KR100862139B1 - 키토산 중의 트로포미오신 측정방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 키토산 중의 알레르기 발현에 관계할 가능성이 있는 단백질, 특히 트로포미오신 및 그 펩티드의 함유량을 간편하게 정밀하게 측정할 수 있는, 키토산을 유기산 수용액에 용해한 상태로, 면역측정법(immunoasaay)으로 측정하는 것을 특징으로 하는 트로포미오신 측정방법, 및, 상기 측정방법에 의해 얻을 수 있는 측정치가 일정치 이하이고, 알레르기를 일으킬 가능성이 낮다고 평가되는 키토산을 제공한다.

Description

키토산 중의 트로포미오신 측정방법{METHOD OF DETERMINING TROPOMYOSIN IN CHITOSAN}
본 발명은, 키토산 중의 트로포미오신(tropomyosin) 측정방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 면역측정법(immunoassay), 특히 ELISA 방법에 의해서, 키토산 중의 트로포미오신을 측정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 측정방법에 의해 트로포미오신 함량이 측정된 키토산에 관한 것이다.
키토산은 기능성 다당이며, 화장품, 건강식품, 사료첨가물 등의 원료로서 넓게 사용되고 있다. 현재 국내에서 일반적으로 판매되고 있는 키토산의 대부분은 게 껍질을 원료로 공업적으로 생산되고 있다. 공업적으로는, 키토산은 다음과 같이 제조된다. 우선, 수산물 가공 공장 등에서 발생하는 게 껍질을 수집한다. 수집한 게 껍질을 희석한 염산에 침지하여, 게 껍질 중의 탄산칼슘을 염화칼슘으로 전환시키고, 상기 염화칼슘을 물로 씻어 제거함으로써 게 껍질로부터 키틴을 단리(單離)시킨다. 이어서, 그 키틴을 40 중량% 이상의 고농도 수산화나트륨 수용액에 침지하고, 키틴을 키토산으로 탈아세틸화하기 위하여 가열하며, 그 후 생성된 키토산을 철저하게 물로 씻어, 과잉의 수산화나트륨 및 부차적으로 생긴 초산나트륨을 제거하고, 건조하는 것에 의해 키토산 플레이크를 얻을 수 있다.
상기와 같이 키토산의 제조공정은, 산(acid) 및 알칼리에서의 침지공정 및 수세(水洗)공정의 반복으로 이루어진다. 또한, 키틴의 탈아세틸화는, 40 중량% 이상의 고농도 수산화나트륨 수용액으로 키틴을 팽윤시켜, 키틴 내의 아세틸아미노기의 약 80% 이상이 탈아세틸화되어 아미노기가 될 때까지 행하여진다. 탈아세틸화 된 키틴, 즉, 생성된 키토산은, 그 후 완전하게 물로 씻겨지므로, 최종 제품의 키토산 중에 게 껍질에 부착된 단백질은 물론 게 껍질 중의 단백질도 변형되지 않은 채로, 즉 분해되지 않고 그대로 키토산 중에 잔존하고 있다고는 생각하기 어렵다.
한편, 키토산 중의 단백질을, 종래 공지의 단백질 측정방법으로 측정하면, 키토산의 구성요소인 글루코사민 단위가, 단백질 측정의 저해인자가 되어, 단백질 함유량의 평가에 바람직한 결과를 얻을 수 없었다.
키토산의 원재료인 게 껍질은, 음식 알레르기를 일으키는 알레르기성 단백질을 함유하고 있는 것으로 알려져 있다. 상술한 바와 같이, 최종 제품의 키토산 중에서 게 껍질에 부착한 단백질은 물론 게 껍질 중의 단백질도 변형되지 않은 채로, 즉 분해되지 않고 그대로 잔존하고 있다고는 생각하기 어렵다고 것이 현재의 상식이며, 따라서, 상기한 방법으로 제조한 키토산 중에 알레르기성 단백질이 그대로 잔존하고 있다고는 생각하기 어렵다.
현재, 키토산을 함유하는 건강식품이 폭넓게 소비되고 있지만, 해당 건강식품에는 키토산의 기원이 게 껍질인 것이 명기되어 있는 것, 하루에 먹는 상기 건강식품 중의 키토산의 상한(上限)을 1g로 하고 있는 것 등과 함께, 지금까지 키토산 식용에 의한 알레르기 문제는 일어나지 않았다.
키토산 중의 단백질의 양, 특히 알레르기성 단백질의 양 또는 그 단백질의 일부인 펩티드 단편(이하, 그 펩티드라고 생략한다) 혹은 그 단백질을 구성하는 아미노산 잔기의 양을 측정하는 것은 곤란한 상황속에서, 알레르기 발현에 관계할 가능성이 있는 단백질 및 그 펩티드의 함유량을 측정하여, 그러한 함유량을 알레르기를 일으킬 가능성의 지표로서 이용하여, 시장에 출시되는 키토산을 평가하는 것은, 상기 함유량이 알레르기의 강도와 전혀 상관이 없거나, 또는 대부분 상관이 없다 하더라도 가치가 있는 것이며, 또한, 상기 함유량이 낮은 키토산을 제조하고, 상기 함유량을 평가한 키토산을 시장에 출시하는 것이 중요한 것이다.
최근 아미노산 분석의 정확도는 상당히 좋아져, 새로운 정교한 분석기로는 상기 글루코사민 단위 등과 같은 방해 인자에 영향을 받지 않고 키토산 중의 아미노산을 정량하는 것이 가능해졌지만, 여기서 분석되는 것은 어디까지나 아미노산이며, 상기 알레르기성 단백질이 키토산 중에 모노머의 단백질로서 존재하는지, 올리고머로서 존재하는지, 분해되어 펩티드로서 존재하는지, 아미노산으로서 존재하는지는 확정할 수 없다. 또한, 이러한 분석기는 매우 고가이므로 일상적으로 사용하기에는 바람직하지 않다.
따라서 본 발명의 목적은, 키토산 중의 알레르기 발현에 관계할 가능성이 있는 단백질, 특히 트로포미오신(tropomyosin) 및 그 펩티드의 함유량을 간단하면서도 정확하게 측정하는 방법 및 그 측정방법에 의해 얻을 수 있는 측정치가 일정치 이하이며, 알레르기를 일으킬 가능성이 낮다고 평가된 키토산을 제공하는 것이다.
[과제를 해결하기 위한 수단]
트로포미오신은, 분자량 약 3만 3천의 서브유닛으로 이루어지는 갑각류의 근육 단백질이며, 현재, 작은 새우의 주된 알레르겐인 것이 확인되었다. 또한, 랍스터 및 게의 분자 클로닝 실험에 의해, 이 단백질이 갑각류의 공통의 알레르겐이라고 간주된다. 따라서, 식품에 의한 알레르기 사고를 미연에 방지하기 위해, 일반 식품 중의 트로포미오신의 측정은 중요하고, 그 측정을 위해, 실제로 면역반응을 이용한 방법(효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay)(ELISA))이 개발되어 실제 이용되고 있다.
