KR20030096369A - 저분자량 하이알루론산과 폴리펩티드 독소의 면역원성접합체 - Google Patents

저분자량 하이알루론산과 폴리펩티드 독소의 면역원성접합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 A군 및 C군 연쇄상구균에 의해 유발된 감염 및 질병의 치료 및 예방을 위한 항원성 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 저분자량 하이알루론산, 담체에 결합된 저분자량 하이알루론산 및 그를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 A군 및 C군 연쇄상구균와 교차반응성이 있고 천연 하이알루론산과는 극미한 교차반응성이 있는 저분자량 하이알루론산에 대한 항체를 유도한다. 본 발명은 A군 및 C군 연쇄상구균으로 감염되거나 또는 감염될 위험이 있는 이들을 위한 능동적 및 수동적 면역원성 보호를 둘다 제공하는데 특히 유용하다. 또한, 본 발명은 A군 및 C군 연쇄상구균에 의해 유발된 감염 및 질병을 진단하는데 유용한 방법 및 조성물을 제공한다.

Description

저분자량 하이알루론산과 폴리펩티드 독소의 면역원성 접합체 {Immunogenic Conjugates of Low Molecular Weight Hyaluronic Acid with Polypeptide Toxins}
하이알루론산 (HA)은 자연발생적 글리코스아미노글리칸이다. 이것은 N-아세틸글루코사민 및 글루쿠론산의 반복 단위로 구성된다. 도 1을 참조한다. HA는 동물 조직, 예를 들면, 척수액, 눈물, 윤활액, 피부, 및 일부 연쇄상구균, 예를 들어 A군 및 C군 연쇄상구균의 피막 (capsule)에 존재한다. 이러한 점액성 또는 고도로 피막화된 A군 연쇄상구균 균주 (strain)는 유달리 심한 감염 및 급성 류머티스열 둘다에 관련된다 [Johnson et al, 1992, J. Infect. Dis. 166:374-382]. A군 및 C군 연쇄상구균에 의해 유발되는 인간 침습성 연조직 감염은 상당한 이병률 및 사망률과 관련된다. C군 연쇄상구균도 또한 인두염 및 반응관절염과 관련된다. 또한,C군 연쇄상구균성 감염은 말에 널리 퍼져 있다.
A군 및 C군 연쇄상구균의 점액 집락 형태는 하이알루론산으로 구성된 피막 다당류가 다량 생산된 결과이다. A군 연쇄상구균의 하이알루론산 피막은 최근 이들 유기체의 병원성에 여러가지 중요한 역할을 담당하는 것으로 나타났다. 특히, HA 피막은 포식작용으로부터 점액성 A군 연쇄상구균을 보호하며 발병력에 중요한 역할을 담당한다 [Wessels et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8317-21; Dale et al., 1996, Infect. Immunol. 64:1495-501; 및 Moses et al., 1997 Infect. Immumol. 65;64-71]. 또한, HA 피막은 M 단백질로 매개된 부착을 변조하고, A군 연쇄상구균이 인간 각질세포 상의 CD44에 부착되도록 하는 리간드로서 작용한다. A군 연쇄상구균의 HA 피막은 고도로 보존성이면서도 표면에 노출되어 있는데, 이것은 HA가 다른 박테리아 균주가 인두 점막 및 피부에 부착되는 것을 위한 보편적인 부착 부위로서 작용할 수 있음을 나타낸다 [Schrager et al., 1998, J. Clin. Invest. 101:1708-16].
연쇄상구균와 같은 그램-양성 병원체로 감염되는 것의 예방 및 치료는 일단 확립되면 치료 및 근절이 어려운 저항성 주의 발생 때문에 특히 중요하다. 다당류 항원 또는 면역학적으로 불활성인 탄수화물 불완전항원을 단백질과 같은 가슴샘 의존성 (TD) 항원에 접합시키면 면역원성이 향상되나, 그러한 면역원성 반응이, HA에 대해 유도될 경우, A군 또는 C군 연쇄상구균와 같은 HA 함유 박테리아에 대한 보호성을 제공할 것인지는 명확하지 않다. 또한, HA는 포유동물 조직 및 연쇄상구균 둘다에 존재하므로, 숙주 조직에서 지시된 자가면역 반응을 유도할 가능성 때문에HA를 연쇄상구균의 감염을 치료 또는 예방하기 위한 탄수화물 항체로서 개발하는 것은 어렵다.
최근까지, HA는 비면역원성 분자인 것으로 생각되어 왔다 [Meyer, 1936, J. Biol. Chem. 114:689 및 Humphreys, 1943, Biochem J. 37:460]. 그러나, 보다 최근의 연구는 HA에 대한 수 종의 자연발생적 항체가 존재함을 나타낸다 [Underhill, 1982, Biophys. Res. Commun. 108:1488]. 필리트 (Fillit) 등은 리포솜에 결합된 HA로 마우스 내에 HA에 대한 항체를 유도하였다. 이들은 HA가 면역원성임을 보고하였고, 분자 상에서 2개의 항원결정기를 확인하였다. 필리트 등은 또한 HA가 리포솜에 전달 (presentation)되는 방식이 그의 면역원성에 중요하다는 점에 주목하였다. 마지막으로, 필리트 등은 HA 항체가 헤파란 황산염과 교차반응성이 있으며, 이러한 교차반응이 자가면역 혈관 질병의 발병기전에 연관될 수 있다고 보고하였다 [Fillit et al., 1988, J. Exp. Med. 168:971-982]. 상기 요약한 보고를 기준으로 하면, HA 또는 HA 접합체가 A군 및 C군 연쇄상구균와 같이 HA를 함유하는 박테리아로부터의 감염을 억제 또는 치료하기에 유용한 면역 반응을 유도할 것인지는 여전히 예측할 수 없다.
<발명의 요약>
본 발명은 폴리펩타이트 또는 단백질 담체에 접합된 HA 및 LMW-HA를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명의 접합체 분자는 A군 및 C군 연쇄상구균와 같이 HA를 함유하는 박테리아에 교차반응성이 있는 항체를 유도하는데 유용하다. 본 발명의 접합체 분자 및 이를 포함하는 제약 조성물은 A군 및 C군 연쇄상구균을 포함하는 상기 박테리아에 의해 유발된 감염 및 질병의 치료 및 진단 방법에 유용하다.
본 출원인은 놀랍게도 LMW-HA 접합체가 포유동물에서 면역원성임을 발견하였다. 더욱 놀랍게도, 본 출원인은 본 발명의 접합체에 의해 유도된 항체가 A군 및 C군 연쇄상구균와 교차반응성이 있으나 포유동물 조직과 관련된 천연 HA와 단지 극미한 교차반응성이 있음을 발견하였다.
LMW-HA를 폴리펩티드에 접합시키는 방법으로는 환원성 아미노화, 시아노겐 브로마이드 처리, 담체의 자유 아미노기 및 LMW-HA의 카르복실레이트 잔기 사이의 아미드 결합 형성, 또는 링커 (linker) 분자의 사용이 포함된다. 본 발명은 LMW-HA의 접합체 분자를 포함하는 제약 조성물, 및 A군 및 C군 연쇄상구균와 같은 HA 함유 박테리아에 의한 감염의 치료를 위한 백신 및 진단을 위한 항체를 유도하기 위한 이들 조성물의 용도를 제공한다. 탄수화물 T 세포 비의존성 반응을 T 세포 의존성 반응으로 전환시키는 임의의 폴리펩티드가 담체로서 사용하기에 적합하다. 예는 파상풍 유독소, 디프테리아 유독소 및 백일해 독소 또는 유독소와 같은 독소 및 유독소, 나이세리아 구멍단백 (porin), 예를 들면, 임균의 PorA, 및 수막염구균의 PorB이다.
본 발명은 또한 면역원성 LMW-HA-폴리펩티드 접합체로부터 유도된 제약 조성물, 백신 및 다른 면역원성 작용제를 제공한다.
본 발명은 또한 박테리아성 감염에 대한 포유동물의 면역화 방법에 관한 것이다. 이 방법은 질병 유발 유기체로부터 감염을 막기 위한 포유동물에 유효량의본 발명의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 이 방법은 A군 및 C군 연쇄상구균와 같이 HA를 함유하는 박테리아에 의한 감염을 예방 또는 치료하는데 유용한다.
본 발명은 또한 본 발명의 LMW-HA-폴리펩티드 접합체로 포유동물, 바람직하게는 인체에 항체를 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 다당류-폴리펩티드 접합체를 사용한 포유동물의 면역화에 대한 반응으로 유도된 면역글로불린 조성물 및 단리된 항체를 제공한다. 이러한 면역글로불린 및 단리된 항체는 치료제 및 진단제로서 유용하다.
