JP5413766B2 - レプチン測定方法 - Google Patents
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Lund, E. M., et al., J. Am. Vet. Med. Assoc. 214: 1336-1341, 1999 Laflamme, D., Canine Practice 22: 10-15, 1997 Zhang, Y., et al., Nature 372: 425-431, 1994 Shibata, H., et al., J. Vet. Med. Sci. 65(11): 1207-1211, 2003 Maffei, H., et al., Nature Medicine 1: 1155-1161, 1995 Iwase, M., et al., Res. Vet. Sci. 68: 109-114, 2000 Iwase, M., et al., Res. Vet. Sci. 62: 207-209, 2000
抗レプチン抗体固相化96ウエルプレートの各ウエルに、ネコ血清検体を10倍から7段階希釈して50μlづつ添加して室温で1時間反応させ、0.05%ツイーン(登録商標)20−10mMPBSで洗浄した。このように調製したプレートの各ウエルに対して、HRP標識結合ヤギ抗ネコIgG50μlづつを添加して室温で1時間反応させ、0.05%ツイーン(登録商標)20−10mMPBSで洗浄した。この各ウエルに、発色剤としてTMBをそれぞれ50μlづつを添加して室温で10分間反応させて、1M硫酸50μlづつを添加して反応を停止させた。各ウエルの450nm(Δ620nm)吸光度を測定した結果を表1および図2に示す。
ネコ検体(血清または血漿)に、1/10 (v/v) 量の1M 塩酸を添加し攪拌した後、最終濃度が 50% になるように飽和硫酸アンモニウム溶液(pH 2.5) を添加した。得られた溶液を室温で10分間攪拌した後、最終濃度が 70% になるようにエタノール−10 mM 塩酸を添加して室温で10分間攪拌した。このように処理した溶液を遠心分離 (2800 rpm, 15 min, 4 ℃) またはフィルターで不溶解物を除去し、得られた上清またはろ液を測定用検体として使用した。
また、ネコ検体に組換えイヌレプチンを添加した場合でも、添加しない場合でも、前処理を施さなかったときには、いずれの場合も測定不能であった。
ラット血清(血漿):10μl/ウエル
検体量は10〜50μl/ウェルの範囲でウェルに添加し、総液量は緩衝液(リン酸系緩衝液)で調整して50μlとした。
あらかじめ調製した洗浄液(0.05% ツイーン20(登録商標) 10 mM PBS)を抗体固相化96ウエルプレート(乾燥プレートタイプ)の各ウエルに満たし4回洗浄した後、ウエルに残った洗浄液を取り除いた。次に、検体測定ウェルに緩衝液(リン酸系緩衝液)を40μlずつ分注し、さらに検体を10μl添加した。なお、検体量は10〜50μlの範囲で調整した。ただし、各ウェルの総液量は50μlにした。上記のように調整した各濃度の標準溶液を標準品測定ウエルに50μlずつ分注し、マイクロプレート振とう器などを用いて撹拌した。さらに、各ウエルにビオチン結合抗レプチン抗体を50μlずつ分注し、マイクロプレート振とう器などを用いて撹拌した後、室温(20〜25℃)で2時間静置して反応させた。反応終了後、反応液を捨て洗浄液を各ウエルに満たし4回洗浄した。洗浄後、各ウエルに残った液を取り除いた。その後、各ウエルに、ペルオキシダーゼ・アビジン結合物を100μlずつ分注し、マイクロプレート振とう器などを用いて軽く撹拌して、室温(20〜25℃)で30分間静置して反応させた。反応終了後、反応液を捨て洗浄液を各ウエルに満たし4回洗浄し、各ウエルに残った液を取り除いた。次に、各ウエルに、発色液を100μlずつ分注します。マイクロプレート振とう器などを用いて軽く撹拌した後、室温(20〜25℃)で30分間静置した。その後、各ウエルに反応停止液を100μlずつ分注し撹拌して発色反応を停止させた。次に、マイクロプレート用分光光度計で450nm(副波長620nm)での吸光度を測定した。
