WO2006057308A1 - キトサン中のトロポミオシン測定方法 - Google Patents
キトサン中のトロポミオシン測定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2006057308A1 WO2006057308A1 PCT/JP2005/021597 JP2005021597W WO2006057308A1 WO 2006057308 A1 WO2006057308 A1 WO 2006057308A1 JP 2005021597 W JP2005021597 W JP 2005021597W WO 2006057308 A1 WO2006057308 A1 WO 2006057308A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- chitosan
- antibody
- tropomyosin
- measurement
- measurement method
- Prior art date
Links
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 title claims abstract description 178
- 102000005937 Tropomyosin Human genes 0.000 title claims abstract description 96
- 108010030743 Tropomyosin Proteins 0.000 title claims abstract description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 93
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 49
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 23
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 49
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 46
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 27
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 27
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 claims description 27
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 13
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 13
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 claims description 12
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 claims description 9
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 9
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 7
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 7
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 7
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 6
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 5
- 229940079889 pyrrolidonecarboxylic acid Drugs 0.000 claims description 5
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 4
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- SKQZZVCKYVHQPI-UHFFFAOYSA-N [NH4+].[NH4+].C(C)N1C(SC2=C1C=CC=C2)S(=O)(=O)[O-].C(C)N2C(SC1=C2C=CC=C1)S(=O)(=O)[O-] Chemical compound [NH4+].[NH4+].C(C)N1C(SC2=C1C=CC=C2)S(=O)(=O)[O-].C(C)N2C(SC1=C2C=CC=C1)S(=O)(=O)[O-] SKQZZVCKYVHQPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 20
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 abstract description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 9
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 abstract description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 22
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 21
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 11
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 11
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 7
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 7
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 7
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 7
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-M 5-oxo-L-prolinate Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-M 0.000 description 6
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 6
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 6
- 229940071139 pyrrolidone carboxylate Drugs 0.000 description 6
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 4
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 4
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000000850 deacetylating effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- -1 organic acid salt Chemical class 0.000 description 3
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 235000020932 food allergy Nutrition 0.000 description 2
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000238586 Cirripedia Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000238578 Daphnia Species 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010016946 Food allergy Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000008934 Muscle Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010074084 Muscle Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 240000005893 Pteridium aquilinum Species 0.000 description 1
- 235000009936 Pteridium aquilinum Nutrition 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910001854 alkali hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000008044 alkali metal hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- FEOYLBRDNMCIHQ-UHFFFAOYSA-N carbonic acid;pyrrolidin-2-one Chemical compound OC(O)=O.O=C1CCCN1 FEOYLBRDNMCIHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M cyanate Chemical compound [O-]C#N XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 241000238565 lobster Species 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- QVLTXCYWHPZMCA-UHFFFAOYSA-N po4-po4 Chemical compound OP(O)(O)=O.OP(O)(O)=O QVLTXCYWHPZMCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010517 secondary reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
- A23L29/20—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents
- A23L29/275—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of animal origin, e.g. chitin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
- C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
- C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Definitions
- the present invention relates to a method for measuring tropomyosin in chitosan. More specifically, the present invention relates to a method for measuring tropomyosin in chitosan by an immunoassay method, particularly an ELISA method. The present invention also relates to chitosan whose tropomyosin content was evaluated by the measurement method. Background art
- Chitosan is a functional polysaccharide and is widely used as a raw material for cosmetics, health foods, feed additives and the like. Most of the chitosan currently sold in the country is industrially produced from power-shell. Industrially, chitosan is produced as follows. First, force-shells generated from fish processing plants are collected. Chitin is isolated from the force-shell by immersing the collected force-shell in dilute hydrochloric acid, changing the calcium carbonate in the force two shells to salty calcium and removing the salty calcium by washing with water.
- the chitin is immersed in a high-concentration sodium hydroxide aqueous solution of 40% by mass or more and heated to deacetylate the chitin to form chitosan, and then the chitosan produced is thoroughly washed with water to remove excess. Chitosan flakes are obtained by removing sodium hydroxide and by-product sodium acetate and drying.
- the production process of chitosan also has a repetition force of an immersion process in an acid and an alkali and a washing process with water.
- chitin deacetylation is carried out until the chitin is swollen with a high concentration sodium hydroxide aqueous solution of 40% by mass or more until about 80% or more of the acetylylamino group in the chitin is deacetylated to form an amino group. Is called.
- the deacetylated chitin that is, the produced chitosan, is then thoroughly washed with water, so that the protein in the force-shell as well as the protein attached to the force-shell in the final chitosan remains intact.
- Chitosan's raw material, power-husk is known to contain allergic proteins that cause food allergies.
- the protein in the force-shell as well as the protein in the force-shell in the final product chitosan is not denatured and is unlikely to remain undegraded. It is common sense, and therefore, it is difficult to think that allergenic proteins remain in chitosan produced by a conventional method.
- an object of the present invention is to simply and accurately measure the content of a protein, particularly tropomyosin and its peptide, that may be related to the expression of allergy in chitosan.
- the present invention provides a method and a chitosan evaluated that the measurement value obtained by the measurement method is not more than a certain value and is less likely to cause allergy.
- Tropomyosin is a muscle protein in crustaceans consisting of subunits with a molecular weight of about 33,000, and has now been confirmed to be the main allergen of shrimp.
- molecular clawing experiments in Robusta and force have identified this protein as a common allergen in crustaceans. Therefore, it is important to measure tropomyosin in general foods in order to prevent food allergy accidents, and a method using an actual immune reaction (enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA method)) has been developed. And put into practical use.
- ELISA method enzyme-linked immunosorbent assay
- the present inventor examined whether the ELISA method for measuring tropomyosin developed for general foods can be applied to the measurement of tropomyosin in chitosan.
- an ELISA method in which solid chitosan is dissolved in an aqueous solution containing at least one organic acid having a chitosan solubility such as acetic acid, lactic acid or pyrrolidone carboxylic acid, and various antibodies are used as the measurement sample. It was found that tropomyosin in chitosan can be measured by using it.
- the present invention provides a tropomyosin measurement method characterized by measuring tropomyosin in chitosan by an immunoassay method in a state where chitosan is dissolved in an aqueous solution of an organic acid.
- the above measurement method it is an immunoassay method ELIS A method;
- the ELIS A method is a sandwich method using at least one anti-crustacean tropomyosin antibody as a primary antibody and at least one labeled antibody.
- the labeled antibody is preferably an enzyme-labeled anti-crustacean tropomyosin polyclonal antibody or an enzyme-labeled anti-immunoglobulin antibody.
- the crustacean is a shrimp
- the enzyme Force At least one selected from the group force consisting of peroxidase, alkaline phosphatase and j8-galactosidase; the anti-crustacean tropomyosin antibody is coated on the inner wall of the measurement container; and the enzyme is peroxidase It is preferable to use o-phenylenediamine, 2,2,1-azinobis (3-ethyl-benzthiazolinesulfonic acid) diammonium salt and tetramethylbenzidine as the substrate.
- the tropomyosin is measured by measuring the blue color of the measurement system; the tropomyosin is measured by adding sulfuric acid or phosphoric acid to the measurement system exhibiting blue color. And the measurement system is changed to yellow and the yellow is measured; the organic acid is at least one selected from the group power of acetic acid, lactic acid and pyrrolidone carboxylic acid; and the organic acid
- the concentration of the organic acid in the aqueous solution is preferably 0.1% by mass or more and 1% by mass or less.
- chitosan is preferably chitosan of 1.0% by mass or less by a measurement method having an insoluble component force or less.
- the present invention also provides chitosan characterized by a tropomyosin content power of lOOppm (measured value obtained by the measurement method of the present invention) or less.
- tropomyosin in chitosan can be measured easily and accurately. Furthermore, it is possible to evaluate whether or not the above-mentioned chitosan has an extremely low potential for the development of allergic reactions in humans.
- the present invention also provides the allergic reaction. It is possible to provide chitosan evaluated as having a very low possibility of response.
- “Measurement” shall include quantification and simple detection of tropomyosin.
- Primary antibody shall mean an anti-antigen antibody, ie an antibody against an antigen. This primary antibody shall also include monoclonal and polyclonal antibodies. The primary antibody may or may not be labeled. As an example of a primary antibody, an anti-crustacean tropomyosin antibody can be mentioned.
- biological species that produce primary antibodies various biological species that are usually used in the art can be used. The biological species includes cultured cells such as hypridoma.
- “Secondary antibody” means an anti-immunoglobulin antibody, that is, an antibody having an antibody against the antibody as an antigen.
- the immunoglobulin itself eg, IgG
- the immunoglobulin of an organism that produces an antibody that is not only an antibody against an antigen, that is, the IgG of the organism that produced the antibody even if it cannot specifically bind to the antigen. It also means an antibody that can specifically bind. Others are the same as the primary antibody. This secondary antibody may or may not be labeled.
- Tropomyosin includes not only tropomyosin itself but also a peptide that is a part of tropomyosin.
- tropomyosin or its peptide may be simply referred to as “tropomyosin”.
- the present invention is a method for measuring tropomyosin in chitosan.
- the chitosan is made from chitin isolated from crustaceans.
- the crustacean chitin isolation method is generallyhackman's method based on acid treatment and alkali treatment as described above, but enzymes such as proteases can be used instead of alkali treatment. It has been developed so far, such as how to use it.
- Chitosan can be obtained by deacetylating the isolated chitin in a hydroxide-alkali aqueous solution.
- sodium hydroxide and potassium hydroxide are used as the hydroxide and alkali, and the concentration of the hydroxide and alkali aqueous solution is preferably 35% by mass or more.
- concentration of the hydroxide and alkali aqueous solution is preferably 35% by mass or more.
- temperature of deacetylation it is 20 ° C or higher, preferably 50 ° C or higher.
- the obtained chitosan is thoroughly washed with water.
- the chitosan used in the method of the present invention is, as an example, but when chitosan is dissolved in an aqueous solution having an acetic acid concentration of 1% by mass at a concentration of 0.5% by mass, chitosan having an insoluble content in the chitosan of 1% by mass or less is obtained. Is preferred. If it is such, there is no limitation in the deacetylation degree of chitosan.
- a heterogeneous deacetylation method in an aqueous alkali hydroxide solution without dissolving chitin, which is the current general industrial production method, is used.
- a degree of deacetylation of 70% or more is required, and homogeneous deacetylation method (method of deacetylating chitin in a dissolved state)
- a deacetylation degree of 30% or more is required.
- the degree of deacetylation is the molar fraction of darcosamine units in the chitosan constituent sugar units by colloid titration.
- the molecular weight of chitosan is not limited.
- chitosan for measuring tropomyosin is used in a state dissolved in an organic acid aqueous solution.
- chitosan is a polymer that is difficult to disperse.
- chitosan is in an insufficiently dispersed state, which may cause an error in the tropomyosin measurement result. Therefore, when measuring tropomyosin in chitosan, add an organic acid aqueous solution to the chitosan to be measured, or force chitosan into an organic acid aqueous solution to bring chitosan into an aqueous solution and measure tropomyosin in chitosan. It is preferable to set.