생성된 면역글로불린 및 항체는 LMW-HA에 특이적이다. 본 발명의 접합체 분자는 또한 널리 공지된 방법에 따라 단클론항체 및 항개별특이형 항체를 발생시키는데 유용하다.
본 발명은 하이알루론산/폴리펩티드 접합체 분자, 및 그를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 하이알루론산, 보다 바람직하게는 저분자량 하이알루론산 (LMW-HA), 및 A군 및 C군 연쇄상구균 (Streptococcus) 둘다에 교차반응성이 있는, 하이알루론산에 대한 항체를 유도하는 LMW-HA/폴리펩티드 접합체 분자에 관한 것이다. 본 발명의 분자 및 그를 포함하는 제약 조성물은 A군 및 C군 연쇄상구균에 의해 유발되는 감염의 치료 및 예방 및 질병의 진단에 유용하다.
도 1: 하이알루론산 (HA)의 구조
도 2: 초음파분해 및(또는) 산 처리에 의한 항원성 저분자량 LMW-HA의 생성
도 3: 연쇄상구균의 HA 보호 에피토프 (epitope)의 구조; a) 초음파분해된 HA로부터의 사당류; b) 하이알루론산 분해요소의 작용후 생성된 사당류
도 4: 초음파분해된 HA-TT 접합체에 대한 토끼 항혈청의 ELISA 역가
도 5: 산 가수분해된 LMW-HA/TT 접합체에 대한 토끼 항혈청의 ELISA 역가
도 6: 초음파분해된 LMW-HA/TT 접합체에 대한 토끼 항혈청의 역가
도 7: 산 가수분해된 LMW-HA/TT 접합체에 대한 토끼 항혈청의 역가
도 8: LMW-HA/HSA 코팅된 플레이트 상의 산 가수분해된 HA, 초음파분해된 HA 및 초음파분해된 HA 접합체를 이용한 토끼 항혈청 # 75295의 억제
도 9: LMW-HA/HSA 코팅된 플레이트 상의 초음파분해된 HA, 천연 HA, D-글루쿠론산, HA 이당류 및 HA 사당류를 이용한 토끼 항혈청 # 75295의 억제
도 10: LMW-HA/HSA 코팅된 플레이트 상의 초음파분해된 HA, 천연 HA, D-글루쿠론산, HA 이당류 및 HA 사당류를 이용한 토끼 항혈청 # 72700의 억제
도 11: LMW-HA/HSA 코팅된 플레이트 상의 초음파분해된 HA, 천연 HA, HA 이당류, HA 사당류 및 HA 6당류/HA 8당류를 이용한 토끼 항혈청 # 72700의 억제
도 12: LMW-HA/rPorB 접합체에 대한 BALB/c 마우스 항혈청의 ELISA 역가
도 13: LMW-HA/rPorB 접합체에 대한 CD1 마우스 항혈청의 ELISA 역가
도 14: 토끼 항혈청을 이용한 Balb/c 마우스의 수동적 면역화; GAS 6형 (4,400 cfu/mL)을 이용한 항원투여. ▽ PBS/CFA에 대한 토끼 항혈청; ○ 초음파분해된 LMW-HA/TT에 대한 토끼 항혈청; ● 초음파분해된 LMW-HA/TT에 대한 토끼 항혈청; ▼ 초음파분해된 LMW-HA/TT에 대한 토끼 항혈청
도 15: 토끼 항혈청을 이용한 Balb/c 마우스의 수동적 면역화; GAS 3형 (2.5×105cfu/mL)을 이용한 항원투여. ▽ PBS/CFA에 대한 토끼 항혈청; ○ 초음파분해된 LMW-HA/TT에 대한 토끼 항혈청; ● 산 가수분해된 LMW-HA/TT에 대한 토끼 항혈청; ▼ 초음파분해된 LMW-HA/TT에 대한 토끼 항혈청
하이알루론산은 보호 및(또는) 치료 반응을 일으키기 위한 면역원으로 사용된다. 특히, HA는 A군 및 C군 연쇄상구균와 같이 표면 상에 HA를 갖는 박테리아와 교차반응성이 있는 면역 반응을 일으키는데 유용하다. 이론에 얽매임없이, A군 및 C군 연쇄상구균와 교차반응성이 있는 에피토프는 잔기가 약 3 또는 4인 길이를 가지며, 비환원성 말단에 위치한다고 생각된다. 비환원성 말단의 글루쿠론산 잔기가 포화 또는 불포화인지는 두 에피토프가 모두 보호성이 있으므로 크게 중요하지 않은 것으로 나타났다. 또한, 말단 글루쿠론산은 혈액 및 다른 신체 유체내에서 불포화 글루쿠론산으로 전환되는 것으로 나타났다. HA는 글리코스아미닐 또는 글루쿠로닐 잔기로 종결될 수 있고, HA의 비환원성 말단에서 글루쿠론산 또는 불포화 글루쿠론산의 백분율이 N-아세틸글루코사민의 백분율보다 크게 증가할 경우 면역 반응이 향상된다.
본 발명에 따라 천연 HA가 접합체의 제조에 사용할 수 있으나, 바람직하게는 약 3 또는 4개 내지 약 2000개의 당, 또는 약 600 달톤 내지 약 400 Kd의 크기를 갖는 LMW-HA를 접합체의 제조에 사용한다. 보다 바람직하게는, LMW-HA는 약 4개의 당 또는 2개의 반복 단위 내지 100 개의 반복 단위, 또는 약 800 달톤 내지 약 40 Kd의 크기를 갖는다. LMW-HA의 가장 바람직한 크기는 반복 단위 약 10 또는 약 20개, 또는 약 800 달톤 내지 약 4 또는 8 Kd이다. LMW-HA는 전형적으로 400 Kd 내지 수백만 달톤의 분자량을 갖는 천연 HA (시그마 (Sigma)로부터 입수하거나, 미국 특허 제4,141,973호에 따라 정제)로부터, 초음파분해 [Kubo K; et al., Glycoconj J., 1993, 10(6):435] 또는 화학적 방법 [Blatter G, Carbohydr. Res. 1996,288:109-125 및 Halkes K. M., Carbohydr. Res. 1998, 309: 161-164] 및(또는) 효소적 방법 [De Luca et al., J. Am. Chem. Soc. 1995 117:5869-5870]을 포함한 다양한 방법으로 얻을 수 있다.
본 발명은 또한 비환원성 말단에 글루쿠론산 잔기를 함유하는 LMW-HA 분자를 제공한다. 글루쿠론산 말단 HA 단편을 얻기 위한 한 방법은 문헌 [Kubo K, et al., Glycoconj J., 1993, 10(6):435]의 방법에 따라 천연 HA를 초음파분해하는 것이다. 글루쿠론산 말단을 갖는 분자의 백분율은 초음파분해 생성물을 엑소-β-N-아세틸 글루코사민 분해효소로 처리하여 임의의 비환원성 말단의 N-아세틸 글루코사미닐 잔기를 제거하여 분자의 비환원성 말단의 글루쿠로닐 잔기의 백분율이 보다 높은 LMW-HA을 제공함으로써 증가시킬 수 있다. LMW-HA를 얻는 다른 방법으로는 천연 HA를 온화한 산성 조건하에 처리하여 비환원성 말단에 N-아세틸 글루코사미닐 및 글루쿠로닐 잔기의 혼합물을 함유하는 분자를 생성시키는 것이다. 산 해중합된 LMW-HA 상의 말단 비환원성 글루코사미닐기를 엑소-β-N-아세틸 글루코사민 분해효소로 제거하여 분자의 비환원성 말단에 글루쿠로닐 잔기를 갖는 LMW-HA를 제공할 수 있다. 도 2를 참조한다. 본 발명은 또한 비환원성 말단에 4,5-불포화 글루쿠로닐 잔기를 함유하는 LMW-HA 분자를 제공한다. 도 3을 참조한다. 4,5-불포화 글루쿠로닐 말단 HA 단편을 얻기 위한 한 방법은 천연 HA를 하이알루론산 분해효소로 처리하는 것이다.
본 발명에 사용하기 위한 LMW-HA를 구성하는 단편의 약 90％ 이상은 비환원성 말단에 글루쿠론산 또는 불포화 글루쿠론산을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 LMW-HA 단편의 약 95％ 이상이 비환원성 말단에 글루쿠론산 또는 불포화 글루쿠론산을 갖는다.
초음파분해를 사용할 경우, 천연 HA는 인산염 완충 염수와 같은 적합한 용해시키고, 목적하는 양의 해중합이 얻어질 때까지 용액을 초음파분해할 수 있다. 예를 들어 문헌 [Kubo et al., Glycoconj. J, 1993, 10:435]를 참조한다. 이러한 처리로 얻어진 LMW-HA는 바람직하게는 분자량이 약 10 내지 20 Kd이고, 비환원성 말단에 글루쿠론산 잔기를 주로, 즉 95％를 넘게 함유한다.
