图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

以下实施例的涉及包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子包括：α-半乳糖苷酶分子和壳聚糖纳米粒子，其中：α-半乳糖苷酶分子被壳聚糖纳米粒子包被于外部，α-半乳糖苷酶分子与壳聚糖纳米粒子相互交联形成壳聚糖笼型结构；其中：所述的壳聚糖纳米粒子可以任选10nm、495nm、1000nm粒径进行实施。

以下实施例的涉及上述包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子的制备方法，具体如下：

实施例1

将50mg壳聚糖(50kd)溶于50mL 1％醋酸溶液中，调节pH到4.0；在磁力搅拌下缓慢加入等体积α-半乳糖苷酶粗酶液(0.1mg/mL)；混合均匀后向α-半乳糖苷酶中逐滴加入25mL三聚磷酸钠溶液(1mg/mL)；室温下搅拌30分钟，α-半乳糖苷酶混合液呈现均匀的蓝白色，即已经形成包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子。α-半乳糖苷酶包封率为63.0％；在pH5.5条件下，60℃温浴30分钟，耐性提高35.5％；在pH5.5条件下，室温贮藏90天，酶活损失6.9％；当pH为3.0的环境下，10分钟内的释放率为93.2％。

实施例2

将1000mg壳聚糖(1800kd)溶于50mL 1％醋酸溶液中，调节pH到6.0；在磁力搅拌下缓慢加入等体积α-半乳糖苷酶粗酶液(5.0mg/mL)；混合均匀后向α-半乳糖苷酶混合液中逐滴加入250mL三聚磷酸钠溶液(1mg/mL)；室温下搅拌30分钟，α-半乳糖苷酶混合液呈现蓝白色并伴有少量絮状沉淀，即已经形成包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子。α-半乳糖苷酶包封率为72.5％；在pH5.5条件下，60℃温浴30分钟，耐性提高50.2％；在pH5.5条件下，室温贮藏90天，酶活损失4.6％；当pH为10.0的环境下10分钟内的释放率为82.4％。

实施例3

将475mg壳聚糖(900kd)溶于50mL 1％醋酸溶液中，调节pH到5.0；在磁力搅拌下缓慢加入等体积α-半乳糖苷酶粗酶液(2.45mg/mL)；混合均匀后向α-半乳糖苷酶混合液中逐滴加入120mL三聚磷酸钠溶液(1mg/mL)；室温下搅拌30分钟，α-半乳糖苷酶混合液呈现均匀的蓝白色，即已经形成包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子。α-半乳糖苷酶包封率为87.3％；在pH5.5条件下，60℃温浴30分钟，耐性提高60.3％；在pH5.5条件下，室温贮藏90天，酶活损失2.7％；当pH为7.0环境下10分钟内释放率为35.2％。

实施例4

将200mg壳聚糖(400kd)溶于50mL 1％醋酸溶液中，调节pH到5.5；在磁力搅拌下缓慢加入等体积α-半乳糖苷酶粗酶液(1.0mg/mL)；混合均匀后向α-半乳糖苷酶混合液中逐滴加入50mL三聚磷酸钠溶液(1mg/mL)；室温下搅拌30分钟，α-半乳糖苷酶混合液呈现均匀的蓝白色，即已经形成包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子。α-半乳糖苷酶包封率为92.8％；在pH5.5条件下，60℃温浴30分钟，耐性提高68.7％；在pH5.5条件下，室温贮藏90天，酶活损失2.4％；当pH为3.0、7.0和10.0的环境下10分钟内的释放率分别为93.7％、41.7％和91.9％。

Claims

1.一种包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子的制备方法，其特征在于：该纳米粒子包括：α-半乳糖苷酶分子和壳聚糖纳米粒子，其中：α-半乳糖苷酶分子被壳聚糖纳米粒子包被于外部，α-半乳糖苷酶分子与壳聚糖纳米粒子相互交联形成壳聚糖笼型结构；

所述的壳聚糖纳米粒子的粒径分布为10～1000nm；

所述的壳聚糖纳米粒子的包封率为63％～92.8％；60℃下热处理30分钟酶耐热性提高35％以上；pH5.5下室温贮藏90天酶活损失低于10％；在pH3.0或pH10.0可以快速释放α-半乳糖苷酶，10分钟内释放率不低于90％，在中性即pH7.0条件下10分钟内释放率低于50％；

所述方法包括以下步骤：

第一步、将壳聚糖溶解于醋酸水溶液中，配制成壳聚糖原液；

第二步、向壳聚糖原液中加入等体积的α-半乳糖苷酶粗酶液，采用磁力搅拌法混合均匀，制成α-半乳糖苷酶混合液；

第三步、向α-半乳糖苷酶混合液中逐滴加入三聚磷酸钠水溶液，在室温环境下磁力搅拌，制成包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子；

所述的壳聚糖原液中壳聚糖的浓度为1～20mg/mL，pH为4.0～6.0，该壳聚糖原液的粘均分子量为50～1800kD；

所述的α-半乳糖苷酶粗酶液中总蛋白的浓度为0.1～5mg/mL，其中α-半乳糖苷酶活力为100～5000IU/mL；

所述的三聚磷酸钠水溶液的用量为α-半乳糖苷酶混合液体积的0.25～2.5倍，该三聚磷酸钠水溶液的浓度为1mg/mL。

2.根据权利要求1所述的包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子的制备方法，其特征是，所述的醋酸水溶液的体积百分比浓度为1％。

3.根据权利要求1所述的包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子的制备方法，其特征是，所述的α-半乳糖苷酶粗酶液是指：液态或固态发酵生产的含有α-半乳糖苷酶的粗酶液或含有α-半乳糖苷酶的酶粉，经蒸馏水浸提及浓缩后获得的α-半乳糖苷酶粗酶液。

4.一种包埋α-半乳糖苷酶的壳聚糖纳米粒子，其特征在于，根据权利要求1-3中任一所述方法制备得到。