CN105362211A - 纳米金属氧化物-米诺环素纳米缓释凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了纳米金属氧化物-米诺环素纳米缓释凝胶及其制备方法和应用，本发明针对米诺环素局部制剂的药物释放稳定性和有效性不足等现状，以卡波姆作为基质，采用生物可降解高分子材料包裹活性金属氧化物纳米分子和盐酸米诺环素制成水溶性凝胶缓释剂，稳定性好、保湿性强，具有降低药物含量、增强抗菌效果、延长药物作用时间，靶向定位、易于操作、成本低等优点，更加适合于急慢性牙周病和牙龈炎的治疗，具有良好的市场经济效益。

Description

纳米金属氧化物-米诺环素纳米缓释凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及纳米材料与抗菌药物协同作用的临床研究，用于制备牙科用药品，特别用于治疗急慢性牙周炎和牙龈病。

背景技术

牙周病是指侵犯牙龈和牙周支持组织的一类慢性、感染性、破坏性疾病，在世界范围内患病率较高，是导致成人失牙的主要原因。牙周病的发病机制复杂，普遍认为细菌是导致牙周病发生的最关键因素。目前牙周病治疗的主要手段是洁刮治与根面平整，这两种方法虽然可以减少部分龈下致病菌的数量，但不能完全消除龈下致病菌，洁刮治术后龈下细菌会缓慢增长，逐渐恢复到治疗前水平。自20世纪80年代以来，将抗菌药物制成局部制剂，作为洁刮治与根面平整的辅助手段，日益受到关注。

盐酸米诺环素，化学名为7，7-二甲胺四环素，是一种速效、长效的半合成四环素。本品为无臭、味苦的黄色结晶粉末，遇光易变质，微溶于水，易溶于乙醇、碳酸氢钠、氢氧化钠溶液中。盐酸米诺环素能抑制98％的牙周病原菌(如牙龈卟啉单胞菌(Pg)、伴放线杆菌(Aa)等)，抗菌作用为四环素类药物中最强(最低抑菌浓度5μg/mL)。该药物还可粘附在牙根表面，不易被龈沟液冲离牙周袋，可长期保存其抗菌活性和对宿主的调节作用，因此盐酸米诺环素可作为牙周炎的首选药物。但米诺环素是高脂溶性药物，易进入人体组织，半衰期长达20小时，具有较强的肝肾毒性。米诺环素在龈沟液中药物浓度比血浆中高5倍，易于螯合金属离子沉积在牙齿表面，导致牙齿变色，影响美观。因此常用米诺环素局部缓释制剂来解决这一问题。

目前已有研究报道的米诺环素局部缓释制剂主要有五种类型：一、30％米诺环素乙基纤维素薄膜。该缓释剂的载体中含有乙醇、氯仿和聚乙烯乙二醇，它的不足之处是聚乙烯乙二醇是人工合成高分子材料，长期使用易在人体组织内积蓄，通过体内、体外代谢产生有毒物质；二、米诺环素可吸收微球。它的不足之处包括：药物包封率及载药量低；由于微球形状和体内生物降解等造成的药物非零级释放；尚未实现药物在最合适的时间内释放；对缓释系统内药物的不同释放程序和速度的研究不足；三、2％米诺环素凝胶。但浓度波动较大，用药后GCF浓度可达1000μg/mL，3小时后下降3μg/mL；四、米诺环素软膏。但药物释放速度不稳定，有效药物浓度低。五、米诺环素脂质体。液态脂质体的贮存稳定性较差，易发生团聚、融合及药物渗漏，同时脂质体受温度、光线等影响会产生乳析、凝聚、融合和粒径变大等现象，这些不足之处使脂质体的应用受到了很大限制。因此提高米诺环素局部制剂的药物释放稳定性和有效性成为研究的热点之一。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种纳米氧化锌-米诺环素纳米凝胶及其制备方法和应用。