또한, 비환원성 말단에 N-아세틸글루코사미닐 잔기 및 글루쿠로닐 잔기의 혼합물을 함유하는 LMW-HA 단편은 HA를 온화한 산 조건하에 처리하여 얻을 수 있다. 이 방법으로 얻어진 LMW-HA 단편의 약 50％는 비환원성 말단에 글루쿠론산을 갖는다. 산 처리에 이어, 엑소-β-N-아세틸 글루코사민 분해효소 (시그마로부터 입수가능)를 사용하여 단편으로부터 말단 비환원성 글루코사미닐기를 선택적으로 제거하여 분자의 말단에 글루쿠로닐 잔기를 노출시킨다. 반응 조건을 변화시킴으로써 말단 비환원성 글루코사미닐기를 갖는 단편의 백분율을 조절할 수 있다. 예를 들어, 비환원성 말단에 글루쿠론산을 갖는 단편의 목적하는 백분율을 얻기 위해 다양한 완료 시점에서 열 또는 pH로 효소를 중단시켜 반응을 중지시킬 수 있다.
또한, 환원성 말단에 N-아세틸-β-D-글루코사민 또는 β-D-글루쿠론산을 갖는 LMW-HA를 당업계에 공지된 방법으로 화학적으로 합성할 수 있다. 문헌 [Blatter G, Carbohydr. Res. 1996, 288:109-125 및 Halkes K. M., Carbohydr. Res. 1998, 309: 161-164]를 참조한다. 예를 들면, 적합하게 보호된 글루코사민-글루쿠론산 이당류를 먼저 상응하는 단당류로부터 제조할 수 있다. α-트리클로로아세트아미도글루코피라노스를 글리코실 공여체로서 사용하는 것과 같은 당업계에 공지된 방법으로 단당류를 커플링할 수 있다. 이어서, 생성된 이당류를 서로 반복적으로 커플링하여 다양한 크기의 LMW-HA를 형성할 수 있다. 예를 들어, 이당류의 글루쿠론산 부분의 아노머 (anomer) 보호기를 선택적으로 제거할 수 있다. 이 위치에 바람직한 보호기는 4-메톡시페닐기이다. 환원성 말단 이당류, 즉 제1 글리코실 수용체의 경우, 아노머 위치를 메톡시 잔기로 전환시킬 수 있다. 예를 들어, 먼저 4-메톡시페닐기를 세륨 암모늄 니트레이트로 처리하여 아노머 히드록실로 전환시키고, 생성된 아노머 히드록실기를 트리클로로아세토니트릴 및 DBU로 처리하여 α-트리클로로아세트이미데이트 잔기로 전환시키고, α-트리클로로아세트이미데이트 잔기를 무수 메탄올로 처리한 후 트리메틸실릴 트리플레이트 및 트리에틸아민으로 처리하여 메톡시 잔기로 전환시킬 수 있다. 글리코실 공여체로서 사용할 이당류의 경우, 아노머 위치를 상기한 바와 같이 α-트리클로로아세트이미데이트 잔기로 전환시킬 수 있다. 상기한 메톡시로 보호된 이당류는 글루코사민 잔기의 3 위치의 보호기를 선택적으로 제거한 후 글리코실 수용체로 사용할 수 있다. 이 위치에 바람직한 보호기는 에탄올 중의 피리딘 및 티오우레아로 처리하여 제거할 수 있는 클로로아세틸기이다. 이당류 공여체를 상호작용방식으로 수용체와 커플링시켜 LMW-HA를 생성할 수 있다. 즉, 연속적인 각각의 커플링은 하나의 반복 단위가 더 부가된 LMW-HA를 생성한다. 글루코사민 잔기를 위한 또다른 바람직한 보호기는 4,6-O-벤질리덴기 및 2-N-트리클로로아세트아미도기이다. 글루쿠론산 잔기를 위한또다른 바람직한 보호기는 6- 및 4-O-벤조일기 및 C6 메틸 에스테르이다. 이들 및 다른 보호기의 사용은 본원에 참고로 포함된 문헌 ["Protective Groups In Organic Synthesis," 2ndEd., by T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 1991, John Wiley ＆ Sons, Inc.]에 기재되어 있다.
HA 단편은 또한 우리딘 디인산염당 및 HA 합성효소를 사용하여 효소적으로 합성할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [De Luca et al., J. Am. Chem. Soc. 1995 117:5869-5870]를 참조한다. 상기 나중 2개의 방법은 말단에 임의의 백분율의 글루쿠론산을 갖는 LMW-HA의 합성을 가능하게 한다. 따라서, 효소 분해, 효소적 합성 또는 화학적 합성에 의한 LMW-HA의 형성은 약 98％ 초과, 또는 약 99％ 초과의 LMW-HA 단편이 비환원성 말단에 글루쿠론산 또는 불포화 글루쿠론산을 갖는 것을 가능하게 한다.
LMW-HA는 당업계에 공지된 방법으로 담체에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Dick and Beurret in Conjugate Vaccines, Cruse et al., eds., Contrib. Microbiol. Immunol., Basel, Karger, 1989, vol. 10, pp 48-114, 및 Jennings and Sood in Neoglycoconjugates: Preparation and Applications, Lee et al., eds., Chapter 10, pp 325-371, 1994, Academic Press, San Diego]를 참조한다. 이러한 방법으로는 환원성 아미노화, 카르복실레이트 잔기를 통한 커플링, 링커의 사용, 및 시아노겐 브로마이드 또는 그의 유도체의 사용이 포함된다. LMW-HA를 담체에 접합시킬 경우, 다당류의 비환원성 말단의 에피토프의 변경을 피하는 것이 바람직하다. LMW-HA를 담체에 접합시키는 바람직한 방법은 환원성 말단 당류에서의 환원성 아미노화와 같은 직접적인 접합이다. 예를 들어, 붕수소화물을 이용한 환원성 말단 잔기의 환원에 이은 과요오드산염 산화 및 환원성 아미노화에 의해 환원성 말단기를 LMW-HA 내로 선택적으로 도입할 수 있다. 예를 들어 제닝스 (Jennings)의 미국 특허 제4,356,170호를 참조한다.
LMW-HA를 LMW-HA의 주쇄 방향으로 다양한 위치에서 담체에 접합시키는 방법을 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 과요오드산염을 사용하여 LMW-HA를 활성화시켜 다당류의 주쇄 잔기에 알데히드기를 생성시킨 후, 활성화된 LMW-HA를 붕수소화물와 같은 환원제의 존재 하에 자유 아미노기를 함유하는 담체로 처리할 수 있다. 이 방법은 또한 단일 LMW-HA에 1개보다 많은 담체 분자를 접합시킬 수 있어 가교 결합을 가능하게 한다.
본 발명의 접합체 분자의 폴리펩티드 성분은 LMW-HA와 커플링될 경우 T 세포 의존성 반응을 이끌어내는 임의의 생리학적으로 허용가능한 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 폴리펩티드라는 용어는 펩티드, 폴리펩티드 및 천연, 개질 또는 재조합 단백질을 포함하는 단백질을 포함하는 일반적인 용어를 의도한 것이다. 담체로서 유용한 폴리펩티드의 예로는 박테리아성 독소, 유독소, 구멍단백, 외막 단백질, 및 교차반응성 단백질 재료가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 폴리펩티드로는 파상풍 유독소, 디프테리아 유독소 및 백일해 유독소, 연쇄상구균으로부터 유도된 면역원성 폴리펩티드, 인플루엔자로부터 유도된 면역원성 폴리펩티드, 수막염구균으로부터 유도된 면역원성 폴리펩티드, 폐렴쌍구균으로부터 유도된면역원성 폴리펩티드, 및 대장균 (E. coli)으로부터 유도된 면역원성 폴리펩티드가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 특히, 파상풍 유독소, 디프테리아 유독소, CRM197, 및 헤로필루스, 대장균 및 나이세리아로부터 유도된 구멍단백 폴리펩티드, 예를 들어 rPorB가 바람직하다. 예를 들어, 미국 특허 제5,439,808호를 참조한다.
본 발명에 따라 제조된 접합체 분자는 전형적으로 1개 이상의 하이알루론산 단편이 다당류 단편의 주쇄의 말단의 단일 결합 부위를 통해 결합되어 있는 담체 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 따라서, 본 발명은 원할 경우 한쪽 말단을 제외하곤 다당류 성분이 담체에 의해 가리워지지 않은 저분자량 하이알루론산 접합체 분자를 제조할 수 있는 능력을 제공한다. 이러한 유형의 접합체는 네오글리코단백질이라고 언급할 수 있다. 예를 들어, 상기 딕 (Dick) 및 보이렛 (Beurret)의 문헌을 참조한다. 별법으로, 본 발명에 따라 가교결합된 접합체를 형성할 수 있다. 이러한 유형의 접합체는 격자 접합체로 언급할 수 있다. 예를 들어 상기 딕 및 보이렛의 문헌을 참조한다.
