CN112516323B - 一种光交联壳聚糖-甲基丙烯酸纳米粒子的制备方法 - Google Patents

一种光交联壳聚糖-甲基丙烯酸纳米粒子的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种光交联壳聚糖‑甲基丙烯酸纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：步骤S1，将2‑甲基丙烯酸酐加入到壳聚糖溶液中，反应得到壳聚糖‑甲基丙烯酸；步骤S2，制备一定浓度的壳聚糖‑甲基丙烯酸溶液，加入光引发剂；步骤S3，将步骤S2制备的溶液加入到环己烷与正己醇的混合油相中，加入表面活性剂曲拉通X‑100，制备W/O微乳液法；步骤S4，步骤S3制备的微乳液经紫外光照射后，离心分离得到纳米粒子。本发明提供的方法用于制备纳米粒子，可用于包封蛋白质、多肽等生物大分子，维持其生物活性。

Description

一种光交联壳聚糖-甲基丙烯酸纳米粒子的制备方法
技术领域
本发明涉及纳米粒子制备方法，特别涉及一种光交联的壳聚糖-甲基丙烯酸纳米粒子制备方法。
背景技术
壳聚糖是由甲壳质脱乙酰基得到的，具有大量的游离氨基，是许多化学反应的位点，表面带正电荷，不溶于水和有机溶剂，溶于乙酸、硝酸和盐酸等稀酸。在药物递送领域中，壳聚糖具有优良的特性，如良好的生物相容性、可生物降解、黏膜粘附性和无毒性，且能可逆打开紧密连接促进大分子的细胞旁运输。
目前，许多生物大分子，如多肽、蛋白质和核酸等用于疾病治疗，但蛋白质类药物的口服递送仍然面临许多问题，蛋白质容易被胃肠道中的强酸、消化酶所破坏，分子量大，亲水性强，在肠上皮中的渗透性差，而纳米颗粒递送体系作为蛋白质递送体系被广泛研究，可以保护药物免于胃肠道降解，增强黏膜粘附性，延长胃肠道停留时间，促进药物通过肠粘膜的吸收等。
壳聚糖纳米粒子通常通过物理交联或化学交联获得，物理交联基于离子凝胶法，是壳聚糖与聚阴离子电解质(如三聚磷酸钠、柠檬酸钠等)在静电作用下形成纳米粒子，但只在一定pH范围内保持稳定，pH过高或过低都会破坏纳米粒子；化学交联通常采用W/O乳液法制备壳聚糖纳米粒子，加入化学交联剂如戊二醛、京尼平等进行化学交联，虽然该法制备的纳米粒子普遍球形度好，粒径偏小，但化学交联剂普遍存在细胞毒性，如戊二醛、乙二醛等，因此不适用于包封生物活性大分子，而京尼平也存在价格昂贵的问题。
相比离子交联和化学交联得到的纳米粒子，光交联得到壳聚糖纳米粒子在不同pH介质中更稳定，且无需化学交联剂，没有副产物，纳米粒子采用乳液方法制备通常需要超声、高压、高剪切等条件，而W/O微乳液法避免了不良制备条件，有利于生物活性物质的包封与保护。壳聚糖氨基作为反应位点，将光敏基团引入壳聚糖中，在光引发剂和紫外光照射下发生胶凝，形成光交联的纳米粒子，通过改变光敏基团取代度，改变壳聚糖的光交联性能，取代度越高，形成的交联产物越致密，壳聚糖上的氨基数量减少，水溶性得到改善，进一步拓宽了壳聚糖在药物递送领域的应用。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供一种光交联的壳聚糖-甲基丙烯酸纳米粒子的制备方法。
原理及方法：本发明采用W/O微乳液法制备纳米乳液，用光交联固化制备纳米粒子。光交联方法是利用具有光敏性基团的物质，在引发剂和特定波长紫外光照射下，发生自由基反应，得到光交联产物。
壳聚糖与2-甲基丙烯酸酐反应，接枝甲基丙烯酰基团，生成不同取代度的壳聚糖-甲基丙烯酸，利用其光敏特性，加入光引发剂，采用W/O微乳液法制备壳聚糖-甲基丙烯酸纳米乳液，在紫外光照射下形成纳米凝胶。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
