JP3740898B2

JP3740898B2 - 生理活性成分の測定法

Info

Publication number: JP3740898B2
Application number: JP21632099A
Authority: JP
Inventors: 真人高田
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1998-07-31
Filing date: 1999-07-30
Publication date: 2006-02-01
Anticipated expiration: 2019-07-30
Also published as: JP2000241429A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗体、結合タンパク質又はレセプターを用いたアッセイにより、生体試料中の生理活性成分、具体的には、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
成長因子、ホルモン、ビタミン、薬物などの生理活性成分の多くは、生体内において結合性のタンパク質と結合し、その作用や代謝速度が調節されている。抗体、結合タンパク質、又はレセプターを用いたアッセイにより生理活性成分を測定する場合、しばしばこの共存するタンパク質が測定値に影響を及ぼす。
【０００３】
従来、測定しようとする物質に対する結合タンパク質が生体試料中に共存する場合、該結合タンパク質の測定への影響を排除するために様々な前処理が行われてきた。インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）を例に取ると、現在最もよく行われている方法として「酸エタノール法」が挙げられる（W.H. Daughaday Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 1980, Vol.51 p781-788）。この方法は、生体試料を塩酸−エタノール混液で処理すると、酸性条件でＩＧＦ−Ｉを乖離した結合タンパク質はエタノール雰囲気下で不溶性となるため、遠心操作によって容易に試料中から除くことができることを利用したものである。
【０００４】
しかしながら、酸エタノール法において、遠心操作を省略すると、中和した時点でＩＧＦ−Ｉに対する結合タンパク質の結合活性が回復し、測定値に影響を及ぼす。この欠点を補うため、酸処理した後の中和用緩衝液に、再結合阻害剤を添加する方法が報告されている（特開平８−１４５９９８）。この方法では、中和後の生体試料溶液中には、ＩＧＦ−Ｉが全て遊離状態で存在すると考えられるので、結合タンパク質の共存は測定値に影響を与えない。再結合阻害剤としては、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸塩（ＡＮＳ）などが用いられている。
【０００５】
ＡＮＳは、甲状腺ホルモンを結合タンパク質から乖離させる目的で古くから使用されているものであるが、光や空気酸化に対して不安定であり、かつ毒性が強い等の操作上の問題の他に、免疫反応に影響を及ぼす場合があることが指摘され、生体試料の測定に用いるには制約が多い。
【０００６】
また試料中に含まれている結合タンパク質の影響を除去する方法として、ビタミンＢ₁₂の分析において結合タンパク質にチオール基を導入し、ビタミンＢ₁₂に対する結合活性を消失させる方法（特許登録１９４０５９６）や、ペルオキシ酸を用いて結合タンパク質を変性させる方法（特許登録２０２３９２７）が知られている。しかしこれらの方法においては、過剰の変性剤を添加するため、結合タンパク質を変性させた後、余剰の変性剤を失活させる必要があった。
【０００７】
ＩＧＦ−Ｉの測定法として、試料中に過剰のＩＧＦ−IIを添加する方法が知られている。ＩＧＦ−IIは結合タンパク質の結合部位を全てふさぐため、追い出される格好で遊離するＩＧＦ−Ｉをイムノアッセイで測定する方法である（W.F. Blum, Acta Endocrinokogica, 1988, Vol.118 p374-380)。この方法では測定に用いる抗体がＩＧＦ−IIと交差反応しないことが求められるが、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−IIは構造が酷似しているため、前処理で添加する過剰量のＩＧＦ−IIに全く影響を受けない抗体を得ることは困難である。同様な方法がステロイドホルモンの測定でも報告されているが（特開平０６−１０２２７５）、使用可能な測定系が限定される上に、コストが高くつくなどの欠点があった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従来は、上述のように生体試料中に共存する結合タンパク質の影響を除去するのに、高価な試薬や毒性の高い試薬を、前処理剤、中和剤、又は測定用緩衝液に加えることが必要であったり、あるいは煩雑な操作や特別な機器を必要とした。そのため、このような既存方法の有する欠点を解決することが求められていた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明では、測定対象物の活性に影響を及ぼさない範囲で、特定の前処理剤を試料に添加すると、結合タンパク質のみが失活し、この混合物をそのまま測定に供することができることを見い出した。
【００１０】
すなわち、生体試料を界面活性剤及び／又はアルカリ剤に曝すことによって、結合タンパク質がインスリン様成長因子から乖離し、同時に不可逆的変性を起こす。前処理を終えた試料は、変性剤の官能基を中和したり、インスリン様成長因子と結合タンパク質の再結合を阻止するような特別な物質を加える必要はなく、pHが測定に適した条件になるように中和もしくは希釈すればよい。あるいはそのまま測定に供することが可能となるのである。
【００１１】
本発明によれば、血清、血漿、尿などの生体試料中のインスリン様成長因子、より具体的には、インスリン様成長因子１及びインスリン様成長因子２の測定に、煩雑な操作や危険性の高い特別な試薬を必要とせず、測定系の精度を損なわないで前処理を行う測定系が提供される。
【００１２】
本発明では前処理剤として界面活性剤及び／又はアルカリ剤を使用するものである。前処理剤は通常、水性媒体として用いられ、２種以上の成分を用いる場合は、別々の液として用いても、混合液として用いてもよいが実用上、後者が好ましい。
【００１３】
