JP2000241429A - 生理活性成分の測定法 - Google Patents
生理活性成分の測定法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 生体試料中に共存する結合タンパク質の影響
を除去して測定対象物を測定するための前処理法を提供
する。 【解決手段】 生体試料に界面活性剤及びアルカリ剤か
ら選ばれた少なくとも１種の前処理剤を混合し、生体試
料中の結合タンパク質を測定対象物から乖離させ、同時
に不可逆的変性を起こし失活させる。
を除去して測定対象物を測定するための前処理法を提供
する。 【解決手段】 生体試料に界面活性剤及びアルカリ剤か
ら選ばれた少なくとも１種の前処理剤を混合し、生体試
料中の結合タンパク質を測定対象物から乖離させ、同時
に不可逆的変性を起こし失活させる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗体、結合タンパ
ク質又はレセプターを用いたアッセイにより、生体試料
中の生理活性成分を測定する方法に関する。
ク質又はレセプターを用いたアッセイにより、生体試料
中の生理活性成分を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】成長因子、ホルモン、ビタミン、薬物な
どの生理活性成分の多くは、生体内において結合性のタ
ンパク質と結合し、その作用や代謝速度が調節されてい
る。抗体、結合タンパク質、又はレセプターを用いたア
ッセイにより生理活性成分を測定する場合、しばしばこ
の共存するタンパク質が測定値に影響を及ぼす。
どの生理活性成分の多くは、生体内において結合性のタ
ンパク質と結合し、その作用や代謝速度が調節されてい
る。抗体、結合タンパク質、又はレセプターを用いたア
ッセイにより生理活性成分を測定する場合、しばしばこ
の共存するタンパク質が測定値に影響を及ぼす。
【０００３】従来、測定しようとする物質に対する結合
タンパク質が生体試料中に共存する場合、該結合タンパ
ク質の測定への影響を排除するために様々な前処理が行
われてきた。インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）を
例に取ると、現在最もよく行われている方法として「酸
エタノール法」が挙げられる（W.H. Daughaday Journal
of Clinical Endocrinology and Metabolism, 1980, V
ol.51 p781-788）。この方法は、生体試料を塩酸−エタ
ノール混液で処理すると、酸性条件でＩＧＦ−Ｉを乖離
した結合タンパク質はエタノール雰囲気下で不溶性とな
るため、遠心操作によって容易に試料中から除くことが
できることを利用したものである。
タンパク質が生体試料中に共存する場合、該結合タンパ
ク質の測定への影響を排除するために様々な前処理が行
われてきた。インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）を
例に取ると、現在最もよく行われている方法として「酸
エタノール法」が挙げられる（W.H. Daughaday Journal
of Clinical Endocrinology and Metabolism, 1980, V
ol.51 p781-788）。この方法は、生体試料を塩酸−エタ
ノール混液で処理すると、酸性条件でＩＧＦ−Ｉを乖離
した結合タンパク質はエタノール雰囲気下で不溶性とな
るため、遠心操作によって容易に試料中から除くことが
できることを利用したものである。
【０００４】しかしながら、酸エタノール法において、
遠心操作を省略すると、中和した時点でＩＧＦ−Ｉに対
する結合タンパク質の結合活性が回復し、測定値に影響
を及ぼす。この欠点を補うため、酸処理した後の中和用
緩衝液に、再結合阻害剤を添加する方法が報告されてい
る（特開平８−１４５９９８）。この方法では、中和後
の生体試料溶液中には、ＩＧＦ−Ｉが全て遊離状態で存
在すると考えられるので、結合タンパク質の共存は測定
値に影響を与えない。再結合阻害剤としては、８−アニ
リノ−１−ナフタレンスルホン酸塩（ＡＮＳ）などが用
いられている。
遠心操作を省略すると、中和した時点でＩＧＦ−Ｉに対
する結合タンパク質の結合活性が回復し、測定値に影響