標準曲線を作成します。片対数を使用し、X 軸 (Log 側) を標準溶液濃度 (pg/ml)、Y軸を吸光度の標準曲線グラフを作成した(図3参照)。次に、希釈検体の吸光度が標準曲線範囲内に入る希釈検体を選択し、標準曲線より、選択した希釈検体の吸光度に対応する濃度 (pg/ml) を読み取った。読み取った濃度に検体希釈率(標準測定法では5倍)を乗じ測定値とした(表4)。なお、検体の吸光度が標準曲線吸光度より外れた場合は、検体を緩衝液にて適当倍率に調整し再度測定を実施するのがよい。
(A)抗体固相化96ウエルプレート(乾燥プレートタイプ)・・・1枚
(B)標準イヌレプチン溶液 (5000pg/ml)・・・・・・500μl/1本
(C)緩衝液・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・60ml/1本
(D)ビオチン結合抗レプチン抗体・・・・・・・・・・200μl/1本
(E)ペルオキシダーゼ・アビジン結合物・・・・・・・200μl/1本
(F)発色液 (TMB) ・・・・・・・・・・・・・・・12ml/1本
(H)反応停止液 (1M H2SO4)・・・・・・・・・・・・12ml/1本
(I)濃縮洗浄液(10x)・・・・・・・・・・・・・・・100ml/1本
(A)抗体固相化96ウエルプレート(乾燥プレートタイプ)・・・・・・1枚
(B)標準ラットレプチン溶液 (5000pg/ml)・・・・・・・・500μl/1本
(C)緩衝液・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・60ml/1本
(D)ビオチン結合抗レプチン抗体・・・・・・・・・・・・200μl/1本
(E)ペルオキシダーゼ・アビジン結合物・・・・・・・・・200μl/1本
(F)発色液 (TMB) ・・・・・・・・・・・・・・・・・・12ml/1本
(H)反応停止液 (1 M H2SO4)・・・・・・・・・・・・・・・12ml/1本
(I)濃縮洗浄液(10x)・・・・・・・・・・・・・・・・・100ml/1本
洗浄液は、濃縮洗浄液(0.5% ツイーン20(登録商標) 100 mM PB、1.5 M NaCl)を精製水で10倍に希釈した。
ビオチン結合抗レプチン抗体は緩衝液を用いて100倍に希釈した。
ペルオキシダーゼ・アビジン結合物は緩衝液を用いて100倍に希釈した。
その他の試薬はそのまま使用した。
キットの試薬類は室温(20℃〜25℃)に戻してから使用した。
プレート固相化抗体としてはウサギ由来ポリクローナル抗体を使用し、検出抗体としてはヤギ由来ポリクローナル抗体を使用した。いずれのポリクローナル抗体の免疫原としてはレプチンを使用し、いずれもレプチンに対して特異性を有していた。また、濃度が3000 pg/ml での交差反応性は表5に示す通りであった。なお、表中、+は交差反応性あり、−は交差反応性無しを意味する。
Claims (4)
- ネコ検体を酸性にしてネコレプチンに結合している自己抗体を分離し、かつ、タンパク質沈殿剤を添加してネコレプチンに結合していない自己抗体を分離し、該ネコ検体から自己抗体を除去した後、ネコ検体中に存在するネコレプチンを測定することを特徴とするネコレプチン測定方法。
- 請求項1に記載のネコレプチン測定方法であって、無機酸または有機酸を使用して前記ネコ検体を酸性にすることを特徴とするネコレプチン測定方法。
- 請求項1または2に記載のネコレプチン測定方法であって、前記タンパク質沈殿剤が飽和硫酸アンモニウム、飽和硫酸ナトリウムおよびポリエチレングリコールから選ばれることを特徴とするネコレプチン測定方法。
- 請求項1ないし3のいずれか1項に記載のネコレプチン測定方法であって、アルコールをさらに添加してネコレプチンを分離することを特徴とするネコレプチン測定方法。
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