本发明的第一个目的是提供一种光交联的壳聚糖-甲基丙烯酸纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1，称取壳聚糖盐酸盐，溶于去离子水中，搅拌均匀，得到浓度为1％(w/v)的壳聚糖溶液，向壳聚糖溶液中加入2-甲基丙烯酸酐，避光，25℃～60℃条件下搅拌反应24h，反应结束后，将反应液在超纯水中透析，直至除去反应中过量的2-甲基丙烯酸酐，冻干，得到白色絮状固体壳聚糖-甲基丙烯酸；
步骤S2，将步骤S1所得的壳聚糖-甲基丙烯酸溶于体积百分比为1％的乙酸(v/v)中，加入光引发剂，搅拌均匀，调节pH＝7，得到壳聚糖-甲基丙烯酸溶液；
步骤S3，取模型蛋白，将步骤S2的壳聚糖-甲基丙烯酸溶液与模型蛋白混合后得到水相，即微乳液中的分散相，滴入环己烷(即微乳液体系中的连续相)和助表面活性剂的混合溶剂中，所述环己烷：助表面活性剂：水相的体积比＝2.75:1:1(v/v/v)，再逐滴加入表面活性剂，直到溶液变得澄清透明，即停止加表面活性剂，得到W/O微乳液。
优选的，所述模型蛋白为水溶性小分子多肽或具有二维及以上结构的水溶性蛋白；
步骤S4，将步骤S3的W/O微乳液放在紫外灯下照射，紫外光交联结束后，加入乙醇破坏乳液，直至乳液变浑浊，即停止加入乙醇，6000rpm离心10min，得到白色纳米粒子，将纳米粒子依次用乙醇、去离子水反复洗涤，最后冻干，制备得到所述光交联的壳聚糖-甲基丙烯酸纳米粒子。
进一步地，步骤S1中2-甲基丙烯酸酐与所述壳聚糖溶液中壳聚糖糖单元的摩尔比为：0.4:1-5:1。
优选的，2-甲基丙烯酸酐与所述壳聚糖溶液中壳聚糖糖单元的摩尔比为5:1；反应温度60℃。
进一步地，步骤S2中光引发剂在1％的乙酸(v/v)中的含量(w/v)为0.02％-5％，所述光引发剂为2-羟基-2-甲基苯丙酮。
进一步地，步骤S2中壳聚糖-甲基丙烯酸溶液中，步骤S1所得的壳聚糖-甲基丙烯酸在1％的乙酸(v/v)中的浓度(w/v)为1％-2％。
进一步地，步骤S3中助表面活性剂为正己醇，表面活性剂为曲拉通X-100。
进一步地，步骤S4中所用紫外光源峰值波长365～370nm，紫外线强度15000UW/cm2，照射时间10min。
进一步地，所述紫外光交联纳米粒子口服递送蛋白质。
本发明的第二个目的是提供前述的制备方法制备得到的光交联的壳聚糖-甲基丙烯酸纳米粒子。
进一步地，所述光交联的壳聚糖-甲基丙烯酸纳米粒子粒径为90-100nm；
本发明的第三个目的是提供前述的光交联的壳聚糖-甲基丙烯酸纳米粒子在制备口服蛋白质药物中的应用。
进一步地，所述口服蛋白质药物能够在胃部和肠部保护包封的蛋白的结构与活性，优选的，所述口服蛋白质药物能够在胃部、小肠部和结肠部保护包封的蛋白的结构与活性。
本发明制备的纳米粒子负载蛋白质药物，在微乳液制备前，将目标蛋白加入到壳聚糖-甲基丙烯酸水溶液中，利用蛋白质与载体材料间的静电作用，可将蛋白质包封在纳米粒子内部，光交联形成的致密三维网状结构，防止胃酸和消化酶的破坏，能达到胃肠道内维持蛋白质活性的效果，本发明制备纳米粒子能维持蛋白质活性，可逆地打开肠道紧密连接，促进蛋白质药物的吸收。
本发明的有益效果：
(1)本发明以壳聚糖为主要原料，改性所得材料无细胞毒性，具有良好的生物相容性和可降解性，满足口服材料要求；
(2)取代度不同的壳聚糖-甲基丙烯酸的性质不同，取代度高的壳聚糖光交联速度更快，交联网络更致密；