を及ぼす。この欠点を補うため、酸処理した後の中和用
緩衝液に、再結合阻害剤を添加する方法が報告されてい
る（特開平８−１４５９９８）。この方法では、中和後
の生体試料溶液中には、ＩＧＦ−Ｉが全て遊離状態で存
在すると考えられるので、結合タンパク質の共存は測定
値に影響を与えない。再結合阻害剤としては、８−アニ
リノ−１−ナフタレンスルホン酸塩（ＡＮＳ）などが用
いられている。
【０００５】ＡＮＳは、甲状腺ホルモンを結合タンパク
質から乖離させる目的で古くから使用されているもので
あるが、光や空気酸化に対して不安定であり、かつ毒性
が強い等の操作上の問題の他に、免疫反応に影響を及ぼ
す場合があることが指摘され、生体試料の測定に用いる
には制約が多い。
質から乖離させる目的で古くから使用されているもので
あるが、光や空気酸化に対して不安定であり、かつ毒性
が強い等の操作上の問題の他に、免疫反応に影響を及ぼ
す場合があることが指摘され、生体試料の測定に用いる
には制約が多い。
【０００６】また試料中に含まれている結合タンパク質
の影響を除去する方法として、ビタミンＢ12の分析にお
いて結合タンパク質にチオール基を導入し、ビタミンＢ
12に対する結合活性を消失させる方法（特許登録１９４
０５９６）や、ペルオキシ酸を用いて結合タンパク質を
変性させる方法（特許登録２０２３９２７）が知られて
いる。しかしこれらの方法においては、過剰の変性剤を
添加するため、結合タンパク質を変性させた後、余剰の
変性剤を失活させる必要があった。
の影響を除去する方法として、ビタミンＢ12の分析にお
いて結合タンパク質にチオール基を導入し、ビタミンＢ
12に対する結合活性を消失させる方法（特許登録１９４
０５９６）や、ペルオキシ酸を用いて結合タンパク質を
変性させる方法（特許登録２０２３９２７）が知られて
いる。しかしこれらの方法においては、過剰の変性剤を
添加するため、結合タンパク質を変性させた後、余剰の
変性剤を失活させる必要があった。
【０００７】ＩＧＦ−Ｉの測定法として、試料中に過剰
のＩＧＦ−IIを添加する方法が知られている。ＩＧＦ−
IIは結合タンパク質の結合部位を全てふさぐため、追い
出される格好で遊離するＩＧＦ−Ｉをイムノアッセイで
測定する方法である（W.F. Blum, Acta Endocrinokogic
a, 1988, Vol.118 p374-380)。この方法では測定に用い
る抗体がＩＧＦ−IIと交差反応しないことが求められる
が、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−IIは構造が酷似しているた
め、前処理で添加する過剰量のＩＧＦ−IIに全く影響を
受けない抗体を得ることは困難である。同様な方法がス
テロイドホルモンの測定でも報告されているが（特開平
０６−１０２２７５）、使用可能な測定系が限定される
上に、コストが高くつくなどの欠点があった。
のＩＧＦ−IIを添加する方法が知られている。ＩＧＦ−
IIは結合タンパク質の結合部位を全てふさぐため、追い
出される格好で遊離するＩＧＦ−Ｉをイムノアッセイで
測定する方法である（W.F. Blum, Acta Endocrinokogic
a, 1988, Vol.118 p374-380)。この方法では測定に用い
る抗体がＩＧＦ−IIと交差反応しないことが求められる
が、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−IIは構造が酷似しているた
め、前処理で添加する過剰量のＩＧＦ−IIに全く影響を
受けない抗体を得ることは困難である。同様な方法がス
テロイドホルモンの測定でも報告されているが（特開平
０６−１０２２７５）、使用可能な測定系が限定される
上に、コストが高くつくなどの欠点があった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従来は、上述のように
生体試料中に共存する結合タンパク質の影響を除去する
のに、高価な試薬や毒性の高い試薬を、前処理剤、中和
剤、又は測定用緩衝液に加えることが必要であったり、
あるいは煩雑な操作や特別な機器を必要とした。そのた
め、このような既存方法の有する欠点を解決することが
求められていた。
生体試料中に共存する結合タンパク質の影響を除去する
のに、高価な試薬や毒性の高い試薬を、前処理剤、中和