- organic acid used for dissolving chitosan as a measurement object include acetic acid, lactic acid and pyrrolidone carboxylic acid.
- the acid concentration of these organic acid aqueous solutions is preferably 0.1% by mass or more and less than 2% by mass, more preferably 0.5% by mass or more and 1% by mass or less.
- an inorganic acid such as hydrochloric acid
- the acid concentration of the organic acid is 2% by mass or more
- the resulting chito This is not preferable because the pH of the aqueous sun solution tends to be too low, and the variation in the measured value of tropomyosin in the aqueous chitosan solution tends to increase.
- the organic acid concentration is less than 0.1% by mass, chitosan does not dissolve sufficiently.
- the above organic acid may be used in the form of a salt with chitosan. In this case, instead of dissolving chitosan in the above organic acid aqueous solution, an organic acid salt of chitosan may be dissolved in a solvent for sample preparation.
- the concentration of chitosan in the chitosan aqueous solution used for the measurement depends on the acid concentration of the organic acid aqueous solution to be used and cannot be generally stated. For example, when the concentration of the organic acid aqueous solution is 1% by mass, chitosan Examples of the concentration include 0.5% by mass or more and 1% by mass or less. This concentration is the concentration before tropomyosin is diluted with an extraction buffer or the like.
- chitosan used for measurement of tropomyosin is preferably used in an aqueous solution state dissolved in an organic acid aqueous solution. If chitosan in an aqueous state is used in this way, the measurement of tropomyosin in chitosan is not particularly limited as long as it is measured by the immunoassay method.
- chitosan to be used is not particularly limited in terms of deacetylation concentration and molecular weight.
- chitosan when chitosan is dissolved in an aqueous solution having an acetic acid concentration of 1% by mass at a concentration of 0.5% by mass, chitosan is used. It is preferable that chitosan having an insoluble content therein is 1% by mass or less. The insoluble content in chitosan is measured as follows.
- the present invention is a method for measuring tropomyosin (hereinafter, sometimes referred to as an antigen unless otherwise specified) in the chitosan using the immunoassay method.
- Atsey method There are two types of the Atsey method: a competitive immunoassay method and a sandwich method. Book In the invention, both can be suitably used.
- isotopes m I, 125 I, “C, 3 H, 57 Co, 75 Se, etc.
- fluorescent substances or enzymes, etc. are labeled as antigens or antibodies as measurement indicators. Any method can be used in the present invention.
- ELISA method a method using an antibody labeled with an enzyme
- sandwich method the following primary antibody-antigen-labeled antibody (primary or secondary) conjugate (both complex !!) and primary antibody antigen unlabeled antibody (primary or secondary)
- primary antibody antigen unlabeled antibody primary or secondary
- tropomyosin used as an antigen for preparing an antibody is particularly preferably derived from crustaceans.
- the antibody used in the present invention is an organism immunized (sensitized) with an antigen, such as a mouse, hamster, -bird, goat, rat, or rabbit, or a cell isolated therefrom, or an antigen It is preferable to prepare lymphocytes from the spleen of an immunized organism using the cell (hypridoma) obtained by fusing the lymphocyte with a cancer cell (eg, myeloma).
- a cancer cell eg, myeloma
- the present invention is not limited to these examples. That is, any antibody derived from a living organism or cell that can achieve the object of the present invention may be used.
- Monoclonal antibodies are preferably prepared using Hypridoma.
- a method of forming a primary antibody-antigen-labeled antibody (primary or secondary) conjugate also referred to as a complex.
- the primary antibody used in this method is at least one primary antibody.
- the primary antibody may or may not be immobilized (also referred to as an insoluble coating or coating). Since the present invention is a method for measuring tropomyosin in chitosan, it may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it is an tropomyosin antibody. From the viewpoint of measurement accuracy, it is more preferable to use a monoclonal antibody as the primary antibody.
- the labeled antibody used in the above method includes at least one primary antibody or at least one secondary antibody, or a mixture thereof. These antibodies may be monoclonal antibodies or polyclonal antibodies as described above.
- Suitable antibodies include an anti-small shrimp (shrimp) tropomyosin antibody as a primary antibody, and a peroxidase-labeled anti-immunoglobulin antibody or a peroxidase-labeled anti-shrimp (shrimp) tropomyosin polyclonal as a labeled antibody.
- An antibody etc. are mentioned.
- the present invention is not limited to these exemplary antibodies.
- an immobilized antibody when used, the antibody is immobilized on glass, plastic, paper, or the like.
- antibody immobilization can be performed by measuring containers such as glass, plastic or paper, ie, test tubes, small centrifuge tubes, plates with grooves (eg, microtiter plates), or beads. It is preferable to carry out the above.
- Antibody immobilization can be performed by a conventionally known method.
- the above-mentioned immobilized antibody and labeled antibody may be prepared by immunizing the same organism, but it is preferable to prepare by immunizing different organisms.
- an antigen is sandwiched between the primary antibody and the labeled antibody to form a conjugated substance (composite).
- any fluorescent substance can be used as long as the object of the present invention can be achieved.
- fluorescein isothiocyanate, rhodamine isoform is used. Examples include cyanate and phycoerythrin.
- the labeling of the fluorescent substance to the antibody can be achieved by a conventionally known method.
- an enzyme is used as a labeling substance, it is called an ELISA method.
- peroxidase, alkaline phosphatase, j8-galactosidase, and the like can be mentioned as preferable ones in terms of measurement accuracy and simplicity. Among these, peroxidase can be mentioned as a particularly suitable one because of its measurement accuracy.
- the substrate of the above enzyme is shown below.
- the enzyme is peroxidase, o-phenylenediamine (color: brown), 2, 2, monoazinobis (3-ethyl-benzthiazoline sulfonic acid) diammonium salt, tetramethylbenzidine (3, 3 ', 5, 5 , One tet ramethylbenzidine) (coloring: blue), ABTS (diammonium 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzot hiazoline-6-sulfate)) (coloring: blue) and the like.
- tetramethylbenzidine is more preferred because of its color sensitivity.
- the enzyme is alkaline phosphatase, such as p ditrophyl phosphate (color: yellow), if the enzyme is
- the present invention is not limited to the above examples.
- any conventionally known method can be suitably used.
- the labeling method is a method in which the antibody is first piotinated (piotinated antibody), the enzyme is labeled with streptavidin, and the binding between piotin and streptavidin of the piotini antibody is used. Is preferred.
- the enzymatic reaction can be performed under conventionally known conditions.
- an unlabeled primary or secondary antibody is used in place of the labeled antibody in the above method 1, and a labeled secondary antibody is further used.
- the labeled secondary antibody is specifically an antibody against the unlabeled antibody (anti-immunoglobulin antibody) or an antibody that specifically binds to the unlabeled antibody (for example, the antibody of the animal from which the labeled antibody was produced). Any antibody may be used as long as it is a binding antibody.
- the labeled secondary antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
- a polyclonal antibody is used. Other than that, it is the same as the method 1 described above.
- the primary antibody (this antibody may or may not be immobilized as in the method of 1. above, but is preferably immobilized) and the antigen.
- unlabeled primary or secondary antibody binds to the conjugate.
- the labeled secondary antibody binds to the bound product.
- the label and the labeling method are the same as in the above method 1.
- antibodies include primary antibodies that include anti-syrup tropomyosin antibodies, and labeled secondary antibodies that include peroxidase-labeled anti-immunoglobulin (polyclonal) antibodies.
- the present invention is not limited to these examples.
- the antibody-derived organism used is not particularly limited.
- the solid phase antibody is derived from mouse or rat, and the labeled antibody is used.
- the solid phase antibody is derived from mouse or rat
- the unlabeled antibody is derived from rabbit or goat
- the labeled secondary antibody is derived from goat or rabbit.
- the measurement containers coated with various antibodies used in the methods 1 and 2 are commercially available (for example, from ELISA SYSTEMS, BETHYL, etc.). Is preferred.
- the desired antibody and the measurement container coated with the desired antibody may be obtained upon request for their production.
- An example of a request destination is Takara Bio Inc.
- a method of forming a conjugate of primary antibody-antigen-labeled antibody comprises the following steps.
- a primary antibody is immobilized (coated) on the inner wall surface or surface of a measurement container such as a test tube or a plate (eg, microtiter plate) having a groove (well).
- a measurement container such as a test tube or a plate (eg, microtiter plate) having a groove (well).
- the measurement container used for the fixed column one that has been subjected to high protein adsorption treatment for ELISA and one that is used for normal cell culture is preferably used.
- the primary antibody is diluted with a buffer solution, added to the container, and left at room temperature for 30 minutes to 3 hours and at a low temperature such as 0 ° C to 10 ° C for about 10 minutes. Thereafter, the primary antibody solution is removed, an appropriate amount of blocking solution (BSA dissolved in buffer) is added, and after standing as described above, the blocking solution is removed.
- BSA blocking solution
- the measurement sample (chitosan aqueous solution) is preferably diluted with an antigen extraction buffer and used for measurement as a plurality of samples having different concentrations.
- a solution containing the labeled antibody (primary or secondary) is added to the container after the washing in 3) above, and the mixture is allowed to stand as described above. By binding, an immobilized antibody-antigen-labeled antibody conjugate can be formed. This reaction may be referred to as a secondary immune reaction.
- buffer solution for example, phosphate buffer PBS, pH: 6 to 8 and concentration: 2 mM to 500 mM can be used.
- a-2) Measure the absorbance or fluorescence intensity of the solution (reaction solution) after addition of the enzyme substrate solution using an appropriate wavelength.
- the reaction solution also referred to as a measurement system
- the reaction solution may be measured as it is over time at an appropriate wavelength.
- a reaction stop solution such as acid or azide salt after an appropriate reaction time!
- the method of adding a reaction stop solution is a more preferable method than the simplicity.
- Suitable acids include phosphoric acid (orthophosphoric acid) or sulfuric acid. When 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine is used as the enzyme substrate, the reaction solution is blue, but when an acid is added to the reaction solution, it becomes yellow, so measure it at an appropriate wavelength.
- the isotope activity is determined by scintillation power. Measure with a counter.
- the method described above uses an immobilized antibody, but in the method using an antibody that does not immobilized, centrifugation is performed before the primary reaction, before the secondary reaction, and before the tertiary reaction. It is preferable to separate the bound substance (composite) by separation.
- a measuring instrument in the above measurement, a commercially available instrument may be used.
- a microplate reader can be used. What is necessary is just to measure at a suitable wavelength.
- the measurement reagents and the like are commercially available as kits, it is convenient and preferable to use them to achieve the object of the present invention.
- ELISA kits manufactured by ELISA SYSTEMS PTY Ltd, ustraliia no rustacean Tropomyosin ResidueJiicrowell ELIbA Product Code: E SCRUR-48 Analysis Kit, etc. Measure according to the analysis procedure.
- the present invention also provides chitosan characterized by having a tropomyosin content of 1 OOppm or less as measured by the method of the present invention.
- chitosan characterized by having a tropomyosin content of 1 OOppm or less as measured by the method of the present invention.