본 발명의 접합체 분자에서 LMW-HA : 폴리펩티드 또는 단백질의 분자 비율은 폴리펩티드 또는 단백질 1개 분자 당 LMW-HA 약 1개 내지 약 100개 분자인 것이 바람직하다. 상기 비율은 폴리펩티드 또는 단백질 1개 분자 당 LMW-HA 또는 에피토프 약 10개 및 약 20개 분자인 것이 보다 바람직하다. 별법으로, LMW-HA : 폴리펩티드 또는 단백질의 비율은 중량비로 결정될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 접합체 분자에서 폴리펩티드 또는 단백질 중량에 대해 LMW-HA는 약 10 중량％ 내지 약 500 중량％이다. 바람직하게는, 본 발명의 접합체에서 폴리펩티드 또는 단백질 중량에 대해 LMW-HA는 약 30 중량％ 내지 약 100 중량％이다. 한 실시양태에서, 고도의 저분자량 하이알루론산, 즉, 반복 단위가 약 20개 미만인 하이알루론산을 사용하여 에피토프의 밀도가 증가된 접합체를 형성한다. LMW-HA/폴리펩티드 또는 단백질 비율은 접합 조건의 조정, 특히, 접합 반응시에 출발 성분들의 비율을 조정하여 변화시킬 수 있다.
본 발명은 폴리펩티드 또는 단백질에 접합된 저분자량 하이알루론산을 포함하는 접합체 분자를 제공할 뿐만 아니라, 여러가지 다당류들이 단일 폴리펩티드에 접합된 다가 접합체 및 이를 포함하는 제약 조성물 및 백신도 포함한다. 예를 들면, 저분자량 하이알루론산을 다른 다당류들과 다양하게 배합하여 폴리펩티드 또는 단백질에 결합시킬 수 있다. 이러한 다당류의 예는 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilous influenzae) b형의 피막 다당류; B군 연쇄상구균 Ia형 및 Ib형, II형, III형, IV형, V형, VI형 및 VIII형; 수막염구균 A군, B군 및 C군; 및 A군 연쇄상구균 다당류 등이 있다.
본 발명에 따른 면역원성 접합체는 포유동물, 특히 인간 및 말에서 HA를 함유하는 박테리아, 예를 들어 A군 및 C군 연쇄상구균에 의한 감염에 대한 보호를 제공하는데 중요한 백신과 같은 유용한 제약 조성물을 제공한다. 추가로, 이들 백신을 출생 전의 신생아에게 보호 항체를 제공하는 수단으로서 임산부에게 투여하는데에도 유용하다.
본 발명의 면역원성 조성물은 예방, 치유 및 진단 목적에 유용한 단클론 항체, 다클론 항체 또는 항개별특이형 항체를 발생시키는 수단으로서 사용할 수 있다. HA를 함유하는 박테리아, 예를 들어 A군 또는 C군 연쇄상구균에 의한 다양한 감염 및 그에 의해 유발된 질환을 모니터링하고 검출하는 진단 목적에 특히 유용하다. 본 발명의 면역원성 조성물은 특히 A군 또는 C군 연쇄상구균에 감염되거나 또한 감염될 위험이 있는 개체에서 능동적 및 수동적 면역원성 보호 둘다를 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 수동적 보호에 사용되는 살균 항체는 포유동물을 본 발명의 임의의 면역원성 조성물로 면역화시킨 후에 살균 항체를 회수하여 생성된다. 본 발명에 사용하기 위한 살균 항체는 혈청, 감마 글로불린 분획물과 같은 부분적으로 정제된 분획물 중에 존재하거나 정제된 항체일 수 있다. 예를 들면, 단백질 A-아가로스 또는 단백질 G-아가로스를 사용하여 조 단백질 혼합물, 예를 들어 혈청 또는 복수액으로부터 IgG를 정제할 수 있다. 단백질 A는 IgG의 Fc 부분에 결합한다. 또한, 단백질 G는 Fc 영역에 결합하지만 Fab 영역에도 결합할 수 있어서, IgG의 F(ab)'2단편 정제에 유용하다. IgG의 조 샘플은 단백질 A-아가로스 컬럼 또는 단백질 G-아가로스 컬럼을 사용하여 정제할 수 있다. 혈청 샘플, 복수액 또는 조직 배양 상청액은 컬럼에 로딩하기 전에 완충액을 사용하여 1 : 1 이상으로 희석해야 한다. 샘플을 로딩한 후에는 컬럼을 세척 완충액, 예를 들어 20 mM 인산나트륨, 150 mM NaCl (pH = 7.4)을 사용하여 불순물 대부분이 제거될 때까지 세척한다. 이어서, IgG를 용출 완충액, 예를 들어 100 mM 글리신 (pH = 3.0)으로 용출시킨다.이어서, IgG를 투석여과로 농축하거나 이온 교환 크로마토그래피 또는 크기 배제 크로마토그래피를 통해 추가로 정제할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 단클론 항체를 기초로 하는 "인간화" 항체 (키메라 항체 및 CDR-이식된 항체 등), 항체 단편 및 특히 이중특이적 항체를 고려하며, 이를 테면 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 생산된 재조합 항체-관련 생성물 등이다. 예를 들어 Fab 단편 및 F(ab')2단편과 같은 항체 단편은, 본 발명의 항체의 가변 영역에 대한 구조적 (서열) 정보를 결정한 후에 대장균, 효모, 곤충 및 포유동물 세포 등과 같은 숙주 세포에 의해 배양물 내에 생산될 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제6,180,377호를 참조한다. 가변 영역에 대한 서열 정보를 이용하여, CDR-이식된 항체를 제조할 수도 있다. 또한, 키메라 항체 (예를 들어 마우스/인간 항체)는 형질전환된 마우스 골수종 세포 또는 하이브리도마 세포를 사용하여 제조할 수 있고, 이중특이적 항체는 하이브리드 하이브리도마 세포를 사용하여 제조할 수 있다.
전형적으로, 본 발명의 제약 조성물 및 백신은 저분자량 하이알루론산 및(또는) 접합체를 적합한 제약상 허용가능한 담체, 예를 들어 생리 염수, 인산염 완충 염수 또는 다른 주사가능한 액체 중에 분산시켜 형성된다. 상기 제약 조성물 또는 백신은 비경구 투여할 수 있으며, 예를 들어 피하, 복강내 또는 근육내 투여할 수 있다. 백신과 같은 제약 조성물에 통상적인 첨가제를 추가할 수도 있으며, 이의 예로는 안정화제, 예를 들어 락토스 또는 소르비톨 및 보조제, 예를 들어 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 황산알루미늄, 모노포스포릴 지질 A, QS21 또는 스테아릴 티로신 등이 있다. 이러한 제약 조성물은 저분자량 하이알루론산, 그의 접합체 또는 저분자량 하이알루론산 및(또는) 그의 접합체에 대한 항체를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 단독으로 투여되거나 1종 이상의 다른 작용제, 예를 들어 보조제 또는 안정화 화합물과의 배합물로 투여될 수 있으며, 이는 염수, 완충 염수, 덱스트로스 및 물 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는 임의의 살균된 생체적합성 제약 담체 중의 형태일 수 있다. 상기 조성물은 환자에게 단독으로 투여되거나 다른 작용제, 약물, 호르몬 또는 생물학적 반응 개질제와의 배합물로 투여될 수 있다.
상기 제약 조성물 및 백신은 면역원성 반응을 일으키기에 충분한 양으로 투여한다. 통상적으로, 투여량은 체중 1 kg 당 접합체 분자 약 0.1 ㎍ 내지 50 ㎍의 범위일 것이다. 투여량은 개체의 몸집, 체중 또는 연령에 따라 조정될 수 있으며, 이는 당업자의 수준 내이다. 최적의 면역성을 위해서는 일련의 투여를 반복할 수 있다. 개체 내에서의 항체 반응은 항체 역가 또는 살균 활성을 측정하여 모니터링할 수 있고, 필요에 따라서는 반응을 증진시키기 위해 개체를 부스팅 (boosting)할 수 있다.