따라서 본 발명자는, 일반 식품용으로 개발된 상기 트로포미오신을 측정하는 ELlSA 방법을, 키토산 중의 트로포미오신의 측정에 적용할 수 있을지를 검토하였다. 그 결과, 고체의 키토산을 초산, 유산 또는 피롤리돈 카르본산 등의 키토산 용해력을 갖는 유기산류의 적어도 1종을 함유하는 수용액에 용해하여, 상기 수용액을 측정 시료로서 각종 항체를 사용하는 ELISA 방법을 이용하는 것에 의해, 키토산 중의 트로포미오신을 측정하는 것이 가능하다는 것을 알았다. 이 측정방법에 의해서 키토산 중의 트로포미오신 및 그 펩티드의 잔존량의 평가가 가능하고, 또한, 이 트로포미오신 및 그 펩티드의 잔존량이 100ppm 이하의 키토산은, 알레르기를 일으킬 가능성이 현격히 낮거나, 또는 그 가능성이 없다는 것을 발견하였다.
즉, 본 발명은, 키토산 중의 트로포미오신을, 키토산을 유기산 수용액에 용해한 상태로, 면역측정법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 트로포미오신 측정방법을 제공한다.
상기 측정방법에 있어서는, 면역측정법이 ELISA 방법이고; 상기 ELlSA 방법이, 1차 항체로서의 적어도 1종의 항갑각류 트로포미오신 항체와, 적어도 1종의 표식 항체를 사용하는 샌드위치 방법이며; 및 상기 표식 항체가, 효소 표식 항갑각류 트로포미오신 폴리크로날 항체 또는 효소 표식 항면역 글로불린 항체인 것이 바람직하다.
또한, 상기 측정방법에 있어서는, 상기 갑각류가, 작은 새우(shrimp)류이며, 효소가, 페록시다아제(peroxidase), 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase) 및 β-갈락토시다아제(β-galactosidase)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 것; 상기 항갑각류 트로포미오신 항체가, 측정용 용기의 내벽에 코팅되어 있는 것; 및 상기 효소가, 페록시다아제이며, 그 기질로서 o-페닐렌디아민(o-phenylenediamine), 2,2'-아지노비스(3-에틸-벤즈티아졸린술폰산)디암모늄염(2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazolinesulfonate) diammonium) 및 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine)으로부터 선택되는 적어도 1종을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 측정방법에 있어서는, 상기 트로포미오신의 측정을, 측정계의 청색을 측정하여 실시하는 것; 상기 트로포미오신의 측정을, 청색을 나타내는 측정계에 황산 또는 인산을 첨가하며, 측정계를 황색으로 바꾸어, 상기 황색을 측정하여 실시하는 것; 유기산이, 초산, 유산 및 피롤리돈 카르본산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 것; 및 유기산 수용액의 유기산 농도가, 0.1 중량% 이상 1 중량% 이하인 것이 바람직하다.
또한, 상기 측정방법에 있어서는, 키토산은, 그 불용해 성분이, 이하의 측정방법:
(1) 키토산을 105℃에서 3시간 건조하는 단계,
(2) 건조 전후의 중량비로부터 키토산 순도를 계산하는 단계,
(3) 건조 전의 키토산을 1 중량%의 초산 수용액에 키토산 순분(A그램) 농도 0.5 중량%로 용해하는 단계,
(4) 상기 수용액을, 일정 중량으로 건조된 G3 유리 필터(B그램)로 여과하는 단계,
(5) 상기 필터상의 여과찌꺼기를 증류수로 세정하는 단계,
(6) 여과찌꺼기를 포함한 필터를 105℃에서 3시간 건조하여, 중량(C그램)을 측정하는 단계, 및
(7) 식[(C-B)/A×100]에 의해 키토산 중의 불용해 성분(중량%)을 계산하는 단계,로 측정하여 1.0 중량% 이하의 키토산인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은, 트로포미오신의 함유량이, 100ppm(상기 본 발명의 측정방법에 의해 얻어진 측정치) 이하인 것을 특징으로 하는 키토산을 제공한다.
[발명의 효과]
본 발명에 의하면, 키토산 중의 트로포미오신을 간편하고 정확하게 측정할 수 있다. 게다가, 해당 측정에 의해, 상기 키토산의 사람에 대한 알레르기 반응 발현의 가능성이 현저하게 낮은지 또는 발현 가능성이 없는지를 평가할 수 있다. 본 발명은, 또한, 상기 알레르기 반응의 가능성이 현저하게 낮거나 또는 없다고 평가된 키토산을 제공할 수 있다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명을 설명하기 전에, 본 발명에서 사용하는 용어를 설명한다.
'측정'이란, 트로포미오신의 정량 및 단순한 검출도 포함하는 것으로 한다.
'1차 항체'란, 항항원항체(anti-antigen antibody), 즉, 항원에 대한 항체를 의미하는 것으로 한다. 이 1차 항체에는 모노크로날 항체 및 폴리크로날 항체도 포함하는 것으로 한다. 1차 항체는, 표식되어 있어도 좋고, 되어 있지 않아도 좋다. 1차 항체를 예시한다면, 항갑각류 트로포미오신 항체를 들 수 있다. 1차 항체를 산생하는 생물종으로서는, 해당 분야에서 통상 사용되는 여러 가지의 생물종을 이용할 수 있다. 해당 생물종에는, 하이브리도마(hybridomas)와 같은 배양 세포도 포함한다.
'2차 항체'란, 항면역 글로불린항체, 즉, 항체에 대한 항체를 항원으로 하는 항체를 의미한다. 본 발명에 있어서는, 항원에 대한 항체의 항체뿐만이 아니라, 항체를 제작한 생물의 면역 글로불린 자신(예, IgG), 즉, 항원과 특이적으로 결합할 수 없어도, 항체를 제작한 생물의 IgG에 특이적으로 결합할 수 있는 항체도 의미한다. 그 외는 1차 항체와 같다. 이 2차 항체는, 표식되어 있어도 좋고, 되어 있지 않아도 좋다.
'트로포미오신'이란, 트로포미오신 자체에 더하여, 트로포미오신의 일부인 펩티드를 포함하는 것으로 하여, 이후 '트로포미오신 또는 그 펩티드'를 단순히 '트로포미오신'으로 약칭하는 경우가 있다.
그 외의 용어는, 만약 특별히 지시가 없는 경우라면, 현재 면역학, 분자생물학 및 생화학의 분야에서 사용되고 있는 것과 같은 의미를 가진다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 최선의 형태를 예로 들어 본 발명을 더 자세하게 설명한다.