- the chitosan is used as a raw material for food or cosmetics, there is no possibility of causing an allergic phenomenon to humans, or its possibility is extremely low and safety is high.
- chitosan with a tropomyosin content of more than lOOppm is concerned about the allergic reaction to humans.
- the tropomyosin measurement method in the following examples and comparative examples is the ELISA method in the Imnoassay method.
- This is a sandwich assay method using anti-mouse shrimp tropomyosin antibody as a primary antibody and anti-mouse shrimp tropomyosin polyclonal antibody conjugate peroxidase (peroxidase-labeled anti-mouse shrimp tropomyosin polyclonal antibody) as a labeled antibody.
- the kit was prepared according to the package insert attached to the product. That is, buffer for concentration washing 25 mL of the solution (NaCl-containing phosphate buffer) was poured into 475 mL of ion-exchanged water and placed in a wash bottle as a wash buffer. In addition, 25 mL of the concentrated extraction solution (phosphate buffer solution containing NaCl) was poured into 475 mL of ion-exchanged water and placed in a storage bin as an antigen extraction solution.
- buffer for concentration washing 25 mL of the solution (NaCl-containing phosphate buffer) was poured into 475 mL of ion-exchanged water and placed in a wash bottle as a wash buffer.
- 25 mL of the concentrated extraction solution phosphate buffer solution containing NaCl
- chitosan having a viscosity measured by a rotational viscometer at 20 ° C of 500 mPa's and a deacetylated concentration by colloid titration of 90%
- 1 part of pure chitosan was dissolved in 99 parts of deionized water containing 0.5 part of lactic acid to obtain a 1% aqueous chitosan solution.
- 1 part of this chitosan aqueous solution was added to 9 parts of the extraction solution preheated to 60 ° C. and mixed to obtain a 0.1% chitosan aqueous solution.
- the insoluble content of chitosan in chitosan was 0.5% by the above-described measurement method.
- the above 0.1% chitosan aqueous solution was placed in a 60 ° C warm bath for 15 minutes, and tropomyosin was extracted by mixing with shaking Z every 5 minutes for 1 minute.
- the extract was allowed to stand and filtered through a G3 glass filter. After the filtrate was mixed well, it was subjected to a tropomyosin measurement test as a sample.
- the kit was prepared according to the method of using the kit. That is, before using the kit, return the kit to room temperature (20 ° C to 25 ° C), prepare a well plate with the number of wells required for sample and control measurement, and place it in the holder. . At this time, an identification mark was put on each well plate to prevent erroneous measurement. The well is coated with an anti-syrup tropomyosin antibody.
- Negative control tropomyosin concentration: Oppm
- positive control 0.05 ppm, 0.10 ppm, 0.25 ppm, and 0.50 ppm
- aqueous solutions were added to each well in an amount of L.
- 100 / z L of each sample was added to each sample.
- Each control and sample were measured in duplicate.
- the holder was slowly slid for 10 seconds to mix the solution in the well. This was incubated at room temperature for 30 minutes to perform a primary immune reaction. After the reaction, the solution in the well was removed, and each well was filled with a washing buffer until it overflowed, and then the solution in the well was completely removed. This operation was repeated 5 times for washing. Add 100 ⁇ L of peroxidase-labeled anti-shrimp tropomyosin polyclonal antibody solution to each well. Added to the phone. Gently slide the holder for 10 seconds to mix the solution in the well
- reaction solution in the fuel was removed, and the solution in the fuel was completely removed by filling each well with a washing buffer until it overflowed. This operation was repeated 5 times for washing.
- the absorbance was measured with a microplate reader (manufactured by TOSOH, MPR-A4ill).
- the measurement was performed at a wavelength of 450 nm for the sample and 620 nm for the reference. The value measured with an empty well was set to zero. Measurements were taken within 30 minutes of adding the stop solution.
- a calibration curve was obtained by plotting the absorbance against the tropomyosin concentration in each control. Using this calibration curve, the tropomyosin concentration was determined from the absorbance of each sample, the crustacean-derived tropomyosin in the sample was quantified, and the presence or absence of tropomyosin was determined.
- the tropomyosin concentration in the sample having a pure chitosan content of 0.1% was determined to be a calibration curve force of 0.05 ppm. Therefore, it was confirmed that 50 ppm of tropomyosin was contained per lg of chitosan sample. This chitosan sample showed no significant allergic reaction.
- the extraction solution and the washing buffer were prepared in the same manner as in Example 1.
- chitosan with a viscosity measured by a rotational viscometer at 20 ° C of lOOmPa's and a deacetylation concentration by colloid titration of 78% 1 part of the pure pyrrolidone carboxylate was mixed with 99 parts of diluted extract solution that had been pre-warmed to 60 ° C. A 1% aqueous solution of phosphate was obtained. In this case, the insoluble content of chitosan in chitosan was 0.3% according to the measurement method.
- This aqueous solution was placed in a 60 ° C water bath for 15 minutes, and tropomyosin was extracted by shaking Z mixing for 1 minute every 5 minutes. The extract was allowed to stand and filtered through a G3 glass filter. The filtrate was mixed well and then subjected to the test. Further, 1 part of this aqueous solution was added to 9 parts of the extraction solution preheated to 60 ° C. and mixed to obtain a 0.1% aqueous solution of chitosan pyrrolidonecarboxylate. After mixing well, it was subjected to the test.
- the concentration of tropomyosin in a 1% aqueous solution of chitosan pyrrolidonecarboxylate was determined to be 0.5 ppm from a calibration curve. Therefore, it was confirmed that the pure lg of pyrrolidone carboxylate of chitosan contained 50 ppm tropomyosin.
- the tropomyosin concentration in a 0.1% aqueous solution of chitosan pyrrolidone carbonate was determined to be 0.05 ppm from the calibration curve. Therefore, it was confirmed that 50 ppm of tropomyosin was contained per lg of pure pyrrolidone carboxylate of chitosan.
- the tropomyosin was measured in the same manner as in Example 1 except that a 1% acetic acid aqueous solution was used instead of the lactic acid aqueous solution in Example 1 and the chitosan concentration was 1% . The same results as in Example 1 were obtained. was gotten.
- a chitosan sample with a viscosity measured by a rotational viscometer at 20 ° C of 300 mPa's and deacetylated strength S 100% by colloid titration 1 part of pure chitosan was dissolved in 99 parts of deionized water containing 0.5 part of lactic acid to obtain a 1% aqueous chitosan solution.
- 1 part of this chitosan aqueous solution was added to 9 parts of the extraction solution previously heated to 60 ° C. and mixed to obtain a 0.1% chitosan aqueous solution.
- the insoluble content in chitosan in the chitosan was 0.2% according to the measurement method.
- the chitosan in Example 1 was replaced with the chitosan described above, When pomiosin was measured, tropomyosin in the chitosan was below the detection limit of this method. This chitosan sample showed no significant allergic reaction.
- an extraction solution and a washing buffer were prepared in the same manner as in Example 1. Add 1 part of the pure chitosan sample used in Example 1 to a beaker containing 9 parts of extraction solution preheated to 60 ° C, mix the solution with a magnetic stirrer stirrer, and add 10% chitosan dispersion. Got. This dispersion was placed in a 60 ° C. water bath for 15 minutes, and tropomyosin was extracted by shaking Z mixing for 1 minute every 5 minutes. The extract was allowed to stand and filtered through a G3 glass filter. The filtrate was mixed well and then subjected to the test.
- Example 1 1 part of the pure part of the chitosan sample used in Example 1 was added to 99 parts of the diluted extraction solution previously warmed to 60 ° C and mixed to obtain a 1% chitosan dispersion. This dispersion was placed in a 60 ° C water bath for 15 minutes, and tropomyosin was extracted by shaking Z mixing every 5 minutes for 1 minute. The extract was allowed to stand and filtered through a G3 glass filter. The filtrate was mixed well and then subjected to the test.
- Example 1 and Comparative Example 1 use the same chitosan sample, but the results are very different. The difference is that in Example 1, chitosan was dissolved and used for measurement, whereas in Comparative Example 1, chitosan was simply dispersed and used for measurement. In simple dispersion as in Comparative Example 1, chitosan was used in measurement. Of tropomyosin is not sufficiently extracted, and it is preferable to dissolve chitosan and use it for measurement in chitosan analysis. Show.
- tropomyosin in chitosan can be measured easily and accurately. Furthermore, it is possible to evaluate whether or not the above-mentioned chitosan has an extremely low potential for the development of allergic reactions in humans.
- the present invention can also provide chitosan evaluated as having an extremely low possibility of the allergic reaction.