剤、又は測定用緩衝液に加えることが必要であったり、
あるいは煩雑な操作や特別な機器を必要とした。そのた
め、このような既存方法の有する欠点を解決することが
求められていた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明では、測定対象物
の活性に影響を及ぼさない範囲で、特定の前処理剤を試
料に添加すると、結合タンパク質のみが失活し、この混
合物をそのまま測定に供することができることを見い出
した。
の活性に影響を及ぼさない範囲で、特定の前処理剤を試
料に添加すると、結合タンパク質のみが失活し、この混
合物をそのまま測定に供することができることを見い出
した。
【００１０】すなわち、生体試料を界面活性剤及び／又
はアルカリ剤に曝すことによって、結合タンパク質が測
定対象物から乖離し、同時に不可逆的変性を起こす。前
処理を終えた試料は、変性剤の官能基を中和したり、測
定対象物と結合タンパク質の再結合を阻止するような特
別な物質を加える必要はなく、pHが測定に適した条件に
なるように中和もしくは希釈すればよい。あるいはその
まま測定に供することが可能となるのである。
はアルカリ剤に曝すことによって、結合タンパク質が測
定対象物から乖離し、同時に不可逆的変性を起こす。前
処理を終えた試料は、変性剤の官能基を中和したり、測
定対象物と結合タンパク質の再結合を阻止するような特
別な物質を加える必要はなく、pHが測定に適した条件に
なるように中和もしくは希釈すればよい。あるいはその
まま測定に供することが可能となるのである。
【００１１】本発明によれば、血清、血漿、尿などの生
体試料中の成長因子、特にインスリン様成長因子１及び
インスリン様成長因子２、ホルモン、ビタミン又は薬
物、あるいはアミノ酸、アミノ酸代謝物、ペプチド又は
タンパク質の測定に、煩雑な操作や危険性の高い特別な
試薬を必要とせず、測定系の精度を損なわないで前処理
を行う測定系が提供される。
体試料中の成長因子、特にインスリン様成長因子１及び
インスリン様成長因子２、ホルモン、ビタミン又は薬
物、あるいはアミノ酸、アミノ酸代謝物、ペプチド又は
タンパク質の測定に、煩雑な操作や危険性の高い特別な
試薬を必要とせず、測定系の精度を損なわないで前処理
を行う測定系が提供される。
【００１２】本発明では前処理剤として界面活性剤及び
／又はアルカリ剤を使用するものである。前処理剤は通
常、水性媒体として用いられ、２種以上の成分を用いる
場合は、別々の液として用いても、混合液として用いて
もよいが実用上、後者が好ましい。
／又はアルカリ剤を使用するものである。前処理剤は通
常、水性媒体として用いられ、２種以上の成分を用いる
場合は、別々の液として用いても、混合液として用いて
もよいが実用上、後者が好ましい。
【００１３】界面活性剤としては、アニオン性界面活性
剤、カチオン性界面活性剤、ノニオン性（非イオン性）
界面活性剤、両性界面活性剤が用いられる。好ましく
は、アニオン性界面活性剤が用いられる。アニオン性界
面活性剤としては、例えば、アルキルベンゼンスルホン
酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと略記）
等、カチオン性界面活性剤としては、例えば、ドデシル
トリメチルアンモニウムクロリド、ジドデシルジメチル
アンモニウムクロリド等、ノニオン性界面活性剤として
はアルキルポリオキシエチレンエーテル、アルキルポリ
オキシエチレンフェノール、ポリオキシエチレンソルビ
タンアルキルエステル（Ｔｗｅｅｎ）等、両性界面活性
剤としては、アルキルトリメチルアンモニウム塩等が用
いられる。本発明においては、アニオン性界面活性剤が
好ましく用いられ、特に好ましくはＳＤＳが用いられ
る。前処理剤中の界面活性剤の濃度としては、例えば、
０．０１〜５重量％、好ましくは０．０５〜１重量％が
用いられるが、測定対象物や使用する界面活性剤によっ
て至適濃度を決定するのが好ましい。
剤、カチオン性界面活性剤、ノニオン性（非イオン性）
界面活性剤、両性界面活性剤が用いられる。好ましく
は、アニオン性界面活性剤が用いられる。アニオン性界
面活性剤としては、例えば、アルキルベンゼンスルホン
酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと略記）
等、カチオン性界面活性剤としては、例えば、ドデシル