본 발명은, 키토산 중의 트로포미오신을 측정하는 방법에 관한 것이다. 해당 키토산은 갑각류로부터 분리한 키틴을 원료로 하여 생산된다. 갑각류로부터 키틴을 단리하는 방법으로서, 상기한 바와 같은 산처리 및 알칼리처리를 기본으로 하는 해크만(Hackman) 방법이 일반적이지만, 이것에 한정되는 일 없이, 알칼리처리 대신에 프로테아제와 같은 효소를 이용하는 방법 등의 지금까지 개발되고 있는 어떠한 방법이라도 좋다.
키토산은, 단리한 키틴을 수산화 알칼리 수용액에서 탈아세틸화하여 얻을 수 있다. 이 경우, 수산화 알칼리로서는 수산화나트륨이나 수산화칼륨 등이 사용될 수 있으며, 수산화 알칼리 수용액의 농도는 35 중량% 이상인 것이 바람직하다. 탈아세틸화 온도에 제한은 없지만, 저온으로 인해 반응 속도가 비현실적으로 되기 때문에, 20℃ 이상, 바람직하게는 50℃ 이상이다.
키틴의 탈아세틸화 후, 얻어진 키토산을 충분히 물로 씻는다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 키토산으로는, 예를 들어, 초산농도 1 중량%의 수용액에 키토산을 농도 0.5 중량%로 용해했을 때, 키토산 중의 불용해 성분이 1 중량% 이하의 키토산이 바람직하다. 그러한 키토산이 사용되는 한 키토산의 탈아세틸화 정도에 한정은 없다.
상기와 같은 불용해 성분이 적은 키토산을 얻기 위해서는, 현재의 일반적인 공업적 생산 방법인, 불균일계 탈아세틸화법(키틴을 용해하지 않고 수산화 알칼리 수용액에 침지하여 키틴을 탈아세틸화하는 방법)에서 얻는 키토산의 경우, 70% 이상의 탈아세틸화도가 필요하고, 균일계 탈아세틸화법(키틴을 용해 상태로 탈아세틸화하는 방법)에서 얻는 키토산의 경우, 30% 이상의 탈아세틸화도가 필요하다. 한편, 탈아세틸화도는 콜로이드 적정에 의한 키토산을 구성하는 당단위 중의 글루코사민 단위의 몰분율이다. 본 발명에 있어서는, 키토산의 분자량에는 제한이 없다.
본 발명에 있어서 트로포미오신을 측정하는 키토산은, 유기산 수용액에 용해된 상태로 사용된다. 이에 대해서, 키토산은, 분산하기 어려운 폴리머이며, 키토산이 분산상태인 경우, 키토산의 분산이 불충분하게 되어, 트로포미오신의 측정 결과에 오차를 일으킬 가능성이 있다. 따라서 키토산 중의 트로포미오신을 측정할 때, 측정대상의 키토산에 유기산 수용액을 가하거나, 또는 유기산 수용액에 키토산을 가하거나 하여, 키토산을 수용액 상태로 하여 키토산 중의 트로포미오신을 측정하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 측정 대상물인 키토산을 용해하기 위해서 사용하는 유기산으로서는, 초산, 유산 및 피롤리돈 카르본산 등을 바람직한 것으로서 들 수 있다. 이러한 유기산 수용액의 산농도는, 0.1 중량% 이상 2 중량% 미만이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.5 중량% 이상 1 중량% 이하이다. 상기 유기산 대신에 염산 등의 무기산을 사용하거나, 유기산이라도 그 산농도가 2 중량% 이상이면, 얻을 수 있는 키토산 수용액의 pH가 너무 낮아져서, 키토산 수용액 중의 트로포미오신의 측정치의 불균형이 커지는 경향이 있어 바람직하지 않다. 또한, 유기산 농도가 0.1 중량% 미만에서는 키토산은 충분히 용해하지 않는다. 상기의 유기산은 키토산과 염을 형성하고 있는 상태로 사용해도 좋다. 이러한 경우에, 상기의 유기산 수용액에 키토산을 용해하는 대신에, 키토산의 유기산염을 시료 조제용 용매에 용해하면 좋다.
측정에 사용하는 키토산 수용액의 키토산의 농도는, 사용되는 유기산 수용액의 산농도에 의존하므로 특정적으로 말할 수 없지만, 예를 들면, 유기산 수용액의 농도가 1 중량%의 경우에는, 키토산 농도로서 0.5 중량% 이상 1 중량% 이하를 예시할 수 있다. 이 농도는, 트로포미오신을 추출용 완충액 등으로 희석하기 전의 농도이다.
상기와 같이 본 발명의 방법에 있어서는, 트로포미오신의 측정에 사용하는 키토산은, 유기산 수용액에 용해된 수용액 상태로 사용하는 것이 바람직하다. 이와 같이 수용액 상태의 키토산을 이용하면, 키토산 중의 트로포미오신의 측정은, 면역측정법에 의한 측정이면 어떠한 방법이라도 좋고, 특별히 한정되지 않는다.
또한, 사용하는 키토산은, 그 탈아세틸화 정도나 분자량에 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 초산농도 1 중량%의 수용액에 키토산을 농도 0.5 중량%로 용해했을 때, 키토산 중의 불용해 성분이 1 중량% 이하의 키토산인 것이 바람직하다. 키토산 중의 불용해 성분은, 이하와 같이 측정된다.
(1) 키토산을 105℃에서 3시간 건조한다.
(2) 건조 전후의 중량비로부터 키토산 순도를 계산한다.
(3) 건조전의 키토산을 1 중량%의 초산 수용액에 키토산(A그램) 순수 농도 0.5중량%로 용해한다.
(4) 상기 수용액을, 일정 중량으로 건조된 G3 유리 필터(B그램)로 여과한다.
(5) 상기 필터상의 여과찌꺼기를 증류수로 세정한다.
(6) 여과찌꺼기를 포함한 필터를 105℃에서 3시간 건조하여, 중량(C그램)을 측정한다.
(7) 식[(C-B)/A×100]에 의해 키토산 중의 불용해 성분(중량%)을 계산한다.