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本発明は、キトサン中のアレルギー発現に関係する可能性のあるタンパク質、特にトロポミオシンおよびそのペプチドの含有量を簡便に精度よく測定することができる、キトサンを有機酸の水溶液に溶解した状態で、イムノアッセイ方法で測定することを特徴とするトロポミオシン測定方法、ならびに、該測定方法によって得られる測定値が一定値以下であり、アレルギーを引き起こす可能性が低いと評価されたキトサンである。
Description
明 細 書
キトサン中のトロポミオシン測定方法
技術分野
[0001] 本発明は、キトサン中のトロポミオシン測定方法に関する。より詳しくは、ィムノアッセ ィ方法、特に ELISA方法によって、キトサン中のトロポミオシンを測定する方法に関 する。また、当該測定方法によりトロポミオシン含量が評価されたキトサンに関する。 背景技術
[0002] キトサンは機能性多糖であり、化粧品、健康食品、飼料添加物などの原料として広 く使用されている。現在国内で一般に販売されているキトサンの殆どは、力-殻を原 料に工業生産されている。工業的には、キトサンは次のように製造される。まず、水産 加工場などから発生する力-殻を収集する。収集した力-殻を希塩酸に浸漬して、力 二殻中の炭酸カルシウムを塩ィ匕カルシウムに変え、該塩ィ匕カルシウムを水洗除去す ることにより、力-殻からキチンを単離する。次いで、このキチンを 40質量％以上の高 濃度水酸ィ匕ナトリウム水溶液に浸漬して加熱することによって、キチンを脱ァセチル 化してキトサンとし、その後生成したキトサンを徹底的に水洗して、過剰の水酸化ナト リウムおよび副生する酢酸ナトリウムを除去し、乾燥することによりキトサンフレークが 得られる。
[0003] 上記のようにキトサンの製造工程は、酸およびアルカリ中への浸漬工程および水洗 工程の繰り返し力もなる。また、キチンの脱ァセチルイ匕は、 40質量％以上の高濃度 水酸ィ匕ナトリウム水溶液でキチンを膨潤させ、キチン中のァセチルァミノ基の約 80% 以上が脱ァセチルイ匕されてァミノ基になるまで行われる。脱ァセチルイ匕されたキチン 、すなわち、生成したキトサンは、その後徹底的に水洗されるので、最終製品のキト サン中に力-殻に付着したタンパク質はもちろん力-殻中のタンパク質も未変性のま ま、分解を受けずにそのままキトサン中に残存して 、るとは考え難 、。
[0004] 一方、キトサン中のタンパク質を、従来公知のタンパク質測定方法で測定すると、キ トサンの構成要素であるダルコサミン単位力 タンパク質測定の阻害因子となり、タン パク質含有量の評価に値する結果が得られなかった。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] キトサンの原材料である力-殻は、食物アレルギーを引き起こすアレルギー性タン パク質を含有することが知られている。上述した通り、最終製品のキトサン中に力-殻 に付着したタンパク質はもちろん力-殻中のタンパク質も未変性のまま、分解を受け ずにそのまま残存しているとは考え難いというのが現在の常識であり、従って、常法 で製造したキトサン中にアレルギー性タンパク質がそのまま残存して 、るとは考えにく い。
[0006] 現在、キトサンを含有する健康食品が広く食用されているが、当該健康食品にはキ トサンの起源が力-殻であることが明記されていること、一日に食する上記健康食品 中のキトサンの上限量を lgとしていることなどと相まって、これまでキトサン食用による ァレノレギー問題は起きて ヽな 、。
[0007] キトサン中のタンパク質の量、特にアレルギー性のタンパク質の量またはそのタンパ ク質の一部であるペプチド断片（以下、そのペプチドと略す)もしくはそのタンパク質 を構成するアミノ酸残基の量を測定することは困難である状況の中で、アレルギー発 現に関係する可能性のあるタンパク質およびそのペプチドの含有量を測定し、それら の含有量をアレルギーを引き起こす可能性の指標として用い、巿場に出すキトサンを 評価することは、前記含有量がアレルギーの強さとまったく相関しない、あるいは殆ど 相関しないとしても有意義なことであり、また、前記含有量の低いキトサンを製造し、 前記含有量を評価したキトサンを巿場に出すことは重要なことである。
[0008] 最近アミノ酸分析の精度が格段に良くなり、新鋭機では前記ダルコサミン単位など の妨害因子に影響されることなくキトサン中のアミノ酸を定量することが可能となった 力 ここで分析されるのはあくまでもアミノ酸であり、前記アレルギー性タンパク質が、 キトサン中にぉ 、てモノマーのタンパク質として存在するの力、オリゴマーとして存在 するのカゝ、分解され、ペプチドとして存在するのか、アミノ酸として存在するのかは確 定できない。また、この分析機器は非常に高価であり汎用には適さない。
[0009] 従って本発明の目的は、キトサン中のアレルギー発現に関係する可能性のあるタン ノ ク質、特にトロポミオシンおよびそのペプチドの含有量を簡便に精度よく測定する
方法ならびにその測定方法によって得られる測定値が一定値以下であり、アレルギ 一を引き起こす可能性が低いと評価されたキトサンを提供することにある。
課題を解決するための手段
[0010] トロポミオシンは、分子量約 3万 3千のサブユニットからなる甲殻類中の筋肉タンパク 質であり、現在、小ェビの主なアレルゲンであることが確認されている。また、ロブスタ 一および力-における分子のクローユング実験により、このタンパク質が甲殻類の共 通のアレルゲンであると見なされている。従って食品によるアレルギー事故を未然に 防ぐうえで、一般食品中のトロポミオシンの測定は重要であり、その測定のため、実際 に免疫反応を利用した方法（enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA方法））が 開発および実用化されて 、る。
[0011] そこで本発明者は、一般食品用に開発された前記トロポミオシンを測定する ELIS A方法を、キトサン中のトロポミオシンの測定に適用できるかどうかを検討した。その 結果、固体のキトサンを酢酸、乳酸またはピロリドンカルボン酸などのキトサン溶解力 を持つ有機酸類の少なくとも 1種を含有する水溶液に溶解し、該水溶液を測定試料 として各種抗体を使用する ELIS A方法を用いることにより、キトサン中のトロポミオシ ンを測定することが可能であるとの知見を得た。この測定方法よつてキトサン中のトロ ポミオシンおよびそのペプチドの残存量の評価が可能であること、また、このトロポミ ォシンおよびそのペプチドの残存量が lOOppm以下のキトサンは、アレルギーを引き 起こす可能性が格段に低いこと、またはその可能性がないことを見出した。
[0012] すなわち、本発明は、キトサン中のトロポミオシンを、キトサンを有機酸の水溶液に 溶解した状態で、ィムノアッセィ方法で測定することを特徴とするトロポミオシン測定 方法を提供する。
上記測定方法においては、ィムノアッセィ方法力 ELIS A方法であること;該 ELIS A方法が、一次抗体としての少なくとも 1種の抗甲殻類トロポミオシン抗体と、少なくと も 1種の標識抗体を使用するサンドイッチ方法であること；および上記標識抗体が、酵 素標識抗甲殻類トロポミオシンポリクローナル抗体または酵素標識抗免疫グロブリン 抗体であることが好ましい。
[0013] また、上記測定方法においては、上記甲殻類が、小ェビ (a shrimp)類であり、酵素
力 ペルォキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび j8—ガラクトシダーゼからなる 群力も選ばれる少なくとも 1種であること;上記抗甲殻類トロポミオシン抗体が、測定用 容器の内壁にコーティングされて ヽること；および前記酵素が、ペルォキシダーゼで あり、その基質として o—フエ-レンジァミン、 2, 2，一アジノビス（3—ェチルーベンズ チアゾリンスルホン酸）ジアンモ -ゥム塩およびテトラメチルベンジジン力 選ばれる 少なくとも 1種を使用することが好ましい。
[0014] また、上記測定方法にお!、ては、前記トロポミオシンの測定を、測定系の青色を測 定して行うこと;前記トロポミオシンの測定を、青色を呈する測定系に硫酸またはリン 酸を添加して、測定系を黄色に変え、該黄色を測定して行うこと;有機酸が、酢酸、乳 酸およびピロリドンカルボン酸力 なる群力 選ばれる少なくとも 1種であること；およ び有機酸水溶液の有機酸濃度が、 0. 1質量％以上 1質量％以下であることが好まし い。
[0015] また、上記測定方法においては、キトサンが、その不溶解分力 以下の測定方法に より 1. 0質量％以下のキトサンであることが好ま U、。
(1)キトサンを 105°Cにて 3時間乾燥する。
(2)乾燥前後の質量比からキトサン純分率を計算する。
(3)乾燥前のキトサンを 1質量％の酢酸水溶液にキトサン純分 (Aグラム)濃度 0. 5質 量％に溶解する。
(4)上記水溶液を、恒量にした G3のグラスフィルター（Bグラム）で濾過する。
(5)上記フィルター上の濾過残物を蒸留水で洗浄する。
(6)濾過残物を含むフィルターを 105°Cにて 3時間乾燥し、秤量 (Cグラム)する。
(7)式 [ (C— B) ZA X 100]によりキトサン中の不溶解分 (質量％)を計算する。
[0016] また、本発明は、トロポミオシンの含有量力 lOOppm (前記本発明の測定方法によ り得られた測定値)以下であることを特徴とするキトサンを提供する。
発明の効果
[0017] 本発明によれば、キトサン中のトロポミオシンを簡便かつ精度よく測定することがで きる。さらに、当該測定により、上記キトサンのヒトに対するアレルギー反応発現の可 能性力 著しく低いかまたはないかを評価できる。本発明は、また、該アレルギー反
応の可能性が著しく低 、かまたはな 、と評価されたキトサンを提供することができる。 発明を実施するための最良の形態
[0018] 本発明を説明する前に、本発明で使用する用語を説明する。
「測定」とは、トロポミオシンの定量および単なる検出をも含めるものとする。 「一次抗体」とは、抗抗原抗体、すなわち、抗原に対する抗体を意味するものとする 。この一次抗体にはモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体をも含めるものと する。一次抗体は、標識されていてもよぐされていなくてもよい。一次抗体を例示す るならば、抗甲殻類トロポミオシン抗体を挙げることができる。一次抗体を産生する生 物種としては、当該分野で通常使用される種々の生物種を用いることができる。当該 生物種の中には、ハイプリドーマなどの培養細胞をも含む。
[0019] 「二次抗体」とは、抗免疫グロブリン抗体、すなわち、抗体に対する抗体を抗原とす る抗体を意味する。本発明においては、抗原に対する抗体の抗体だけでなぐ抗体 を作製した生物の免疫グロブリン自身 (例、 IgG)、すなわち、抗原と特異的に結合で きなくても、抗体を作製した生物の IgGに特異的に結合できる抗体をも意味する。そ の他は一次抗体と同様である。この二次抗体は、標識されていてもよぐされていなく てもよい。
[0020] 「トロポミオシン」とは、トロポミオシン自体に加えて、トロポミオシンの一部であるぺプ チドをも含むものとし、以後「トロポミオシンまたはそのペプチド」のことを単に「トロポミ ォシン」と略称する場合がある。
その他の用語は、特別に断りがない場合は、現在の免疫学、分子生物学および生 化学の分野で使用されているものと同様な意味を有する。
[0021] 以下、本発明を実施するための最良の形態を挙げて本発明をさらに詳しく説明す る。
本発明は、キトサン中のトロポミオシンを測定する方法である。当該キトサンは甲殻 類から単離したキチンを原料として作られる。甲殻類力 のキチンの単離方法は前記 したような酸処理およびアルカリ処理を基本とした Hackmanの方法が一般的であるが 、これに限定されることなぐアルカリ処理の代わりにプロテアーゼなどの酵素を利用 する方法などのこれまでに開発されて 、る 、ずれの方法でもよ 、。
[0022] キトサンは、単離したキチンを水酸ィ匕アルカリ水溶液中で脱ァセチルイ匕して得られ る。この場合、水酸ィ匕アルカリとしては水酸ィ匕ナトリウムや水酸ィ匕カリウムなどが使用さ れ、水酸ィ匕アルカリ水溶液の濃度は 35質量％以上であることが好ましい。脱ァセチ ルイ匕温度に制限はないが、低温であると反応速度が非現実的なものになってしまう ので、 20°C以上、好ましくは 50°C以上である。
[0023] キチンを脱ァセチル化後、得られたキトサンを十分に水洗する。本発明方法に使用 するキトサンは、一例としてではあるが、酢酸濃度 1質量％の水溶液にキトサンを濃度 0. 5質量％で溶解した時、キトサン中の不溶解分が 1質量％以下のキトサンが好適 である。そのようなものであればキトサンの脱ァセチルイ匕度に限定はない。
[0024] 上記のような不溶解分の少な 、キトサンを得るためには、現在の一般的な工業生産 方法である、不均一系脱ァセチル化法 (キチンを溶解せずに水酸化アルカリ水溶液 中に浸漬してキチンを脱ァセチルイ匕する方法)で得るキトサンの場合、 70%以上の 脱ァセチル化度が必要であり、均一系脱ァセチルイ匕法 (キチンを溶解状態で脱ァセ チル化する方法)で得るキトサンの場合、 30%以上の脱ァセチルイ匕度が必要である 。なお、脱ァセチルイ匕度はコロイド滴定によるキトサン構成糖単位中のダルコサミン単 位のモル分率である。本発明においては、キトサンの分子量には限定はない。
