CN115957343A - 一种胶体粒子及其被诱导自组装成衣壳的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胶体粒子及其被诱导自组装成衣壳的制备方法和应用，属于生物功能材料技术领域。本发明的胶体粒子无生物毒性，在小鼠体内不引起免疫反应和组织损伤。本发明所提供的负电药物诱导胶体粒子自组装形成衣壳的方法无需交联剂，封装效率高，原料利用率高，具有成本低廉、操作简便、保护能力强的优势。本发明制备负电药物诱导胶体粒子自组装衣壳与传统方法相比，可获得厚且致密的衣壳，提供更强的保护药物免受胃肠环境的侵害能力，且促进口服益生菌在肠道的定殖，有望用于口服药品治疗相关疾病。

Description

一种胶体粒子及其被诱导自组装成衣壳的制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物功能材料技术领域，涉及一种用于口服药物递送生物材料的制备方法和应用。

背景技术

对于不耐酸或需要经肠吸收的药物，口服过程中存在生物利用度低、对胃刺激大等缺点。近年来，大量研究表明益生菌可以调节宿主肠道菌群与系统免疫功能，促进营养吸收保持肠道健康。因此，越来越多的益生菌类药物被开发用以治疗胃肠道疾病。

然而，口服给药过程中，胃内强酸性胃液和肠内胆汁盐的杀菌能力导致大多数益生菌被杀死，难以在肠道发挥有益功能。即使有少量益生菌存活下来，由于停留时间短，仍然很难附着在肠道表面进行定殖，极大地限制了益生菌发挥有益功能。

因此，在此类药物的口服递送过程中，开发了药物包埋封装技术，以提高其对胃酸的抵抗能力。现有技术中，益生菌包埋封装技术主要以海藻酸盐及其复合物为主。海藻酸钠是一种存在于褐藻细胞壁中的天然多糖，其生物相容性高，易与阳离子形成凝胶。由于海藻酸钠胶体在高亲和力离子或高浓度的非离子凝胶诱导剂存在的情况下会导致凝胶稳定性下降，因此依据包裹芯材的生物特性的不同，常联合应用海藻酸钠与壳聚糖、淀粉、明胶或乳清蛋白等多种传统天然高分子壁材材料的单一或多重复配。然而，水凝胶的孔隙不能有效地防止氢离子和胆酸盐对益生菌的杀伤，而且这些常用封装材料没有粘附性能，导致益生菌难以粘附和定殖在肠道上。此外，在技术层面上，还存在微胶囊尺寸难以控制、水凝胶包封效率低或交联剂有害等缺陷。

发明内容

本发明的目的是提供一种胶体粒子，利用其可以在带负电粒子表面自组装形成衣壳的特性，将益生菌等不耐酸且需要经肠吸收的药物包埋封装，以解决现有技术中存在的问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种氨基化聚环糊精-单宁酸胶体粒子，包括氨基化聚环糊精和单宁酸，氨基化聚环糊精中的环糊精空腔和单宁酸的邻苯三酚单元通过主客体作用形成胶体粒子。所述的氨基化聚环糊精-单宁酸胶体粒子具有较好的稳定性和尺寸均一性，且带有一定的正电能被带负电的药物诱导自组装成衣壳。所述的氨基化聚环糊精-单宁酸胶体粒子无生物毒性，在小鼠体内不引起免疫反应和组织损伤。

进一步地，所述氨基化聚环糊精包括乙二胺氨基化聚环糊精、丁二胺氨基化聚环糊精和己二胺氨基化聚环糊精。

进一步地，所述氨基化聚环糊精的浓度为1～15mg mL^-1；氨基化聚环糊精与单宁酸的浓度相同，二者的体积比为2:1。当氨基化聚环糊精与单宁酸比例升高时，单宁酸相对含量减少，不足以连接不同的聚环糊精链段，胶体粒子无法形成；当氨基化聚环糊精与单宁酸比例减少时，单宁酸相对含量增加，连接了过量的聚环糊精链段导致胶体粒子发生聚集。

