CN114829313A - 作为具有pH切换控制释放的核酸载体的生物活性玻璃 - Google Patents

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Abstract

pH可切换载体组合物包含多个生物活性玻璃颗粒，其中，每个生物活性玻璃颗粒任选地至少部分涂覆了表面改性剂；其中，(具有或不具有表面改性剂的)生物活性玻璃颗粒可以在约7至约11的pH范围内接触之后与核酸化合物粘结，并在约5至约6的pH范围内展现出核酸化合物的受控释放。

Description

作为具有pH切换控制释放的核酸载体的生物活性玻璃
相关申请的交叉参考
本申请根据35U.S.C.§119，要求2019年12月9日提交的美国临时申请系列第62/945779号的优先权，本文以其作为基础并将其全文通过引用结合于此。
技术领域
本公开内容涉及用于将核酸传递到细胞中或者微生物中的玻璃组合物。具体来说，本公开内容涉及能够在指定pH环境中捕获和控制核酸释放(leasing)的生物活性玻璃组合物。
背景技术
利用或转移外源核酸进行基因调节或调控应用是新兴市场，尤其是在农业和治疗领域。小干扰RNA(siRNA)调节基因表达的能力具有潜在的治疗应用，但其使用受到低效传递的限制。具体来说，由于核酸的稳定性和细胞摄取效率，外源核酸传递到目标有机物或细胞中仍然是具有挑战性的。因此，存在强烈的需求来开发具有改进的表面性质的新的玻璃组合物，其能够作为核酸载体来强化细胞摄取速率。
发明内容
根据第一个方面，pH可切换的载体组合物包括多个生物活性玻璃颗粒，其中，每个生物活性玻璃颗粒任选地至少部分涂覆了表面改性剂。在某些实施方式中，(具有或不具有表面改性剂的)生物活性玻璃颗粒可以在约7至约11的pH范围内接触之后与核酸化合物粘结，并在约5至约6的pH范围内展现出核酸化合物的受控释放。在某些实施方式中，以氧化物的重量％计，生物活性玻璃颗粒主要包含：约30％至约75％SiO2、约2％至约40％CaO以及约3％至约15％P2O5。在某些实施方式中，包含约75％SiO2、约2％至约40％CaO以及约3％至约15％P2O5的生物活性玻璃颗粒，以氧化物的重量％计，还包含：约0％至约5％B2O3；约0％至约5％Al2O3；约0％至约20％MgO；约0％至约10％ZrO2；约0％至约5％F；以及约0％至约30％R2O，其中，R2O包含约0％至约10％K2O和约0％至约30％Na2O。
在某些实施方式中，以氧化物的重量％计，生物活性玻璃颗粒主要包含：约30％至约70％B2O3、约5％至约25％CaO以及约1％至约10％P2O5。在某些实施方式中，包含约30％至约70％B2O3、约5％至约25％CaO以及约1％至约10％P2O5的生物活性玻璃颗粒，以氧化物的重量％计，还包含：约0％至约5％SiO2；约0％至约15％Al2O3；约0％至约10％MgO；约0％至约10％ZrO2；约0％至约5％F；以及约0％至约20％R2O，其中，R2O包含约0％至约20％K2O和约0％至约10％Na2O。
在某些实施方式中，生物活性玻璃颗粒包括钙磷酸盐玻璃。在某些实施方式中，生物活性玻璃颗粒至少部分涂覆了表面改性剂，以及表面改性剂包括聚阳离子化合物。在某些实施方式中，聚阳离子化合物选自下组：多胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、聚亚烷基亚胺(polyalkylenimine)、壳聚糖、聚烷基氨基烷基甲基丙烯酸酯，及其衍生物，或其任意组合。在某些实施方式中，聚阳离子化合物选自下组：聚亚乙基亚胺、虾壳聚糖、低分子量壳聚糖，及其衍生物。在某些实施方式中，低分子量壳聚糖或者衍生物的分子量是约50kDa至约375kDa。
在某些实施方式中，其中，核酸化合物选自下组：核糖核酸化合物、脱氧核糖核酸化合物，或其衍生物。在某些实施方式中，生物活性玻璃颗粒的粒度是约1μm至约10μm。在某些实施方式中，生物活性玻璃颗粒的粒度是约1μm至约5μm。在某些实施方式中，在中性条件下，未改性的生物活性玻璃颗粒的zeta电势是约-10mV至约-40mV。在某些实施方式中，在中性条件下，表面改性的生物活性玻璃颗粒的zeta电势是约0mV至约-20mV。在某些实施方式中，核酸的浓度范围是载体组合物的总重的约5ng/mg至约10μg/mg。
根据第二个方面，生物活性玻璃颗粒任选地至少部分涂覆了表面改性剂；其中，(具有或不具有表面改性剂的)生物活性玻璃颗粒可以在约7至约11的pH范围内接触之后与核酸化合物粘结，并在约5至约6的pH范围内展现出核酸化合物的受控释放；以及其中，以氧化物的重量％计，生物活性玻璃颗粒主要包含：(a)约30％至约75％SiO2、约2％至约40％CaO以及约3％至约15％P2O5，或者(b)约30％至约70％B2O3、约5％至约25％CaO以及约1％至约10％P2O5。
根据第三个方面，生物活性玻璃载体的制造方法包括：将生物活性玻璃加工成细颗粒；将生物活性玻璃的细颗粒与液体介质混合以形成溶液；在溶液中通过表面改性剂对生物活性玻璃颗粒的表面任选地进行改性，在液体介质中使得生物活性玻璃颗粒与核酸化合物接触以形成混合物(admixture)；在核酸化合物与生物活性玻璃颗粒非共价粘结的条件下对混合物进行培养。在某些实施方式中，方法包括通过用表面改性剂对生物活性玻璃颗粒进行培养来对生物活性玻璃颗粒的表面进行改性。在某些实施方式中，表面改性剂包括聚阳离子化合物。在某些实施方式中，在约为环境温度至约65℃的温度进行表面改性剂对生物活性玻璃颗粒的培养。在某些实施方式中，用表面改性剂对生物活性玻璃颗粒进行培养持续约8至24小时的时间段。
在第三个方面的某些实施方式中，方法还包括：在液体介质中使得表面改性的生物活性玻璃颗粒与核酸化合物接触以形成混合物；以及在核酸化合物与表面改性的生物活性玻璃颗粒非共价粘结的条件下对混合物进行培养。在某些实施方式中，在室温进行核酸对表面改性的生物活性玻璃颗粒的培养。在某些实施方式中，用核酸对表面改性的生物活性玻璃颗粒进行培养持续约15分钟至2小时的时间段。在方法的某些实施方式中，液体介质选自下组：水、醇类或烃类。
在第三个方面的方法的某些实施方式中，以氧化物的重量％计，生物活性玻璃颗粒主要包含：约30％至约75％SiO2、约2％至约40％CaO以及约3％至约15％P2O5。在某些实施方式中，包含约75％SiO2、约2％至约40％CaO以及约3％至约15％P2O5的生物活性玻璃颗粒，以氧化物的重量％计，还包含：约0％至约5％B2O3；约0％至约5％Al2O3；约0％至约20％MgO；约0％至约10％ZrO2；约0％至约5％F；以及约0％至约30％R2O，其中，R2O包含约0％至约10％K2O和约0％至约30％Na2O。
在第三个方面的方法的某些实施方式中，以氧化物的重量％计，生物活性玻璃颗粒主要包含：约30％至约70％B2O3、约5％至约25％CaO以及约1％至约10％P2O5。在某些实施方式中，包含约30％至约70％B2O3、约5％至约25％CaO以及约1％至约10％P2O5的生物活性玻璃颗粒，以氧化物的重量％计，还包含：约0％至约5％SiO2；约0％至约15％Al2O3；约0％至约10％MgO；约0％至约10％ZrO2；约0％至约5％F；以及约0％至约20％R2O，其中，R2O包含约0％至约20％K2O和约0％至约10％Na2O。
根据第四个方面，载剂包括根据第一个方面的pH可切换载体组合物。在某些实施方式中，组合物包括多个生物活性玻璃颗粒，其中，每个生物活性玻璃颗粒任选地至少部分涂覆了表面改性剂。在某些实施方式中，(具有或不具有表面改性剂的)生物活性玻璃颗粒可以在约7至约11的pH范围内接触之后与核酸化合物粘结，并在约5至约6的pH范围内展现出核酸化合物的受控释放。在某些实施方式中，载剂包括：药物传递载剂、基因传递载剂、组织再生载剂、作物治疗或作物保护、免疫调节载体或基因编辑复合载剂。