[0025] 本発明にお ヽてトロポミオシンを測定するキトサンは、有機酸水溶液に溶解した状 態で使用する。これに対して、キトサンは、分散しにくいポリマーであり、キトサンが分 散状態である場合、キトサンが分散不十分な状態となり、トロポミオシンの測定結果に 誤差を生じる可能性があるので好ましくない。そこでキトサン中のトロポミオシンを測 定する際、測定対象のキトサンに有機酸水溶液を加えるカゝ、または有機酸水溶液に キトサンをカ卩える力して、キトサンを水溶液状態にしてキトサン中のトロポミオシンを測 定するのが好ましい。
[0026] 本発明にお 、て測定対象物であるキトサンを溶解するために使用する有機酸とし ては、酢酸、乳酸およびピロリドンカルボン酸などが好ましいものとして挙げられる。こ れらの有機酸水溶液の酸濃度は、 0. 1質量％以上 2質量％未満が望ましぐより好 適には 0. 5質量％以上 1質量％以下である。上記有機酸の代わりに塩酸などの無機 酸を使用したり、有機酸であってもその酸濃度が 2質量％以上であると、得られるキト
サン水溶液の pHが低くなりすぎ、キトサン水溶液中のトロポミオシンの測定値のバラ つきが大きくなる傾向があり、好ましくない。また、有機酸濃度が 0. 1質量％未満では キトサンは十分には溶解しな ヽ。上記の有機酸はキトサンと塩を形成して ヽる状態で 使用してもよい。この場合は、上記の有機酸水溶液にキトサンを溶解する代わりに、 キトサンの有機酸塩を試料調製用の溶媒に溶解すればよい。
[0027] 測定に使用するキトサン水溶液のキトサンの濃度は、使用する有機酸水溶液の酸 濃度に依存するので一概に言えないが、例えば、有機酸水溶液の濃度が 1質量％ の場合には、キトサン濃度として 0. 5質量％以上 1質量％以下を例示できる。この濃 度は、トロポミオシンを抽出用緩衝液などで希釈する前の濃度である。
[0028] 上記のように本発明の方法においては、トロポミオシンの測定に使用するキトサンは 、有機酸水溶液に溶解した水溶液状態で使用することが好ましい。このように水溶液 状態のキトサンを用いれば、キトサン中のトロポミオシンの測定は、ィムノアッセィ方法 による測定であればどのような方法でもよぐ特に限定されない。
[0029] また、使用するキトサンは、その脱ァセチルイ匕度や分子量に特に制限はないが、例 えば、酢酸濃度 1質量％の水溶液にキトサンを濃度 0. 5質量％で溶解した時、キトサ ン中の不溶解分が 1質量％以下のキトサンであることが好適である。キトサン中の不 溶解分は、以下のように測定される。
(1)キトサンを 105°Cにて 3時間乾燥する。
(2)乾燥前後の質量比からキトサン純分率を計算する。
(3)乾燥前のキトサンを 1質量％の酢酸水溶液にキトサン純分 (Aグラム)濃度 0. 5質 量％に溶解する。
(4)上記水溶液を、恒量にした G3のグラスフィルター（Bグラム）で濾過する。
(5)上記フィルター上の濾過残物を蒸留水で洗浄する。
(6)濾過残物を含むフィルターを 105°Cにて 3時間乾燥し、秤量 (Cグラム)する。
(7)式 [ (C— B) ZA X 100]によりキトサン中の不溶解分 (質量％)を計算する。
[0030] 本発明は、前記のキトサン中のトロポミオシン (以下、特別に断らない限り、抗原と称 する場合がある。）をィムノアッセィ方法を用いて測定する方法である。当該アツセィ 方法には、競合ィムノアッセィ方法およびサンドイッチ方法の二つの形式がある。本
発明においてはどちらも好適に使用できる。さらに、これらの方法においては、測定 のインジケーター (indicator)として、アイソトープ (mI、 125I、 "C、 3H、 57Co、 75Seなど） 、蛍光物質または酵素などを、抗原または抗体に標識して使用する方法が知られて いる。本発明においては、いずれの方法も使用することができる。
[0031] 本発明において、測定方法としてサンドイッチ方法を使用する場合、測定精度およ び簡便性の面から、酵素で標識した抗体を使用する方法 (ELISA方法と称される。 ) 力 り好適である。サンドイッチ方法においては、下記に示す一次抗体—抗原—標 識抗体 (一次または二次)の結合物 (複合物とも!ヽぅ。 )を形成させる方法および一次 抗体 抗原 無標識抗体 (一次または二次） 標識二次抗体の結合物を形成させ る方法がある。本発明においては、どちらも好適に使用できる。
[0032] 本発明において、抗体を作成するための抗原として使用するトロポミオシンは、特に 甲殻類由来のものがよい。例えば、力二、ェビ、ミジンコ、フジッボ、アミ、ワラジムシな どに由来するトロポミオシンを挙げることができる。より好適にはイセェビ (lobster)、小 ェビ（shrimp)および力- (crab)由来のトロポミオシンである。
[0033] 本発明において使用する抗体は、抗原を使用して免疫 (感作)したマウス、ハムスタ 一、 -ヮトリ、ャギ、ラット、ゥサギなどの生物もしくはそれらから単離した細胞、または 、抗原を使用して免疫した生物の脾臓からリンパ球を分離し、当該リンパ球をガン細 胞 (例えば、ミエローマ）と融合させて得た細胞 (ハイプリドーマ)などを使用して調製 するのがよい。しかし、本発明においてはこれらの例示に限定されない。すなわち、 本発明の目的を達成できる生物もしくは細胞由来の抗体であればよい。モノクローナ ル抗体はハイプリドーマを用いて調製するのが好適である。
[0034] 1.一次抗体-抗原—標識抗体 (一次または二次)の結合物 (複合物ともいう。）を 形成させる方法。
この方法において使用する一次抗体は、少なくとも 1種の一次抗体である。該一次 抗体は、固定化 (不溶ィ匕またはコーティングともいう。）されていても、いなくともよい。 本発明は、キトサン中のトロポミオシンを測定する方法であるので、トロポミオシンの抗 体であるならば、ポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体でもよい。測定精度の 点から、一次抗体は、モノクローナル抗体を使用するのがより好適である。
[0035] 上記方法において使用する標識抗体としては、少なくとも 1種の一次抗体もしくは 少なくとも 1種の二次抗体、またはその混合物を含む。これらの抗体は、前記と同様 にモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよ ヽ。より好適な抗体の具体例とし て、一次抗体として抗小ェビ (シュリンプ）トロポミオシン抗体が挙げられ、また、標識 抗体としてペルォキシダーゼ標識抗免疫グロブリン抗体またはペルォキシダーゼ標 識抗小ェビ (シュリンプ）トロポミオシンポリクローナル抗体などが挙げられる。しかし、 本発明はこれらの例示の抗体に限定されない。
[0036] 上記方法において、固定化された抗体を使用する場合、抗体の固定ィ匕は、ガラス、 プラスチックまたは紙などに対して行われる。具体的には、抗体の固定ィ匕を、ガラス、 プラスチックまたは紙などの測定用容器、すなわち、試験管、小遠心チューブ、溝 (ゥ エル）を有するプレート（例えば、マイクロタイタープレート）、またはビーズなどに行う のが好適である。抗体の固定ィ匕は、従来公知の方法で行うことができる。上記の固定 化された抗体および標識抗体の調製は、同じ生物を免疫して調製してもよいが、異 なった生物を免疫して調製するのが好適である。上記の方法においては、一次抗体 と標識抗体との間に抗原が挟まれて、サンドイッチ状の結合物（conjugated substance ) (複合物)が形成される。
[0037] 本発明において、標識物質として蛍光物質を使用する場合、蛍光物質としては、本 発明の目的が達成できるものであればいかなるものでもよいが、例えば、フルォレセ インイソチオシァネート、ローダミンイソチアネートおよびフィコェリシリン（phycoerythri n)などを挙げることができる。蛍光物質の抗体への標識は、従来公知の方法で達成 できる。標識物質として酵素を使用する場合、 ELISA方法と称される。 ELISA方法 において、用いられる上記酵素としては、測定の精度および簡便性など力もペルォ キシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび j8—ガラクトシダーゼなどを好適なものとし て挙げることができる。これらのなかでもペルォキシダーゼを測定精度カゝら特に好適 なちのとして挙げることができる。
[0038] 上記の酵素の基質の好適な例示を以下に示す。酵素がペルォキシダーゼの場合 は、 o—フエ-レンジァミン（発色：茶褐色）、 2, 2，一アジノビス（3—ェチルーベンズ チアゾリンスルホン酸）ジアンモ -ゥム塩、テトラメチルベンジジン（3, 3 ' , 5, 5，一tet
ramethylbenzidine) (発色：青色)、 ABTS (diammonium 2,2'— azino— bis(3— ethylbenzot hiazoline-6-sulfate) ) (発色：青色）などが例示できる。これらのなかでも、発色の鋭敏 性力 テトラメチルベンジジンがより好まし 、。酵素がアルカリホスファターゼの場合は 、 p 二トロフエ-ルリン酸塩 (発色:黄色)など、酵素が |8—ガラクトシダーゼの場合 は、。—-トロフエ-ルリン酸 (発色:黄色)などが挙げられる。し力しながら、本発明に お!、ては、上記の例示に限定されるものではな 、。
[0039] 酵素を抗体に標識する方法としては、従来公知の方法がいずれも好適に利用でき る。標識方法の一つの具体例としては、抗体をまずピオチン化して (ピオチン化抗体 )、酵素をストレプトアビジンで標識して、ピオチンィ匕抗体のピオチンとストレプトァビジ ンとの結合を利用する方法がより好適である。酵素反応は、従来公知の条件で行うこ とがでさる。
[0040] 2.一次抗体 抗原 無標識抗体 (一次または二次） 標識二次抗体の結合物を 形成させる方法。
この方法は、前記 1の方法における標識抗体の代わりに、無標識の一次または二 次抗体を使用し、さらに、標識二次抗体を使用するものである。当該標識二次抗体 は、上記無標識の抗体に対する抗体 (抗免疫グロブリン抗体)か、または上記無標識 抗体に特異的に結合する抗体 (例えば、標識抗体を作製した動物の抗体に、特異的 に結合する抗体)であればよぐその由来を問わない。標識二次抗体は、本発明の場 合、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でも使用できる力 好適にはポリクロ 一ナルを使用するのがよい。それ以外は前記 1の方法と同様である。
[0041] 上記の方法においては、一次抗体 (この抗体は前記 1.の方法と同様に固定ィ匕され ていてもいなくともよいが、固定化されている方が好適である。）と抗原とが結合し、そ の結合物に無標識の一次または二次抗体が結合する。そして該結合物に標識二次 抗体が結合する形式になる。標識物、標識方法などは前記 1.の方法と同様である。
[0042] 上記の方法にぉ 、て、より好適な抗体の具体例として、一次抗体としては、抗シユリ ンプトロポミオシン抗体が挙げられ、標識二次抗体としては、ペルォキシダーゼ標識 抗免疫グロブリン (ポリクローナル)抗体を挙げることができる。しかし、本発明はこれら の例示に限定されない。
[0043] 上記方法 1.および 2.において、使用する抗体の由来生物は、特に限定されない 力 好適な一例を挙げると、前記 1.の方法では、固相抗体ではマウスまたはラット由 来、標識抗体ではゥサギまたはャギ由来、前記 2.の方法では、固相抗体ではマウス またはラット由来、無標識抗体ではゥサギまたはャギ由来、標識二次抗体ではャギま たはゥサギ由来が挙げられる。なお、前記 1.および 2.の方法に使用する、各種の抗 体をコーティングした測定用容器は、巿販されている（例えば、 ELISA SYSTEMS社、 BETHYL社などから）ので、それらを用いるのが好適である。また、所望の抗体、およ び所望の抗体をコーティングした測定用容器は、それらの作製を依頼して入手しても よい。依頼先として、タカラバイオ株式会社 (大津巿)などを例示できる。
[0044] 次に、サンドイッチ方法の一般的な測定手順の一例について説明する。本発明は 決してこれらの例に限定されることなぐ種々の変法の使用が可能である。また、これ らの手順は一般成書、例えば、（実験医学別冊）「免疫学的プロトコール」中内啓光 編、羊土社、 2004年発行； I.Roitt、「Essential Immunology] , 8th, BlackwelU 1994 年；「超高感度酵素免疫測定法」石川栄治編、学会出版センター、 1993年)などに 記載されているので、詳しくはそれらを参照することにより本発明の実施が可能であ る。
[0045] 以下サンドイッチ方法のうち固定ィ匕された抗体を使用する方法について例示する。
i)前記 1.の方法:一次抗体-抗原—標識抗体 (一次抗体または二次抗体)の結合 物を形成させる方法は以下の手順を含む。
1)一次抗体を試験管または溝 (ゥエル)を有するプレート (例えば、マイクロタイタープ レート)またはビーズなどの測定用容器内壁面または表面に固定ィ匕 (コーティング)す る。ここで、固定ィ匕に用いる測定用容器としては、 ELISA用の高タンパク吸着処理済 のもの、また、通常の細胞培養用のものが好適に用いられる。