(3)本发明制备的纳米粒子负载蛋白质药物，在微乳液制备前，将模式蛋白加入到壳聚糖-甲基丙烯酸水溶液中，可将蛋白质包封在纳米粒子内部，达到保护蛋白质，维持其活性的效果；
(4)本发明采用W/O微乳液法制备纳米粒子，避免高压、高剪切等条件，保持蛋白质的活性。
附图说明
附图1(a)为不同取代度壳聚糖-甲基丙烯酸和壳聚糖盐酸盐的红外谱图，图1(b)为壳聚糖-甲基丙烯酸CS-MA4的红外谱图；
附图2为不同取代度壳聚糖-甲基丙烯酸和壳聚糖盐酸盐的HNMR谱图；
附图3为本发明纳米粒子制备示意图；
附图4(a)为本发明实施例2纳米粒子粒径分布图，附图4(b)为实施例3纳米粒子在不同pH条件下的Zeta电位和粒径图；
附图5为本发明实施例3制备条件下纳米粒子的透射电镜图，标尺见图右下；其中，附图5(a)为1:500nm比例下壳聚糖-甲基丙烯酸CS-MA4纳米粒子的透射电镜图，附图5(b)为1:100nm比例下壳聚糖-甲基丙烯酸CS-MA4纳米粒子的透射电镜图
附图6(a)为壳聚糖-甲基丙烯酸CS-MA4与结肠癌细胞HCT116细胞相容性实验结果，附图6(b)为壳聚糖-甲基丙烯酸CS-MA4与结肠癌细胞HT29细胞相容性实验结果；附图6(c)为壳聚糖-甲基丙烯酸CS-MA4与小鼠巨噬细胞RAW细胞相容性实验结果；附图6(d)为壳聚糖-甲基丙烯酸CS-MA4纳米粒子与结肠癌细胞HCT116细胞相容性实验结果；
附图7为本发明负载牛血清白蛋白的纳米粒子体外溶出曲线；
附图8为本发明实施例3制备的纳米粒子和实施例6中纳米粒子的荧光图像。
具体实施方式
下面结合实施例和附图具体介绍本发明的技术方案。
下述实施例中水溶性壳聚糖的分子量为500-2000kDa，脱乙酰度为80％-90％，牛血清白蛋白的分子量为68kDa。
实施例1：壳聚糖-甲基丙烯酸的合成及表征
合成步骤：称取0.5g壳聚糖盐酸盐分别溶于25mL去离子水中，搅拌均匀，得到澄清壳聚糖溶液，在强烈搅拌下向壳聚糖溶液中逐滴滴加2-甲基丙烯酸酐，不同条件下避光搅拌反应24h，如表1所示，反应条件1、2、3和4中的2-甲基丙烯酸酐与壳聚糖糖单元摩尔比和反应温度分别为：0.4:1和25℃、1:1和25℃、5:1和25℃、5:1和60℃，所得反应产物依次记为CS-MA1、CS-MA2、CS-MA3、CS-MA4，反应结束后，将反应液在超纯水中透析3-4天，直至除去反应液中过量的2-甲基丙烯酸酐，将透析液冻干得到白色絮状固体。
红外光谱：分别取2mg冻干后的壳聚糖-甲基丙烯酸产物CS-MA1、CS-MA2、CS-MA3、CS-MA4以及壳聚糖盐酸盐，加入一定量干燥的溴化钾研细混匀，放入压片机中压片，用KBr空白片进行背景测量，扣除背景后，放入待测样品片，用红外光谱仪(Thermo Nicolet iS5)测量，在400至4000cm-1的波数范围内获得不同取代度壳聚糖-甲基丙烯酸酐的红外谱图。
H1NMR谱图：取5mg冻干后的壳聚糖-甲基丙烯酸溶于1mL的D2O中，加入20μL氘代盐酸，用300MHz ULTRASHIELD PLUSTMB-ACS 60光谱仪测量，扫描16次，得到不同取代度壳聚糖-甲基丙烯酸酐的H1NMR谱图。
结果讨论：壳聚糖盐酸盐FTIR谱图中，1630cm-1处为C＝O的伸缩振动峰(酰胺Ⅰ谱带)，1517cm-1处的吸收峰为-NH3 +，表明壳聚糖的盐酸盐，1382cm-1处为酰胺键中N-H伸缩振动和C-N面内弯曲振动(酰胺Ⅲ谱带)，CS-MA1、CS-MA2、CS-MA3、CS-MA4的红外谱图表明成功接枝双键图1(a)，壳聚糖-甲基丙烯酸CS-MA4的FTIR谱图中，1660cm-1处的吸收峰是双键＝C-H伸缩振动峰，2926cm-1处新出现的峰是-CH3的C-H吸收峰，表明甲基丙烯酰基团已经成功接枝到壳聚糖主链上图1(b)。