界面活性剤としては、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、ノニオン性（非イオン性）界面活性剤、両性界面活性剤が用いられる。好ましくは、アニオン性界面活性剤が用いられる。
アニオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと略記）等、カチオン性界面活性剤としては、例えば、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ジドデシルジメチルアンモニウムクロリド等、ノニオン性界面活性剤としてはアルキルポリオキシエチレンエーテル、アルキルポリオキシエチレンフェノール、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル（Ｔｗｅｅｎ）等、両性界面活性剤としては、アルキルトリメチルアンモニウム塩等が用いられる。
本発明においては、アニオン性界面活性剤が好ましく用いられ、特に好ましくはＳＤＳが用いられる。
前処理剤中の界面活性剤の濃度としては、例えば、０．０１〜５重量％、好ましくは０．０５〜１重量％が用いられるが、測定対象物や使用する界面活性剤によって至適濃度を決定するのが好ましい。
【００１４】
一方、アルカリ剤としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどが挙げられ、特に、水酸化ナトリウムが好ましい。前処理剤中のアルカリ剤の濃度は、通常、０．００１〜１重量％である。
また、前処理剤として、他の種々の配合剤（変性剤、乖離剤等）を用いても差し支えない。一例として低級脂肪族アルコールを併用することができる。このアルコールとしては、通常、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノールなどが挙げられるが、エタノールが最適である。アルコールの使用量としては前処理剤全量に対して２５〜３０重量％が望ましい。
【００１５】
上述のような前処理剤と生体試料とを混合処理することにより、生体試料中の結合タンパク質の影響が抑制されるが、この前処理においては、通常室温程度（例えば１０〜４０℃）で撹拌処理することで十分な効果が得られる。
この混合処理において、生体試料中に供給される界面活性剤の量としては、通常、生体試料に対して０．０１〜５重量％、好ましくは０．０５〜１重量％であり、また、アルカリ剤の量は、通常、生体試料に対して０．００１〜１重量％、好ましくは０．０１〜０．５重量％である。
かかるアルカリ剤は、界面活性剤と併用する場合は少ない使用量で、単独で用いる場合は多めの使用量とする等、その量を適宜調整して使用される。
【００１６】
本発明では上記の前処理により生体試料中の結合タンパク質の悪影響がなくなるが、この混合液を引き続き競合法又はサンドイッチ法などの公知の測定法により、インスリン様成長因子を測定する。その際、本発明では前記混合液を固液分離や抽出などの特段の操作をすることなく、そのままあるいはｐＨ調整後に測定に供する。
【００１７】
競合的測定法又はサンドイッチ法としては、抗体、結合タンパク質又はレセプターを用いることができる。この際、標識として放射性物質、酵素、蛍光試薬又は化学発光基質を用いた免疫測定法；あるいはラテックス、磁性ラテックスもしくは蛍光標識ラテックスを用いた凝集反応による測定法等を例示することができる。
【００１８】
本発明はまた、測定用キットを含む。そのようなキットを構成する試薬例としては、少なくとも以下の成分を挙げることができる。一例として、測定対象物がインスリン様成長因子（ＩＧＦ）測定用キットは、
例えば、サンドイッチ法の場合、
（ａ）界面活性剤を含む前処理液
（ｂ）標識抗ＩＧＦ抗体
（ｃ）固相化抗ＩＧＦ抗体
競合法の場合、
（ａ）界面活性剤を含む前処理液
（ｂ）標識ＩＧＦ
（ｃ）抗ＩＧＦ抗体
ラテックス凝集法を用いた競合法の場合、
（ａ）界面活性剤を含む前処理液
（ｂ）ＩＧＦ固定ラテックス
（ｃ）抗ＩＧＦ抗体
蛍光標識ラテックスを用いたサンドイッチ法の場合、
（ａ）界面活性剤を含む前処理液
（ｂ）抗ＩＧＦ抗体固定蛍光（ユーロピウム）標識ラテックス
（ｃ）抗ＩＧＦ抗体固定磁性ラテックス
を少なくとも含有するキットが一例として挙げられる。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
実施例１（界面活性剤を用いたインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）の測定）
ａ）前処理液の調製
▲１▼０．１５％ＳＤＳを調製した。
▲２▼対照のための酸エタノール液として、０．１ＭＨＣｌ、９０％エタノールになるよう前処理液を調製した。
【００２０】
ｂ）抗体ビーズの調製
抗ＩＧＦ−Ｉモノクローナル抗体を、アルカリ条件下でポリスチレンビーズに物理的に吸着させ、測定に供した。
【００２１】
ｃ）トレーサーの調製
上記ｂ）の抗体とともに、ＩＧＦ−Ｉに対してサンドイッチを形成しうるモノクローナル抗体に、標識としてクロラミンＴ法でヨウ素¹²⁵ を導入した。このトレーサーを下記ウシ血清アルブミンなどを含むリン酸緩衝液で希釈し、測定に供した。
０．１M リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4)
０．１５M 塩化ナトリウム
１０mMエデト酸二ナトリウム
０．１％ウシ血清アルブミン
０．１％ツィーン２０（界面活性剤）
０．０２％アジ化ナトリウム
【００２２】
ｄ）標準ＩＧＦ−Ｉの調製
（株）東洋紡より入手したヒトＩＧＦ−Ｉを、上記と同様のウシ血清アルブミンなどを含むリン酸緩衝液で０．３〜１００ng/ml になるように希釈した。
【００２３】
ｅ）ヒト血清試料の入手
健常人より採血し、血清分離後速やかに凍結して、使用時まで保管した。
【００２４】
ｆ）試料の前処理
試料のヒト血清２５μl を試験管にはかり取り、これに上記▲１▼又は▲２▼の前処理液５００μl を加えた。上記▲１▼の前処理液は、試料撹拌後直ちに測定に供した。▲２▼の酸エタノール抽出液は、試料撹拌後、遠心操作を加え、上清を測定に供した。
【００２５】
ｇ）免疫測定
標準ＩＧＦ−Ｉ及び前処理済み試料各２５μl ずつを試験管にはかり取り、これにトレーサー溶液３００μl を添加した。混和後、各試験管に抗体ビーズを１個入れて室温で２時間撹拌した後、精製水各３mlで２回ずつ洗浄し、抗体ビーズに結合した放射能をγカウンターで測定した。標準ＩＧＦ−Ｉの７濃度の結合放射能量から検量線を作製した（表１及び図１）。
【００２６】
【表１】