[0046] まず、一次抗体を緩衝液で希釈して前記容器に添加し、室温で 30分以上 3時間以 下、 0°C以上 10°C以下などの低温で約ー晚静置する。その後、一次抗体溶液を除き 、ブロッキング溶液 (緩衝液に BSAを溶解したもの）を適量を添加し、前記と同様に静 置後、ブロッキング溶液を除く。力べして、抗体を固定ィ匕することができる。
2)前記のようにして調製された容器に測定対象の前記キトサン水溶液を添加し、前
記と同様に静置する。力べして、もし、キトサン水溶液中に抗原が存在するならば、抗 原が抗体と結合する。この反応を一次免疫反応という場合がある。なお、測定用試料 (キトサン水溶液）は、抗原抽出用緩衝液で希釈し、濃度の異なる複数の試料として 測定に用いるのが好適である。
3)上記反応後の容器に、洗浄用緩衝液を添加し、次にそれを除去することにより、 固定化された抗体と抗原との結合物を洗浄する。
[0047] 4)上記 3)の洗浄後の容器に、標識抗体 (一次または二次）を含む溶液を添加して、 前記と同様に静置する。カゝくして、固定化抗体 抗原 標識抗体の結合物を形成さ せることができる。この反応を二次免疫反応と 、う場合がある。
5)上記 4)の反応後の容器に、洗浄用緩衝液を添加し、次にそれを除去することによ り結合物を洗浄する。
上記の緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液 PBS、 pH : 6以上 8以下、濃度： 2m M以上 500mM以下を使用できる。
6)以下の a)乃至 c)の手順を行う。
a)標識抗体の標識物が酵素である場合次の手順を行う。
[0048] a— 1)上記 5)の洗浄後の結合物に酵素基質溶液を添加して酵素反応させる。酵 素反応の時間および温度などの条件は、標識酵素の種類によって異なるが、当該酵 素につ 、て従来公知の一般的条件で行ってょ 、。
[0049] a— 2)上記酵素基質溶液添加後の溶液 (反応液)の吸光度または蛍光強度を適当 な波長を用いて測定する。この場合、反応液 (測定系ともいう）をそのまま経時的に、 適当な波長で測定してもよい。また、適当な反応時間後に、酸またはアジィ匕塩などの 反応停止液を添加してから測定するのもよ!ヽ。反応停止液を添加する方法は簡便性 力 より好適な方法である。好適な酸としてはリン酸 (オルトリン酸)または硫酸を挙げ ることができる。酵素基質として 3, 3 ' , 5, 5 '—テトラメチルベンジジンを用いる場合、 反応液は青色であるが、反応液に酸を加えると黄色になるので、適当な波長でそれ を測定する。
[0050] b)標識抗体の標識物が蛍光物質の場合、反応液の蛍光強度を測定する。
c)標識抗体の標識物がアイソトープの場合、アイソトープ活性をシンチレーシヨン力
ゥンターで測定する。
[0051] ii)前記 2.の方法:一次抗体 抗原 無標識抗体 (一次または二次） 標識二次抗 体の結合物を形成させる方法は以下の手順を含む。
1)一次抗体の固定化 (コーティング）：前記 i)の方法と同様である。
2)一次免疫反応：前記 i)の 2)の方法と同様である。
3)二次免疫反応：上記 2)の洗浄後の容器に無標識抗体 (一次または二次)を含む 溶液を添加して、固定化一次抗体 抗原 無標識抗体 (一次または二次)の結合物 を形成させる。
[0052] 4)上記 3)の反応後の容器に、緩衝液を添加して、次にそれを除去して、固定化さ れた抗体と抗原との結合物を洗浄する。
5)上記 4)の洗浄後の溶液に標識二次抗体を含む溶液を添加し、固定化抗体ー抗 原 無標識抗体 (一次または二次） 標識二次抗体の結合物を形成させる。この反 応を三次免疫反応と!/、う場合がある。
6)上記 5)の反応後の容器に緩衝液を添加し、次にそれを除去して、結合物を洗浄 する。
7)以下の a)乃至 c)の手順を行う。
a)標識抗体の標識物が酵素である場合の手順：前記 i)の 6)の a)の方法と同様で ある。
b)標識抗体の標識物が蛍光物質である場合の手順：前記 i)の 6)の の方法と同 様である。
c)標識抗体の標識物がアイソトープの場合:前記 i)の 6)のじ）の方法と同様である。
[0053] 上記に説明した方法は、固定ィ匕した抗体を使用するものであるが、固定ィ匕しない抗 体を使用する方法においては、一次反応前、二次反応前および三次反応前に遠心 分離により、結合物 (複合物）を分離するのが好適である。
上記の測定においては、測定対象のサンプルにカ卩え、標準となる抗原についても 並行して測定を行うのが好適である。また、陽性コントロールおよび陰性コントロール についての測定も、並行して行うのがよい。また、例えば、実際の測定に先立ち、濃 度が既知のサンプルにつ ヽて検量線を作成してぉ 、て、試料の濃度を検量線から
求める方がより精度の高 、測定値が得られる。
[0054] 上記の測定における測定器 (機）は、それ用に市販されているものを使用するのが よい。例えば、マイクロプレートリーダなどを挙げることができる。好適な波長で測定す ればよい。
[0055] また、測定試薬などはキットとして、市販されているので、それを使用して本発明の 目的を達成するのが、簡便であり好適である。例えば、 ELISA SYSTEMS PTY Ltd製 、 ustraliiaノの「し rustacean Tropomyosin ResidueJ iicrowell ELIbA Product Code : E SCRUR— 48分析キットなどを挙げることができる。このようなキットを購入し、添付され て 、る説明書および分析手順に従って測定するのがよ 、。
[0056] また、本発明は、上記本発明の方法で測定した時に、トロポミオシンの含有量力 1 OOppm以下であることを特徴とするキトサンを提供する。当該キトサンは、例えば、食 品用原料や化粧品原料として使用した場合、ヒトに対してアレルギー現象を生じる可 能性がないか、あるいはその可能性が極めて低く安全性が高い。これに対してトロポ ミオシンの含有量が lOOppmを超えるキトサンでは、ヒトに対するアレルギー反応があ る程度は心配される。
実施例
[0057] 次に実施例および比較例を挙げて本発明を具体的に説明する。なお、文中「部」ま たは「％」とあるのは特に断りのない限り質量基準である。
以下の実施例および比較例におけるトロポミオシン測定方法は、ィムノアッセィ法の 中の ELISA法である。そして一次抗体として抗マウスシュリンプトロポミオシン抗体の 使用および標識抗体として抗マウスシュリンプトロポミオシンポリクローナル抗体コン ジュゲートペルォキシダーゼ（ペルォキシダーゼ標識抗マウスシュリンプトロポミオシ ンポリクローナル抗体)を使用するサンドイッチ測定方法である。
[0058] 実施例 1
ELISA SYSTEMS社の力- 'ェビ用アレルゲンテストキットである「Crustacean Tropo myosin Residue J Microwell ELISA Product Code:ESCRUR- 48分析キット 48)を用いて 、以下の手順で力-由来キトサン中に残存するトロポミオシンを測定した。
キットの調製法は、製品に付属の添付文書に従った。すなわち、濃縮洗浄用緩衝
液 (NaCl含有リン酸緩衝液）の 25mLを、 475mLのイオン交換水中に投入し、洗浄 用緩衝液として洗浄ビンに入れた。また、濃縮抽出用溶液 (NaClを含むリン酸緩衝 液)の 25mLを 475mLのイオン交換水中に投入し、抗原の抽出用溶液として保存ビ ンに人れた。
[0059] キトサン濃度および酢酸濃度ともに 0. 5%の水溶液とした場合、 20°Cにおける回転 粘度計による測定粘度が 500mPa' sであり、かつコロイド滴定による脱ァセチルイ匕度 が 90%であるキトサンサンプルから、キトサン純分 1部を 0. 5部の乳酸を含む脱ィォ ン水 99部に溶解し、 1%キトサン水溶液を得た。また、このキトサン水溶液の 1部を予 め 60°Cに暖めた抽出用溶液 9部に加えて混合し、 0. 1%キトサン水溶液を得た。こ の場合のキトサン中のキトサン不溶解分は前記測定方法により 0. 5%であった。 上記 0. 1%キトサン水溶液を 60°Cの温浴に 15分間入れ、 5分毎に 1分間振盪 Z混 合することによりトロポミオシンの抽出を行った。この抽出液を静置し、 G3ガラスフィル ターで濾過した。濾液をよく混合した後、サンプルとしてトロポミオシン測定試験に供 した。
[0060] 次いでキットの使用方法に従いキットの準備を行った。すなわち、キットの使用前に キットの一式を室温（20°C以上 25°C以下）に戻し、サンプルおよびコントロールの測 定に必要な数のゥエルを有するゥエルプレートを準備してホルダーにセットした。この 時、各ゥエルプレートに識別マークを入れて誤測定を防いだ。なお、ゥエルには抗シ ュリンプトロポミオシン抗体がコーティングされている。
[0061] 陰性コントロール（トロポミオシン濃度 Oppm)ならびに陽性コントロール（同 0. 05pp m、0. 10ppm、0. 25ppmおよび 0. 50ppm)水溶液を、各々 ΙΟΟ Lずつゥエルに 添加した。また、上記各サンプルの 100 /z Lずつをゥエルーつづつに添カ卩した。なお 、各コントロールおよびサンプルは 2連で測定を行った。
[0062] 10秒間ホルダーをゆっくりとスライドさせ、ゥエル内の溶液を混合した。これを室温 で 30分間インキュベートし、一次免疫反応を行った。反応後、ゥエル内の溶液を除去 し、洗浄用緩衝液を用いて各々のゥエルをオーバーフローするまで満たしてからゥェ ル内の溶液を完全に除去した。この操作を 5回繰り返し洗浄を行った。ペルォキシダ ーゼ標識抗シュリンプトロポミオシンポリクローナル抗体溶液の 100 μ Lを各々のゥェ
ルに添カ卩した。 10秒間ホルダーをゆっくりとスライドさせ、ゥエル内の溶液を混合した
。これを室温で 15分間インキュベートし、二次免疫反応を行った。
[0063] 反応後、ゥエル内の反応液を除去し、洗浄用緩衝液を用いて各々のゥ ルをォー バーフローするまで満たしてカもゥエル内の溶液を完全に除去した。この操作を 5回 繰り返し洗浄を行った。
[0064] 酵素基質溶液の 100 Lを各々のゥヱルに添カ卩した。 10秒間ホルダーをゆっくりと スライドさせ、ゥエル内の溶液を混合した。これを室温で 10分間インキュベートし、発 色反応を行った。この段階で、陽性の溶液は青色に呈色した。停止液 (オルソリン酸 水溶液）の 100 μ Lを各々のゥエルに添カ卩した。 10秒間ホルダーをゆっくりとスライド させてゥエル内の溶液を混合し、酵素反応を停止した。ここで、上記青色に呈色した 溶液は、黄色へと変化した。
[0065] 吸光度の測定はマイクロプレートリーダ（TOSOH社製、 MPR-A4ill)により行った。
すなわち、サンプルは 450nm、リファレンスは 620nmの波長で測定を行った。なお、 空のゥエルにて測定した値をゼロとした。また、測定は、停止液の添加から 30分以内 に行つた。各コントロール中のトロポミオシン濃度に対する吸光度をプロットして検量 線を得た。この検量線を用いて、各サンプルの吸光度からトロポミオシン濃度を求め 、サンプル中の甲殻類由来トロポミオシンを定量し、トロポミオシンの有無について判 定を行った。
[0066] キトサン純分が 0. 1%である上記サンプル中のトロポミオシン濃度は、検量線力 0 . 05ppmと求められた。よって、キトサンサンプルの純分 lg当たり、 50ppmのトロポミ オシンを含むことが確認できた。このキトサンサンプルは有意なアレルギー反応を示 さなかった。
[0067] 実施例 2
トロポミオシン測定試験の準備として、抽出用溶液および洗浄用緩衝液は、実施例 1と同様に調製した。キトサン濃度および酢酸濃度がともに 0. 5%である水溶液とし た場合、 20°Cにおける回転粘度計による測定粘度が lOOmPa' sであり、かつコロイ ド滴定による脱ァセチルイ匕度が 78%であるキトサンのピロリドンカルボン酸塩の純分 1部を、予め 60°Cに暖めた希釈抽出溶液 99部と混合し、キトサンのピロリドンカルボ
ン酸塩の 1%水溶液を得た。この場合のキトサン中のキトサン不溶解分は前記測定 方法により 0. 3%であった。
[0068] この水溶液を 60°Cの水浴に 15分間入れ、 5分毎に 1分間振盪 Z混合することによ りトロポミオシンの抽出を行った。この抽出液を静置し、 G3ガラスフィルターで濾過し た。濾液をよく混合した後、試験に供した。また、この水溶液の 1部を、予め 60°Cに暖 めた抽出用溶液 9部に加えて混合し、キトサンのピロリドンカルボン酸塩の 0. 1%水 溶液を得た。よく混合した後、試験に供した。
[0069] キトサンのピロリドンカルボン酸塩の 1%水溶液におけるトロポミオシン濃度は、検量 線から 0. 5ppmと求められた。よって、キトサンのピロリドンカルボン酸塩の純分 lgあ たり、 50ppmのトロポミオシンを含むことが確認できた。また、キトサンのピロリドンカル ボン酸塩の 0. 1%水溶液におけるトロポミオシン濃度は、検量線から 0. 05ppmと求 められた。よって、キトサンのピロリドンカルボン酸塩の純分 lgあたり、 50ppmのトロポ ミオシンを含むことが確認できた。
[0070] キトサンのピロリドンカルボン酸塩中のキトサン含有量は 70%であるので、キトサン 純分 lgあたり 71ppmのトロポミオシンを含むことが確認できた。このキトサンのピロリド ンカルボン酸は有意なアレルギー反応を示さなかった。
[0071] 実施例 3