附图说明
图1显示根据本文所示和所述一个或多个实施方式的生物活性玻璃颗粒的X射线衍射(XRD)图案。
图2显示根据本文所示和所述一个或多个实施方式的示例性生物活性玻璃组合物的粒度分布图。
图3显示根据本文所示和所述一个或多个实施方式的载体组合物和表面改性的生物活性玻璃颗粒的SEM图像。
图4的柱状图显示根据本文所示和所述一个或多个实施方式的生物活性玻璃颗粒的DLS粒度分布。
图5A和5B显示根据本文所示和所述一个或多个实施方式的水性溶液中的生物活性玻璃在4至12的pH范围上的净表面电荷特性。
图6显示根据本文所示和所述一个或多个实施方式的各种生物活性玻璃组合物的DNA载荷和洗脱率。
图7A-7D显示根据本文所示和所述一个或多个实施方式的各种生物活性玻璃组合物通过采用改进
Figure BDA0003685814260000041
钙细胞测试测得的累积钙浓度所得到的溶解动力学。
具体实施方式
下面将详细参考各种实施方式，它们在附图中示出。只要可能，在附图中使用相同的附图标记表示相同或相似的部分。附图中的组件不一定是成比例的，相反地，进行了突出强调来显示示例性实施方式的原理。
如上文所讨论的那样，本文技术大体上涉及用于将所需材料(例如核酸)传递进入到细胞和组织中的玻璃组合物和方法。在各种实施方式中，本文提供的组合物和体系包含可用于将治疗剂传递到植物、动物和昆虫的细胞或组织的生物活性玻璃颗粒及其制造和使用方法。
下文提供本说明书所用的某些术语的定义。除非另有定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语通常具有本文技术所属领域普通技术人员通常所理解的含义。
在本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”，“一种”和“该”包括多个指示物，除非上下文中有明显的表示。因此，例如，提到的“一种”组分包括具有两种或更多种这类组分的方面，除非文本中有另外的明确表示。例如，涉及“一种细胞”包括两种或更多细胞的组合等。此外，用词“或”的使用当没有先行词“任一”时(或者表明“或”是明确表示排除性的其他类似用语，例如，x或y中的仅一个时)，应该解读为包含性的(例如，“x或y”表示x或y中的一个或两个)。通常，本文所用的命名和下述细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学和核酸化学均为本领域熟知和常用的。
术语“和/或”也应解读为包含性的(例如，“x和/或y”表示x或y中的一个或两个)。在“和/或”或者“或”用于一组三个或更多个项目的情形时，应该将组理解为仅包含一个项目，包含全部项目一起，或者项目的任意组合或数量。此外，用于说明书和权利要求书的术语，例如：具有、有、包含了和包括了应解读为与术语包括和包含相同含义。通过“和/或”条款，除了具体指定的元素之外可以任选地存在其他元素，无论它们与具体指定的那些元素是否相关或者无关。作为非限制性例子，涉及“X和/或Y”在一个实施方式中可以指的是仅X(任选地包含除了Y之外的元素)；在一些实施方式中可以指的是仅Y(任选地包含除了X之外的元素)；在一些实施方式中可以指的是X和Y两者(任选地包含其他元素)。
除非另有说明或者上下文存在其他证据，否则如本文所用，涉及数字的术语“约”通常认为包含了在该数字任一方向上(大于或小于)1％、5％或10％范围内的数字(排除了此类数字会小于0％或者超过100％的可能数值的情况)。
除非另有说明，否则如本文所用，术语“粒度”指的是颗粒直径。将粒度表述为例如峰值粒度，这代表了通过动态光散射(DLS)技术得到的颗粒的水动力直径、或者中值粒度或平均粒度。
如本文所用，术语“生物活性玻璃(BAG)”或者“生物上具有活性的玻璃”表示这样的无机玻璃材料，其具有硅的氧化物或者硼的氧化物作为其主要组分并且其能够与所需的生物材料(例如，核酸、细胞和组织)粘结。
如本文所用，术语“可调节”或“可切换”指的是响应环境刺激改变其行为的生物活性玻璃载体。例如，pH可切换载体会证实具有基于pH的可切换行为，其中，载体能够在特定pH与核酸粘结并在另一个pH洗脱核酸。
如本文所用，术语“受控释放”指的是核酸根据预定曲线从纳米颗粒的释放。在一些方面中，所选择的受控释放可以包括在特定pH范围内的核酸化合物的释放。
组成
本公开内容的各种方面和/或实施方式涉及包含生物活性玻璃的组合物。在各种实施方式中，本文提供的是包含生物活性玻璃颗粒的pH可切换载体组合物，其中，载体能够证实具有基于pH的可切换表现行为。载体能够在特定pH与核酸粘结以及在另一pH洗脱核酸。本文公开的组合物展现出优异的生物相容性。玻璃的生物活性特性源自生理条件下玻璃表面上的一系列的复杂物理化学反应。例如，当玻璃暴露于动物或昆虫中的体液时，可能发生阳离子交换，从而来自玻璃表面的阳离子被来自溶液的质子替换。界面pH变得更为碱性并且由于玻璃表面上发生的网络溶解伴随着Ca2+和PO4 3-离子释放进入到溶液中。这促进了形成了透钙磷石(brushite)(CaHPO4·2H2O)，一种已知的生物活性陶瓷，或者形成了羟磷灰石(HCA)，它们能够粘结到界面代谢物、胶原蛋白和糖蛋白。因此，发现了生物活性玻璃的医疗应用，例如用于骨科和牙科领域。本文技术旨在提供具有强化了生物活性的生物活性玻璃。
在一个方面中，本文提供了包含生物活性玻璃颗粒的pH可切换载体组合物，其中，生物活性玻璃颗粒任选地至少部分涂覆了表面改性剂，以及其中，(具有或不具有表面改性剂的)生物活性玻璃颗粒可以在约7至约11的pH范围内接触之后与核酸化合物粘结，并在约5至约6的pH范围内展现出核酸化合物的受控释放。
载体组合物的生物活性玻璃可以由来自硅酸盐和硼酸盐家族的前体玻璃组合物形成，其展现出不同pH环境下的优异的核酸俘获/释放效率。用于该技术的合适的玻璃前体材料包括但不限于如下的氧化物：硅、硼、磷、钾、钠、钙、锂、铝、镁、锆、铷、铯、锶、钡、铬、钛、钨、铁和锌。玻璃可以额外包含卤化物(例如氟化物)。组合物的生物相容性和分解受到生物活性玻璃的组成的影响。在各种实施方式中，生物活性玻璃颗粒可以包括钙磷酸盐玻璃。
在各种实施方式中，用于生物活性玻璃的前体玻璃组合物包含SiO2。当SiO2的含量太低时，玻璃可能具有差的化学耐久性和机械耐久性。另一方面，当SiO2的含量太高时，玻璃的熔化能力下降，因为纯SiO2的熔化温度太高。随着SiO2含量的增加，玻璃的生物活性下降。在某些实施方式中，用于生物活性玻璃的前体玻璃组合物可以包括硅酸盐玻璃，其包含SiO2作为主要的形成玻璃的氧化物。在硅酸盐玻璃的各种实施方式中，存在于前体玻璃组合物中的SiO2的量是约30重量％至约75重量％，例如前体玻璃组合物的总重的约35重量％至约70重量％、约40重量％至约65重量％、约45重量％至约60重量％、约50重量％至约55重量％，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。
在某些实施方式中，硅酸盐玻璃组合物包含约0重量％B2O3至约5重量％B2O3，例如前体玻璃组合物的总重的约0.2重量％至约4.5重量％、约0.5重量％至约4重量％、约1重量％至约3.5重量％、约1.5重量％至约3重量％或者约2重量％至约2.5重量％B2O3，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。
在某些实施方式中，用于生物活性玻璃的前体玻璃组合物可以包括硼酸盐玻璃，其包含B2O3作为主要的形成玻璃的氧化物。硼酸盐玻璃远没有硅酸盐玻璃那么耐用，这使得它对于快速降解具有吸引力。在硼酸盐玻璃的各种实施方式中，存在于前体玻璃组合物中的B2O3的量是约30重量％至约70重量％，例如前体玻璃组合物的总重的约35重量％至约65重量％、约40重量％至约60重量％、约45重量％至约55重量％、约50重量％至约55重量％，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。