본 발명은 HA를 함유하는 박테리아, 특히 A군 또는 C군 연쇄상구균에 감염되거나 그에 노출될 위험이 있는 포유동물에게 수동적 면역을 제공하는데 유용한 항체, 예를 들어 정제된 항체, 감마 글로불린 분획물 및 혈청을 포함하는 조성물을 제공한다. 연쇄상구균에 의해 유발된 많은 병리 상태 중에서 침습성 연조직 감염은 상당한 이병률 및 사망률과 관련이 있다. 예를 들어 문헌 [Ashbaugh et al. J.Clin. Invest., 1998, 102:550]을 참조한다. 본 발명이 제공하는 IgG, 항체 단편, 항체, 감마 글로불린 분획물 및 혈청은 HA를 함유하는 박테리아, 예를 들어 A군 및 C군 연쇄상구균에 의한 감염 및 그로 인한 조직 괴사 및 그러한 감염으로 발생하는 다른 병리 상태를 억제하거나 예방하는데 유용하다. 전형적으로, 항체, 예를 들어 정제된 항체, 감마 글로불린 분획물 및 혈청을 포함하는 제약 조성물은 상기 항체를 적합한 제약상 허용가능한 담체, 예를 들어 생리 염수, 인산염 완충 염수 또는 다른 주사가능한 액체 중에 분산시켜 형성된다. 상기 제약 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 예를 들어 피하, 복강내 또는 근육내 투여할 수 있다. 제약 조성물에 통상적인 첨가제를 추가할 수도 있다. 상기 조성물은 단독으로 투여되거나 1종 이상의 다른 작용제, 예를 들어 안정화 화합물과의 배합물로 투여될 수 있으며, 이는 염수, 완충 염수, 덱스트로스 및 물 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는 임의의 살균된 생체적합성 제약 담체 중의 형태일 수 있다. 상기 조성물은 환자에게 단독으로 투여되거나 다른 작용제, 약물, 호르몬 또는 생물학적 반응 개질제와의 배합물로 투여될 수 있다.
항체를 포함하는 제약 조성물은 박테리아 감염 억제에 충분한 양으로 투여한다. 투여량은 개체의 몸집, 체중 또는 연령에 따라 조정될 수 있으며, 이는 당업자의 수준 내이다. 최적의 면역성을 위해서는 일련의 투여를 반복할 수 있다. 개체 내에서의 투여량 반응은 항체 역가 또는 살균 활성을 측정하여 모니터링할 수 있고, 필요에 따라서는 반응을 증진시키기 위해 개체에게 추가로 투여할 수 있다.
본 발명에 따라 제조한 항체는 다양한 면역시약을 제조하는데 유용하고 면역분석시에 사용하기에도 유용하다. 예를 들면, 면역분석을 위해서 저분자량 하이알루론산 단편 또는 그들의 접합체를 고체 지지체에 직접 고정시키거나, 폴리펩티드 링커 등을 비롯한 링커를 통해 고정시킬 수 있다. 고정화에는 접합체 제조에 사용한 방법과 유사한 방법을 사용할 수 있다. 이어서, HA를 함유하는 박테리아, 예를 들어 A군 또는 C군 연쇄상구균의 존재를 검출하기 위해서, 상기 항체를 방사선면역 분석 및 ELISA 등을 비롯하여 당업계에 공지된 다양한 면역분석 시스템에 사용할 수 있다. 이러한 분석법을 사용하여 혈청 또는 다른 체액 중에 A군 또는 C군 연쇄상구균 항체의 존재 여부에 관해 분석함으로써, 개체에서 감염의 존재를 진단할 수 있다.
본원에서 제시한 실시예는 본 발명을 수행하는 다양한 측면을 예시하려는 것이며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 본 명세서에서 언급하는 모든 간행물, 특허 문헌 및 논문은 그 전문이 본 명세서에 도입된다.
실시예 1: LMW-HA의 제조
산 가수분해에 의한 하이알루론산의 해중합
하이알루론산 (100 mg, 라이프코어 (Lifecore) 제품번호 1-9062-5)을 0.05 N HCl 용액 10 mL에 첨가했다. 상기 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 가열하고 교반하여 고체 전체를 용해시켰다. 이어서, 상기 샘플을 100℃에서 1.5시간 동안 더 가열했다. 수퍼로스 (Superose) (등록상표) 12 HR 10/30 컬럼 (파르마샤 (Pharmacia) 제품)이 장착된 바이오-래드 (Bio-Rad) 시스템 (바이올로직(Biologic))에서 다양한 시간마다 반응 혼합물로부터 분취액을 취하여 해중합을 모니터링하고 분석하였다. 상기 용액을 0.5 N NaOH로 중화시킨 후에, 분자량 컷-오프 (cut-off) (MWCO)가 3,500인 디아플로 (Diaflo) (등록상표) 막으로 투석하여 동결건조시켰다. 상기 생성물을 수퍼덱스 (Superdex) (등록상표) 200 PG 컬럼 (파르마샤 제품)을 통해 분자 크기별로 분획화하여 고체 생성물 65 mg을 수득했다. 샘플을 500 MHz에서1H-NMR 분석하여, 하이알루론산 (HA)의 이당류-반복 단위 구조를 확인하였다. 생성된 단편의 평균 분자량은, 다각도 레이저 광 산란 광도측정기 (SEC-MALLS)와 커플링시킨 크기 배제 크로마토그래피로 측정했을 때 약 12,000 달톤인 것으로 추정되었다.
비환원성 말단에 D-글루쿠론산을 함유하는 HA 올리고당의 제조
하이알루론산 (100 mg, 라이프코어 제품번호 1-9062-5)에 0.1 N HCl을 80℃에서 10시간 동안 처리했다. 상기 용액을 0.5 N NaOH로 중화시키고, 세파덱스 (Sephadex) (등록상표) G-20 컬럼 (파르마샤 제품)을 사용하여 물로 용출시켜 염을 제거하였다. 염이 제거된 생성물을 동결건조시키고 β-N-아세틸 글루코스아미니다제 (EC 3.2.1.30; 칼바이오켐 (Calbiochem) 제품)으로 처리하여, 반복 단위가 약 4개 내지 약 20개이고 비환원성 말단에 D-글루쿠론산을 함유하는 LMW-HA 단편을 생성했다. 올리고당의 구조는 NMR 분광법 및 메틸화 분석을 통해 확인하였다.
초음파분해에 의한 하이알루론산의 해중합
하이알루론산 (100 mg, 라이프코어 제품번호 1-9062-5)을 10 mM PBS 완충액20 mL 중에 용해시키면서, 상기 현탁액을 용해될 때까지 교반하였다. 브란손 (Branson) 초음파분해기 모델 450로 샘플을 18시간 동안 초음파분해했다 (초음파분해 설정값: 출력 조절 3; 듀티 사이클 (Duty cycle) 50％, 온도 2℃). 투석 및 동결건조 후에 고체 생성물 57 mg을 회수하였다. 이로써 수득한 초음파분해된 하이알루론산의 평균 분자량은 미니다운 (MiniDawn) 기기 (미국 캘리포니아주 산타 바바라에 소재하는 야트 테크놀로지 (Wyatt technology) 제품) 및 수퍼로스 (등록상표) 12 HR 10/30 컬럼 (파르마샤 제품)을 사용한 SEC-MALLS에 의해 18,000 달톤인 것으로 측정되었다. 500 MHz에서 샘플을1H-NMR 분석하여, 하이알루론산의 이당류-반복 단위 구조를 확인하였다.
실시예 2: LMW-HA 접합체의 제조
NaBH 4 를 사용한, 산-처리된 하이알루론산의 환원
염산 (65 mg)으로 해중합시킨 하이알루론산을 탈이온수 6.5 mL 중에 용해시켰다. 0.5 N NaOH을 사용하여 pH를 10으로 조정하고, 이 용액에 NaBH464.5 mg을 첨가했다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 유지시켰다. 잉여 NaBH4는 1 M 아세트산으로 소실시켰다. MWCO 3,500인 디아플로 (등록상표) 막을 사용하여 탈이온수에 대해 투석한 후에 동결건조시켜 고체 생성물 35 mg을 수득했다.
환원된 산-처리된 하이알루론산의 과요오드산염에 의한 산화
환원시켜 크기에 따라 분류한 (sized) 다당류의 18 mg짜리 샘플 2개를 각각10 mM NaIO4수용액 1.3 mL 및 0.87 mL 중에 용해하여, 각각의 산화도 (d.o.)가 10％ 및 20％로 달성되었다. 상기 반응물을 암(暗)조건하에 2시간 동안 실온에서 교반하고, 각각을 에틸렌 글리콜 20 ㎕로 급냉시켰다. 이어서, 상기 반응 혼합물을 투석하고 동결건조시켜 고체 생성물 17 mg을 수득했다.