本发明的技术方案如下：

一种纳米金属氧化物-米诺环素纳米缓释凝胶的制备方法，以生物可降解高分子材料包裹米诺环素及纳米金属氧化物制成纳米金属氧化物-米诺环素纳米粒，以卡波姆(carbopol-940)为基质，以卡波姆和生物可降解高分子材料作为缓释材料制成缓释凝胶；组分重量百分比为：米诺环素0.005％～0.5％(W/W)，生物可降解高分子材料20％～40％(W/W)，化学交联剂0.01％～0.02％(W/W)，纳米金属氧化物0.2％～0.6％(W/W)，卡波姆胶CBM-94060％～80％(W/W)，所述卡波姆胶是按照1g卡波姆胶固体：100mL蒸馏水置于40℃水浴搅拌至固体完全溶解得到。

所述的制备方法，纳米金属氧化物-米诺环素蛋白纳米粒尺寸为100nm左右。

所述的制备方法，所述生物可降解高分子材料包括聚乳酸(PLA)、羧甲基纤维素盐(CMC-Na)、海藻酸盐、白蛋白中的一种或多种。

所述的制备方法，所述的化学交联剂包括甲醛、戊二醛、多聚甲醛、多聚磷酸中的一种或几种。

所述的制备方法，所述的纳米金属氧化物包括氧化锌、氧化银、二氧化钛中的一种或多种。

所述的制备方法，所述纳米金属氧化物-米诺环素纳米粒的制备步骤如下：称取盐酸米诺环素溶于适量水中，将盐酸米诺环素水溶液加入磷酸盐缓冲液中，配置成盐酸米诺环素质量分数为0.05～50％的磷酸盐缓冲溶液，pH＝8，加入所述金属氧化物和生物可降解高分子材料，搅拌使之形成悬浊液；向上述悬浊液中加入有机相，水相与有机相的体积比为1∶4～1∶5，并加入所述的化学交联剂，搅拌30min，待其充分固化后离心，洗涤得金属氧化物-米诺环素纳米粒。

所述的制备方法，缓释凝胶的制备方法如下：取卡波姆胶固体，加入蒸馏水，水浴搅拌至固体完全溶解；冷却至室温后，放置到搅拌器中，边搅拌边加入质量分数为0.05％～10％的金属氧化物-米诺环素纳米粒，搅拌混匀，逐滴滴加三乙醇胺调节pH值，pH值为7时形成透明凝胶，超声波脱气后即得目标产品

根据任一所述的制备方法制备得到的纳米金属氧化物-米诺环素纳米缓释凝胶。

所述纳米金属氧化物-米诺环素纳米缓释凝胶在制备治疗口腔牙周疾病药物中的应用。

本发明的有益效果如下：

(1)活性氧化物纳米粒子携带药物分子通过内吞作用进入细胞并聚集在靶细胞的特定部位，提高靶区的药物浓度、药物利用率和疗效，降低药物的毒副作用以及一些不良反应。(2)缓控释效果好。可降解生物高分子材料和凝胶都具有缓控释作用，可以在牙周袋内维持较长时间的药物浓度，可持续起效10天。

附图说明

图1是本发明的活性氧化物-米诺环素纳米粒电镜图。

图2是本发明的体外实验结果：活性氧化物-米诺环素纳米粒凝胶细胞毒性研究。

图3是本发明的体外实验结果：活性氧化物-米诺环素纳米粒凝胶的抑菌性能测试。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1：纳米氧化锌-米诺环素白蛋白凝胶的制备

一、纳米氧化锌的制备

十六烷基三甲基溴化铵CTAB0.3644g、环己烷10ml置于反应瓶中，精确滴加异丙醇IPA5ml，室温搅拌至形成均匀的乳白色乳液；保持搅拌的状态，向溶液中缓慢滴加1mol/L的乙酸锌水溶液，直到溶液体系瞬间澄清。3000～4000rpm旋转离心得纳米氧化锌颗粒，粒径保持在20～200纳米。

二、米诺环素缓冲液的制备

100mg盐酸米诺环素胶囊内容物置于500mL烧杯中，加入200mL蒸馏水溶解，充分搅拌后过滤取清液，用氢氧化钠的甲醇溶液调至pH值为7.5，得50％浓度的米诺环素溶液。

取27.22g磷酸二氢钾于1000mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，得0.2mol/L磷酸二氢钾溶液。取8.00g氢氧化钠于1000mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，得0.2mol/L氢氧化钠溶液。取250ml磷酸二氢钾溶液(0.2mol/L)与230.5mL氢氧化钠溶液(0.2mol/L)于1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(pH值为8)。