在某些实施方式中，硼酸盐玻璃组合物包含约0重量％SiO2至约5重量％SiO2，例如前体玻璃组合物的总重的约0.2重量％至约4.5重量％、约0.5重量％至约4重量％、约1重量％至约3.5重量％、约1.5重量％至约3重量％或者约2重量％至约2.5重量％SiO2，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。
在另一个方面中，提供了生物活性玻璃颗粒，其任选地至少部分涂覆了表面改性剂；其中，(具有或不具有表面改性剂的)生物活性玻璃颗粒可以在约7至约11的pH范围内接触之后与核酸化合物粘结，并在约5至约6的pH范围内展现出核酸化合物的受控释放；以及其中，以氧化物的重量％计，生物活性玻璃颗粒主要包含：(a)约30％至约75％SiO2、约2％至约40％CaO以及约3％至约15％P2O5，或者(b)约30％至约70％B2O3、约5％至约25％CaO以及约1％至约10％P2O5。
在另一个方面中，提供了生物活性玻璃颗粒，其任选地至少部分涂覆了表面改性剂；其中，(具有或不具有表面改性剂的)生物活性玻璃颗粒可以在约7至约11的pH范围内接触之后与核酸化合物粘结，并在约5至约6的pH范围内展现出核酸化合物的受控释放；以及其中，以氧化物的重量％计，生物活性玻璃颗粒主要包含：(a)约30％至约75％SiO2、约2％至约40％CaO以及约3％至约15％P2O5，或者(b)约30％至约70％B2O3、约5％至约25％CaO以及约1％至约10％P2O5。
用于生物活性玻璃的前体玻璃组合物还可以包含P2O5，其起到网络形成剂的作用。此外，磷酸根离子释放到生物活性玻璃的表面对形成Ca-P化合物(例如，透钙磷石或磷灰石)做出贡献。通过生物活性玻璃提供磷酸根离子增加了矿物形成速率以及骨组织的结合能力。此外，P2O5增加了玻璃的粘度，这进而扩大了操作温度范围，并且因而对于制造和形成玻璃是有利的。在各种实施方式中，存在于前体玻璃组合物中的P2O5的量是前体玻璃组合物的总重的约0重量％至约20重量％，包括约1重量％至约10重量％以及约3重量％至约15重量％的P2O5，以前体玻璃组合物的总重计。在某些实施方式中，硅酸盐玻璃组合物包含约3重量％P2O5至约15重量％P2O5，例如前体玻璃组合物的总重的约4重量％至约14重量％、约5重量％至约13重量％、约6重量％至约12重量％、约7重量％至约11重量％、或者约8重量％至约10重量％P2O5，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。在某些实施方式中，硼酸盐玻璃组合物包含约1重量％至约10重量％，例如前体玻璃组合物的总重的约2重量％至约9重量％、约3重量％至约8重量％、约4重量％至约7重量％、或者约5重量％至约6重量％P2O5，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。
用于生物活性玻璃的前体玻璃组合物还可以包含Al2O3和ZrO2，其帮助改善了硼酸盐玻璃中的化学耐久性同时没有毒性问题。在各种实施方式中，存在于用于生物活性玻璃的前体玻璃组合物中的Al2O3的量是前体玻璃组合物的总重的约0重量％至约20重量％，包括约0重量％至约5重量％以及约0.1重量％至约15重量％的Al2O3，以前体玻璃组合物的总重计。在某些实施方式中，硅酸盐玻璃组合物包含约0重量％Al2O3至约5重量％Al2O3，例如前体玻璃组合物的总重的约0.2重量％至约4.5重量％、约0.5重量％至约4重量％、约1重量％至约3.5重量％、约1.5重量％至约3重量％或者约2重量％至约2.5重量％Al2O3，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。在某些实施方式中，硼酸盐玻璃组合物包含约0.1重量％至约15重量％Al2O3，例如前体玻璃组合物的总重的约0.5重量％至约12重量％、约1重量％至约10重量％、约3重量％至约8重量％、或者约5重量％至约7重量％Al2O3，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。
在各种实施方式中，前体玻璃组合物(硅酸盐和硼酸盐这两种情况)中存在的ZrO2的量是约0重量％ZrO2至约10重量％ZrO2(以前体玻璃组合物的总重计)，例如前体玻璃组合物的总重的约2重量％至约9重量％、约3重量％至约8重量％、约4重量％至约7重量％、或者约5重量％至约6重量％ZrO2，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。
用于生物活性玻璃的前体玻璃组合物还可以包含碱性氧化物(Li2O、Na2O、K2O、Rb2O和Cs2O)，其对于实现低熔融温度和低液相线温度起了助剂的作用，并且改善了生物活性。在各种实施方式中，存在于用于生物活性玻璃的前体玻璃组合物中的Na2O的量是前体玻璃组合物的总重的约0重量％至约35重量％，包括约0重量％至约30重量％Na2O以及约0重量％至约10重量％的Na2O，以前体玻璃组合物的总重计。在某些实施方式中，硅酸盐玻璃组合物包含约0重量％Na2O至约30重量％Na2O，例如前体玻璃组合物的总重的约2重量％至约25重量％、约5重量％至约20重量％、约7重量％至约15重量％、约8重量％至约12重量％或者约9重量％至约10重量％Na2O，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。在某些实施方式中，硼酸盐玻璃组合物包含约0重量％Na2O至约10重量％Na2O，例如前体玻璃组合物的总重的约0.5重量％至约9重量％、约1重量％至约8重量％、约2重量％至约7重量％、或者约5重量％至约6重量％Na2O，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。
在各种实施方式中，存在于用于生物活性玻璃的前体玻璃组合物中的K2O的量是前体玻璃组合物的总重的约0重量％至约25重量％，包括约0重量％至约10重量％K2O以及约0重量％至约20重量％的K2O，以前体玻璃组合物的总重计。在某些实施方式中，硅酸盐玻璃组合物包含约0重量％K2O至约10重量％K2O，例如前体玻璃组合物的总重的约0.5重量％至约9重量％、约1重量％至约8重量％、约2重量％至约7重量％、或者约5重量％至约6重量％K2O，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。在某些实施方式中，硼酸盐玻璃组合物包含0重量％K2O至约20重量％K2O，例如前体玻璃组合物的总重的约2重量％至约18重量％、约5重量％至约15重量％、约6重量％至约12重量％、或者约8重量％至约10重量％K2O，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。
在各种实施方式中，用于生物活性玻璃的前体玻璃组合物可以包括二价阳离子氧化物(例如，碱土氧化物)，其改善了玻璃的熔化行为和生物活性。发现当浸入模拟体液(SBF)或者在体内时，CaO能够与P2O5反应形成磷灰石。从玻璃表面释放的Ca2+离子对形成富集了磷酸钙的层起到贡献。在各种实施方式中，存在于用于生物活性玻璃的前体玻璃组合物中的CaO的量是前体玻璃组合物的总重的约0重量％至约50重量％，包括约2重量％至约40重量％以及约5重量％至约25重量％的CaO，以前体玻璃组合物的总重计。在某些实施方式中，硅酸盐玻璃组合物包含约2重量％CaO至约40重量％CaO，例如前体玻璃组合物的总重的约5重量％至约35重量％、约10重量％至约30重量％、约15重量％至约25重量％、或者约18重量％至约22重量％CaO，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。在某些实施方式中，硼酸盐玻璃组合物包含5重量％CaO至约25重量％CaO，例如前体玻璃组合物的总重的约7重量％至约22重量％、约10重量％至约20重量％、约12重量％至约18重量％、或者约15重量％至约18重量％CaO，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。