산-처리된 하이알루론산-파상풍 유독소 접합체 (LMW-HA/TT)의 제조
과요오드산염으로 산화되고 (d.o. 10％ 및 20％) 산-처리된 하이알루론산 (각각 10 mg씩) 및 정제된 파상풍 유독소 단량체 (각 샘플 당 5 mg, 덴마크 코펜하겐에 소재하는 스타텐스 세럼 인스티튜트 (Statens Serum Institute) 제품)를 0.2 M 인산나트륨 (pH = 7.4) 0.5 mL 중에 용해시켰다. 재결정화시킨 시아노붕수소화나트륨 (각 샘플 당 10 mg)을 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 밤새 유지시켰다. 수퍼로스 (등록상표) 12 HR 10/30 컬럼 (파르마샤 제품)이 장착된 바이오-래드 (바이올로직) 시스템에서 반응의 진행을 다양한 시간마다 모니터링했다. 다당류와 단백질의 접합은 컬럼의 공극 부피로 용출된 UV (280 nm) 피크의 점진적인 증가로 지시되었다. 접합이 완료된 후, 각 샘플에 0.1 N NaOH 1 mL 중 NABH410 mg을 첨가하여 임의의 남아있는 미접합된 알데히드를 환원시켰다. 상기 접합체를 수퍼덱스 (등록상표) 200 PG 컬럼 (1.6 ×60 cm) (파르마샤 제품)에 통과시키면서 0.01％ 티메로살을 함유하는 10 mM PBS로 용출시켜 정제하였다. 공극 부피 피크에 상응하는 분획물을 풀링 (pooling)하고 4℃에서 저장했다. 이들 각각은 다당류의 10％ 및 20％가 산화된 것이며, 각각을 접합체 1 및 접합체 2라고 명명하였다.
초음파분해된 하이알루론산의 과요오드산염에 의한 산화
초음파분해된 다당류의 26 mg 및 30 mg짜리 샘플 2개를 각각 탈이온수 2 mL 및 1.5 mL 중에 용해시키고 각각을 10 mM 수성 NaIO40.65 mL 및 1.5 mL로 처리하여, 산화도 (d.o.)가 각각 10％ 및 20％로 달성되었다. 상기 반응물을 암조건하에 2시간 동안 실온에서 교반하고, 각각의 반응물을 에틸렌 글리콜 20 ㎕로 급냉시켰다. 이어서, 상기 용액을 투석하고 동결건조시켜 각각에서 생성물 24 mg 및 25 mg을 수득했다.
초음파분해된 하이알루론산-파상풍 유독소 접합체 (LMW-HA/TT)의 제조
초음파분해되고 과요오드산염으로 산화된 HA (각 샘플 당 7 mg, d.o. 10％ 및 20％) 및 정제된 파상풍 유독소 단량체 (각 샘플 당 3.5 mg)를 0.2 M 인산나트륨 (pH = 7.4) 350 ㎕ 중에 용해시켰다. 시아노붕수소화나트륨 (각 샘플 당 7 mg)을 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 밤새 유지시켰다. 수퍼로스 (등록상표) 12 HR 10/30 컬럼 (파르마샤 제품)이 장착된 바이오-래드 (바이올로직) 시스템에서 각 접합 반응의 진행을 다양한 시간마다 모니터링한 후에 분석하였다. 다당류와 폴리펩티드의 접합은 컬럼의 공극 부피로 용출된 UV 흡광 피크 (280 nm)의 점진적인 증가로 지시되었다. 접합이 완료된 후, 상기 반응 혼합물에 NABH4(각 샘플 당 0.1 N NaOH 1 mL 중 10 mg)를 첨가하여 임의의 남아있는 미접합된 알데히드를 환원시켰다. 상기 접합체를 수퍼덱스 (등록상표) 200 PG 컬럼 (파르마샤 제품)에 통과시키면서 0.01％ 티메로살을 함유하는 10 mM PBS로 용출시켜 정제하였다. 공극 부피피크에 상응하는 분획물을 풀링하여 4℃에서 저장했고, 이들 각각은 다당류의 10％ 및 20％가 산화된 것이며, 각각을 접합체 3 및 접합체 4라고 명명하였다.
초음파분해된 하이알루론산과 재조합 클래스 3 나이세리아 ( Neisseria ) 구멍단백 (LMW-HA/rPorB)의 커플링
초음파분해되고 과요오드산염으로 산화된 하이알루론산 (20 mg, d.o. 20％ ) 및 rPorB (10 mg)를 0.25 M NaCl 및 0.05％ 쯔비터전트 (Zwittergent) Z 3,14 (미국 캘리포니아주 산 디에고에 소재하는 칼바이오켐 제품)를 함유하는 0.25 M HEPES 완충액 (pH = 8.5) 717 ㎕ 중에 용해시켰다. 시아노붕수소화나트륨 (20 mg)을 첨가하고, 상기 혼합물을 37℃에서 1일 동안 인큐베이션시켰다. 접합이 완료된 후, 상기 반응 혼합물에 0.1 N NaOH 1 mL 중의 붕수소화나트륨 10 mg을 첨가하여 임의의 남아있는 알데히드를 제거하였다. 상기 접합체를 수퍼덱스 (등록상표) 200 PG 컬럼 (파르마샤 제품)에 통과시키면서 0.01％ 티메로살을 함유하는 10 mM PBS로 용출시켜 정제하였다. 280 nm에서의 UV 흡광도를 모니터링했을 때 공극 부피 피크에 상응하는 분획물을 풀링하여 4℃에서 저장하였고, 접합체 5라고 명명하였다.
ELISA 코팅 항원으로서 하이알루론산-인간 혈청 알부민 접합체 (LMW-HA/HAS)의 제조
산-처리되고 초음파분해되어 과요오드산염으로 산화 (d.o. 10％)된 하이알루론산 및 인간 혈청 알부민 (HSA, 플루카 (Fluka) 제품)을 인산나트륨 완충액 (pH = 7.4) 0.5 mL 중에 용해시켰다. 시아노붕수소화나트륨을 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 1일 동안 인큐베이션시켰다. 접합이 완료된 후에는 다른 접합체에 대해 기재한 바와 같이 상기 반응 혼합물에 0.1 N NaOH 중의 붕수소화나트륨을 첨가하여 임의의 남아있는 알데히드를 제거하였다. 상기 접합체를 투석하고 동결건조시켰다.
LMW-HA/단백질 접합체의 물리화학적 특징
접합체 담체 단편화 방식 PS d.o. 접합체 중 HA의 비율(％)
1 TT 초음파분해 10 30
2 TT 초음파분해 20 28
3 TT 산 가수분해 10 31
4 TT 산 가수분해 20 20
5 rPorB 초음파분해 20 16
접합체 중의 하이알루론산 함량 및 단백질 함량은 각각 카르바졸 (우론산에 대한 것임) [Bitter, T. 1962 Anal. Biochem. 4:330] 및 쿠마시 (coomassie) (바이오-래드 제품) 분석법으로 측정했다.
실시예 3: 하이알루론산 올리고당 억제제의 단리
10 mM PBS 중 내용물이 스트렙토마이세스 하이알루롤리티쿠스 (Streptomyces hyalurolyticus)의 하이알루론산염 분해효소 (EC 4.2.2.1) (시그마 바이오케미칼스 (Sigma Biochemicals) 제품)인 3개 앰플을 초음파분해된 하이알루론산 (60 mg)에 첨가하고 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 반응 혼합물을 1분 동안 100℃의 수조에서 비등시켜 반응을 중지시켰다. 용출액으로서 10 mM PBS (유속 0.75 mL/분)를 사용하는 수퍼덱스 (등록상표) 펩티드 컬럼 (파르마샤 제품)이 장착된 바이오-래드 시스템 (바이올로직)에서 반응 혼합물로부터 분취액을 취하여 효소 소화의 진행을 모니터링하고 분석하였다. 상기 용액을 추가의 정제시까지 4℃에 저장하였다.
올리고당의 단리는, 다이오드-배열 검출기, 프로그래밍가능한 자동 주입기, 분획물 수집기 및 시스템 제어 및 데이타 수득/처리를 위한 휴렛 패커드 켐스테이션 (Hewlett Packard Chemstation) 소프트웨어 프로그램이 장착된 HPLC 1090 (휴렛 패커드 1090 시리즈 II) 시스템을 사용하여 Mono-Q HR 5/5 컬럼 (파르마샤 제품)으로 음이온-교환 크로마토그래피하여 수행했다. 트리스-HCl 완충액 중 단계별 구배의 염화나트륨을 사용하여 분리하였다. 각각 18분 내지 26분 사이에 용출된 이량체 (DP2) 및 28분 내지 31분 사이에 용출된 사량체 (DP4)에 상응하는 2개의 올리고당 분획물을 수집하여 동결건조시키고, 세파덱스 G-10 컬럼 (파르마샤 제품)을 사용하고 용출액으로서 탈이온수를 사용하여 염을 제거했다. 상기 올리고당의 구조는 500 MHz에서1H-NMR 스펙트럼을 조사하여 확인하였다. DP2 올리고당은 Δ4,5-β-GlcU-(1,3)-D-GlcNAc에 상응하였고, DP4는 Δ4,5-β-GlcU-(1,3)-β-D-GlcNAc-(1,4) -β-D-GlcU-(1,3)-β-D-GlcNAc에 상응하였다.