进一步地，所述氨基化聚环糊精-单宁酸胶体粒子的直径范围为15～50nm，氨基化聚环糊精-单宁酸胶体粒子的直径通过控制氨基化聚环糊精的浓度而成。

一种上述氨基化聚环糊精-单宁酸胶体粒子自组装形成药物衣壳的制备方法，氨基化聚环糊精-单宁酸胶体粒子通过带负电药物的静电吸引而组装到药物表面形成衣壳，具体包括以下步骤：

(1)将冻存益生菌菌保加入Luria-Bertani(LB)培养基中，37°活化5小时，转速为200rpm，取出后离心并用去离子水冲洗三次，配制成益生菌菌液；或者将肝素加入去离子水中配制成肝素溶液。

(2)将益生菌菌液或肝素溶液加入氨基化聚环糊精-单宁酸胶体粒子中，快速振荡，正电荷的氨基化聚环糊精-单宁酸胶体粒子自组装在益生菌或者肝素表面，形成衣壳；然后离心去除未反应的胶体粒子，用去离子水清洗三遍，得到带有衣壳的益生菌或肝素。

进一步地，步骤(1)中，所述的益生菌包括Escherichia coli Nissle 1917(EcN)或Bacillus coagulans(BC)。

进一步地，步骤(1)中，制备的益生菌菌液浓度为5×10⁸～5×10⁹CFU mL^-1，优选为8×10⁸～2×10⁹CFU mL^-1。

进一步地，步骤(1)中，制备的肝素浓度为5～15mg mL^-1，优选为8～12mgmL^-1。

进一步地，步骤(2)中，离心的转速为500～3000rpm，优选为800～1200rpm。

进一步地，步骤(2)中，氨基化聚环糊精-单宁酸胶体粒子的浓度为5～15mgmL^-1，氨基化聚环糊精-单宁酸胶体粒子与益生菌菌液或者肝素溶液的体积比例为3:1。

氨基修饰的聚环糊精带有一定的正电荷，其中的环糊精为单宁酸提供了一个客体空腔进行主客体作用，单宁酸和聚环糊精之间的主客体作用和正电排斥达到平衡，形成了胶体粒子。细菌细胞壁中丰富的磷胆酸磷酸基团使细菌表面带有负电荷，其可以屏蔽正电荷胶体粒子之间的静电排斥作用。带负电的益生菌或肝素可以诱导胶体粒子自组装形成致密而厚的壳层对其进行封装。

一种氨基化聚环糊精-单宁酸胶体粒子自组装形成的衣壳在口服药物递送中的应用。

本发明的有益效果：本发明的胶体粒子无生物毒性，在小鼠体内不引起免疫反应和组织损伤。本发明所提供的负电药物诱导胶体粒子自组装形成衣壳的方法无需交联剂，封装效率高，原料利用率高，具有成本低廉、操作简便、保护能力强的优势。本发明制备负电药物诱导胶体粒子自组装衣壳与传统方法相比，可获得厚且致密的衣壳，提供更强的保护药物免受胃肠环境的侵害能力，且促进口服益生菌在肠道的定殖，有望用于口服药品治疗相关疾病。

附图说明

图1为益生菌诱导胶体粒子自组装形成衣壳示意图。

图2为益生菌诱导胶体粒子自组装形成衣壳的激光共聚焦图片；其中(a)为益生菌EcN，(b)为NTc形成的衣壳，(c)为被衣壳保护的益生菌NTcEcN，(d)为NTcEcN的横切面。

图3为衣壳对益生菌EcN在模拟胃液和胆汁盐环境中的保护能力统计图；其中(a)为益生菌EcN在模拟胃酸中的存活情况，(b)为益生菌EcN在胆汁盐中的存活情况。

图4为衣壳对益生菌EcN在模拟肠道环境下的增强黏附能力荧光图片；其中(a)为衣壳对益生菌EcN在静态黏附下的增强能力，(b)为衣壳对益生菌EcN在动态黏附下的增强能力。