取0.5％的米诺环素溶液0.1ml于10mL容量瓶中，加0.9ml磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液至刻度，摇匀，即得0.05％米诺环素缓冲液。

三、纳米氧化锌-米诺环素蛋白纳米粒的制备

取纳米氧化锌固体0.1mg、白蛋白4mg于10mL西林瓶中，加入0.05％米诺环素磷酸盐缓冲液1mL，室温下500rpm匀速搅拌10min后，加入4mL乙醇，稍微搅拌1min后，加入多聚磷酸20μL，继续搅拌30min后得纳米氧化锌-米诺环素蛋白纳米粒，粒径仪检测粒径发现粒径控制在300nm左右。

按照上述方法分别制备含氧化锌质量分数为0％、0.2％、0.4％、0.6％的纳米氧化锌-米诺环素的蛋白纳米粒。

四、纳米氧化锌-米诺环素凝胶的制备

取卡波姆胶固体1g于100mL烧杯中，加入100mL蒸馏水，置于40℃水浴搅拌至固体完全溶解。冷却至室温后，放置到搅拌器中，边搅拌边加入含氧化锌质量分数为0％、0.2％、0.4％、0.6％等不同浓度的纳米氧化锌-米诺环素的蛋白纳米粒，搅拌混匀，逐滴滴加三乙醇胺调节pH值，pH值为7时形成透明凝胶，超声波脱气30min后即得目标产品。

实施例2：纳米氧化银-米诺环素白蛋白凝胶的制备

一、纳米氧化银的制备

向含0.04mol/LNaOH溶液和环己烷各10mL的反应瓶中加入0.3688gCTAB固体，室温搅拌至固体完全溶解，向溶液中缓慢滴加0.04mol/L的硝酸银水溶液，40℃搅拌1h，溶液有黑褐色混浊生成。反应结束后，用低速自动平衡离心机在4000rpm离心分离，产物依次用无水乙醇、蒸馏水各洗涤3次以除去残留的离子和CTAB。洗涤后的产物置于60℃真空干燥箱中干燥1d，得到最终的纳米氧化银粉末，粒径保持在70～100纳米，粒径分布均匀，分散性较好。

二、米诺环素缓冲液的制备

100mg盐酸米诺环素胶囊内容物置于500mL烧杯中，加入200mL蒸馏水溶解，充分搅拌后过滤取清液，用氢氧化钠的甲醇溶液调至pH值为7.5，得50％浓度的米诺环素溶液。

取27.22g磷酸二氢钾于1000mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，得0.2mol/L磷酸二氢钾溶液。取8.00g氢氧化钠于1000mL容量瓶中，用水溶解并稀释至至刻度，得0.2mol/L氢氧化钠溶液。取250ml磷酸二氢钾溶液(0.2mol/L)与230.5mL氢氧化钠溶液(0.2mol/L)于1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(pH值为8)。

取0.5％的米诺环素溶液0.1ml于10mL容量瓶中，加0.9ml磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液至刻度，摇匀，即得0.05％米诺环素缓冲液。

三、纳米氧化银-米诺环素蛋白纳米粒的制备

取纳米氧化银固体0.1mg、白蛋白4mg于10mL西林瓶中，加入0.05％米诺环素磷酸盐缓冲液1mL，室温下500rpm匀速搅拌10min后，加入4mL乙醇，稍微搅拌1min后，加入化学交联剂多聚磷酸20μL，继续搅拌30min后得纳米氧化银-米诺环素蛋白纳米粒，粒径仪检测粒径发现粒径控制在300nm左右。

按照上述方法分别制备含氧化银质量分数为0％、0.2％、0.4％、0.6％的纳米氧化银-米诺环素的蛋白纳米粒。

四、纳米氧化银-米诺环素凝胶的制备

取卡波姆胶固体1g于100mL烧杯中，加入100mL蒸馏水，置于40℃水浴搅拌至固体完全溶解。冷却至室温后，放置到搅拌器中，边搅拌边加入质量分数为0％、0.2％、0.4％、0.6％等不同浓度的纳米氧化银-米诺环素的蛋白纳米粒，搅拌混匀，逐滴滴加三乙醇胺调节pH值，pH值为7时形成透明凝胶，超声波脱气30min后即得目标产品。