실시예 4: 혈청학적 연구 - 저분자량 하이알루론산 (LMW-HA)에 대한 토끼 항혈청의 면역특이성
면역원성 연구
LMW-HA/TT를 사용하여 뉴질랜드 흰토끼를 21일 간격으로 3회 (제0일, 제21일 및 제41일) 피하 면역화시켰고, 이때 LMW-HA/TT (1차 투여시에는 프로인트 (Freund's) 완전 아쥬반트 중이었고, 2차 및 3차 투여시에는 불완전 프로인트 아쥬반트 중이었음) 1회 투여 당 접합된 다당류 10 ㎍을 사용했다. 제21일, 제31일 및제41일에 토끼의 귀에서 채혈하고, 3차 면역화 10일 후에는 심장 천자(穿刺) 시험을 수행했다.
LMW-HA/HSA 코팅된 플레이트에서 토끼 항혈청의 적정
PBS (50 mM 인산나트륨, 150 mM NaCl, pH = 7.4) 중에 희석한 초음파분해된 LMW-HA/HSA 또는 산 가수분해된 LMW-HA/HSA 접합체 (100 ㎕/웰 중 대략 25 ng PS)로 미량역가 플레이트 (넌크 폴리소르프 (NUNC Polysorp) 제품)를 1시간 동안 37℃에서 수동적으로 코팅했다. 플레이트를 PBS + 0.05％ Tween (등록상표) 20 (PBS Tween, pH = 7.4)으로 세척한 후에 150 ㎕/웰 PBS + 0.1％ 소 혈청 알부민 (PBS + BSA, pH = 7.4)으로 1시간 동안 실온에서 후코팅했다. 후코팅 후에는 플레이트를 다시 세척하고 사용할 때까지 2℃ 내지 8℃에서 저장했다.
초음파분해된 LMW-HA/HSA 또는 산 가수분해된 LMW-HA/HSA를 사용하여 최종 부피 100 ㎕/웰로 코팅시킨 미량역가 플레이트의 웰에서 토끼 항혈청을 PBS Tween 중에 계단식으로 희석하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 상기 플레이트를 PBS Tween으로 세척하고, 각 웰에 PBS Tween 중 1 : 2,500으로 희석한 염소 항토끼 IgG-양고추냉이 과산화효소 접합체 (키르케가아드 (Kirkegaard)와 페리 (Perry)의 연구소) 100 ㎕을 첨가하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시킨 후에 다시 세척하고, 각 웰에 TMB 기질 용액 (KPL 제품) 100 ㎕을 첨가했다. 플레이트를 5분 내지 10분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 각 웰에 1-성분 중지 용액 (KPL 제품) 100 ㎕을 첨가하여 발색을 중지시켰다. 각 웰의 광학 밀도를 450 nm에서 판독하였고, 각 조건에 대한 적정 곡선을 작도하였다.
LMW-HA/HSA 코팅된 플레이트에서 초음파분해된 LMW-HA/TT에 대한 토끼 항혈청의 결합 억제
미량역가 플레이트를 상기와 같이 코팅하였다. 초음파분해된 LMW-HA/HSA 접합체로 코팅된 플레이트에서 토끼 항-초음파분해된 LMW-HA/TT 항혈청을 적정하였다. 최대 신호의 대략 절반에 해당하는 희석률을 억제 연구에 적당한 것으로 선택하였다. 토끼 항혈청을 PBS Tween 중에 희석하였다. 억제제를 타이터튜브 (Titertube) (등록상표) (바이오-래드 제품) 중 묽은 항혈청을 함유하는 완충액 중에 계단식으로 희석하고, 타이터튜브 (등록상표)로부터 샘플을 100 ㎕씩 취하여 코팅된 미량역가 플레이트의 웰에 바로 첨가하였다. 샘플들을 미량역가 플레이트에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 상기 미량역가 플레이트를 PBS Tween으로 세척한 후에, 각 웰에 PBS Tween 중 1 : 2,500으로 희석한 염소 항-토끼 IgG-HRP 접합체 (KPL 제품) 100 ㎕을 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하고, PBS Tween으로 세척하였다. 각 웰에 TMB 기질 용액 (KPL 제품) 100 ㎕을 첨가했다. 플레이트를 5분 내지 10분 동안 실온에서 인큐베이션하고 각 웰에 1-성분 중지 용액 (KPL 제품) 100 ㎕을 첨가하여 발색을 중지시키고, 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다. 억제는 임의의 억제제 부재하에서 묽은 항혈청으로 달성된 최대 신호에 대한 백분율(％)로 측정하였다.
뉴질랜드 흰토끼의 면역 반응
뉴질랜드 흰토끼 8 마리를 초음파분해된 하이알루론산-파상풍 유독소 (LMW-HA/TT) 또는 산 가수분해된 하이알루론산-파상풍 유독소 (LMW-HA/TT) 접합체로 3회피하 주사 (각 접합체 당 동물 4 마리씩)했다. 도 4는 초음파분해된 LMW-HA/TT 접합체 면역원에 대한 각 개별 토끼들의 면역 반응을 나타낸다. 모든 4 마리 동물은 50,000 초과의 ELISA 역가로 하이알루론산에 반응하였다. 도 5는 산 가수분해된 LMW-HA/TT 접합체로 면역화시킨 각 개별 토끼들의 면역 반응을 나타낸다. 모든 4 마리 개개의 동물들은 대략 10,000 이상의 ELISA 역가로 하이알루론산에 반응하였다.
토끼의 면역 반응은 면역화에 사용한 접합체의 특성에 따라 특이적이라는 것이 입증되었다. 도 6은 초음파분해된 LMW-HA/TT 접합체로 면역화된 동물의 항체가 일반적으로 산 가수분해된 LMW-HA/HSA로 코팅된 플레이트보다 초음파분해된 LMW-HA/HSA로 코팅된 플레이트에 보다 쉽게 반응한다는 것을 나타낸다. 이들 상이한 코팅 항원 사이의 면역반응성은 1 위수(order) 이상의 차이가 있다. 산 가수분해된 LMW-HA/TT 접합체로 면역화된 동물의 경우에는 이와 반대이다. 도 7은 이들 항혈청이 초음파분해된 LMW-HA/HSA 고상에 대한 경우와는 반대로 산 가수분해된 LMW-HA/HSA 접합체에 대해 1 위수의 선호도가 있음을 나타낸다.
뉴질랜드 흰토끼에서, 초음파분해된 LMW-HA/TT에 대한 항혈청의 특이성
초음파분해된 LMW-HA/TT 접합체로 면역화시킨 토끼에서 생산된 항혈청의 특이성을 미량역가 플레이트 억제 연구로 조사하였다. 초음파분해된 LMW-HA/TT로 면역화시킨 토끼 #75295의 항혈청을 사용한 억제 연구의 결과를 도 8 및 도 9에 제시하였다. 도 8은 여러 종의 초음파분해된 HA 및 여러 종의 산 가수분해된 HA를 억제제로 사용한 것이다. 본 실험에서, 모든 형태의 산 가수분해된 HA는 코팅된 초음파분해된 LMW-HA/HSA에 대한 항체 결합에 대해 불량한 억제제였다. 초음파분해된 종의 억제제인 경우, 초음파분해로 생성된 HA 단편은 그 크기가 작을 수록 억제제로서 보다 효율적이라는 경향이 나타난다. 이는 HA 분자가 더 작을수록 더 커다란 종의 HA 분자에 비해 단위 질량 당 에피토프를 더 많이 제시한다는 것을 지시한다.
도 9에 제시한 결과는 이러한 발견을 추가로 설명하고 있다. 여기서, 고도의 고분자량 천연 HA는 매우 불량한 억제제인 것으로 나타나며, 면역원으로 사용된 20 kD HA에 비해 거의 3 위수 더 불량했다. 또한, 본 실험에서는 더 작은 종도 억제제로 사용했다. HA의 사당류 형태는 비교적 효율적인 억제제였으나, 이당류 및 D-글루쿠론산 형태는 고상에 대한 항체 결합을 전혀 억제하지 못했다.