トリメチルアンモニウムクロリド、ジドデシルジメチル
アンモニウムクロリド等、ノニオン性界面活性剤として
はアルキルポリオキシエチレンエーテル、アルキルポリ
オキシエチレンフェノール、ポリオキシエチレンソルビ
タンアルキルエステル（Ｔｗｅｅｎ）等、両性界面活性
剤としては、アルキルトリメチルアンモニウム塩等が用
いられる。本発明においては、アニオン性界面活性剤が
好ましく用いられ、特に好ましくはＳＤＳが用いられ
る。前処理剤中の界面活性剤の濃度としては、例えば、
０．０１〜５重量％、好ましくは０．０５〜１重量％が
用いられるが、測定対象物や使用する界面活性剤によっ
て至適濃度を決定するのが好ましい。
【００１４】一方、アルカリ剤としては、例えば、水酸
化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどが挙げ
られ、特に、水酸化ナトリウムが好ましい。前処理剤中
のアルカリ剤の濃度は、通常、０．００１〜１重量％で
ある。また、前処理剤として、他の種々の配合剤（変性
剤、乖離剤等）を用いても差し支えない。一例として低
級脂肪族アルコールを併用することができる。このアル
コールとしては、通常、メタノール、エタノール、イソ
プロパノール、ブタノールなどが挙げられるが、エタノ
ールが最適である。アルコールの使用量としては前処理
剤全量に対して２５〜３０重量％が望ましい。
化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどが挙げ
られ、特に、水酸化ナトリウムが好ましい。前処理剤中
のアルカリ剤の濃度は、通常、０．００１〜１重量％で
ある。また、前処理剤として、他の種々の配合剤（変性
剤、乖離剤等）を用いても差し支えない。一例として低
級脂肪族アルコールを併用することができる。このアル
コールとしては、通常、メタノール、エタノール、イソ
プロパノール、ブタノールなどが挙げられるが、エタノ
ールが最適である。アルコールの使用量としては前処理
剤全量に対して２５〜３０重量％が望ましい。
【００１５】上述のような前処理剤と生体試料とを混合
処理することにより、生体試料中の結合タンパク質の影
響が抑制されるが、この前処理においては、通常室温程
度（例えば１０〜４０℃）で撹拌処理することで十分な
効果が得られる。この混合処理において、生体試料中に
供給される界面活性剤の量としては、通常、生体試料に
対して０．０１〜５重量％、好ましくは０．０５〜１重
量％であり、また、アルカリ剤の量は、通常、生体試料
に対して０．００１〜１重量％、好ましくは０．０１〜
０．５重量％である。かかるアルカリ剤は、界面活性剤
と併用する場合は少ない使用量で、単独で用いる場合は
多めの使用量とする等、その量を適宜調整して使用され
る。
処理することにより、生体試料中の結合タンパク質の影
響が抑制されるが、この前処理においては、通常室温程
度（例えば１０〜４０℃）で撹拌処理することで十分な
効果が得られる。この混合処理において、生体試料中に
供給される界面活性剤の量としては、通常、生体試料に
対して０．０１〜５重量％、好ましくは０．０５〜１重
量％であり、また、アルカリ剤の量は、通常、生体試料
に対して０．００１〜１重量％、好ましくは０．０１〜
０．５重量％である。かかるアルカリ剤は、界面活性剤
と併用する場合は少ない使用量で、単独で用いる場合は
多めの使用量とする等、その量を適宜調整して使用され
る。
【００１６】本発明では上記の前処理により生体試料中
の結合タンパク質の悪影響がなくなるが、この混合液を
引き続き競合法又はサンドイッチ法などの公知の測定法
により、生理活性成分を測定する。その際、本発明では
前記混合液を固液分離や抽出などの特段の操作をするこ
となく、そのまま測定に供する。
の結合タンパク質の悪影響がなくなるが、この混合液を
引き続き競合法又はサンドイッチ法などの公知の測定法
により、生理活性成分を測定する。その際、本発明では
前記混合液を固液分離や抽出などの特段の操作をするこ
となく、そのまま測定に供する。
【００１７】競合的測定法又はサンドイッチ法として
は、抗体、結合タンパク質又はレセプターを用いること
ができる。この際、標識として放射性物質、酵素、蛍光
試薬又は化学発光基質を用いた免疫測定法；あるいはラ
テックス、磁性ラテックスもしくは蛍光標識ラテックス
を用いた凝集反応による測定法等を例示することができ