総放射能（Ｔ）：１８２５３９ｅｐｍ
ＮＳＢ以外の標準液の結合放射能量（Ｂ）は、ＮＳＢの結合放射能量（２３６ｃｐｍ）を引いた値で表示した。
【００２７】
標準曲線と前処理済み試料の結合放射能量から、前処理済み試料中のＩＧＦ−Ｉ濃度を求め、２１倍することで処理前の試料中ＩＧＦ−Ｉ濃度を求めた。結果を表２に示す。
【００２８】
【表２】

【００２９】
実施例２（界面活性剤とアルカリ剤を併用したインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）の測定）
実施例１と同様の試料中のＩＧＦ−Ｉ濃度を、前処理液として▲１▼０．１M ＨＣｌ＋９０％エタノール混液と、▲２▼０．１８％ＳＤＳ＋１ｍＭＮａＯＨ＋３０％エタノールを使用した場合とを実施例１と同様に測定し比較した。その結果を表３に示す。
【００３０】
【表３】

【００３１】
▲１▼０．１M ＨＣｌ＋９０％エタノールに対し、▲２▼１ｍＭＮａＯＨ＋０．１８％ＳＤＳ＋３０％エタノールでは、操作性をあげることが可能であった。
【００３２】
実施例３（アルカリ剤を用いたインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）の測定）
ａ）前処理液の調製
▲１▼５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液を調製した。
▲２▼対照のための酸のエタノール液として、１規定塩酸１容にエタノール９容を加えた前処理液を調製した。以下、（ｂ）抗体ビーズの調製、（ｃ）トレーサーの調製、（ｄ）標準ＩＧＦ−Ｉの調製、（ｅ）ヒト血清試料の入手、（ｆ）試料の前処理は実施例１と同様に行った。
【００３３】
ｇ）免疫測定
標準ＩＧＦ−Ｉ及び前処理済み試料各２５μl ずつを試験管にはかり取り、これにトレーサー溶液３００μl を添加した。混和後、各試験管に抗体ビーズを１個入れて室温で２時間撹拌した後、精製水各３mlで２回ずつ洗浄し、抗体ビーズに結合した放射能をγカウンターで測定した。標準ＩＧＦ−Ｉの７濃度の結合放射能量から検量線を作製した（表４及び図２）。
【００３４】
【表４】