実施例 1における乳酸水溶液に代えて濃度 1%の酢酸水溶液を使用し、かつキトサ ン濃度を 1%にした以外は実施例 1と同様にしてトロポミオシンを測定したところ、実 施例 1と同じ結果が得られた。
[0072] 実施例 4
キトサン濃度および酢酸濃度ともに 0. 5%の水溶液とした場合、 20°Cにおける回転 粘度計による測定粘度が 300mPa' sであり、かつコロイド滴定による脱ァセチルイ匕度 力 S 100%であるキトサンサンプルから、キトサン純分 1部を 0. 5部の乳酸を含む脱ィ オン水 99部に溶解し、 1%キトサン水溶液を得た。また、このキトサン水溶液の 1部を 予め 60°Cに暖めた抽出用溶液 9部に加えて混合し、 0. 1%キトサン水溶液を得た。 この場合のキトサン中のキトサン不溶解分は前記測定方法により 0. 2%であった。 実施例 1におけるキトサンを上記キトサンに代えた以外は実施例 1と同様にしてトロ
ポミオシンを測定したところ、上記キトサン中のトロポミオシンは本方法の検出限界以 下であった。このキトサンサンプルは有意なアレルギー反応を示さなかった。
[0073] 比較例 1
トロポミオシン測定試験の準備として、抽出用溶液および洗浄用緩衝液を、実施例 1と同様に調製した。実施例 1で使用したキトサンサンプルの純分 1部を、予め 60°C に暖めた抽出用溶液 9部を入れたビーカーに加え、該溶液をマグネット攪拌子スター ラで混合し 10%キトサン分散液を得た。この分散液を 60°Cの水浴に 15分間入れ、 5 分毎に 1分間振盪 Z混合することによりトロポミオシンの抽出を行った。この抽出液を 静置し、 G3ガラスフィルターで濾過した。濾液をよく混合した後、試験に供した。
[0074] 同様に、実施例 1で使用したキトサンサンプルの純分 1部を、予め 60°Cに暖めた希 釈抽出溶液 99部に加えて混合し、 1%キトサン分散液を得た。この分散液を 60°Cの 水浴に 15分間入れ、 5分毎に 1分間振盪 Z混合することによりトロポミオシンの抽出 を行った。この抽出液を静置し、 G3ガラスフィルターで濾過した。濾液をよく混合した 後、試験に供した。
また、上記 1%キトサン分散液の 1部を、予め 60°Cに暖めた抽出用溶液 9部と混合 し、 0. 1%キトサン分散液を得た。いずれもよく混合した後、トロポミオシン測定試験 に供した。
[0075] 実施例 1と同様に測定を行い、トロポミオシン測定結果の判定を行った。キトサン純 分を 10%、 1%または 0. 1%含むキトサン分散液のいずれにおいてもトロポミオシン は検出されなかった。本キットのトロポミオシンの検出限界が 0. lppmであるので、キ トサンサンプルの純分 lgあたり、トロポミオシン含有量は 10%キトサン分散液では lp pm以下、 1%キトサン分散液では lOppm以下、 0. 1%キトサン分散液では lOOppm 以下であると結論できた。
[0076] 実施例 1および比較例 1は同一のキトサンサンプルを使用しているが、結果は大きく 異なっている。この相違は、実施例 1ではキトサンを溶解して測定に用いるのに対し、 比較例 1ではキトサンを簡単に分散しただけで測定に使用しており、比較例 1程度の 簡単な分散ではキトサン中のトロポミオシンが十分に抽出されないためであると考え られ、キトサン分析の際にはキトサンを溶解して測定に使用するのが好適であることを
示している。
産業上の利用可能性
本発明によれば、キトサン中のトロポミオシンを簡便かつ精度よく測定することがで きる。さらに、当該測定により、上記キトサンのヒトに対するアレルギー反応発現の可 能性力 著しく低いかまたはないかを評価できる。本発明は、また、該アレルギー反 応の可能性が著しく低 、かまたはな 、と評価されたキトサンを提供することができる。
Claims
請求の範囲
[I] キトサン中のトロポミオシンを、キトサンを有機酸の水溶液に溶解した状態で、ィムノ アツセィ方法で測定することを特徴とするトロポミオシン測定方法。
[2] ィムノアッセィ方法力 ELISA方法である請求項 1に記載の測定方法。
[3] ELISA方法力 一次抗体としての少なくとも 1種の抗甲殻類トロポミオシン抗体と、 少なくとも 1種の標識抗体を使用するサンドイッチ方法である請求項 2に記載の測定 方法。
[4] 標識抗体が、酵素標識抗甲殻類トロポミオシンポリクローナル抗体または酵素標識 抗免疫グロブリン抗体である請求項 3に記載の測定方法。
[5] 甲殻類が、小ェビ類であり、酵素が、ペルォキシダーゼ、アルカリホスファターゼぉ よび j8—ガラタトシダーゼ力もなる群力 選ばれる少なくとも 1種である請求項 4に記 載の測定方法。
[6] 抗甲殻類トロポミオシン抗体力 測定用容器の内壁にコーティングされている請求 項 3に記載の測定方法。
[7] 酵素が、ペルォキシダーゼであり、その基質として o—フエ-レンジァミン、 2, 2，一 アジノビス（3—ェチルーベンズチアゾリンスルホン酸）ジアンモ -ゥム塩およびテトラ メチルベンジジン力 選ばれる少なくとも 1種を使用する請求項 4に記載の測定方法
[8] トロポミオシンの測定を、測定系の青色を測定して行う請求項 7に記載の測定方法
[9] トロポミオシンの測定を、青色を呈する測定系に硫酸またはリン酸を添加して、測定 系を黄色に変え、該黄色を測定して行う請求項 8に記載の測定方法。
[10] 有機酸が、酢酸、乳酸およびピロリドンカルボン酸力 なる群力 選ばれる少なくと も 1種である請求項 1に記載の測定方法。
[II] 有機酸水溶液の有機酸濃度が、 0. 1質量％以上 2質量％未満である請求項 1に記 載の測定方法。
[12] キトサンが、その不溶解分が、以下の測定方法により 1. 0質量％以下のキトサンで ある請求項 1に記載の測定方法。
(1)キトサンを 105°Cにて 3時間乾燥する。
(2)乾燥前後の質量比からキトサン純分率を計算する。
(3)乾燥前のキトサンを 1質量％の酢酸水溶液にキトサン純分 (Aグラム)濃度 0. 5質 量％に溶解する。
(4)上記水溶液を、恒量にした G3のグラスフィルター（Bグラム）で濾過する。
(5)上記フィルター上の濾過残物を蒸留水で洗浄する。
(6)濾過残物を含むフィルターを 105°Cにて 3時間乾燥し、秤量 (Cグラム)する。
(7)式 [ (C— B) ZA X 100]によりキトサン中の不溶解分 (質量％)を計算する。 トロポミオシンの含有量力 lOOppm (請求項 1に記載の測定方法により得られた測 定値)以下であることを特徴とするキトサン。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE602005015354T DE602005015354D1 (de) | 2004-11-25 | 2005-11-24 | Verfahren zur bestimmung von tropomyosin in chitosan |
| US11/667,412 US20070292903A1 (en) | 2004-11-25 | 2005-11-24 | Method of detemining tropomyosin in chitosan |
| CA2586587A CA2586587C (en) | 2004-11-25 | 2005-11-24 | Method of determining tropomyosin in chitosan |
| EP05809400A EP1816474B1 (en) | 2004-11-25 | 2005-11-24 | Method of determining tropomyosin in chitosan |
| US13/066,369 US20110196140A1 (en) | 2004-11-25 | 2011-04-13 | Chitosan having tropomyosin content assessed by method of determining tropomyosin in chitosan |
| US13/317,664 US20120045783A1 (en) | 2004-11-25 | 2011-10-25 | Method of determining tropomyosin in chitosan |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004-340669 | 2004-11-25 | ||
| JP2004340669 | 2004-11-25 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| US11/667,412 A-371-Of-International US20070292903A1 (en) | 2004-11-25 | 2005-11-24 | Method of detemining tropomyosin in chitosan |
| US13/066,369 Division US20110196140A1 (en) | 2004-11-25 | 2011-04-13 | Chitosan having tropomyosin content assessed by method of determining tropomyosin in chitosan |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2006057308A1 true WO2006057308A1 (ja) | 2006-06-01 |
Family
ID=36498044
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2005/021597 WO2006057308A1 (ja) | 2004-11-25 | 2005-11-24 | キトサン中のトロポミオシン測定方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20070292903A1 (ja) |
| EP (1) | EP1816474B1 (ja) |
| JP (1) | JP2011017724A (ja) |
| KR (1) | KR100862139B1 (ja) |
| CA (1) | CA2586587C (ja) |
| DE (1) | DE602005015354D1 (ja) |
| WO (1) | WO2006057308A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103983593A (zh) * | 2013-11-20 | 2014-08-13 | 中国科学院海洋研究所 | 一种测定壳聚糖与壳寡糖混合物的脱乙酰度的方法 |
| CN103792368B (zh) * | 2014-01-27 | 2015-10-07 | 暨南大学 | 一种表面等离子体共振免疫传感芯片及其制备方法与应用 |
| JPWO2017175523A1 (ja) * | 2016-04-06 | 2019-02-14 | コニカミノルタ株式会社 | 蛍光免疫染色法 |
| CN108663511B (zh) * | 2018-05-25 | 2021-01-29 | 南京斯博伏特新材料有限公司 | 一种碱性磷酸酶抗原抗体专用稀释液 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06239902A (ja) * | 1993-02-08 | 1994-08-30 | Chon Dong Won | 高純度キチン及びキトサンの製造方法 |
| JPH09506126A (ja) * | 1993-12-01 | 1997-06-17 | マリン ポリマー テクノロジーズ，インコーポレーテッド | ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミン |
| JP2004346267A (ja) * | 2003-05-26 | 2004-12-09 | Buitekku:Kk | 高純度キトサン水溶液の製造方法 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4536207A (en) * | 1983-07-26 | 1985-08-20 | Igi Biotechnology, Inc. | Nematocidally active chitin-protein complex |
| US4760024A (en) * | 1983-08-10 | 1988-07-26 | Miles Inc. | Immobilization of enzymes |
| JP2560363B2 (ja) * | 1987-12-23 | 1996-12-04 | ライオン株式会社 | キチン又はキトサン類の精製法 |
| US5518736A (en) * | 1994-06-27 | 1996-05-21 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew | Method of preparing natural-oil-containing emulsions and microcapsules and its uses |
| JP2790786B2 (ja) * | 1995-10-16 | 1998-08-27 | 利夫 佐藤 | 皮膚保護剤及びその製造方法 |