图5为衣壳对益生菌EcN在小鼠体内的增强黏附能力成像荧光图片；其中(a)为整鼠的荧光成像，(b)为小鼠的肠道组织的荧光成像。

图6为衣壳包裹的益生菌EcN治疗沙门氏菌诱导的肠炎小鼠效果数据图。

图7为不同二胺氨基化的聚环糊精和单宁酸形成的胶体粒子的粒径和表面电位；其中(a)为胶体粒子的粒径大小，(b)为胶体粒子的电位情况。

图8为不同二胺氨基化的聚环糊精和单宁酸之间的结合能力，以及形成的胶体粒子对益生菌的保护能力；(a)为益生菌EcN在模拟胃酸中的存活情况，(b)为益生菌BC在模拟胃酸中的存活情况。

图9为肝素诱导胶体粒子自组装后形成的悬浊液在600nm处的吸光值。

具体实施方式

以下，举出实施例来说明本发明的具体实施方式，但本发明的实施方式不受如下这些实施例的限制，可在不影响本发明所要达到的技术效果的范围内做出任意选择和变更。实施例和试验例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

本实施例选用的胶体粒子为乙二胺氨基化聚环糊精和单宁酸形成的胶体粒子，以购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心的益生菌Escherichia coli Nissle1917(EcN)为模型，对本发明的保护益生菌和促进益生菌定殖体系作阐述和验证，包括以下步骤：

1.制备氨基化聚环糊精和单宁酸形成的胶体粒子

(1)氨基化聚环糊精(NPCD)的制备

将2.0g聚环糊精(PCD)与3.0g乙二胺(EDA)溶于10mL去离子水中；将反应液在40℃的油浴中搅拌24h，然后将反应液逐滴加入乙醇中，得到沉淀物乙二胺氨基化聚环糊精；再用乙醇反复洗涤得到的乙二胺氨基化聚环糊精3次，将其在50℃下真空干燥过夜，4℃保存后使用。

(2)乙二胺氨基化聚环糊精和单宁酸形成胶体粒子

将步骤(1)制得的乙二胺氨基化聚环糊精(400μL，具体浓度如表1所示)加入到单宁酸(200μL，具体浓度如表1所示)水溶液中，保持浓度相同，振荡10s，得到胶体粒子。

接着，通过动态光散射仪对上述制备的胶体粒子进行测试，动态光散射数据展示出不同浓度的氨基化聚环糊精制备的胶体粒子的粒径，参数如表1所示：

表1氨基化聚环糊精和单宁酸制备的胶体粒子粒径与浓度的关系

2.准备待保护的益生菌样品

将益生菌EcN在LB培养基中培养5小时，温度为37℃，摇床转速为200rpm。然后将其在5000rpm下离心3min进行收集，再用去离子水洗涤三次，最后用去离子水重悬得到不同浓度的EcN益生菌菌液(浓度分别为5×10⁸CFUs mL^-1、1×10⁹CFUs mL^-1、5×10⁹CFUs mL^-1)。

3.益生菌诱导胶体粒子组装形成衣壳

将200μL上述三种浓度的EcN益生菌菌液均加入到三种不同浓度的步骤1制得的乙二胺氨基化聚环糊精-单宁酸胶体粒子(600μL，浓度分别为5，10，15mgmL^-1)中，立即用涡旋混合器剧烈混合10s。然后在不同转速下(转速分别为500、1000、3000rpm)下离心3min，去离子水洗涤3次，4℃保存后使用。当EcN益生菌菌液浓度为1×10⁹CFUs mL^-1，胶体粒子浓度为10mg mL^-1且离心转速为1000rpm下，得到的衣壳质量最好。

图1清晰地展示了益生菌诱导胶体粒子自组装形成衣壳的过程；图2所示的激光共聚焦图片显示EcN益生菌菌液浓度为1×10⁹CFUs mL^-1，胶体粒子浓度为10mg mL^-1时衣壳直径大小为15μm左右，横切面图片显示益生菌均匀的封装在衣壳中。

4.衣壳对益生菌在模拟胃液和胆汁盐环境中的保护实验

将衣壳包裹的Escherichia coli Nissle 1917(NTcEcN)放入模拟胃液(pH 2.0,含胃蛋白酶)和胆汁盐(4％w/v)中孵育2小时，然后在5000rpm下离心3min，去离子水洗涤3次，梯度稀释涂平板，24小时后计数统计生存率。同时，选取一种商用肠溶聚合物