【００３５】
標準曲線と前処理済み試料の結合放射能量から、前処理済み試料中のＩＧＦ−Ｉ濃度を求め、２１倍することで処理前の試料中ＩＧＦ−Ｉ濃度を求めた。結果を表５に示す。
【００３６】
【表５】

【００３７】
実施例４（アルカリ剤とエタノールを用いたインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）の測定）
実施例３と同様に試料中のＩＧＦ−Ｉ濃度を、前処理液として▲２▼５０mMＮａＯＨ液単用と、▲３▼５mMＮａＯＨ＋３０％エタノール混液を使用した場合と、▲１▼対照として０．１M ＨＣｌ＋９０％エタノール混液を使用した場合とを実施例３と同様に測定し比較した。その結果を表６に示す。
【００３８】
【表６】

【００３９】
ＮａＯＨ濃度を単独使用の５０mMよりも、併用の５mMに落とすことによって、前処理後の試料の保存安定性が向上し、また試験者が濃いアルカリ液に暴露される危険性を低減させることができた。
【発明の効果】
本発明によれば、測定対象物の活性を損なうことなく、試料中に共存する結合タンパク質のみが失活する濃度の界面活性剤を前処理に用いているので、高価な試薬や毒性の高い試薬、または煩雑な操作や特別な機器を用いずに、生体試料中の測定対象物濃度を正確に測定することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】標準ＩＧＦ−Ｉの結合放射能の検量線を示す。
【図２】標準ＩＧＦ−Ｉの結合放射能の検量線を示す。

Claims

生体試料に界面活性剤及びアルカリ剤から選ばれた少なくとも１種の前処理剤を混合し、得られた生体試料混合物を分離や抽出を行うことなく測定に供することを特徴とする、インスリン様成長因子の測定法。
界面活性剤がアニオン性界面活性剤である請求項１記載の測定法。
アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である請求項２記載の測定法。
アルカリ剤が水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニア水溶液である請求項１〜３のいずれかに記載の測定法。
界面活性剤の使用量が０．０１〜５重量％である請求項１〜４のいずれかに記載の測定法。
アルカリ剤の使用量が０．００１〜１重量％である請求項１〜５のいずれかに記載の測定法。
前処理剤として、界面活性剤及びアルカリ剤を併用することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の測定法。
前記前処理剤とともに低級脂肪族アルコールを共存させる請求項１〜７のいずれかに記載の測定法。
生体試料が体液である請求項１〜８のいずれかに記載の測定法。
測定法が、抗体、結合タンパク質又はレセプターを用いた測定法であり、標識として放射性物質、酵素、蛍光物質もしくは化学発光基質を用いた測定法；又はラテックス、磁性ラテックスもしくは蛍光標識ラテックスを用いた測定法である請求項１〜９のいずれかに記載の測定法。
請求項１〜１０のいずれかに記載の測定法に用いられるためのキットであって、少なくとも次の試薬（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含み、生体試料中のインスリン様成長因子をサンドイッチ法により測定するためのキット。
（ａ）界面活性剤及び／又はアルカリ剤を含む前処理液
（ｂ）標識抗ＩＧＦ抗体
（ｃ）固相化抗ＩＧＦ抗体
請求項１〜１０のいずれかに記載の測定法に用いられるためのキットであって、少なくとも次の試薬（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含み、生体試料中のインスリン様成長因子を競合法により測定するためのキット。
（ａ）界面活性剤及び／又はアルカリ剤を含む前処理液
（ｂ）標識ＩＧＦ
（ｃ）抗ＩＧＦ抗体
請求項１〜１０のいずれかに記載の測定法に用いられるためのキットであって、少なくとも次の試薬（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含み、生体試料中のインスリン様成長因子をラテックス凝集法を用いた競合法により測定するためのキット。
（ａ）界面活性剤及び／又はアルカリ剤を含む前処理液
（ｂ）ＩＧＦ固定ラテックス
（ｃ）抗ＩＧＦ抗体
請求項１〜１０のいずれかに記載の測定法に用いられるためのキットであって、少なくとも次の試薬（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含み、生体試料中のインスリン様成長因子を蛍光標識ラテックスを用いたサンドイッチ法により測定するためのキット。
（ａ）界面活性剤及び／又はアルカリ剤を含む前処理液
（ｂ）抗ＩＧＦ抗体固定蛍光標識ラテックス
（ｃ）抗ＩＧＦ抗体固定磁性ラテックス