如图2所示，CS-MA1、CS-MA1、CS-MA2、CS-MA3、CS-MA4在5.3和5.6ppm处新出现的峰为双键上的氢，表明表明甲基丙烯酰基团已经成功接枝到壳聚糖主链上，按照如下公式计算壳聚糖的甲基丙烯化程度：
Figure BDA0002858303830000051
计算结果如表1所示，CS-MA1的取代度最低，CS-MA4的取代度最高，从结果可知，反应物投料比与反应温度对产物的取代度有影响，进料摩尔比越高，取代度越高，温度的升高也有利于产物取代度的增加。
表1
编号 进料摩尔比 反应温度(℃) 甲基丙烯酸取代度(％)
CS-MA1 0.4 25 15.78
CS-MA2 1 25 17.64
CS-MA3 5 25 21.43
CS-MA4 5 60 42.86
实施例2：壳聚糖-甲基丙烯酸的紫外光交联过程
光交联过程：将10mg壳聚糖-甲基丙烯酸CS-MA1、2、3、4溶于1mL的1％乙酸(v/v)中，加入0.05％(w/v)光引发剂Irgacure1173(2-羟基-2-甲基苯丙酮)，搅拌均匀，加入0.1M的氢氧化钠溶液调节溶液pH＝7，配置得到浓度为1％(w/v)的壳聚糖-甲基丙烯酸溶液，紫外光照射1min、5min、10min、20min、30min、60min。
结果讨论：CS-MA1、CS-MA2、CS-MA3在照射60min后呈现部分胶凝状态，但仍然能够流动，未形成完全的凝胶，而CS-MA4在照射1min后即完全胶凝，形成凝胶，不能流动。原因在于1％的CS-MA1、CS-MA2、CS-MA3溶液中双键数量过低，不能形成致密的交联网络，因此后续实验使用取代度高的CS-MA4。
实施例3：纳米粒子的制备方法以及粒径分布、微观形态
(1)制备方法：将10mg壳聚糖-甲基丙烯酸CS-MA4溶于1mL的1％乙酸(v/v)中，加入0.05％(w/v)光引发剂Irgacure1173(2-羟基-2-甲基苯丙酮)，搅拌均匀，加入0.1M的氢氧化钠溶液调节CS-MA4溶液pH＝7，配制得到浓度为1％(w/v)的壳聚糖-甲基丙烯酸溶液。将1mL的1％(w/v)的壳聚糖-甲基丙烯酸溶液滴入2.75mL环己烷和1mL正己醇的混合溶剂中，再逐滴加入表面活性剂曲拉通X-100，直至溶液变得澄清透明，即停止加入表面活性剂，形成W/O微乳液，将微乳液在紫外灯下照射10min，加入乙醇破坏乳液，直至乳液变浑浊，6000rpm离心10min，得到白色纳米粒子，将纳米粒子依次用乙醇、去离子水反复洗涤，最后加入冷冻保护剂冻干待用。制备过程如图3所示。
(2)粒径分布和Zeta电位：取一定量冻干后的CS-MA纳米粒子悬浮于超纯水中，超声之后取上层清液，用安东帕激光粒度仪(Litesizer 500)测粒径分布和Zeta电位。
(3)透射电镜：将冻干后的纳米粒子悬浮于1％乙酸溶液，将纳米粒子悬浮液滴在铜网上，5min后用滤纸吸干多余水分，滴加1％磷酸钨，染色10min后，吸干染料，自然晾干，用透射电镜观察。
结果讨论：DLS(动态光散射)显示CS-MA纳米粒子水合粒径在110-130nm范围内，在pH1～6范围内，纳米粒子的平均Zeta电位为正。根据透射电镜结果，大部分纳米粒子球形度良好，直径在90-100nm之间，粒径分布较均匀，相比动态光散射测量的粒径偏小，部分粒子发生粘连(图4、5)。
实施例4：纳米粒子负载蛋白质、包封率