在各种实施方式中，存在于前体玻璃组合物中的MgO的量是前体玻璃组合物的总重的约0重量％至约25重量％，包括约0重量％至约20重量％以及约0重量％至约10重量％的MgO，以前体玻璃组合物的总重计。在某些实施方式中，硅酸盐玻璃组合物包含约0重量％MgO至约10重量％MgO，例如前体玻璃组合物的总重的约0.5重量％至约9重量％、约1重量％至约8重量％、约2重量％至约7重量％、约3重量％至约6重量％或者约4重量％至约5重量％MgO，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。在某些实施方式中，硼酸盐玻璃组合物包含0重量％MgO至约20重量％MgO，例如前体玻璃组合物的总重的约0.5重量％至约18重量％、约1重量％至约15重量％、约3重量％至约10重量％、或者约5重量％至约8重量％MgO，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。
玻璃组合物还可以任选地包含少量氟化物。在某些实施方式中，前体玻璃组合物(硅酸盐和硼酸盐这两者)包含约0重量％F至约5重量％F，例如前体玻璃组合物的总重的约0.2重量％F至约4.5重量％F、约0.5重量％F至约4重量％F、约1重量％F至约3.5重量％F、约1.5重量％F至约3重量％F或者约2重量％F至约2.5重量％F，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。
在各种实施方式中，以氧化物的重量％计，生物活性玻璃颗粒主要包含：约30％至约75％SiO2、约2％至约40％CaO以及约3％至约15％P2O5。在此类实施方式中，以氧化物的重量％计，生物活性玻璃颗粒还包含：约0％至约5％B2O3；约0％至约5％Al2O3；约0％至约20％MgO；约0％至约10％ZrO2；约0％至约5％F；以及约0％至约30％R2O，其中，R2O包含约0％至约10％K2O和约0％至约30％Na2O。
在各种实施方式中，以氧化物的重量％计，生物活性玻璃颗粒主要包含：约30％至约70％B2O3、约5％至约25％CaO以及约1％至约10％P2O5。在此类实施方式中，以氧化物的重量％计，生物活性玻璃颗粒还包含：约0％至约5％SiO2；约0％至约15％Al2O3；约0％至约10％MgO；约0％至约10％ZrO2；约0％至约5％F；以及约0％至约20％R2O，其中，R2O包含约0％至约20％K2O和约0％至约10％Na2O。
以重量％表示，示例性硅酸盐玻璃组合物可以包含：
30至75％SiO2，
3至15％P2O5，
0至5％B2O3，
0至5％Al2O3，
0至30％Na2O，
0至10％K2O，
0-20％MgO，
2-40％CaO，
0-10％ZrO2，
0-5％F。
以重量％表示，示例性硼酸盐玻璃组合物可以包含：
0至5％SiO2，
30至70％B2O3，
1至10％P2O5，
0.1至15％Al2O3，
0至10％Na2O，
0至20％K2O，
0-10％MgO，
5-25％CaO，
0-10％ZrO2，
0-5％F。
在某些实施方式中，可以通过空气喷射碾磨将生物活性玻璃研磨成1-10μm的细颗粒。采用玻璃料的摩擦研磨或者球磨，粒度会在1-100μm范围内变化。此外，可以采用不同方法(例如，行星球磨或湿法碾磨)将这些玻璃后续加工至亚微米级。复杂组成是可能的，但是通过自下往上工艺(例如，溶胶凝胶成形)不是容易实现的。生产具有精密尺寸控制的生物活性玻璃颗粒的另一种有效方法是采用微反应器，例如康宁先进流反应器。对于工业规模而言，可以在碾磨或研磨之后采用自上往下熔化方案来生产具有所需尺寸的玻璃颗粒，这提供了组成设计的灵活性以及低成本制造。在某些实施方式中，可以采用空气喷射、球磨或研磨将生物活性玻璃研磨成细颗粒。所需尺寸的玻璃颗粒可以就这样使用或者可以被整合到聚合物基质中，这取决于目标应用。
生物活性玻璃颗粒可以在各种pH条件下与核酸化合物粘结。核酸可以涂覆在或者位于生物活性玻璃颗粒的表面上。合适的核酸包括任何核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)，它们可以经过修饰或者未经修饰。在各种实施方式中，核酸包括但不限于：单链或双链RNA，单链或双链DNA，单链和双链区的混合物的RNA，单链和双链区的混合物的DNA，包含DNA和RNA的混合分子(可以是单链的，或者更通常来说是双链的，或者单链和双链区的混合物)。此外，核酸涉及包含RNA或DNA或者它们两者的三链区，含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA，以及出于稳定性或其他原因修饰了主链的DNA或RNA。在一些实施方式中，核酸包括核糖核酸、脱氧核糖核酸，或其衍生物。在一些实施方式中，核酸包括核糖核酸或其衍生物。在其它实施方式中，核酸包括脱氧核糖核酸或其衍生物。在一些实施方式中，核酸包括干扰核糖核酸分子。
在各种实施方式中，生物活性玻璃颗粒至少部分涂覆了表面改性剂。在各种实施方式中，表面改性剂可以包括有助于将核酸传递到细胞的化合物或组合物。例如，表面改性剂可以包括阳离子化合物，这是在生理pH值或其附近带正电荷的具有极性基团的化合物。示例性阳离子化合物包括但不限于：聚阳离子、阳离子脂质、阳离子聚合物或其混合物。在各种实施方式中，表面改性剂包括聚阳离子化合物。要用作表面改性剂的聚阳离子可以是合成聚合物、天然存在的聚合物或者经过化学改性的天然存在的聚合物。聚阳离子合适地在5至11的pH具有多个带正电荷的基团。带电基团可以选自：烷基胺(包括伯胺、仲胺、叔胺和季铵)、亚胺、胍和芳香胺。合适的聚阳离子包括但不限于：多胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、聚亚烷基亚胺、壳聚糖、寡肽、阳离子化多糖、阳离子化植物蛋白或阳离子化动物蛋白、鱼精蛋白、活性树枝聚物、二乙氨基乙基葡聚糖、聚酰氨基胺、聚(β-氨基酯)、氨基多糖聚丙烯亚胺、聚烯丙胺、聚乙烯胺的均聚物或共聚物、聚(乙烯基吡啶)、均聚物或共聚物、聚(甲基)丙烯酸酯的均聚物或共聚物、聚(甲基)丙烯酰胺的均聚物或共聚物，及其衍生物，包括肽和蛋白质片段或其组合的阳离子化合物，或其组合。优选n的例子是：聚乙烯亚胺(PEI)、溴化六菊酯(Hexadimethrine bromide)(可以以商品名polybrene购得)、聚六亚甲基胍(PHMG)、聚六亚甲基双胍、聚烯丙胺、胍基化聚(烯丙胺)、聚氨基丙基甲基丙烯酰胺、聚-[N-(3-胍丙基)甲基丙烯酰胺]、聚氨基乙基(甲基)丙烯酸酯、聚二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(PDMAEMA)。在各种实施方式中，聚阳离子化合物选自下组：多胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、聚亚烷基亚胺(polyalkylenimine)、壳聚糖、聚烷基氨基烷基甲基丙烯酸酯，及其衍生物，或其任意组合。壳聚糖可以包括低分子量壳聚糖、高分子量壳聚糖或从甲壳动物壳(例如，虾)获得的壳聚糖。在各种实施方式中，聚阳离子包括聚亚乙基亚胺(PEI)。在各种实施方式中，聚阳离子包括低分子量壳聚糖。在各种实施方式中，聚阳离子包括虾壳聚糖。在各种实施方式中，聚阳离子化合物选自下组：聚亚乙基亚胺、虾壳聚糖、低分子量壳聚糖，及其衍生物。
