CN104237500B - 一种透明质酸固相包被方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种透明质酸的包被方法，由以下步骤组成：(1)透明质酸用强酸水解，使用的酸过量；(2)用NaOH中和多余的酸，所述的NaOH浓度为0.5‑5mol/L；(3)用硼酸盐缓冲液进行透析或层析柱脱盐；(4)用NHS活化的生物素和处理过的透明质酸反应，避光，2‑8℃，震荡反应4h；(5)用磷酸盐缓冲液透析或层析柱除去未结合的生物素；(6)将链霉亲和素包被到固相载体上；(7)将标有生物素的透明质酸链霉亲和素包被的固相共同孵育，孵育温度37℃，孵育时间1h。本发明的优点是：生物素化的透明质酸与链霉亲和素固化更稳定，且采用二次包被生物素，结构比以试剂形式添加的生物素更稳定，同时也缩短了反应时间。

Description

一种透明质酸固相包被方法
技术领域
本发明涉及免疫化学试验物质的制备技术领域，具体地，本发明提供一种透明质酸固相包被方法。
背景技术
透明质酸(Hyaluronan，HA)是一种产生于间质细胞的氨基多糖，由N-已酰氨基葡萄糖及D-葡萄糖醛酸的重复结构组成的线形多糖结构。分子式：(C14H20NNaO11)n，分子量4,000-8,000万，由肝内皮细胞摄取、降解，其广泛存在于结缔组织、皮肤、关节液及玻璃体液中，是结缔组织基质的主要成份之一，是反映肝脏内皮细胞功能和活动性纤维化的良好指标。
透明质酸(HA)定量检测试剂盒的免疫反应系统采用竞争法原理，将透明质酸(HA)与生物素偶联后，将其包被于偶联有链霉亲和素的固相载体上(固相包括微孔板、磁微粒、酶标板等)。校准品或样品中的HA与固相上的HA竞争结合辣根过氧化物酶标记的透明质酸结合蛋白，充分反应后，洗掉游离成分，加入底物工作液，在氧化剂作用下，HRP催化鲁米诺生成处于激发态的氨基邻苯二甲酸离子，其恢复到基态时，释放出425nm的光子，于第5-15分钟测定各加样本孔的发光值RLU。样本的RLU与样本HA浓度呈负相关。样本中的HA浓度依据由校准品HA浓度和对应的RLU建立的数学模型进行定量，从而检测人血清中的HA含量。
对于生物素标记的透明质酸包被于偶联有链霉亲和素的固相载体上，得到组合物不稳定，影响检测结果的准确性与精密性，针对此问题，本发明提供了一种新的包被方法，使包被物更稳定，检测结果更可靠。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种透明质酸固相包被方法，该方法采用二次包被生物素，结构比以试剂形式添加的生物素更稳定，同时也缩短了反应时间。解决了生物素标记的透明质酸包被于偶联有链霉亲和素的固相载体时得到组合物不稳定，影响检测结果的准确性与精密性的问题。本发明提供的技术方案是：
一种透明质酸固相包被方法，其特征在于，由以下步骤组成：
(1)透明质酸用过量强酸水解；
(2)用NaOH中和多余的酸；
(3)用硼酸盐缓冲液进行透析或层析柱脱盐；
(4)用NHS活化的生物素和处理过的透明质酸反应；反应条件为：避光，2-8℃，震荡反应4h。
(5)用磷酸盐缓冲液透析或层析柱除去未结合的生物素；
(6)将链霉亲和素包被到固相载体上；
(7)将标有生物素的透明质酸与链霉亲和素包被的固相共同孵育，孵育温度37℃，孵育时间1h。
进一步，步骤(1)中所述的强酸是硫酸、盐酸、硝酸、高锰酸或高氯酸。
进一步，步骤(1)中所述强酸为盐酸，浓度为0.5-1.5mol/L。
进一步，步骤(2)所述的NaOH浓度为0.5-1.5mol/L。
进一步，步骤(6)所述的固相载体为酶标板、发光板或磁微粒。
本发明的优点是：透明质酸很难直接生物素化，使用强酸水解后，将N-乙酰葡糖胺水解成葡糖胺；使生物素化的透明质酸与链霉亲和素固化更稳定，且采用二次包被生物素，结构比以试剂形式添加的生物素更稳定，同时也缩短了反应时间。本发明显著提高了透明质酸定量检测结果的精密性和可靠性，增强了试剂盒的稳定性。
具体实施方式
实施例1：
1、透明质酸的处理：
(1)称取5mg透明质酸溶于1ml蒸馏水中；
(2)加入0.1ml 1.5mol/L盐酸，2-8℃反应过夜；
(3)加入0.1ml 1.5mol/L NaOH，中和至中性；
(4)硼酸盐缓冲液透析2小时以除去多余的盐离子；
2、NHS活化的生物素和处理过的透明质酸反应：
(1)取0.5mgNHS-LC-LC-Biotin溶于0.5ml蒸馏水中；将Biotin溶液加入水解后的透明质酸溶液中，暗置振荡反应4小时，得到HA-Biotin复合物、未结合的NHS-LC-LC-Biotin混合溶液；
(2)称取53.5mgNH4Cl溶解到1ml蒸馏水中，配制成1mol/LNH4Cl溶液；
(3)将(2)制得的溶液加入到(1)中，在避光条件，2-8℃下，震荡反应4h；
(4)用磷酸盐缓冲液于2-8℃透析24h，得到HA-biotin复合物。
4、链霉亲和素固相包被：
(1)将链霉亲和素按照2μg/ml的浓度包被到白色聚苯乙烯塑料板上，每孔100uL，37℃条件下反应2h；
(2)洗板：用tris-tween洗液洗涤3次，甩干；
5、HA-biotin复合物二次包被：
(1)将HA-biotin复合物加入链霉亲和素包被板中，每孔100uL，37℃反应1小时；
(2)洗板：用tris-tween洗液洗涤3次，甩干；
(3)用含有1％牛血清白蛋白的蛋白溶液进行封闭，每孔加入200uL封闭液，37℃反应2h，弃去孔内封闭液，甩干；
(4)将包被板置于37℃烘箱4h，即完成透明质酸在固相塑料板上的包被，之后用铝箔袋密封，存放于-20℃保存备用。
实施例2：包被板加速稳定性试验
用本发明的方法包被96孔发光板，包被三批，每批分成两部分，一部分放置于4℃冰箱，一部分放置于37℃做加速稳定性，于7天后取出，平衡至室温，测校准品、企标、质控品，检测包被板的精密性、灵敏度、线性，以判断其稳定性。实验结果如下表：
从表中可以看出，包被板放置37℃条件下7天，与4℃比较，其灵敏度、质控品精密性、线性均无显著性差异，稳定性很好，且精密性未受影响。
实施例3：包被板测值准确性试验
分别采用常规方法和本发明方法包被透明质酸，测9个样本，高值、中值、低值各3个，比较两组包被测值精确性，得到如下结果：
从表中可以看出，本发明包被方法测值准确性较常规方法有显著提高。