본 발명은, 상기의 키토산 중의 트로포미오신(이하, 특별한 언급이 없으면, "항원"이라고 언급할 수 있다)을 면역측정법을 이용하여 측정하는 방법이다. 상기 면역측정법에는, 경합 면역측정법 및 샌드위치 방법의 두 개의 형식이 있다. 본 발명에 있어서는 어느 쪽이나 바람직하게 사용할 수 있다. 게다가, 이러한 방법에 있어서는, 측정 인디케이터(indicator)로서, 동위원소(131I, 125I, 14C, 3H, 57Co, 75Se 등), 형광물질 또는 효소 등을, 항원 또는 항체에 표식하여 사용하는 방법이 알려져 있다. 본 발명에 있어서는, 어느 방법이나 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 측정방법으로서 샌드위치 방법을 사용하는 경우, 측정정밀도 및 간편성의 관점에서, 효소로 표식한 항체를 사용하는 방법("ELISA 방법"이라고 칭해진다)이 보다 바람직하다. 이하에서 설명되는 것처럼, 샌드위치 방법에 있어서는, 1차 항체-항원-표식 항체(1차 또는 2차)의 결합물(복합물이라고도 한다)을 형성하는 방법 및 1차 항체-항원-표식이 없는 항체(1차 또는 2차)-표식 2차 항체의 결합물을 형성하는 방법이 있다. 본 발명에 있어서는, 어느 쪽이나 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 항체를 만들기 위한 항원으로서 사용되는 트로포미오신은, 특히 갑각류에서 유래하는 것이 좋다. 예를 들면, 게, 새우, 물벼룩(Daphnia pulex), 큰 따깨비(Tetraclita Japonica), 곤쟁이(Mysidacea), 쥐며느리(Isopoda) 등에서 유래하는 트로포미오신을 들 수 있다. 랍스터(lobster), 작은 새우(shrimp) 및 게(crab)에서 유래하는 트로포미오신이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서 사용하는 항체는, 항원을 사용해 면역(감작)화된 마우스, 햄스터, 닭, 염소, 쥐, 토끼 등의 동물 또는 그것들로부터 단리한 세포, 또는, 항원을 사용하여 면역화된 동물의 비장(脾臟)으로부터 임파구를 분리하여, 해당 임파구를 암세포(예를 들면, 골수종)와 융합시켜 얻은 세포(하이브리도마) 등을 사용하여 조제하는 것이 좋다. 그러나, 본 발명에 있어서는 이러한 예시에 한정되지 않는다. 즉, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 생물 또는 세포에서 유래된 항체면 바람직하다. 모노크로날 항체는 하이브리도마를 이용하여 조제하는 것이 바람직하다.
1. 1차 항체-항원-표식 항체(1차 또는 2차)의 결합물(복합물이라고도 한다)을 형성하는 방법.
이 방법에 있어서 사용하는 1차 항체는, 적어도 1종의 1차 항체이다. 상기 1차 항체는, 고정화(불용화 또는 코팅이라고도 한다)되어 있거나 그렇지 않아도 좋다. 본 발명은, 키토산 중의 트로포미오신을 측정하는 방법이므로, 트로포미오신의 항체라면, 폴리크로날 항체 또는 모노크로날 항체라도 좋다. 측정 정확도의 관점에서, 1차 항체는, 모노크로날 항체를 사용하는 것이 보다 바람직하다.
상기 방법에 있어서 사용하는 표식 항체로서는, 적어도 1종의 1차 항체 혹은 적어도 1종의 2차 항체, 또는 그 혼합물을 포함한다. 이러한 항체는, 상기와 같이 모노크로날 항체 또는 폴리크로날 항체라도 좋다. 보다 바람직한 항체의 구체적인 예로서, 1차 항체로서 항-작은 새우(쉬림프) 트로포미오신 항체를 들 수 있고, 또한, 표식 항체로서 페록시다아제 표식 항면역 글로불린 항체 또는 페록시다아제 표식 항-작은 새우(쉬림프) 트로포미오신 폴리크로날 항체 등을 들 수 있다. 그러나, 본 발명은 이러한 예시의 항체에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 고정화된 항체를 사용하는 경우, 항체의 고정화는, 유리, 플라스틱 또는 종이 등에 대해서 행하여진다. 구체적으로는, 항체의 고정화를, 유리, 플라스틱 또는 종이 등의 측정용 용기, 즉, 시험관, 작은 원심분리 튜브, 홈(웰)을 갖는 플레이트(예를 들면, 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)), 또는 비드 등에 실시하는 것이 바람직하다. 항체의 고정화는, 종래 공지의 방법으로 실시할 수 있다. 상기의 고정화된 항체 및 표식 항체의 조제는, 동일 생물을 면역화하여 제조해도 되지만, 다른 생물을 면역화하여 제조하는 것이 바람직하다. 상기의 방법에 있어서는, 1차 항체와 표식 항체와의 사이에 항원이 끼워져, 샌드위치형상의 결합물(conjugated substance)(복합물)이 형성된다.
본 발명에 있어서, 표식물질로서 형광물질을 사용하는 경우, 형광물질로서는, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 좋지만, 예를 들면, 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민 이소티아네이트(rhodamine isothiocyanate) 및 피코에리트린(phycoerythrin) 등을 들 수 있다. 형광물질로 항체를 표식하는 것은 종래 공지의 방법으로 달성할 수 있다. 표식물질로서 효소를 사용하는 경우, ELISA 방법이라고 칭해진다. ELISA 방법에 있어서, 이용되는 상기 효소로서는, 측정의 정밀도 및 간편성 등의 관점에서 페록시다아제, 알칼리 포스파타아제 및 β-갈락토시다아제 등을 바람직한 것으로서 들 수 있다. 이들 중에서도 측정 정밀도 관점에서 페록시다아제가 특히 바람직하다.
상기의 효소를 위한 바람직한 기질을 예시하면 다음과 같다. 효소가 페록시다아제의 경우는, o-페닐렌디아민(발색: 다갈색), 2,2'-아지노비스(3-에틸-벤즈티아졸린술폰산) 디암모늄염, 테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)(발색: 청색), ABTS(디암모늄 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-설페이트)(diammonium 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfate))(발색: 청색) 등을 예시할 수 있다. 이들 중에서도, 발색의 민감도에서 테트라메틸벤지딘이 보다 바람직하다. 효소가 알칼리 포스파타아제의 경우는, p-니트로페닐인산염(발색: 황색) 등을 들 수 있고, 효소가 β-갈락토시다아제의 경우는, o-니트로페닐인산(발색: 황색) 등을 들 수 있다. 그러나, 본 발명에 있어서는, 상기의 예시에 한정되는 것은 아니다.
효소를 항체에 표식하는 방법으로서는, 종래 공지의 방법이 모두 바람직하게 이용할 수 있다. 표식 방법 중 하나의 구체적인 예로서는, 항체를 우선 비오틴화하고(비오틴화 항체), 효소를 스트렙토아비딘(streptavidin)으로 표식하여, 비오틴화 항체의 비오틴과 스트렙토아비딘과의 결합을 이용하는 방법이 보다 바람직하다. 효소 반응은, 종래 공지의 조건으로 실시할 수 있다.
2. 1차 항체-항원-표식이 없는 항체(1차 또는 2차)-표식 2차 항체의 결합물을 형성하는 방법.
이 방법은, 상기 1의 방법에 있어서의 표식 항체 대신에, 표식이 없는 1차 또는 2차 항체를 사용하며, 게다가, 표식 2차 항체를 사용하는 것이다. 상기 표식 2차 항체는, 상기 표식이 없는 항체에 대한 항체(항면역 글로불린 항체)이거나, 또는 상기 표식이 없는 항체에 특이적으로 결합하는 항체(예를 들면, 표식 항체를 생산하는 동물의 항체에, 특이적으로 결합하는 항체)이면 좋고, 그 유래에 대한 특정의 제한은 없다. 표식 2차 항체는, 본 발명의 경우, 모노크로날 항체 또는 폴리크로날 항체라도 사용할 수 있지만, 바람직하게는 폴리크로날을 사용하는 것이 좋다. 그 이외는 상기 1의 방법과 같다.