聚阳离子可以是支链和/或直链。例如，在PEI的情况下，直链聚亚乙基亚胺含有所有仲胺，这不同于含有伯氨、仲氨和叔氨基团的支链PEI。推测这些化合物有助于将核酸传递到细胞中，因为它们能够中和核酸的电荷。对于某些应用，在碱性条件下维持净的阳离子电荷。作为结果，核酸保持与聚阳离子的结合，这提供了一些保护免受核酸酶降解(已知聚阳离子/核酸络合物相比于未络合形式展现出更好的稳定性)。聚阳离子可以含有一种或多种类型的含有不同pKa值的氨基基团。聚阳离子可以是均聚物或共聚物。当带正电荷的聚合物是共聚物时，对要与包含带电荷氨基基团的单体共聚化的共聚单体进行选择从而维持共聚物足够的水溶解性水平。其他水溶性聚阳离子可以选自壳聚糖及其衍生物，例如：三甲基壳聚糖、胍基化(guanidilated)壳聚糖、阳离子化多糖(例如DEAE葡聚糖)乙基阳离子化植物蛋白或阳离子化动物蛋白。
在各种实施方式中，低分子量壳聚糖或衍生物的分子量是约50kDa至约375kDa，包括但不限于：约75kDa至约350kDa，约100kDa至约300kDa，约150kDa至约250kDa，或者约180kDa至约220kDa，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。
验证负载到载体上的核酸的容量和能力的关键性质是表面电荷和表面积。可以通过zeta电势测量直接确定表面电荷。载体表面上的正电荷越多，则俘获核酸的负电荷的潜力越高。另一方面，核酸俘获和释放必须是可控和可逆的。承载的核酸应该在传递到目标的同时进行释放。已经细胞内的pH值相比于体液而言略微酸性。因此，对于核酸释放，要求酸性溶液中的载体的负表面电荷。可以采用生物活性玻璃颗粒表面的zeta电势的变化来对核酸粘结在表面上或者生物活性玻璃颗粒的表面上的表面改性剂上进行研究。zeta电势的变化表明配体粘结到生物活性玻璃颗粒的表面或者粘结到表面改性剂。zeta电势是生物活性玻璃颗粒上的表面电荷测量，并且可能对于各种pH条件下的颗粒稳定性具有影响。在各种实施方式中，未改性生物活性玻璃颗粒的zeta电势在中性条件下是约-10mV至约-40mV，包括：约-10mV至约0mV，-5mV至约0mV，约0mV至约10mV，0mV至约20mV，约0mV至约30mV，约0mV至约40mV，约-10mV至约10mV，-10mV至约20mV，约-10mV至约30mV，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。在各种实施方式中，表面改性的生物活性玻璃颗粒的zeta电势在中性条件下是约0mV至约-20mV，包括：约0mV至约-5mV，0mV至约-10mV，约0mV至约-15mV，约0mV至约-18mV，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。
可以通过改变粒度使得生物活性玻璃颗粒的表面积发生变化。组合物的生物活性玻璃颗粒具有窄的粒度分布和优化的水力直径。窄的粒度范围对应于更为均匀的粒度分布。生物活性玻璃颗粒具有小于约100μm的5粒度，例如：小于约90μm，小于约80μm，小于约70μm，小于约60μm，小于约50μm，小于约40μm，小于约30μm，小于约20μm，小于约10μm，或者小于约5μm。生物活性玻璃颗粒的5粒度的范围可以是约1μm至约100μm，例如：约5μm至约90μm，约10μm至约80μm，约20μm至约70μm，约30μm至约60μm，或者约40μm至约50μm，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。在各种实施方式中，生物活性玻璃颗粒的5粒度范围是约1μm至约10μm。在各种实施方式中，生物活性玻璃颗粒的粒度范围是约1μm至约5μm。
(具有或不具有表面改性的)生物活性玻璃颗粒展现出增强的负载到颗粒表面上的核酸的容量。因此，核酸负载要高得多且与数种应用是相容的。在各种实施方式中，负载到生物活性玻璃颗粒上的核酸的浓度范围是载体组合物的总重的约5ng/mg至约10μg/mg，包括：约10ng/mg至约5μg/mg，约100ng/mg至约1μg/mg，约1μg/mg至约10μg/mg，约2μg/mg至约9μg/mg，约3μg/mg至约8μg/mg，约4μg/mg至约7μg/mg，或者约5μg/mg至约6μg/mg，约10ng/mg至约1μg/mg，约20ng/mg至约500ng/mg，约30ng/mg至约100ng/mg，约40ng/mg至约80ng/mg，约50ng/mg至约60ng/mg，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。在某些实施方式中，核酸的浓度范围是载体组合物的总重的约5ng/mg至约10μg/mg。在某些实施方式中，核酸的浓度范围是载体组合物的总重的约100ng/mg至约10μg/mg。在某些实施方式中，核酸的浓度范围是载体组合物的总重的约5ng/mg至约100ng/mg。
在各种实施方式中，通过模拟典型RNAi片段长度的约200bp的人工DNA替代物证实了核酸捕获和释放的能力。没有改性剂的玻璃组合物的载荷对于许多应用可能会是足够的，但是表面改性剂可以在中性条件下有效地增强核酸负载能力(图6，DNA载荷)。俘获的DNA可以在略微酸性缓冲体系中定量化释放，具有明显更短的洗脱时间(例如，30分钟或更短的洗脱时间)。这证实了具有或不具有改性剂的组合物用于核酸传输和传递到目标的潜力。
载体组合物的另一个优点在于玻璃颗粒甚至在没有被细胞摄取的情况下自然发生最终分解。可以通过溶液中的Ca离子浓度来追踪载体颗粒的分解速率(图7，Ca痕迹)，其证实了玻璃颗粒在最初24小时内快速释放Ca离子，然后随时间进行缓慢但是稳定的分解。颗粒最终会完全自然分解，并且所有组分对于环境都是无毒的。
虽然本文相对于核酸对实施方式进行了描述，但是生物活性玻璃颗粒可用于其他合适的治疗剂或药物的载体，所述治疗剂或药物可以包括用于治疗或预防任何特定疾病或紊乱或调节人类或动物受试者生理状况的任何化合物或物质。在一些实施方式中，治疗剂可以包括：抗生素、抗真菌剂、肽、蛋白质、聚合物，或其组合。在一些实施方式中，生物活性玻璃颗粒除了核酸以外可以包含其他治疗剂。合适的核酸和治疗剂可以选自下组：基因、shRNA、siRNA、微RNA、DNA片段、RNA片段、质粒，及其组合。
方法
可以使用各种方法来生产本文所述的生物活性玻璃颗粒和载体组合物。例如，可以首先通过如下方法生产生物活性玻璃，其包括：在合适的熔化设备中，使得前体玻璃的批料在合适的温度熔化持续足以使得前体玻璃的批料发生熔化的时间段；在合适的温度对玻璃进行退火；浇注熔融玻璃；以及将玻璃冷却到室温。本文公开了合适的前体玻璃。
取决于组成，前体玻璃可以在合适的设备(例如，覆盖了铂的坩埚)中在约1000至约1600℃的温度范围熔化，优选约1100至约1500℃的温度范围，更优选约1150℃至约1450℃的温度范围，持续足以使得玻璃熔化的时间，例如约60分钟至约24小时，包括：约90分钟至约20小时，约2小时至约18小时，约5小时至约16小时，或者约8小时至约12小时，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。在熔化和澄清之后，可以倾倒玻璃并在约350℃至约550℃的温度(例如，约400℃至约500℃)进行退火。然后，可以将经退火的玻璃浇注到合适的模具中，之后使所得到的材料以炉速率自然冷却。采用本领域已知的方法(例如，碾磨和研磨)对由此形成的玻璃材料进行尺寸调节至合适的粒度。
本文技术的方面涉及生物活性玻璃载体的制造方法。在各种实施方式中，方法包括：将生物活性玻璃加工成细颗粒；将生物活性玻璃的细颗粒与液体介质混合以形成溶液；在溶液中通过表面改性剂对生物活性玻璃颗粒的表面任选地进行改性，在液体介质中使得生物活性玻璃颗粒与核酸化合物接触以形成混合物；以及在核酸化合物与生物活性玻璃颗粒非共价粘结的条件下对混合物进行培养。