实施例3：纳米氧化钛-米诺环素白蛋白凝胶的制备

一、纳米氧化钛的制备

取6g硫酸钛于1000mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，得0.05mol/L硫酸钛溶液。取0.05mol/L的硫酸钛溶液1000mL置于烧杯中，在搅拌条件下，加入浓度为0.01mol/L的EDTA溶液50mL，静置一段时间后，用氢氧化钠溶液(0.1mol/L)调节溶液pH值至出现白色沉淀为止。水浴加热到80℃保温2小时，沉淀洗涤直到无硫酸根离子为止。洗涤后的产物置于150℃真空干燥箱中干燥2h，在红外线炉中在500℃下煅烧2小时，得到最终的纳米氧化钛颗粒，粒径保持在40～100纳米，粒径分布均匀，分散性较好。

二、米诺环素缓冲液的制备

100mg盐酸米诺环素胶囊内容物置于500mL烧杯中，加入200mL蒸馏水溶解，充分搅拌后过滤取清液，用氢氧化钠的甲醇溶液调至pH值为7.5，得50％浓度的米诺环素溶液。

取27.22g磷酸二氢钾于1000mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，得0.2mol/L磷酸二氢钾溶液。取8.00g氢氧化钠于1000mL容量瓶中，用水溶解并稀释至至刻度，得0.2mol/L氢氧化钠溶液。取250ml磷酸二氢钾溶液(0.2mol/L)与230.5mL氢氧化钠溶液(0.2mol/L)于1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(pH值为8)。

取0.5％的米诺环素溶液0.1ml于10mL容量瓶中，加0.9ml磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液至刻度，摇匀，即得0.05％米诺环素缓冲液。

三、纳米氧化钛-米诺环素蛋白纳米粒的制备

取纳米氧化钛固体0.1mg、白蛋白4mg于10mL西林瓶中，加入0.05％米诺环素磷酸盐缓冲液1mL，室温下500rpm匀速搅拌10min后，加入4mL乙醇，稍微搅拌1min后，加入多聚磷酸20μL，继续搅拌30min后得纳米氧化钛-米诺环素蛋白纳米粒，粒径仪检测粒径发现粒径控制在200nm左右。

按照上述方法分别制备含氧化钛质量分数为0％、0.2％、0.4％、0.6％的纳米氧化钛-米诺环素的蛋白纳米粒。

四、纳米氧化钛-米诺环素凝胶的制备

取卡波姆胶固体1g于100mL烧杯中，加入100mL蒸馏水，置于40℃水浴搅拌至固体完全溶解。冷却至室温后，放置到搅拌器中，边搅拌边加入质量分数为0％、2％、4％、6％等不同浓度的纳米氧化钛-米诺环素的蛋白纳米粒，搅拌混匀，逐滴滴加三乙醇胺调节pH值，pH值为7时形成透明凝胶，超声波脱气30min后即得目标产品。

图1是氧化锌-米诺环素白蛋白纳米粒粒径图，结果显示氧化锌-米诺环素纳米粒粒径保持在100nm以下，属于纳米粒。

细胞毒性试验：收集对数期L929小鼠成纤维细胞，加入96孔平底板，每孔加入100μ，在5％CO₂，37℃孵育至细胞单层铺满孔底。加入浓度梯度的药物，5％CO₂，37℃孵育16～48小时，倒置显微镜下观察。每孔加入20μlMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h后终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值，计算细胞存活率。图2是盐酸米诺环素溶液不同作用时间的细胞毒性实验结果；p＜0.05，同浓度相比较。由图1的体外实验结果可以看出：浓度小于50μg/mL的盐酸米诺环素溶液细胞毒性明显降低，经稀释后的盐酸米诺环素控释纳米凝胶不会对机体产生毒性、过敏反应及免疫作用。

抑菌性能测定以A：血液链球菌/高登链球菌(S.sanguis/S.gordonii)、B：口腔链球菌/缓症链球菌(S.oralis/S.mitis)为需氧菌的代表、C中间普氏菌/黑普氏菌(Prevotellaintemedia，Pi)和D牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，Pg)为厌氧菌的代表，用打孔法来评价水凝胶的抑菌效果。