る。
は、抗体、結合タンパク質又はレセプターを用いること
ができる。この際、標識として放射性物質、酵素、蛍光
試薬又は化学発光基質を用いた免疫測定法；あるいはラ
テックス、磁性ラテックスもしくは蛍光標識ラテックス
を用いた凝集反応による測定法等を例示することができ
る。
【００１８】本発明はまた、測定用キットを含む。その
ようなキットを構成する試薬例としては、少なくとも以
下の成分を挙げることができる。一例として、測定対象
物がインスリン様成長因子（ＩＧＦ）測定用キットは、
例えば、サンドイッチ法の場合、 （ａ）界面活性剤を含む前処理液 （ｂ）標識抗ＩＧＦ抗体 （ｃ）固相化抗ＩＧＦ抗体 競合法の場合、 （ａ）界面活性剤を含む前処理液 （ｂ）標識ＩＧＦ （ｃ）抗ＩＧＦ抗体 ラテックス凝集法を用いた競合法の場合、 （ａ）界面活性剤を含む前処理液 （ｂ）ＩＧＦ固定ラテックス （ｃ）抗ＩＧＦ抗体 蛍光標識ラテックスを用いたサンドイッチ法の場合、 （ａ）界面活性剤を含む前処理液 （ｂ）抗ＩＧＦ抗体固定蛍光（ユーロピウム）標識ラテ
ックス （ｃ）抗ＩＧＦ抗体固定磁性ラテックス を少なくとも含有するキットが一例として挙げられる。
ようなキットを構成する試薬例としては、少なくとも以
下の成分を挙げることができる。一例として、測定対象
物がインスリン様成長因子（ＩＧＦ）測定用キットは、
例えば、サンドイッチ法の場合、 （ａ）界面活性剤を含む前処理液 （ｂ）標識抗ＩＧＦ抗体 （ｃ）固相化抗ＩＧＦ抗体 競合法の場合、 （ａ）界面活性剤を含む前処理液 （ｂ）標識ＩＧＦ （ｃ）抗ＩＧＦ抗体 ラテックス凝集法を用いた競合法の場合、 （ａ）界面活性剤を含む前処理液 （ｂ）ＩＧＦ固定ラテックス （ｃ）抗ＩＧＦ抗体 蛍光標識ラテックスを用いたサンドイッチ法の場合、 （ａ）界面活性剤を含む前処理液 （ｂ）抗ＩＧＦ抗体固定蛍光（ユーロピウム）標識ラテ
ックス （ｃ）抗ＩＧＦ抗体固定磁性ラテックス を少なくとも含有するキットが一例として挙げられる。
【００１９】
【実施例】以下、実施例により本発明を説明するが、本
発明はこれにより限定されるものではない。 実施例１（界面活性剤を用いたインスリン様成長因子１
（ＩＧＦ−Ｉ）の測定） ａ）前処理液の調製 ０．１５％ＳＤＳを調製した。 対照のための酸エタノール液として、０．１Ｍ ＨＣ
ｌ、９０％エタノールになるよう前処理液を調製した。
発明はこれにより限定されるものではない。 実施例１（界面活性剤を用いたインスリン様成長因子１
（ＩＧＦ−Ｉ）の測定） ａ）前処理液の調製 ０．１５％ＳＤＳを調製した。 対照のための酸エタノール液として、０．１Ｍ ＨＣ
ｌ、９０％エタノールになるよう前処理液を調製した。
【００２０】ｂ）抗体ビーズの調製 抗ＩＧＦ−Ｉモノクローナル抗体を、アルカリ条件下で
ポリスチレンビーズに物理的に吸着させ、測定に供し
た。
ポリスチレンビーズに物理的に吸着させ、測定に供し
た。
【００２１】ｃ）トレーサーの調製 上記ｂ）の抗体とともに、ＩＧＦ−Ｉに対してサンドイ
ッチを形成しうるモノクローナル抗体に、標識としてク
ロラミンＴ法でヨウ素125 を導入した。このトレーサー
を下記ウシ血清アルブミンなどを含むリン酸緩衝液で希
釈し、測定に供した。 ０．１M リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4) ０．１５M 塩化ナトリウム １０mMエデト酸二ナトリウム ０．１％ウシ血清アルブミン ０．１％ツィーン２０（界面活性剤） ０．０２％アジ化ナトリウム
ッチを形成しうるモノクローナル抗体に、標識としてク
ロラミンＴ法でヨウ素125 を導入した。このトレーサー
を下記ウシ血清アルブミンなどを含むリン酸緩衝液で希
釈し、測定に供した。 ０．１M リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4) ０．１５M 塩化ナトリウム １０mMエデト酸二ナトリウム ０．１％ウシ血清アルブミン ０．１％ツィーン２０（界面活性剤） ０．０２％アジ化ナトリウム
【００２２】ｄ）標準ＩＧＦ−Ｉの調製 （株）東洋紡より入手したヒトＩＧＦ−Ｉを、上記と同
様のウシ血清アルブミンなどを含むリン酸緩衝液で０．
３〜１００ng/ml になるように希釈した。
様のウシ血清アルブミンなどを含むリン酸緩衝液で０．
３〜１００ng/ml になるように希釈した。