상기의 방법에 있어서는, 1차 항체(이 항체는 상기 1.의 방법과 같이 고정화되어 있거나 그렇지 않아도 좋지만, 고정화되는 것이 바람직하다)와 항원이 결합하고, 그 결합물에 표식이 없는 1차 또는 2차 항체가 결합한다. 그리고 상기 결합물에 표식 2차 항체가 결합하는 형식이 된다. 표식물, 표식방법 등은 상기 1.의 방법과 같다.
상기의 방법에 있어서, 보다 바람직한 항체의 구체적인 예로서 1차 항체로서는, 항-쉬림프 트로포미오신 항체를 들 수 있고, 표식 2차 항체로서는, 페록시다아제 표식 항면역 글로불린(폴리크로날) 항체를 들 수 있다. 그러나, 본 발명은 이러한 예시에 한정되지 않는다.
상기 방법 1. 및 2.에 있어서, 사용되는 항체가 유도되는 생물은, 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 일례를 들면, 상기 1.의 방법에서는, 고정화된 항체로서는 마우스 또는 쥐에서 유도된 항체, 표식 항체로서는 토끼 또는 염소에서 유도된 항체, 상기 2.의 방법에서는, 고정화된 항체로서는 마우스 또는 쥐에서 유도된 항체, 표식이 없는 항체로서는 토끼 또는 염소에서 유도된 항체, 표식 2차 항체로서는 염소 또는 토끼에서 유도된 항체를 들 수 있다. 한편, 상기 1. 및 2.의 방법에 사용하기 유용한, 각종의 항체가 코팅된 측정용 용기는 시판되고(예를 들면, ELISA SYSTEMS사, BETHYL사 등에서)있으므로, 그것들을 이용하는 것이 매우 바람직하다. 또한, 원하는 항체, 및 원하는 항체를 코팅한 측정용 용기는, 그러한 제작을 의뢰하여 입수해도 좋다. 의뢰처로서, 다카라 바이오 가부시키가이샤(TAKARA BIO INC.)(일본, 오츠시) 등을 예시할 수 있다.
다음으로, 샌드위치 방법의 일반적인 측정순서의 일례에 대해서 설명한다. 본 발명은 결코 이러한 예에 한정되지 않으며, 여러 가지의 방법의 사용이 가능하다. 또한, 이러한 순서는 폭넓게 읽혀지는 간행물, 예를 들면, (실험의학 별책)'면역학적 프로토콜(Immunological Protocol)', 나카우치 다카미츠(中內 啓光)편, 요도사(羊土社), 2004년 발행; I.Roitt, '필수 면역학(Essential Immunology)', 8th, 블랙웰(Blackwell), 1994년; '초고감도 효소면역 측정법', 이시카와 에이지(石川 榮治)편, 학회 출판센터, 1993년) 등에 기재되어 있으므로, 자세한 것은 그것들을 참조함으로써 본 발명의 실시가 가능하다.
이하 샌드위치 방법 중 고정화된 항체를 사용하는 방법에 대해서 예시한다.
ⅰ) 상기 1.의 방법 : 1차 항체-항원-표식 항체(1차 항체 또는 2차 항체)의 결합물을 형성하는 방법은 이하의 순서를 포함한다.
1) 1차 항체를 시험관 또는 홈(웰)을 갖는 플레이트(예를 들면, 마이크로타이터 플레이트) 또는 비드 등의 측정용 용기 내벽면 또는 표면에 고정화(코팅)한다. 여기서, 고정화에 이용되는 측정용 용기로서는, ELISA용의 고농도 단백질 용액이 흡착 처리된 용기, 또는, 통상의 세포 배양용 용기가 바람직하게 이용된다.
우선, 1차 항체를 완충액으로 희석하여 상기 용기에 첨가하여, 실온에서 30분 이상 3시간 이하, 0℃ 이상 10℃ 이하의 저온에서 약 하룻밤 정치한다. 그 후, 1차 항체 용액을 제거하고, 블로킹 용액(완충액에 BSA를 용해한 것)을 적당량을 첨가하여, 상기와 같이 정치한 후, 블로킹 용액을 제거한다. 이렇게 하여, 항체를 고정화할 수 있다.
2) 상기와 같이 하여 제조된 용기에 측정 대상의 상기 키토산 수용액을 첨가하여, 상기와 같은 방식으로 정치한다. 이렇게 해서, 만약, 키토산 수용액 중에 항원이 존재한다면, 항원이 항체와 결합한다. 이러한 반응을 1차 면역반응이라고도 한다. 한편, 측정용 시료(키토산 수용액)는, 항원 추출용 완충액으로 희석하여, 농도가 다른 복수의 시료로서 측정에 이용하는 것이 바람직하다.
3) 상기 반응 후의 용기에, 세정용 완충액을 첨가하여, 그것을 제거하는 것에 의해, 고정화된 항체와 항원과의 결합물을 세정한다.
4) 상기 3)의 세정 후의 용기에, 표식 항체(1차 또는 2차)를 포함한 용액을 첨가하여, 상기와 같이 정치한다. 이렇게 하여, 고정화 항체-항원-표식 항체의 결합물을 형성시킬 수 있다. 이러한 반응을 2차 면역반응이라도 한다.
5) 상기 4)의 반응 후의 용기에, 세정용 완충액을 첨가하여, 다음에 그것을 제거하는 것에 의해 결합물을 세정한다.
상기의 완충액으로서는, 예를 들면, 인산 완충액(PBS, pH : 6 이상 8 이하, 농도 : 2mM 이상 500mM 이하)를 사용할 수 있다.
6) 이하의 a) 내지 c)의 순서를 실시한다.
a) 표식 항체의 표식물이 효소인 경우 다음의 순서를 실시한다.
a-1) 상기 5)의 세정 후의 결합물에 효소 기질 용액을 첨가하여 효소 반응시킨다. 효소반응의 시간 및 온도 등의 조건은, 표식 효소의 종류에 따라서 다르지만, 해당 효소에 대한 종래 공지의 일반적 조건으로 실시해도 좋다.
a-2) 상기 효소 기질 용액 첨가 후의 용액(반응액)의 흡광도 또는 형광 강도를 적당한 파장을 이용하여 측정한다. 이 경우, 반응액(측정계라고도 한다)을 그대로 경시적으로, 적당한 파장으로 측정해도 좋다. 또한, 적당한 반응 시간 후에, 산(acid) 또는 아지드염(azide salt) 등의 반응 정지액을 첨가하고 나서 측정하는 것도 좋다. 반응 정지액을 첨가하는 방법은 간편하므로 보다 바람직하다. 바람직한 산(acid)으로서는 인산(오르토인산(orthophosphoric acid)) 또는 황산을 들 수 있다. 효소 기질로서 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘을 이용하는 경우, 반응액은 청색이지만, 반응액에 산을 가하면 황색이 되므로, 적당한 파장으로 그것을 측정한다.
b) 표식 항체의 표식물이 형광물질인 경우, 반응액의 형광 강도를 측정한다.
c) 표식 항체의 표식물이 동위원소인 경우, 동위원소 활성을 신틸레이션 카운터(scintillation counter)로 측정한다.