包封蛋白质的纳米粒子：将10mg壳聚糖-甲基丙烯酸CS-MA4溶于1mL的1％乙酸(w/v)中，加入0.05％(w/v)光引发剂Irgacure1173(2-羟基-2-甲基苯丙酮)，搅拌均匀，加入0.1M的氢氧化钠溶液调节CS-MA溶液pH＝7，加入2.5mg的牛血清白蛋白，涡旋溶解。将1mL的壳聚糖-甲基丙烯酸与牛血清白蛋白混合溶液滴入到2.75mL环己烷和1mL正己醇的混合溶剂中，再逐滴加入表面活性剂曲拉通X-100，直至溶液变得澄清透明，形成W/O微乳液，放在紫外灯下照射10min，紫外光源峰值波长370nm，紫外线强度15000UW/cm2，加入乙醇破坏微乳液，直至乳液变浑浊，6000rpm离心10min得到白色纳米粒子，将纳米粒子依次用乙醇、去离子水反复洗涤，最后加入2％(w/v)甘露醇冻干，采用BCA微量蛋白质试剂盒测定洗涤液中牛血清白蛋白的含量，计算得到平均包封率为86％，平均载药量为5.86％。
实施例5：壳聚糖-甲基丙烯酸对HT29、HCT116、RAW的细胞毒性
(1)HCT116细胞培养：人结直肠腺癌细胞HCT116用含10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素的DMEM培养基，在5％CO2气氛，37℃温度下培养，定期更换培养基，进行细胞传代，待细胞进入指数生长期后开始进行MTT实验。
(2)HT29细胞培养：人结直肠腺癌细胞HT29用含10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基，在5％CO2气氛，37℃温度下培养，定期更换培养基，进行细胞传代，待细胞进入指数生长期后开始进行MTT实验。
(3)RAW细胞培养：小鼠巨噬细胞细胞RAW用含10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素的DMEM培养基，在5％CO2气氛，37℃温度下培养，定期更换培养基，进行细胞传代，待细胞进入指数生长期后开始进行MTT实验。
(4)MTT实验：
壳聚糖-甲基丙烯酸CS-MA4对HCT116/HT29的细胞毒性：将HCT116/HT29细胞以104个细胞/孔的密度接种于96孔中，在37，5％CO2培养箱中孵育24h，向每孔中加入10μL不同浓度的经紫外照射灭菌的壳聚糖-甲基丙烯酸溶液，使细胞培养基中壳聚糖-甲基丙烯酸的最终浓度为100、200、300、400、500μg/mL，对照孔加入等量的培养基，继续培养24h后，向每孔加入10μL的5mg/mL的MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)溶液(PBS溶液)，放入培养箱继续培养4h，随后移除含MTT的培养液，向每孔加入150μLDMSO(二甲基亚砜)，使用酶标仪(SpectraMax i3x)测量每孔在490nm波长处的吸光度值(OD)。
壳聚糖-甲基丙烯酸CS-MA4对RAW细胞的细胞毒性：将RAW细胞以5*104个细胞/孔的密度接种于96孔中，在37，5％CO2培养箱中孵育24h，向每孔中加入10μL不同浓度的经紫外照射灭菌的壳聚糖-甲基丙烯酸溶液，使细胞培养基中壳聚糖-甲基丙烯酸的最终浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2mg/mL，对照孔加入等量的培养基，继续培养24h后，向每孔加入10μL的5mg/mL的MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)溶液(PBS溶液)，放入培养箱继续培养4h，随后移除含MTT的培养液，向每孔加入150μLDMSO(二甲基亚砜)，使用酶标仪(SpectraMax i3x)测量每孔在490nm波长处的吸光度值(OD)。