Claims (7)

1.一种透明质酸固相包被方法，其特征在于，由以下步骤组成：
(1)透明质酸用强酸水解，使用的酸过量；
(2)用NaOH中和多余的酸；
(3)用硼酸盐缓冲液进行透析或层析柱脱盐；
(4)用NHS活化的生物素和处理过的透明质酸反应，避光，2-8℃，震荡反应4h；
(5)用磷酸盐缓冲液透析或层析柱除去未结合的生物素；
(6)将链霉亲和素包被到固相载体上；
(7)将标有生物素的透明质酸与链霉亲和素包被的固相共同孵育，孵育温度37℃，孵育时间1h。
2.根据权利要求1所述的一种透明质酸固相包被方法，其特征在于，步骤(1)中所述的强酸是硫酸、盐酸、硝酸、高锰酸或高氯酸中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种透明质酸固相包被方法，其特征在于，步骤(1)中所述强酸为盐酸，浓度为0.5-5mol/L。
4.根据权利要求1所述的一种透明质酸固相包被方法，其特征在于，步骤(1)中所述强酸为盐酸，浓度为1.5mol/L。
5.根据权利要求1所述的一种透明质酸固相包被方法，其特征在于，步骤(2)所述的NaOH浓度为0.5-5mol/L。
6.根据权利要求1所述的一种透明质酸固相包被方法，其特征在于，步骤(2)所述的NaOH浓度为1.5mol/L。
7.根据权利要求1所述的一种透明质酸固相包被方法，其特征在于，步骤(6)所述的固相载体为酶标板、发光板或磁微粒。
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