ⅱ) 상기 2.의 방법 : 1차 항체-항원-표식이 없는 항체(1차 또는 2차)-표식 2차 항체의 결합물을 형성하는 방법은 이하의 순서를 포함한다.
1) 1차 항체의 고정화(코팅) : 상기 ⅰ)의 방법과 같다.
2) 1차 면역반응 : 상기 ⅰ)의 2) 방법과 같다.
3) 2차 면역반응 : 상기 2)의 세정 후의 용기에 표식이 없는 항체(1차 또는 2차)를 포함하는 용액을 첨가하여, 고정화 1차 항체-항원-표식이 없는 항체(1차 또는 2차)의 결합물을 형성시킨다.
4) 상기 3)의 반응 후의 용기에, 완충액을 첨가하고, 다음에 그것을 제거하여, 고정화된 항체와 항원과의 결합물을 세정한다.
5) 상기 4)의 세정 후의 용액에 표식 2차 항체를 포함하는 용액을 첨가하여, 고정화 항체-항원-표식이 없는 항체(1차 또는 2차)-표식 2차 항체의 결합물을 형성시킨다. 이러한 반응을 3차 면역반응이라고도 한다.
6) 상기 5)의 반응 후의 용기에 완충액을 첨가하고, 다음에 그것을 제거하여, 결합물을 세정한다.
7) 이하의 a) 내지 c)의 순서를 실시한다.
a) 표식 항체의 표식물이 효소인 경우의 순서 : 상기 ⅰ)의 6)의 a)의 방법과 같다.
b) 표식 항체의 표식물이 형광물질인 경우의 순서 : 상기 ⅰ)의 6)의 b)의 방법과 같다.
c) 표식 항체의 표식물이 동위원소인 경우 : 상기 ⅰ)의 6)의 c)의 방법과 같다.
상기에 설명한 방법은, 고정화한 항체를 사용하는 것이지만, 고정화하지 않는 항체를 사용하는 방법에 있어서는, 1차 반응전, 2차 반응전 및 3차 반응전에 원심분리에 의해, 결합물(복합물)을 분리하는 것이 바람직하다.
상기의 측정에 있어서는, 측정 대상의 샘플에 대한 측정에 더하여, 표준이 되는 항원에 대해서도 측정을 병행하여 실시하는 것이 바람직하다. 또한, 양성 대조구 및 음성 대조구에 대한 측정도, 병행하여 실시하는 것이 좋다. 또한, 예를 들면, 실제의 측정에 앞서, 그 농도가 공지된 기존의 샘플에 대해서 검량선을 작성해 두고, 시료의 농도를 검량선으로부터 구하는 편이 보다 정밀도가 높은 측정치를 얻을 수 있다.
상기의 측정에 있어서의 측정기는, 이러한 측정을 위해 시판되고 있는 것을 사용하는 것이 좋다. 예를 들면, 마이크로플레이트 리더(microplate reader) 등을 들 수 있다. 각각의 측정은 적절한 파장으로 실행하는 것이 바람직하다.
또한, 측정 시약 등은 키트로서, 시판되고 있으므로, 그것을 사용하여 본 발명의 목적을 달성하는 것이 간편하고 바람직하다. 예를 들면, ELISA SYSTEMS PTY Ltd제(호주)의 "Crustacean Tropomyosin Residue" Microwell ELISA Product Code : ESCRUR-48 분석키트 등을 들 수 있다. 이러한 키트를 구입하여, 첨부되어 있는 설명서 및 분석 순서에 따라서 측정하는 것이 좋다.
또한, 본 발명은, 상기 본 발명의 방법으로 측정했을 때에, 트로포미오신의 함유량이, 100ppm 이하인 것을 특징으로 하는 키토산을 제공한다. 해당 키토산은, 예를 들면, 식품용 원료나 화장품 원료로서 사용되는 경우, 사람에 대해서 알레르기 현상을 일으킬 가능성이 없거나, 또는 그 가능성이 극히 낮아 안전성이 높다. 이에 반해 트로포미오신의 함유량이 100ppm를 넘는 키토산은, 사람에 대한 알레르기 반응을 일으킬 우려가 있다.
이하에서는 실시예 및 비교예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명한다. 한편, 문장 중 '부' 또는 '%'는 다른 특별한 언급이 없으면 중량을 기준으로 한 것이다.
이하의 실시예 및 비교예에 있어서의 트로포미오신 측정방법은, 면역측정법 중의 ELISA법이다. 그리고 1차 항체로서 항-마우스 쉬림프 트로포미오신 항체를 사용하고 표식 항체로서 항-마우스 쉬림프 트로포미오신 폴리크로날 항체-페록시다아제 접합체(페록시다아제 표식 항-마우스 쉬림프 트로포미오신 폴리크로날 항체)를 사용하는 샌드위치 측정방법이다.
실시예 1
ELISA SYSTEMS사의 게/쉬림프 알레르겐 테스트 키트인 'Crustacean Tropo myosin Residue'(Microwell ELISA Product Code: ESCRUR-48 분석키트 48)를 이용하여, 이하의 순서로 게에서 유도된 키토산 중에 잔존하는 트로포미오신을 측정하였다.
키트의 조제법은, 제품에 부속된 첨부문서에 따랐다. 즉, 농축 세정용 완충액(NaCl 함유 인산 완충액) 25mL를, 475mL의 탈이온수에 투입하여, 세정용 완충액으로서 세정 용기에 넣었다. 또한, 농축 추출용 용액(NaCl를 포함하는 인산 완충 액) 25mL를 475mL의 탈이온수에 투입하여, 항원 추출용 용액으로서 저장 용기에 넣었다.
키토산 농도 및 초산 농도 모두 0.5%의 수용액으로 한 경우, 20℃에서 회전 점도계로 측정한 측정점도가 500mPa·s이고, 또한 콜로이드 적정으로 측정했을 때 탈아세틸화도가 90%인 키토산 샘플로부터, 키토산 순분(純分) 1부를 0.5부의 유산을 포함한 탈이온수 99부에 용해하여, 1% 키토산 수용액을 얻었다. 또한, 이 키토산 수용액 1부를 미리 60℃로 따뜻하게 한 추출용 용액 9부에 가하여 혼합하여, 0.1% 키토산 수용액을 얻었다. 이 경우의 키토산 중의 키토산 불용해 성분은 상기 측정방법에 의해 0.5%이었다.
상기 0.1% 키토산 수용액을 60℃의 중탕(重湯) 냄비에 15분간 넣고, 5분마다 1분간 흔들어 혼합하는 것에 의해 트로포미오신의 추출을 실시하였다. 이 추출액을 정치하여, G3 유리 필터로 여과하였다. 여과액을 잘 혼합한 후, 샘플로서 트로포미오신 측정시험에 제공하였다.