壳聚糖-甲基丙烯酸CS-MA4纳米粒子对RAW细胞的细胞毒性：将RAW细胞以5*104个细胞/孔的密度接种于96孔中，在37，5％CO2培养箱中孵育24h，向每孔中加入10μL不同浓度的经紫外照射灭菌的壳聚糖-甲基丙烯酸溶液，使细胞培养基中壳聚糖-甲基丙烯酸的最终浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2mg/mL，对照孔加入等量的培养基，继续培养24h后，向每孔加入10μL的5mg/mL的MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)溶液(PBS溶液)，放入培养箱继续培养4h，随后移除含MTT的培养液，向每孔加入150μLDMSO(二甲基亚砜)，使用酶标仪(SpectraMax i3x)测量每孔在490nm波长处的吸光度值(OD)，细胞存活率根据如下公式计算：
细胞存活率(％)＝OD490样品/OD490对照×100％
结果讨论：壳聚糖-甲基丙烯酸CS-MA4浸出液与HCT116、HT29、RAW细胞培养24h后，细胞存活率均在80％以上，实验结果表明不同浓度的壳聚糖-甲基丙烯酸CS-MA4溶液对细胞无明显毒性，通过显著性分析，概率值P>0.05表明不同浓度的壳聚糖-甲基丙烯酸CS-MA4溶液对细胞存活率无显著影响，壳聚糖-甲基丙烯酸CS-MA4纳米粒子与HCT116培养24h后，细胞存活率在80％以上，纳米粒子无细胞毒性，表明纳米粒子制备过程不对纳米粒子细胞毒性产生影响。(图6)。
实施例6：体外释放实验与荧光图像
体外释放实验：为了模拟胃肠道的消化条件，根据药典，制备pH＝1.2的模拟胃液、pH＝6.8的模拟肠液和pH＝7.4含壳聚糖酶(5U/mL)的结肠液，将实施例3制备的载有牛血清白蛋白的纳米粒子置于不同溶出介质中，在37℃，100rpm条件下振荡，在规定时间点取1mL，以8000rpm离心2min，取上层清液0.5mL，采用BCA法测定蛋白质含量，剩余液体倒回锥形瓶中，并补充0.5mL新鲜溶出介质。
荧光图像：制备异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白，按照实施例4的方法制备包封有BSA-FITC的壳聚糖-甲基丙烯酸CS-MA4纳米粒子，将冻干后的纳米粒子分别置于pH＝1.2的模拟胃液、pH＝6.8的模拟肠液和pH＝7.4含壳聚糖酶(5U/mL)的结肠液中，在37℃，100rpm条件下振荡，分别遮光振荡2h、4h、6h，离心取沉淀在倒置荧光显微镜下观察，同时，取实施例3中未包封蛋白质的纳米粒子在倒置荧光显微镜下观察，激发波长为496nm，发射波长为515nm。
结果讨论：牛血清白蛋白在胃液和肠液中有少量的释放，在模拟胃液(pH1.2)的溶出速率比模拟肠液中的溶出速率快，在1h内累计释放量达到20％，而在肠液中不到10％，，此后6h内无显著释放，而在肠液中6h内累积释放量不超过10％，在含壳聚糖酶(5U/mL)的结肠液中，1h内的累计释放达到30％，此后7h无显著释放，在结肠液中有突释现象出现，原因可能是光交联的纳米粒子部分被壳聚糖酶降解，但是三维网状结构较为稳定，因此后续没有大量蛋白质释放现象出现，而且纳米粒子对牛血清白蛋白有较好的吸附作用，与牛血清白蛋白的静电作用较强，说明壳聚糖-甲基丙烯酸与牛血清白蛋白形成的纳米粒在胃肠液的pH范围内较为稳定，牛血清白蛋白释放量低，有利于纳米粒子对蛋白质的保护作用，因此，纳米粒子对牛血清白蛋白有很好的包封作用(图7)。