在某些实施方式中，可以通过用表面改性剂对生物活性玻璃颗粒进行培养来对生物活性玻璃颗粒的表面进行改性。例如，可以通过如下方式进行玻璃颗粒上的表面改性：表面改性剂(例如，聚阳离子聚合物(例如，壳聚糖或聚亚乙基亚胺))与玻璃颗粒的混合。然后，可以在提升的温度下，通过温和振荡对掺混化合物进行培养，持续一段时间以形成涂层。最后，经过涂覆的表面改性的生物活性玻璃颗粒进行适当清洗以去除过量聚合物和确保没有来自聚合物团聚颗粒的干扰。在各种实施方式中，在约为环境温度至约65℃的温度通过表面改性剂对生物活性玻璃颗粒进行培养，包括但不限于：约20℃至65℃，约30℃至65℃，约35℃至65℃，约40℃至65℃，或者约50℃至65℃，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。在各种实施方式中，通过表面改性剂对生物活性玻璃颗粒进行培养进行约8至24小时的时间段，包括但不限于：约9小时至约22小时，约10小时至约20小时，约12小时至约18小时，或者约15小时至约16小时，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。
在各种实施方式中，方法还包括：在液体介质中使得表面改性的生物活性玻璃颗粒与核酸化合物接触以形成混合物；以及在核酸化合物与表面改性的生物活性玻璃颗粒非共价粘结的条件下对混合物进行培养。在各种实施方式中，在室温进行核酸对表面改性的生物活性玻璃颗粒的培养。在各种实施方式中，通过核酸对生物活性玻璃颗粒进行培养进行约15分钟至2小时的时间段，包括但不限于：约20分钟至约100分钟，约30分钟至约80分钟，约40分钟至约60分钟，或者约45分钟至约55分钟，或者包括这些值中的任意两个和/或这些值中的任意两个之间的任意范围。在各种实施方式中，可以在合适的液体介质(例如，水、醇类或烃类)中进行将核酸涂覆到生物活性玻璃颗粒的表面上。
本文技术的另一个方面涉及包含本文所述的pH可切换的载体组合物的载剂。载剂可以包括：药物传递载剂、基因传递载剂、组织再生载剂、作物治疗或作物保护、免疫调节载剂或基因编辑复合载剂。载剂可以用于将本文所述的生物活性玻璃颗粒和载体化合物传递到各种类型的细胞。根据本文技术，任何类型的易于传递核酸的细胞类型都可以用作传输的目标。例子包括但不限于：昆虫细胞、动物细胞和胚胎、真菌、鱼类、酵母和植物细胞。稳定的水性悬液可用作用于控制害虫的植物检疫组合物的一部分。例如，稳定的悬液可以用于保护作物免受昆虫影响，在这种情况下，核酸是杀虫双链RNA。采用干扰核糖核酸(RNA)分子，组合物和悬液可以用于预防和/或控制植物的虫害侵扰。本文技术的含有用于局部应用的干扰RNA分子的组合物和组合，例如杀虫剂的形式。
为了传递到动物细胞，载体组合物可以通过静脉注射、肌肉注射或腹腔注射来递送，以提供全身(并且在肌肉注射或腹腔注射时可能是局部)的抗炎作用。这些作用可以是治疗性的和/或预防性的。在一个实施方式中，颗粒是局部输送，例如通过吸入、通过喷雾(以气溶胶的形式)或者通过将颗粒与凝胶(例如，生物相容性水凝胶)、乳膏或其他水性或非水性载体混合，并在稍后要进行手术的部位皮下施用或注射组合物。组合物可以有利地包含其他载体和添加剂。为了传递到植物细胞，可以采用本领域已知的各种方法递送载体组合物，例如通过喷洒、滴灌或灌溉。本文技术的方面涉及保护作物免受虫害影响的方法，该方法包括将包含本文所述的生物活性玻璃颗粒的载体组合物递送到作物。在各种实施方式中，方法包括保护作物免受半翅目、鞘翅目、蚤目、二翅目、鳞翅目、直翅目和双翅目的影响。在此类方法中，组合物中的核酸可以包括杀虫双链核糖核酸。本文技术的另一个方面涉及用于下调害虫物种中目标基因的表达以防止和/或控制虫害侵染的方法，其包括使得所述虫害物种与有效量的本文所述的载体组合物接触，所述载体组合物包含至少一种干扰核糖核酸(RNA)。合适的干扰RNA是本领域已知的。
对本领域的技术人员而言，显而易见的是可以在不背离所要求保护的主题的精神或范围的情况下作出各种修改和变动。因此，除了所附权利要求书及其等价形式外，所要求保护的主题不受限制。
实施例
下面将通过以下实施例来进一步阐明各种实施方式，其并不旨在以任意方式限制本本公开内容。
实施例1：生物活性玻璃组合物的制备
本文所述的示例性生物活性玻璃是硅酸盐或硼酸盐玻璃，其包括的基础组合物包含表1所列出构成组分，以氧化物的重量％计。
表1
Figure BDA0003685814260000191
采用表1所列出的原材料批料，在铂坩埚中制造玻璃。将含有配制的原材料批料的每个坩埚放入经过预加热的炉中，并且在1100-1500℃熔化持续16小时。对玻璃进行澄清以产生熔融前体玻璃，然后将其浇注成7x 11英寸的块状前体玻璃，在400-500℃的温度范围进行退火，如表中所记录的那样。采用空气喷射和球磨对玻璃进行碾碎。图2显示BAG#8(876EKH)在空气喷射和球磨加工之后的粒度分布。额外的球磨可以将D50从(空气喷射碾磨之后的)2.6μm降低至0.9μm。
通过本领域技术人员已知的X射线衍射(XRD)分析技术，利用此类市售可得仪器例如美国马萨诸塞州布鲁克公司(Bruker Corporation,Massachusetts,United States)制造的Bruker D4 Endeavor衍射仪，来确定晶相集合的晶相和/或晶相的晶体尺寸的特性。通常从10至40度的2θ获得光谱。对玻璃进行XRD分析，以及表2显示了所获得的结果。图1显示玻璃粉末在0.02M KH2PO4溶液中浸入14天之后的XRD图案。形成透钙磷石(CaHPO4·2H2O)表明这些玻璃组合物的优秀的生物相容性。在UV和UY(BAG#5和BAG#6)样品中观察到相比于HFK或EKH(BAG#7和BAG#8)更高的结晶度，这表明成形剂更好的生物活性。
表2
原子％ 仅BAG PEI 壳聚糖，虾壳 壳聚糖，低MW
Si 19.55 11.51 10.86 6.02
P 3.04 1.94 – –
Na 0.48 – – 0.25
K 0.71 – 0.29 –
Ca 6.41 4.20 1.07 0.67
O 69.80 45.69 48.43 35.62
C – 36.66 39.35 57.45
实施例2：生物活性玻璃组合物的表面改性和表征
在1.5mL微管中添加100mg根据实施例1的工艺制备的生物活性玻璃(BAG)，并将1mL水和混合物涡流混合，同时等分。制备三组PEI(聚亚乙基亚胺，AL-408727-100ML，支链，～MW 25,000)溶液。将100mg的每个PEI溶液转移到1.5mL微管，向其添加0.8mL水。所得到的溶液在65℃干浴中温暖10分钟。类似地，制备三组低MW壳聚糖(AL-448869-50G，低MW，碱脱乙酰化预处理)溶液。将10mg的每种壳聚糖粉末转移到1.5mL微管，向其添加0.8mL的0.3％乙酸(30μL HOAc/10mL水)。溶液涡流搅拌1分钟。最后，制备三组虾壳壳聚糖(AL-417963-25G，来自虾壳，碱脱乙酰化预处理)溶液，10mg的每份壳聚糖颗粒转移到1.5mL微管，向其添加0.8mL的0.3％乙酸(30μL HOAc/10mL水)。溶液涡流搅拌1分钟。
将200μL的BAG良好悬浮的溶液与800μL的水、制备得到的PEI以及制备得到的低MW和虾壳聚糖溶液结合，在65℃干浴上培养20小时。混合物通过15000rpm的超速离心纯化5分钟。丢弃上清液，以及用400μL水清洗残留物并在15000rpm离心5分钟。纯化步骤重复两次。
表面改性的BAG颗粒溶液重新悬浮在800μL水中。收集两组等分样本，一组用于分析，以及一组用于DNA结合评估。分析组在室温下维持没有溶液直到进行分析。