이어서 키트의 사용 방법에 따라서 키트의 준비를 실시하였다. 즉, 키트의 사용 전에 전체 키트를 실온(20℃ 이상 25℃ 이하)으로 유지하고, 샘플 및 대조구의 측정에 필요한 수만큼의 웰(well)을 갖는 웰 플레이트를 준비하여 홀더에 설치하였다. 이때, 각 웰 플레이트에 식별마크를 넣어 오측정을 막았다. 한편, 웰에는 항-쉬림프 트로포미오신 항체가 코팅되어 있다.
음성 대조구(트로포미오신 농도 0 ppm) 및 양성 대조구(트로포미오신 0.05 ppm, 0.10 ppm, 0.25 ppm 및 0.50 ppm) 수용액을, 각각 100㎕씩 웰에 첨가하였다. 또한, 상기 각 샘플 100㎕씩을 웰 하나하나에 첨가하였다. 한편, 각 대조구 및 샘플은 2번 연속하여 측정을 실시하였다.
10초간 홀더를 앞뒤로 천천히 슬라이드시켜, 웰내의 용액을 혼합하였다. 각각의 용액을 실온에서 30분간 배양하여, 1차 면역 반응을 유도하였다. 반응 후, 웰내의 용액을 제거하고, 세정용 완충액을 이용하여 각각의 웰에서 넘쳐 흐를 때까지 채우고 나서 웰 내의 용액을 완전하게 제거하였다. 이 조작을 5회 반복하여 세정을 실시하였다. 페록시다아제 표식 항-쉬림프 트로포미오신 폴리크로날 항체 용액 100㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 10초간 홀더를 앞뒤로 천천히 슬라이드시켜, 웰 내의 용액을 혼합하였다. 각각의 용액을 실온에서 15분간 배양하여, 2차 면역반응을 실시하였다.
반응 후, 웰 내의 반응액을 제거하고, 세정용 완충액을 이용하여 각각의 웰에서 넘쳐 흐를 때까지 채우고 나서 웰 내의 용액을 완전하게 제거하였다. 이 조작을 5회 반복하여 세정을 실시하였다.
효소 기질 용액 100㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 10초간 홀더를 앞뒤로 천천히 슬라이드시켜, 웰 내의 용액을 혼합하였다. 각각의 용액을 실온에서 10분간 배양하여, 발색 반응을 실시하였다. 이 단계에서, 양성 대조구의 용액은 청색으로 변하였다. 정지액(오르토인산 수용액) 100㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 10초간 홀더를 앞뒤로 천천히 슬라이드시켜 웰 내의 용액을 혼합하여, 효소 반응을 정지하였다. 여기서, 상기 청색을 나타내는 용액은, 황색으로 변화하였다.
흡광도의 측정은 마이크로플레이트 리더(TOSOH사 제품, MPR-A4iII)에 의해 실시하였다. 즉, 샘플은 450nm, 레퍼런스(reference)는 620nm의 파장으로 측정을 실시하였다. 한편, 비어있는 웰에서 측정한 값을 제로로 하였다. 또한, 측정은, 정지액의 첨가로부터 30분 이내에 실시하였다. 각 대조구의 트로포미오신 농도에 대한 흡광도를 이용하여 검량선을 얻었다. 이 검량선을 이용하여, 각 샘플의 흡광도로부터 트로포미오신 농도를 구하고, 각각의 샘플에서 갑각류에서 유도된 트로포미오신을 정량하였으며, 트로포미오신의 유무에 대해서 판정을 실시하였다.
키토산 순분이 0.1%인 상기 샘플 중의 트로포미오신 농도는, 검량선으로부터 0.05ppm으로 구해졌다. 따라서, 키토산 샘플의 순분 1g당, 50ppm의 트로포미오신을 포함하는 것을 확인할 수 있었다. 이 키토산 샘플은 의미가 있는 알레르기 반응을 나타내지 않았다.
실시예 2
트로포미오신 측정시험의 준비를 위해 추출용 용액 및 세정용 완충액은, 실시예 1과 같이 조제하였다.
키토산 농도 및 초산 농도 모두 0.5%의 수용액으로 한 경우, 20℃에서 회전 점도계로 측정한 측정점도가 100mPa·s이고, 또한 콜로이드 적정으로 측정했을 때 탈아세틸화도가 78%인 키토산의 피롤리돈 카르본산염 순분 1부를, 미리 60℃로 따뜻하게 한 희석 추출 용액 99부와 혼합하여, 키토산의 피롤리돈 카르본산염의 1% 수용액을 얻었다. 이 경우의 키토산 중의 키토산 불용해 성분은 상기 측정방법에 의해 0.3%이었다.
이 수용액을 60℃의 중탕 냄비에 15분간 넣고, 5분마다 1분간 흔들어 혼합하 는 것에 의해 트로포미오신의 추출을 실시하였다. 이 추출액을 정치하여, G3 유리필터로 여과하였다. 여과액을 잘 혼합한 후, 시험에 제공하였다. 또한, 이 수용액의 1부를, 미리 60℃로 따뜻하게 한 추출용 용액 9부에 가하여 혼합하여, 키토산의 피롤리돈 카르본산염 0.1%수용액을 얻었다. 잘 혼합한 후, 시험에 제공하였다.
키토산 피롤리돈 카르본산염의 1% 수용액에 있어서의 트로포미오신 농도는, 검량선으로부터 0.5ppm로 구해졌다. 따라서, 키토산의 피로리돈 카르본산염의 순분 1g당, 50ppm의 트로포미오신을 포함하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 키토산 피롤리돈 카르본산염의 0.1%수용액에 있어서의 트로포미오신 농도는, 검량선으로부터 0.05ppm로 구해졌다. 따라서, 키토산의 피롤리돈 카르본산염의 순분 1g당, 50ppm의 트로포미오신을 포함하는 것을 확인할 수 있었다.
키토산의 피롤리돈 카르본산염중의 키토산 함유량은 70%이므로, 키토산 순분 1g당 71ppm의 트로포미오신을 포함하는 것을 확인할 수 있었다. 이 키토산 피롤리돈 카르본산은 의미가 있는 알레르기 반응을 나타내지 않았다.
실시예 3
실시예 1에 있어서의 유산 수용액을 대신하여 농도 1%의 초산 수용액을 사용하고, 또한 키토산 농도를 1%로 설정한 것 이외에는 실시예 1과 같게 하여 트로포미오신을 측정한 바, 실시예 1과 같은 결과를 얻을 수 있었다.