将四种不同的菌接种到琼脂平板上，用直径为4mm的打孔器在每个营养琼脂平板上均匀打出4个孔。用微量移液器加入35μl配置好的不同纳米氧化锌含量的凝胶(米诺环素浓度为5μg/mL)。静置，倒置培养皿于37℃培养24h后，用游标卡尺测量抑菌直径。抑菌圈直径/mm＝总抑菌直径-孔直径(4mm)。图3是本发明的抑菌性能体外实验结果：抑菌圈直径大于7mm视为有抑菌活性。

可以看出，虽然未添加纳米氧化锌的凝胶对细菌有一定的抑菌作用，但是明显低于添加了不同含量纳米氧化锌的抑菌效果，且抑菌效果随着纳米氧化锌含量的增加而增强。当添加到0.6％时，其抑菌作用显著增强(P＜0.05)，达到明显的抑菌效果，而对照组的抑菌圈大小始终相对较小，结果见图3，A：血液链球菌/高登链球菌(S.sanguis/S.gordonii)、B：口腔链球菌/缓症链球菌(S.oralis/S.mitis)、C：中间普氏菌/黑普氏菌(Prevotellaintemedia，Pi)、D：牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，Pg))。由此可知，纳米氧化锌作为抑菌因子提高了凝胶的抑菌性能。添加的纳米氧化锌越多，对细菌的抑制效果越明显。由此可以推断，抑菌性能高低和纳米粒子的多少成正比，纳米氧化锌越多，具备抑菌活性的金属离子溶出越多，进而提高了凝胶的抑菌性能。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种纳米金属氧化物-米诺环素纳米缓释凝胶的制备方法，其特征在于：以生物可降解高分子材料包裹米诺环素及纳米金属氧化物制成纳米金属氧化物-米诺环素纳米粒，以卡波姆(carbopo1-940)为基质，以卡波姆和生物可降解高分子材料作为缓释材料制成缓释凝胶；组分重量百分比为：米诺环素0.005％～0.5％(W/W)，生物可降解高分子材料20％～40％(W/W)，化学交联剂0.01％～0.02％(W/W)，纳米金属氧化物0.2％～0.6％(W/W)，卡波姆胶CBM-94060％～80％(W/W)，所述卡波姆胶是按照1g卡波姆胶固体∶100mL蒸馏水置于40℃水浴搅拌至固体完全溶解得到。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：纳米金属氧化物-米诺环素蛋白纳米粒尺寸为100nm左右。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述生物可降解高分子材料包括聚乳酸(PLA)、羧甲基纤维素盐(CMC-Na)、海藻酸盐、白蛋白中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的化学交联剂包括甲醛、戊二醛、多聚甲醛、多聚磷酸中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的纳米金属氧化物包括氧化锌、氧化银、二氧化钛中的一种或多种。

6.根据权利要求1～5任一所述的制备方法，其特征在于：所述纳米金属氧化物-米诺环素纳米粒的制备步骤如下：

a)称取盐酸米诺环素溶于适量水中，将盐酸米诺环素水溶液加入磷酸盐缓冲液中，配置成盐酸米诺环素质量分数为0.05～50％的磷酸盐缓冲溶液，pH＝8，加入所述金属氧化物和生物可降解高分子材料，搅拌使之形成悬浊液；

b)向上述悬浊液中加入有机相，水相与有机相的体积比为1∶4～1∶5，并加入所述的化学交联剂，搅拌30min，待其充分固化后离心，洗涤得金属氧化物-米诺环素纳米粒。

7.根据权利要求1～5任一所述的制备方法，其特征在于：缓释凝胶的制备方法如下：取卡波姆胶固体，加入蒸馏水，水浴搅拌至固体完全溶解；冷却至室温后，放置到搅拌器中，边搅拌边加入质量分数为0.05％～10％的金属氧化物-米诺环素纳米粒，搅拌混匀，逐滴滴加三乙醇胺调节pH值，pH值为7时形成透明凝胶，超声波脱气后即得目标产品

8.根据权利要求1～5任一所述的制备方法制备得到的纳米金属氧化物-米诺环素纳米缓释凝胶。

9.权利要求8所述纳米金属氧化物-米诺环素纳米缓释凝胶在制备治疗口腔牙周疾病药物中的应用。