通过扫描电子显微镜(SEM，JEOL JSM-6500F，EDS检测器)检查具有/不具有改性剂的生物活性玻璃的化学组成、大致粒度和形貌。图3显示SEM图像。粒度测量还通过基于布朗运动的动态光散射(Malvern Zetasizer Nano ZS)进行检查以及通过和Z-平均粒径进行估计(图4)。观察到表面改性玻璃颗粒的尺寸略大于原始颗粒，并且通过SEM-EDX半定量分析验证了玻璃颗粒表面上的改性剂。
通过在各种pH值测量zeta电势(Malvern Zetasizer Nano ZS)检查表面电荷测量。采用用稀HCl或KOH调节至pH水平的0.01M KCl制备pH溶液。样品超声混合，然后将35μL样品添加到950mL的pH溶液并混合。将其放入马尔文一次性折叠式毛细管单元中进行测试。RI值是1.540。图5显示在pH 4、pH 8和pH 12的生物活性玻璃的zeta电势的表面电荷(H2O中未改性(5A)和涂覆了壳聚糖(5B))。在附图中，RT表示室温下预浸泡在水中，而SS表示源自虾壳的壳聚糖。观察到对于未改性的BAG样品，对于BAG#7，zeta电势随着pH的增加而增加，而对于所有其他测试的BAG样品，其是下降的。对于用虾壳壳聚糖进行改性的BAG样品，观察到类似趋势，但是变化没有未改性颗粒那么明显。通过zeta电位对表面电荷的观察可以部分回答来自BAG表面的核酸的结合-释放机制。来自生物活性玻璃颗粒的暴露阳离子也对核酸结合-释放现象具有贡献作用，特别是当变化电荷呈现负电荷并且载体组合物仍然能够俘获核酸的负电荷时。
实施例3：生物活性玻璃组合物的DNA改性
在表面改性之前等分的BAG浓度是20mg/300μL H2O。在表面改性之后的BAG浓度是10mg/300μL，以及对于下文的每种制备，DNA浓度是100ng/10μL。
将DNA溶液添加到每个BAG溶液并涡流搅拌良好混合，然后在室温下，在装配有平缓振荡器(300rpm)的微管中培养30分钟。样品以14000rpm离心5分钟得到10μL上清液样品，用于Qubit-HS-dsDNA试验进行DNA定量分析。如果Qubit读数表明BAG表面没有被DNA所饱和，则再一次添加100ng/10μL DNA，并且溶液涡流搅拌和再次培养30分钟。这个DNA的添加和定量分析的过程重复数次来评估DNA载荷。
实施例4：生物活性玻璃组合物的DNA洗脱
表面改性或未改性的BAG离心以去除所有的上清液留下DNA定量分析。300μL的50mM的pH为5.4的磷酸盐缓冲液(170mM离子强度)添加到BAG溶液进行洗脱。溶液通过涡流搅拌再次悬浮，采用平缓振动器(300rpm)在室温培养30分钟。溶液以14000rpm离心5分钟去除所有的上清液，用于Qubit-HS-dsDNA试验进行DNA定量分析(10μL样品进行试验)。
DNA改性和DNA洗脱结果如图6所示，其证实了(具有或不具有表面改性剂的)BAG组合物用于核酸传递和递送到目标中的潜力。具体来说，观察到表面改性剂可以增强中性条件下核酸负载效率的能力，并且捕获的DNA可以在略酸性缓冲体系中在30分钟或更短的洗脱时间内定量释放。
实施例5：溶解度测试过程
将20mg BAG(#5、#6#7和#8)以及0.2mL水或0.2mL磷酸盐缓冲液添加到1.5mL的微管中并涡流搅拌混合。混合物在35℃的干浴上加热进行时间追踪。溶液在离心之前涡流搅拌混合。混合物以14000rpm离心持续5分钟。在离心之后，从一组去除上清液并在检查之后用新鲜水或缓冲液替换。对于另一组，取样15μL进行pH测试，以及在检查之后重新填充15μL新鲜水或缓冲液。
实施例6：钙单元测试
通过Merck
Figure BDA0003685814260000221
钙单元测试，在不同时间点通过UV检测对钙浓度进行量化。从单元中等分400μL缓冲溶液至10个微管，并向每个微管中添加100μL的试剂Ca-1K以及100μL的BAG样品。对于标准和样品，pH值约为7。在等待3分钟之后，向每个微管添加50μL的试剂Ca-2K。使用NanoDrop Microvolume分光光度计(2μL样品)来测量1小时内的钙浓度变化。结果如图7所示，其证实了玻璃颗粒在最初24小时内快速释放Ca离子，然后随时间缓慢但是稳定分解。
实施例7：生物活性玻璃组合物的RNA改性
重复实施例3的过程，不同之处在于用RNA替代了DNA。将RNA装载到未改性以及表面改性的BAG颗粒上，并对RNA改性和RNA洗脱结果进行研究。
采用RNA代替DNA进行上面所有实施例。
除非另有明确说明，否则本文所述的任何方法不应理解为其步骤需要按具体顺序进行，或者要求使任何设备具有特定取向。因此，如果方法权利要求没有实际叙述其步骤要遵循的顺序，或者任何设备权利要求没有实际叙述各组件的顺序或取向，或者权利要求书或说明书中没有另外具体陈述步骤限于具体顺序，或者没有叙述设备组件的具体顺序或取向，那么在任何方面都不应推断顺序或取向。这同样适用于任何可能的未明确表述的解释依据，包括：关于设置步骤、操作流程、组件顺序或组件取向的逻辑；由语法结构或标点获得的一般含义；以及说明书所述的实施方式的数量或种类。
将所有揭示的范围理解为包含并提供对陈述了任何和所有子范围或由每个范围所包含的任何和所有单个值的权利要求的支持。例如，应该将陈述的1至10的范围视作包含并提供对陈述了介于和/或包含最小值1和最大值10之间的任何和所有子范围或个别值的支持；也就是说，所有的子范围开始于最小值1或更大和终止于最大值10或更小(例如，5.5至10，2.34至3.56等)，或者1至10的任意值(例如，3、5.8、9.9994等)。任何列出的范围都可以容易地被识别为充分描述并允许将同一范围至少被分解成对半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性例子，本文所讨论的每个范围可以容易地分解成靠下的三分之一、中间的三分之一和靠上的三分之一等。本领域技术人员还会理解的是，所有的语言，例如“最高至”、“至少”、“大于”、“小于”等包括了所陈述的数字，并且涉及可以后续分解成上文所讨论的子范围的范围。最后，本领域技术人员会理解的是，范围包括了每个单独成员。因此，例如，具有1-3层的组指的是具有1层、2层或3层的组。类似地，具有1-5层的组指的是具有1层、2层、3层、4层或5层的组，以此类推。
附图应解读为显示了以成比例绘制的一个或多个实施方式和/或没有成比例绘制的一个或多个实施方式。这意味着，附图可以解读为，例如，显示了如下情况：(a)所有都成比例绘制；(b)任意东西都没有成比例绘制；或者(c)一个或多个特征成比例绘制以及一个或多个特征没有成比例绘制。因此，附图可以用于提供对于单独或相对于彼此叙述的任何所示特征的尺寸，比例和/或其他尺寸的支持。此外，所有此类尺寸、比例和/或其他尺度理解为在任一方向上从0-100％变化，因此为陈述了此类值的权利要求或者可由此类值形成的任何和所有范围或子范围提供支持。
权利要求中所陈述的术语应当通过参考广泛使用的一般词典和/或相关技术词典中的相关条目，本领域技术人员通常理解的含义等来确定它们的普通和惯用含义，并且要理解的是，权利要求书的术语具有这些来源中的任何一个或其组合所赋予的最广泛的含义(例如，两个或多个相关的词典条目应该被组合以提供条目组合的最广泛含义等)，仅受以下例外的约束：(a)如果一个术语的使用方式比其普通和习惯含义更广泛，则该术语应赋予其普通和习惯含义加上额外的扩展含义，或(b)如果术语已明确定义通过如下方式进行了陈述具有不同含义，所述术语是如本文件中使用的术语应该表示或类似语言(例如，“这个术语的意思是”，“这个术语定义为”、“出于本公开内容的目的，这个术语应该表示”等)。对具体例子的引用，使用“即”，使用用语“本文技术”等并不意味着引用例外(b)或以其他方式限制所述权利要求术语的范围。除了适用例外情况(b)的情况外，本文件中所含的任何内容均不应视为放弃权利要求或对权利要求范围的否认。