L100(L100)对EcN进行包裹(L100EcN)作为对比。如图3所示，未包裹的益生菌在模拟胃液中几乎无存活，在胆汁盐中的生存率为28％；L100包裹的益生菌L100EcN在模拟胃液和胆汁盐中的生存率均有所提升；而NTc衣壳包裹的益生菌NTcEcN在模拟胃液和胆汁盐中显示了更为强大的生存能力，统计可得其在模拟胃液中的生存率高达19％，而在胆汁盐中的生存率达到63％。

5.衣壳对益生菌在模拟肠道环境下的增强黏附能力实验

静态黏附：

首先用红色荧光染料TRITC对粘蛋白进行标记，具体来说，将TRITC溶液(1mg mL^-1,DMSO)滴入粘蛋白溶液(2mg mL^-1,pH 9)中，摩尔比为1:10。混合溶液在暗处4℃反应12小时，然后用去离子水透析反应液，冷冻干燥得到TRITC标记的粘蛋白。随后将胶体粒子形成的膜(NTc薄膜)浸泡在TRITC标记的粘蛋白溶液(1mg mL^-1,pH 6.8)中，37℃孵育1小时。薄膜用去离子水冲洗三次，在倒置荧光显微镜下成像。如图4中(a)所示，黏附在NTc薄膜上的粘蛋白的荧光强度是黏附在L100薄膜的7倍左右，显示了NTc对于粘蛋白的强烈结合能力。

动态黏附：

首先将载玻片浸入PEI溶液(2mg mL^-1)中1小时，然后用去离子水冲洗3次；然后在粘蛋白溶液(4mg mL^-1)中再浸泡1小时，用去离子水冲洗。将NTcEcN(2mL，10⁹CFU mL^-1，SYTO9标记)悬浮液滴入粘蛋白涂覆的载玻片上，然后用去离子水冲洗去除无黏附的EcN，用倒置荧光显微镜观察。如图4中(b)所示，NTcEcN在粘蛋白表面的黏附量显著增多，这主要归因于NTc中单宁酸对蛋白的强大黏附能力。

6.衣壳对益生菌在小鼠体内的增强黏附能力成像荧光图片

将NTcEcN通过灌胃投递到小鼠体内，4小时后通过小鼠成像系统观察整鼠荧光强度和取出的肠道的荧光强度。如图5所示，NTcEcN在肠道内的荧光强度显著高于单独的EcN，表明了NTcEcN在小鼠肠道的增强黏附能力。

7.衣壳包裹的益生菌治疗沙门氏菌诱导的肠炎小鼠效果数据图

首先向小鼠灌胃1×10⁹CFU的沙门氏菌以诱导产生肠炎模型，然后在第二天和第四天分别向其灌胃1×10⁹CFU的NTcEcN进行治疗。体内的沙门氏菌的数量变化如图6所示，随着治疗时间的延长，小鼠体内的沙门氏菌数量逐步降低。在第七天时，小鼠体内的沙门氏菌数量比未治疗的小鼠低了两个数量级左右。

实施例2

本实施例选用的胶体粒子为丁二胺氨基化聚环糊精和己二胺氨基化聚环糊精分别与单宁酸形成的胶体粒子，以购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心的Escherichiacoli Nissle 1917(ECN)和Bacillus coagulans(BC)为益生菌模型，对本发明的保护益生菌和促进益生菌定殖体系作阐述和验证，包括以下步骤：

1.制备氨基化聚环糊精和单宁酸形成的胶体粒子

(1)氨基化聚环糊精(NPCDs)的制备

将2.0g PCD与3.0g丁二胺(DAB)或者己二胺(DAH)溶于10mL去离子水中；将反应液在40℃的油浴中搅拌24h，然后将反应液逐滴加入乙醇中，得到沉淀物丁二胺氨基化聚环糊精或己二胺氨基化聚环糊精；用乙醇反复洗涤得到的氨基化聚环糊精3次。并将所得氨基化聚环糊精在50℃下真空干燥过夜，4℃保存后使用。