根据荧光图像，实施例3制备的CS-MA4纳米粒子在特定激发波长和发射波长下，不发出荧光，因此对后续实验结果无干扰，包封蛋白质的纳米粒子在胃液(pH＝1.2)、肠液(pH＝6.8)、结肠液(pH＝7.4)中分别消化2h、4h、6h后仍有很强的荧光，说明大部分蛋白质被包在纳米粒子中(图8)。

Claims (11)

1.一种光交联的壳聚糖-甲基丙烯酸纳米粒子的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤S1，称取壳聚糖盐酸盐，溶于去离子水中，搅拌均匀，得到1%壳聚糖溶液，向壳聚糖溶液中加入2-甲基丙烯酸酐，避光，反应温度25℃~60℃条件下，搅拌反应24 h，反应结束后，将反应液在超纯水中透析，直至除去反应中过量的2-甲基丙烯酸酐，冻干，得到壳聚糖-甲基丙烯酸；
步骤S2，将步骤S1所得的壳聚糖-甲基丙烯酸溶于1%的乙酸中，加入光引发剂，搅拌均匀，调节pH=7，得到壳聚糖-甲基丙烯酸溶液；
步骤S3，取模型蛋白，将步骤S2的壳聚糖-甲基丙烯酸溶液与模型蛋白混合后得到水相，滴入环己烷和助表面活性剂的混合溶剂中，所述环己烷：助表面活性剂：水相=2.75:1:1，再逐滴加入表面活性剂，直到溶液变得澄清透明，即停止加表面活性剂，得到W/O微乳液；
步骤S4，将步骤S3的W/O微乳液放在紫外灯下照射，紫外光交联结束后，加入乙醇破坏乳液，直至乳液变浑浊，即停止加入乙醇，6000 rpm离心10 min，得到白色纳米粒子，将纳米粒子依次用乙醇、去离子水反复洗涤，最后冻干，制备得到所述光交联的壳聚糖-甲基丙烯酸纳米粒子；
步骤S1中2-甲基丙烯酸酐与所述壳聚糖溶液中壳聚糖糖单元的摩尔比为0.4:1-5:1；
步骤S2中所述光引发剂为2-羟基-2-甲基苯丙酮；
步骤S3中助表面活性剂为正己醇，表面活性剂为曲拉通X-100。
2.根据权利要求1所述的光交联壳聚糖-甲基丙烯酸纳米粒子制备方法，其特征在于：2-甲基丙烯酸酐与所述壳聚糖溶液中壳聚糖糖单元的摩尔比为5:1；反应温度60℃。
3.根据权利要求1所述的光交联壳聚糖-甲基丙烯酸纳米粒子制备方法，其特征在于：步骤S2中光引发剂含量为0.02%-5%。
4.根据权利要求1所述的光交联壳聚糖-甲基丙烯酸纳米粒子制备方法，其特征在于：步骤S2中壳聚糖-甲基丙烯酸溶液浓度为1%-2%。
5.根据权利要求1所述的光交联壳聚糖-甲基丙烯酸纳米粒子制备方法，其特征在于：步骤S3所述模型蛋白为水溶性小分子多肽或具有二维及以上结构的水溶性蛋白。
6.根据权利要求1所述的光交联壳聚糖-甲基丙烯酸纳米粒子制备方法，其特征在于：步骤S4中所用紫外光源峰值波长365~ 370 nm，紫外线强度15000 UW/cm2，照射时间为10min。
7.权利要求1至6任意一项权利要求所述的制备方法制备得到的光交联的壳聚糖-甲基丙烯酸纳米粒子。
8.根据权利要求7所述的光交联的壳聚糖-甲基丙烯酸纳米粒子，其特征在于，所述光交联的壳聚糖-甲基丙烯酸纳米粒子粒径为90-100 nm。
9.权利要求7所述的光交联的壳聚糖-甲基丙烯酸纳米粒子在制备口服蛋白质药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述口服蛋白质药物能够在胃部和肠部保护包封的蛋白的结构与活性。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述口服蛋白质药物能够在胃部、小肠部和结肠部保护包封的蛋白的结构与活性。
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