除非另外定义，否则，本文中所使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)都具有本文技术所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。还会理解的是，术语(例如常用字典中定义的那些)应当理解为与其在本申请和相关领域中的定义一致，并且除非本文中有另外的定义，否则不应理解为理想化或者完全形式化的含义。虽然下文没有明确定义，但是此类术语应该根据它们的常用含义进行解读。
另外，对于按照马库什群(Markush group)描述本公开内容的特征或方面的情况，本领域技术人员将会认识到，本公开内容还可由此按照所述马库什群中的任意单独成员或者成员的子群描述。
除非上下文另有明确表述，否则旨在认为本文所述的本文技术的各种特征可以以任意组合使用。此外，在一些实施方式中，本公开内容还考虑了可以排除或者省略本文所述的任意特征或者特征组合。解释来说，如果说明书陈述了联合体包括组分A、B和C，那么它具体地旨在认为A、B或C中的任意或其组合可以被省略或者单独放弃或其任意组合。
除非另有明显说明，否则所有具体的实施方式、特征和术语旨在同时包括所陈述的实施方式、特征或术语及其生物等价性质。
本文所涉及或者引用的所有专利、专利申请、临时申请和公开物它们的全文都通过引用结合如本文，包括所有的附图和表格，所结合的程度是它们没有与本说明书的教导不一致。

Claims (32)

1.一种pH可切换载体组合物，其包含：
多个生物活性玻璃颗粒，其中，每个生物活性玻璃颗粒任选地至少部分涂覆了表面改性剂；
其中，具有或不具有表面改性剂的生物活性玻璃颗粒能够在约7至约11的pH范围内接触之后与核酸化合物粘结，并在约5至约6的pH范围内展现出核酸化合物的受控释放。
2.如权利要求1所述的pH可切换载体组合物，其中，以氧化物的重量％计，生物活性玻璃颗粒主要包含：约30％至约75％SiO2、约2％至约40％CaO以及约3％至约15％P2O5。
3.如权利要求1所述的pH可切换载体组合物，其中，以氧化物的重量％计，生物活性玻璃颗粒主要包含：约30％至约70％B2O3、约5％至约25％CaO以及约1％至约10％P2O5。
4.如权利要求2所述的pH可切换载体组合物，其中，以氧化物的重量％计，生物活性玻璃颗粒还包含：
约0％至约5％B2O3；
约0％至约5％Al2O3；
约0％至约20％MgO；
约0％至约10％ZrO2；
约0％至约5％F；以及
约0％至约30％R2O，其中，R2O包括约0％至约10％K2O和约0％至约30％Na2O。
5.如权利要求3所述的pH可切换载体组合物，其中，以氧化物的重量％计，生物活性玻璃颗粒还包含：
约0％至约5％SiO2；
约0％至约15％Al2O3；
约0％至约10％MgO；
约0％至约10％ZrO2；
约0％至约5％F；以及
约0％至约20％R2O，其中，R2O包括约0％至约20％K2O和约0％至约10％Na2O。
6.如权利要求1所述的pH可切换载体组合物，其中，生物活性玻璃颗粒包括磷酸钙盐玻璃。
7.如权利要求3所述的pH可切换载体组合物，其中，生物活性玻璃颗粒至少部分涂覆了表面改性剂，以及表面改性剂包括聚阳离子化合物。
8.如权利要求7所述的pH可切换载体组合物，其中，聚阳离子化合物选自下组：多胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、聚亚烷基亚胺、壳聚糖、聚烷基氨基烷基甲基丙烯酸酯，及其衍生物，或其任意组合。
9.如权利要求8所述的pH可切换载体组合物，其中，聚阳离子化合物选自下组：聚亚乙基亚胺、虾壳聚糖、低分子量壳聚糖，及其衍生物。
10.如权利要求9所述的pH可切换载体组合物，其中，低分子量壳聚糖或者衍生物的分子量是约50kDa至约375kDa。
11.如权利要求1所述的pH可切换载体组合物，其中，核酸化合物选自下组：核糖核酸化合物、脱氧核糖核酸化合物，或其衍生物。
12.如权利要求1所述的pH可切换载体化合物，其中，生物活性玻璃颗粒具有约1μm至约10μm的粒度。
13.如权利要求12所述的pH可切换载体化合物，其中，生物活性玻璃颗粒具有约1μm至约5μm的粒度。
14.如权利要求1-11中任一项所述的pH可切换载体化合物，其中，未改性的生物活性玻璃颗粒在中性条件下的zeta电势是约-10mV至约-40mV。
15.如权利要求1所述的pH可切换载体化合物，其中，表面改性的生物活性玻璃颗粒在中性条件下的zeta电势是约0mV至约-20mV。
16.如权利要求1所述的pH可切换载体化合物，其中，核酸的浓度范围是载体组合物的总重的约5ng/mg至约10μg/mg。
17.一种生物活性玻璃颗粒，其任选地至少部分涂覆了表面改性剂；
其中，具有或不具有表面改性剂的生物活性玻璃颗粒能够在约7至约11的pH范围内接触之后与核酸化合物粘结，并在约5至约6的pH范围内展现出核酸化合物的受控释放；以及
其中，以氧化物的重量％计，生物活性玻璃颗粒主要包含：
(a)约30％至约75％SiO2、约2％至约40％CaO以及约3％至约15％P2O5；或者
(b)约30％至约70％B2O3、约5％至约25％CaO以及约1％至约10％P2O5。
18.一种制造生物活性玻璃载体的方法，其包括：
将生物活性玻璃加工成细颗粒；
生物活性玻璃的细颗粒与液体介质混合以形成溶液；
在溶液中用表面改性剂对生物活性玻璃颗粒的表面任选地进行改性，
在液体介质中使得生物活性玻璃颗粒与核酸化合物接触以形成混合物；以及
在核酸化合物与生物活性玻璃颗粒非共价粘结的条件下对混合物进行培养。
19.如权利要求18所述的方法，其包括通过用表面改性剂对生物活性玻璃颗粒进行培养来对生物活性玻璃颗粒的表面进行改性。
20.如权利要求18所述的方法，其中，表面改性剂包括聚阳离子化合物。
21.如权利要求18所述的方法，其中，在约为环境温度至约65℃的温度进行表面改性剂对生物活性玻璃颗粒的培养。
22.如权利要求18所述的方法，其中，用表面改性剂对生物活性玻璃颗粒进行培养持续约8至24小时的时间段。
23.如权利要求18所述的方法，其还包括：
在液体介质中使得表面改性的生物活性玻璃颗粒与核酸化合物接触以形成混合物；以及
在核酸化合物与表面改性的生物活性玻璃颗粒非共价粘结的条件下对混合物进行培养。
24.如权利要求23所述的方法，其中，在室温进行核酸对表面改性的生物活性玻璃颗粒的培养。
25.如权利要求23所述的方法，其中，用核酸对表面改性的生物活性玻璃颗粒进行培养持续约15分钟至2小时的时间段。
26.如权利要求18所述的方法，其中，液体介质选自下组：水、醇类或烃类。
27.如权利要求18所述的方法，其中，以氧化物的重量％计，生物活性玻璃颗粒主要包含：约30％至约75％SiO2、约2％至约40％CaO以及约3％至约15％P2O5。
28.如权利要求18所述的方法，其中，以氧化物的重量％计，生物活性玻璃颗粒主要包含：约30％至约70％B2O3、约5％至约25％CaO以及约1％至约10％P2O5。
29.如权利要求27所述的方法，以氧化物的重量％计，生物活性玻璃颗粒还包含：
约0％至约5％B2O3；
约0％至约5％Al2O3；
约0％至约20％MgO；
约0％至约10％ZrO2；
约0％至约5％F；以及
约0％至约30％R2O，其中，R2O包括约0％至约10％K2O和约0％至约30％Na2O。
30.如权利要求28所述的方法，以氧化物的重量％计，生物活性玻璃颗粒还包含：
约0％至约5％SiO2；
约0％至约15％Al2O3；
约0％至约10％MgO；
约0％至约10％ZrO2；
约0％至约5％F；以及
约0％至约20％R2O，其中，R2O包括约0％至约20％K2O和约0％至约10％Na2O。
31.一种载剂，其包含根据权利要求1-16中任一项所述的pH可切换载体组合物。
32.如权利要求31所述的载剂，其中，载剂包括：药物传递载剂、基因传递载剂、组织再生载剂、作物治疗或作物保护、免疫调节载剂或基因编辑复合载剂。
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