(2)氨基化聚环糊精和单宁酸形成胶体粒子

将不同二胺氨基化的聚环糊精(400μL,10mg mL^-1)加入到单宁酸(200μL,10mg mL^-1)水溶液中，振荡10s，得到胶体粒子，放入4℃保存。

接着，随机选取上述制备的胶体粒子，通过动态光散射仪进行测试，图7的动态光散射数据清晰地展示出胶体粒子的粒径均为30nm左右，且带有一定的正电荷。

2.准备待保护的益生菌样品

方法同实施例1。

3.益生菌诱导胶体粒子组装形成衣壳

方法同实施例1。

4.衣壳对益生菌在模拟胃液中的保护实验：

方法同实施例1。如图8所示，丁二胺和己二胺氨基化的环糊精所形成的衣壳均对EcN或BC具有比较好的保护效果。

实施例3

本实施例选用的负电粒子为带负电的肝素，通过乙二胺氨基化聚环糊精与单宁酸形成的胶体粒子对其进行包裹，包括以下步骤：

1.制备氨基化聚环糊精和单宁酸形成的胶体粒子

方法同实施例1。

2.肝素诱导胶体粒子组装形成衣壳

将三种浓度的肝素溶液(200μL,浓度分别为5，10，15mg mL^-1)各加入到三种浓度的乙二胺氨基化聚环糊精和单宁酸形成的胶体粒子(600μL,浓度分别为5，10，15mg mL^-1)中，立即用涡旋混合器剧烈混合10s。吸取200μL的混合液置于96孔板中，测试600nm处的吸光值(OD 600nm)。如图9所示，向乙二胺氨基化聚环糊精和单宁酸形成的胶体粒子(10mg mL^-1)加入肝素(10mgmL^-1)后，溶液600nm处的吸光值急剧增大，表明肝素成功诱导胶体粒子聚集，形成了较大颗粒的聚集体，从而导致浊度的升高。

Claims (10)

1.一种氨基化聚环糊精-单宁酸胶体粒子，其特征在于，所述胶体粒子包括氨基化聚环糊精和单宁酸，氨基化聚环糊精中的环糊精空腔和单宁酸的邻苯三酚单元通过主客体作用形成胶体粒子。

2.根据权利要求1所述的一种氨基化聚环糊精-单宁酸胶体粒子，其特征在于，所述氨基化聚环糊精的浓度为1～15mg mL^-1；氨基化聚环糊精与单宁酸的浓度相同，二者的体积比为2:1。

3.根据权利要求1或2所述的一种氨基化聚环糊精-单宁酸胶体粒子，其特征在于，所述的氨基化聚环糊精包括乙二胺氨基化聚环糊精、丁二胺氨基化聚环糊精和己二胺氨基化聚环糊精。

4.根据权利要求1或2所述的一种氨基化聚环糊精-单宁酸胶体粒子，其特征在于，所述氨基化聚环糊精-单宁酸胶体粒子的直径范围为15～50nm。

5.一种如权利要求1-4任一所述的胶体粒子自组装形成药物衣壳的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)将冻存益生菌菌保加入Luria-Bertani培养基中，37°活化5小时，转速为200rpm，取出后离心并用去离子水冲洗三次，配制成浓度为5×10⁸～5×10⁹CFU mL^-1的益生菌菌液；或者将肝素加入去离子水中配制成浓度为5～15mg mL^-1的肝素溶液；

(2)将益生菌菌液或肝素溶液加入氨基化聚环糊精-单宁酸胶体粒子中，快速振荡，正电荷的氨基化聚环糊精-单宁酸胶体粒子自组装在益生菌或者肝素表面，形成衣壳；然后离心去除未反应的胶体粒子，用去离子水清洗三遍，得到带有衣壳的益生菌或肝素。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，氨基化聚环糊精-单宁酸胶体粒子的浓度为5～15mg mL^-1，氨基化聚环糊精-单宁酸胶体粒子与益生菌菌液或氨基化聚环糊精-单宁酸胶体粒子与肝素溶液的体积比为3:1。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，益生菌菌液浓度为8×10⁸～2×10⁹CFU mL^-1，肝素溶液浓度为8～12mg mL^-1。

8.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述益生菌包括Escherichiacoli Nissle 1917或Bacillus coagulans。

9.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，离心的转速为500～3000rpm。

10.一种如权利要求5-9任一所述制备方法得到的衣壳在口服药物递送中的应用。

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