실시예 4
키토산 농도 및 초산 농도 모두 0.5%의 수용액으로 한 경우, 20℃에서 회전 점도계로 측정한 측정점도가 300mPa·s이고, 또한 콜로이드 적정으로 측정했을 때 탈아세틸화도가 100%인 키토산 샘플로부터, 키토산 순분 1부를 0.5부의 유산을 포함한 탈이온수 99부에 용해하여, 1% 키토산 수용액을 얻었다. 또한, 이 키토산 수용액의 1부를 미리 60℃로 따뜻하게 한 추출용 용액 9부에 가하여 혼합하여, 0.1% 키토산 수용액을 얻었다. 이 경우의 키토산 중의 키토산 불용해 성분은 상기 측정방법에 의해 0.2%이었다.
실시예 1에 있어서의 키토산을 상기 키토산으로 대신한 것 이외는 실시예 1과 같게 하여 트로포미오신을 측정한 바, 상기 키토산 중의 트로포미오신은 본 방법의 검출 한계 이하였다. 이 키토산 샘플은 의미가 있는 알레르기 반응을 나타내지 않았다.
비교예 1
트로포미오신 측정 시험의 준비로서, 추출용 용액 및 세정용 완충액을, 실시예 1과 같이 조제하였다. 실시예 1에서 사용한 키토산 샘플의 순분 1부를, 미리 60℃로 따뜻하게 한 추출용 용액 9부를 넣은 비커에 가하여, 상기 용액을 자기 교반기(magnetic stirrer)로 혼합하여 10% 키토산 분산액을 얻었다. 이 분산액을 60℃의 중탕 냄비에 15분간 넣어, 5분마다 1분간 흔들어 혼합하는 것에 의해 트로포미오신의 추출을 실시하였다. 이 추출액을 정치하여, G3 유리필터로 여과하였다. 여과액을 잘 혼합한 후, 시험에 제공하였다.
마찬가지로 실시예 1에서 사용한 키토산 샘플의 순분 1부를, 미리 60℃로 따뜻하게 한 희석 추출용액 99부에 가하여 혼합하여, 1% 키토산 분산액을 얻었다. 이 분산액을 60℃의 중탕 냄비에 15분간 넣어, 5분마다 1분간 흔들어 혼합하는 것 에 의해 트로포미오신의 추출을 실시하였다. 이 추출액을 정치하여, G3 유리필터로 여과하였다. 여과액을 잘 혼합한 후, 시험에 제공하였다.
또한, 상기 1% 키토산 분산액의 1부를, 미리 60℃로 따뜻하게 한 추출용 용액 9부와 혼합하여, 0.1% 키토산 분산액을 얻었다. 전부 잘 혼합한 후, 트로포미오신 측정 시험에 제공하였다.
실시예 1과 같이 측정을 실시하여, 트로포미오신 측정 결과의 판정을 실시하였다. 키토산 순분을 10%, 1% 또는 0.1% 포함한 키토산 분산액의 어느 것에 있어서도 트로포미오신은 검출되지 않았다. 본 키트의 트로포미오신의 검출 한계가 0.1ppm이므로, 키토산 샘플의 순분 1g당, 트로포미오신 함유량은 10% 키토산 분산액에서는 1ppm 이하, 1% 키토산 분산액에서는 10ppm 이하, 0.1% 키토산 분산액에서는 100ppm 이하라고 결론지을 수 있었다.
실시예 1 및 비교예 1은 동일한 키토산 샘플을 사용하고 있지만, 결과는 크게 차이가 난다. 이 차이는, 실시예 1에서는 키토산을 용해하여 측정에 이용하는데 비해, 비교예 1에서는 키토산을 간단하게 분산한 것만으로 측정에 사용하고 있어, 비교예 1 정도의 간단한 분산에서는 키토산 중의 트로포미오신이 충분히 추출되지 않기 때문이라고 생각되고, 키토산 분석시에는 키토산을 용해하여 측정에 사용하는 것이 바람직한 것을 나타내고 있다.
[산업상의 이용 가능성]
본 발명에 의하면, 키토산 중의 트로포미오신을 간편하게 정확하게 측정할 수 있다. 게다가, 상기 측정에 의해, 상기 키토산의 사람에 대한 알레르기 반응 발 현의 가능성이, 현저하게 낮은지 또는 없는지를 평가할 수 있다. 본 발명은, 또한, 상기 알레르기 반응의 가능성이 현저하게 낮거나 또는 없다고 평가된 키토산을 제공할 수 있다.

Claims (13)

  1. 키토산 중의 트로포미오신을, 키토산을 유기산 수용액에 용해한 상태로, 면역측정법(immunoassay)으로 측정하는 것을 특징으로 하는 트로포미오신 측정방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 면역측정법이, ELISA 방법인 측정방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 ELISA 방법이, 1차 항체로서 적어도 1종의 항-갑각류 트로포미오신 항체와, 적어도 1종의 표식 항체를 사용하는 샌드위치 방법인 측정방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 표식 항체가, 효소 표식 항-갑각류 트로포미오신 폴리크로날 항체 또는 효소 표식 항-면역글로불린 항체인 측정방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 갑각류가, 작은 새우류이며, 효소가, 페록시다아제, 알칼리 포스파타아제 및 β-갈락토시다아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 측정방법.
  6. 제 3 항에 있어서, 상기 항-갑각류 트로포미오신 항체가, 측정용 용기의 내벽에 코팅되어 있는 측정방법.
  7. 제 4 항에 있어서, 효소가, 페록시다아제이며, 그 기질로서 o-페닐렌디아민, 2,2'-아지노비스(3-에틸-벤즈티아졸린술폰산) 디암모늄염 및 테트라메틸벤지딘으로부터 선택되는 적어도 1종을 사용하는 측정방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 트로포미오신의 측정을, 측정계의 청색을 측정하여 실시하는 측정방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 트로포미오신의 측정을, 청색을 나타내는 측정계에 황산 또는 인산을 첨가하여, 측정계를 황색으로 바꾸어, 상기 황색을 측정하여 실시하는 측정방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 유기산이, 초산(acetic acid), 유산(lactic acid) 및 피롤리돈 카르본산(pyrrolidonecarboxylic acid)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 측정방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 유기산 수용액의 유기산 농도가, 0.1중량% 이상 2중량% 미만인 측정방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 키토산은, 그 불용해 성분이, 이하의 측정방법:
    (1) 키토산을 105℃에서 3시간 건조하는 단계,
    (2) 건조 전후의 중량비로부터 키토산 순도를 계산하는 단계,
    (3) 건조 전의 키토산을 1중량%의 초산 수용액에 키토산 순분(A그램) 농도 0.5중량%로 용해하는 단계,
    (4) 상기 수용액을, 일정 중량으로 건조된 G3 유리 필터(B그램)로 여과하는 단계,
    (5) 상기 필터상의 여과찌꺼기를 증류수로 세정하는 단계,
    (6) 여과찌꺼기를 포함한 필터를 105℃에서 3시간 건조하여, 중량(C그램)을 측정하는 단계, 및
    (7) 식[(C-B)/A×100]에 의해 키토산 중의 불용해 성분(중량%)을 계산하는 단계,에 의해 1.0중량% 이하의 키토산인 측정방법.
  13. 삭제
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