또한, 초음파분해된 LMW-HA/TT 접합체로 면역화시킨 토끼 #72700의 항혈청을 사용하여 수행한 억제 연구 결과를 도 10 및 도 11에 제시하였다. 이들 결과는 앞서 기술한 토끼 #75295에서 얻은 결과와 매우 유사하다. 도 10은 도 9와 유사한 결과를 나타낸다. 즉, HA의 사당류 형태 및 HA의 초음파분해된 (20 K) 면역원 형태는 양호하게 억제하였으나, HA의 이당류 형태 및 천연 형태는 불량하게 억제하였다. HA의 육당류 형태를 사용하여 HA의 크기와 면역반응성 사이의 관계를 추가로 조사하였다. 이들 결과는 도 11에 나타내었다. 상기 결과는 이러한 형태의 HA가 항체 결합을 완전히 억제할 수 있음을 지시한다. 이러한 연구로부터, 완전 억제에는 HA가 적어도 사당류 형태 (2개의 반복 서브유닛)로 필요하다는 것이 명백하다. HA의 이당류 형태는 억제에 불충분하며, 천연 형태의 분자는 최적의 억제제가 아니다. 따라서, 커다란 천연 HA 분자의 크기 감소가 면역 인식에 바람직하다.
실시예 5: 마우스에서의 면역원성 연구
마우스에서 하이알루론산-단백질 접합체에 대해 생산된 항혈청
BALB/c 마우스 및 CD1 마우스에게 LMW-HA/단백질 접합체 백신을 3회 주사하여 이들을 면역화시켰다. 접합체는 토끼를 사용한 경우와 같은 초음파분해된 LMW-HA/TT 또는 rPorB에 접합시킨 초음파분해된 HA (LMW-HA/rPorB)였다. LMW-HA/TT 접합체 백신은 면역 반응이 음성 대조군보다 크지 않았다. 그러나, LMW-HA/rPorB 접합체는 면역화시킨 동물의 100％에서 측정가능한 ELISA 역가를 산출했다. 이들 데이타를 BALB/c 마우스 및 CD1 마우스에 대해 각각 도 12 및 도 13에 나타냈다.
실시예 6: 보호 실험
수동적 면역화
성숙한 Balb/c 마우스의 수동적 면역화에서의 보호 분석에는 LMW-HA/TT 접합체에 대한 토끼 항혈청을 사용하였다. A군 연쇄상구균 (GAS) 6형 또는 3형의 LD90 항원투여량을 사용한 항원투여 (IP) 2시간 전에, 살균 PBS 중에 절반으로 희석한 토끼 항혈청 (0.5 mL)을 복강내 (IP) 주사하였다. 인산염 완충 염수 (PBS) 및 완전 프로인트 아쥬반트 (CFA)로 면역화시킨 토끼의 항혈청 및 파상풍 유독소에 접합시킨 A군 연쇄상구균 탄수화물에 대한 토끼 항혈청을 보호 실험에서의 대조군 혈청으로 포함시켰다. 항원투여 후 10일 동안 생존했다.
PBS/CFA로 면역화시킨 토끼 항혈청으로 Balb/c 마우스를 면역화시켜 LD90을 미리 측정하고, 2시간 후에는 투여량 범위의 GAS 6형 또는 3형으로 ip 항원투여했다. GAS 6형 및 3형의 LD90은 각각 5 ×103cfu/mL 및 2 ×105cfu/mL인 것으로 측정되었다. 항원투여 실험 결과는 도 14 및 도 15에 나타냈다.

Claims (33)

  1. 면역학적으로 적합한 폴리펩티드 담체에 공유결합된 하이알루론산을 포함하는 면역원성 접합체 분자.
  2. 제1항에 있어서, 약 50％를 넘는 하이알루론산 분자가 비환원성 말단 글루쿠론산 및(또는) 불포화 글루쿠론산 잔기를 갖는 면역원성 접합체.
  3. 제2항에 있어서, 하이알루론산이 분자량이 약 600 달톤 이상, 약 400 Kd 이하의 저분자량 하이알루론산인 면역원성 접합체.
  4. 제3항에 있어서, 90％ 이상의 저분자량 하이알루론산 단편이 비환원성 말단 글루쿠론산 및(또는) 불포화 글루쿠론산 잔기를 갖는 면역원성 접합체.
  5. 제3항에 있어서, 95％ 이상의 저분자량 하이알루론산 단편이 비환원성 말단 글루쿠론산 및(또는) 불포화 글루쿠론산 잔기를 갖는 면역원성 접합체.
  6. 제3항에 있어서, 98％ 이상의 저분자량 하이알루론산 단편이 비환원성 말단 글루쿠론산 및(또는) 불포화 글루쿠론산 잔기를 갖는 면역원성 접합체.
  7. 제3항에 있어서, 99％ 이상의 저분자량 하이알루론산 단편이 비환원성 말단 글루쿠론산 및(또는) 불포화 글루쿠론산 잔기를 갖는 면역원성 접합체.
  8. 제3항에 있어서, 저분자량 하이알루론산이 글리코실 잔기가 약 4개 이상의 크기를 갖는 면역원성 접합체.
  9. 제3항에 있어서, 저분자량 하이알루론산이 약 2 내지 약 20개의 이당류 아단위를 갖는 면역원성 접합체.
  10. 제9항에 있어서, 저분자량 하이알루론산이 약 2 내지 약 10개의 이당류 아단위를 갖는 면역원성 접합체.
  11. 제3항에 있어서, 폴리펩티드 담체가 파상풍 유독소, 디프테리아 유독소 및 백일해 유독소, 연쇄상구균으로부터 유도된 면역원성 폴리펩티드, 인플루엔자로부터 유도된 면역원성 폴리펩티드, 수막염구균으로부터 유도된 면역원성 폴리펩티드, 폐렴쌍구균으로부터 유도된 면역원성 폴리펩티드, 및 대장균으로부터 유도된 면역원성 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된 면역원성 접합체.
  12. 제3항에 있어서, 폴리펩티드 담체가 나이세리아로부터의 구멍단백 (porin)인 면역원성 접합체.
  13. 제3항에 있어서, 직접적으로 결합된 면역원성 접합체.
  14. 제3항에 있어서, 글루쿠론산 또는 불포화 글루쿠론산을 저분자량 하이알루론산의 비환원성 말단의 당으로 포함하는 에피토프에 결합하는 항체를 유도하는 면역원성 접합체.
  15. 제3항에 있어서, 박테리아에 존재하는 피막 하이알루론산에 결합하는 항체를 유도하는 면역원성 접합체.
  16. 제15항에 있어서, 박테리아가 A군 연쇄상구균 또는 C군 연쇄상구균인 면역원성 접합체.
  17. 제3항의 접합체 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 생리학적으로 허용가능한 보조제를 더 포함하는 제약 조성물.
  19. 저분자량 하이알루론산 단편을 면역학적으로 적합한 폴리펩티드에 공유결합시키는 것을 포함하며, 50％ 이상의 상기 저분자량 하이알루론산 단편이 비환원성말단에 글루쿠론산 및(또는) 불포화 글루쿠론산 잔기를 갖는, 저분자량 하이알루론산-폴리펩티드 접합체 분자의 제조 방법.
  20. 제19항에 있어서, 저분자량 하이알루론산을 면역학적으로 적합한 폴리펩티드에 공유결합시키는 것을 포함하는 방법이 환원성 아미노화를 포함하는 방법.
  21. 제3항의 면역원성 접합체 분자에 결합하는 정제된 항체.
  22. 제21항에 있어서, 저분자량 하이알루론산 단편이 글리코실 잔기가 약 4개 이상의 크기를 갖는 정제된 항체.
  23. 제22항에 있어서, 하이알루론산 단편이 글리코실 잔기가 약 4개 이상이고 약 40 kD 이하의 크기를 갖는 정제된 항체.
  24. 제17항의 조성물에 의해 유도된 항체, 제21항의 항체, 또는 리포솜에 접합된 저분자량 하이알루론산에 의해 유도된 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 항체를 포함하는, A군 및 C군 연쇄상구균 감염을 치료 또는 억제하는데 효과적인 제약 조성물.
  25. 제17항의 제약 조성물을 항체 반응을 유도하기에 충분한 양으로 개별 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물내 항체 반응 유도 방법.
  26. 제25항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 제약 조성물을 근육내 투여, 피하 투여, 복막내 투여 또는 정맥 투여하는 방법.
  28. 제25항에 있어서, 제약 조성물을 체중 1 kg 당 약 0.1 내지 약 50 ㎍의 양으로 투여하는 방법.
  29. 제3항의 면역원성 접합체를 포함하는, 인체에서 유효한 수준의 항 저분자량 하이알루론산 항체를 유도하는 백신.
  30. 제3항의 제약 조성물을 감염을 억제하기에 충분한 양으로 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 연쇄상구균성 감염 억제 방법.
  31. 제24항의 제약 조성물을 포함하는 조성물을 감염의 진행을 억제하기에 충분한 양으로 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, HA 함유 박테리아에 의한 포유동물의 감염의 진행 억제 방법.
  32. 제31항에 있어서, 박테리아가 A군 연쇄상구균 또는 C군 연쇄상구균인 방법.
  33. 제21항의 항체를 포함하는, 연쇄상구균에 의한 감염을 검출하기 위한 진단용 면역분석 키트.
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