| US5726123A (en) * | 1997-02-12 | 1998-03-10 | Dcv Chitin Technologies, L.P. | Method for treating cotyledonous plants |
| JP2000256196A (ja) * | 1999-03-05 | 2000-09-19 | Pias Arise Kk | 抗炎症，抗アレルギー剤 |
| CA2313836C (en) * | 2000-03-15 | 2009-06-09 | Cargill, Incorporated | Chitosan and method of preparing chitosan |
| US7816514B2 (en) * | 2001-02-16 | 2010-10-19 | Cargill, Incorporated | Glucosamine and method of making glucosamine from microbial biomass |
| NO20015986D0 (no) * | 2001-08-02 | 2001-12-06 | Einar J Mustaparta | Produktet chitosan, samt fremstillingsmetode og anvendelse av chitosan |
| US6752938B2 (en) * | 2001-10-13 | 2004-06-22 | Invigor Biotechnology Co., Ltd. | Method of preparing microsphere composite of collagen and bioceramic powder |
| US6896809B2 (en) * | 2002-12-20 | 2005-05-24 | Providence Health System - Oregon | Methods for purifying chitosan |
-
2005
- 2005-11-24 EP EP05809400A patent/EP1816474B1/en not_active Not-in-force
- 2005-11-24 CA CA2586587A patent/CA2586587C/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-11-24 US US11/667,412 patent/US20070292903A1/en not_active Abandoned
- 2005-11-24 DE DE602005015354T patent/DE602005015354D1/de active Active
- 2005-11-24 WO PCT/JP2005/021597 patent/WO2006057308A1/ja active Application Filing
- 2005-11-24 KR KR1020077014243A patent/KR100862139B1/ko active IP Right Grant
-
2010
- 2010-10-08 JP JP2010228431A patent/JP2011017724A/ja active Pending
-
2011
- 2011-04-13 US US13/066,369 patent/US20110196140A1/en not_active Abandoned
- 2011-10-25 US US13/317,664 patent/US20120045783A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06239902A (ja) * | 1993-02-08 | 1994-08-30 | Chon Dong Won | 高純度キチン及びキトサンの製造方法 |
| JPH09506126A (ja) * | 1993-12-01 | 1997-06-17 | マリン ポリマー テクノロジーズ，インコーポレーテッド | ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミン |
| JP2004346267A (ja) * | 2003-05-26 | 2004-12-09 | Buitekku:Kk | 高純度キトサン水溶液の製造方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JEOUNG B.J. ET AL.: "Quantification of the major brown shrimp allergen Pen a 1 (tropomyosin) by a monochlonal antibody based sandwich ELISA.", J. ALLERGY. CLIN. IMMUNOL, vol. 100, no. 2, August 1997 (1997-08-01), pages 229 - 234, XP005189321 * |
| See also references of EP1816474A4 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1816474A4 (en) | 2008-04-02 |
| US20120045783A1 (en) | 2012-02-23 |
| EP1816474B1 (en) | 2009-07-08 |
| US20070292903A1 (en) | 2007-12-20 |
| KR100862139B1 (ko) | 2008-10-09 |
| CA2586587A1 (en) | 2006-06-01 |
| CA2586587C (en) | 2011-01-04 |
| US20110196140A1 (en) | 2011-08-11 |
| DE602005015354D1 (de) | 2009-08-20 |
| KR20070086560A (ko) | 2007-08-27 |
| JP2011017724A (ja) | 2011-01-27 |
| EP1816474A1 (en) | 2007-08-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI76888B (fi) | Nya medel och foerpackningar foer immunologiska analyser. | |
| CA2779191C (en) | Method and kit for measuring component to be assayed in specimen | |
| CN108431607B (zh) | 试剂稀释剂 | |
| JP3322700B2 (ja) | 固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤 | |
| JPH09505667A (ja) | 金属イオンのための酵素増幅競合アッセイ及びサンドイッチキレート化アッセイ | |
| JPH0731199B2 (ja) | 低 ｐＩ蛋白質または炭水化物を含んでなる特異的バインディング組成物ならびに診断試験キットおよび使用方法 | |
| KR20090086231A (ko) | 측정 대상 성분의 면역 측정법 | |
| Seddaoui et al. | A sensitive colorimetric immunoassay based on poly (dopamine) modified magnetic nanoparticles for meat authentication | |
| RU2213973C2 (ru) | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ, СОДЕРЖАЩИХ β-ЛАКТАМНЫЙ ЦИКЛ, В ЖИДКОСТИ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И АНАЛИТИЧЕСКИЙ НАБОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ | |
| CN111175494A (zh) | 一种甲状腺球蛋白抗体检测试剂盒及其使用方法 | |
| CN114184604A (zh) | 一种用于检测神经丝轻链的试剂盒及其方法与应用 | |
| KR101939891B1 (ko) | 당쇄를 포함하는 표적 물질의 검출용 시약, 검출 방법, 및 당쇄를 포함하는 표적 물질을 검출하기 위해서 이용되는 담체 및 그 제조 방법 | |
| WO2006057308A1 (ja) | キトサン中のトロポミオシン測定方法 | |
| AU676469B2 (en) | Method for the elimination of non-specific reactions in immunoassays | |
| JP4197393B2 (ja) | ＩｇＡ腎症の検査法 | |
| US4729961A (en) | Process for the detection and assay by erythroadsorption | |
| Osada et al. | Determination of domoic acid by two different versions of a competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) | |
| US5183735A (en) | Method and diagnostic test kit for detection of anti-dsDNA antibodies | |
| JP4627714B2 (ja) | キトサン中のトロポミオシンを測定する方法およびキトサンの製造方法 | |
| WO1990010229A1 (en) | Method and diagnostic test kit for detection of autoimmune antibody | |
| AU2003216469A1 (en) | Assay for anti-ingap antibodies | |
| JP4124526B2 (ja) | 正常アグリカン測定法とその応用 | |
| EP0206779A1 (en) | Detecting antinuclear antibody | |
| Restani et al. | Development of ELISA methods to detect the presence of milk and egg proteins in wine after fining | |
| WO2000039586A2 (en) | Tetramethylbenzidine formulation for horseradish peroxidase enzyme assays |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| AK | Designated states |
Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS KE KG KM KN KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV LY MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW |
|
| AL | Designated countries for regional patents |
Kind code of ref document: A1 Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG |
|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application | ||
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 2005809400 Country of ref document: EP |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 2586587 Country of ref document: CA |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 11667412 Country of ref document: US |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 1020077014243 Country of ref document: KR |
|
| WWP | Wipo information: published in national office |
Ref document number: 2005809400 Country of ref document: EP |
|
| WWP | Wipo information: published in national office |
Ref document number: 11667412 Country of ref document: US |