【００２３】ｅ）ヒト血清試料の入手 健常人より採血し、血清分離後速やかに凍結して、使用
時まで保管した。
時まで保管した。
【００２４】ｆ）試料の前処理 試料のヒト血清２５μl を試験管にはかり取り、これに
上記又はの前処理液５００μl を加えた。上記の
前処理液は、試料撹拌後直ちに測定に供した。の酸エ
タノール抽出液は、試料撹拌後、遠心操作を加え、上清
を測定に供した。
上記又はの前処理液５００μl を加えた。上記の
前処理液は、試料撹拌後直ちに測定に供した。の酸エ
タノール抽出液は、試料撹拌後、遠心操作を加え、上清
を測定に供した。
【００２５】ｇ）免疫測定 標準ＩＧＦ−Ｉ及び前処理済み試料各２５μl ずつを試
験管にはかり取り、これにトレーサー溶液３００μl を
添加した。混和後、各試験管に抗体ビーズを１個入れて
室温で２時間撹拌した後、精製水各３mlで２回ずつ洗浄
し、抗体ビーズに結合した放射能をγカウンターで測定
した。標準ＩＧＦ−Ｉの７濃度の結合放射能量から検量
線を作製した（表１及び図１）。
験管にはかり取り、これにトレーサー溶液３００μl を
添加した。混和後、各試験管に抗体ビーズを１個入れて
室温で２時間撹拌した後、精製水各３mlで２回ずつ洗浄
し、抗体ビーズに結合した放射能をγカウンターで測定
した。標準ＩＧＦ−Ｉの７濃度の結合放射能量から検量
線を作製した（表１及び図１）。
【００２６】
【表１】 総放射能（Ｔ）：１８２５３９ｅｐｍ ＮＳＢ以外の標準液の結合放射能量（Ｂ）は、ＮＳＢの
結合放射能量（２３６ｃｐｍ）を引いた値で表示した。
結合放射能量（２３６ｃｐｍ）を引いた値で表示した。
【００２７】標準曲線と前処理済み試料の結合放射能量
から、前処理済み試料中のＩＧＦ−Ｉ濃度を求め、２１
倍することで処理前の試料中ＩＧＦ−Ｉ濃度を求めた。
結果を表２に示す。
から、前処理済み試料中のＩＧＦ−Ｉ濃度を求め、２１
倍することで処理前の試料中ＩＧＦ−Ｉ濃度を求めた。
結果を表２に示す。
【００２８】
【表２】
【００２９】実施例２（界面活性剤とアルカリ剤を併用
したインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）の測定） 実施例１と同様の試料中のＩＧＦ−Ｉ濃度を、前処理液
として０．１M ＨＣｌ＋９０％エタノール混液と、
０．１８％ＳＤＳ＋１ｍＭ ＮａＯＨ＋３０％エタノー
ルを使用した場合とを実施例１と同様に測定し比較し
た。その結果を表３に示す。
したインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）の測定） 実施例１と同様の試料中のＩＧＦ−Ｉ濃度を、前処理液
として０．１M ＨＣｌ＋９０％エタノール混液と、
０．１８％ＳＤＳ＋１ｍＭ ＮａＯＨ＋３０％エタノー
ルを使用した場合とを実施例１と同様に測定し比較し
た。その結果を表３に示す。
【００３０】
【表３】
【００３１】０．１M ＨＣｌ＋９０％エタノールに対
し、１ｍＭ ＮａＯＨ＋０．１８％ＳＤＳ＋３０％エ
タノールでは、操作性をあげることが可能であった。
し、１ｍＭ ＮａＯＨ＋０．１８％ＳＤＳ＋３０％エ
タノールでは、操作性をあげることが可能であった。
【００３２】実施例３（アルカリ剤を用いたインスリン
様成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）の測定） ａ）前処理液の調製 ５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液を調製した。 対照のための酸のエタノール液として、１規定塩酸１
容にエタノール９容を加えた前処理液を調製した。以
下、（ｂ）抗体ビーズの調製、（ｃ）トレーサーの調
製、（ｄ）標準ＩＧＦ−Ｉの調製、（ｅ）ヒト血清試料
の入手、（ｆ）試料の前処理は実施例１と同様に行っ
た。
様成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）の測定） ａ）前処理液の調製 ５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液を調製した。 対照のための酸のエタノール液として、１規定塩酸１
容にエタノール９容を加えた前処理液を調製した。以
下、（ｂ）抗体ビーズの調製、（ｃ）トレーサーの調
製、（ｄ）標準ＩＧＦ−Ｉの調製、（ｅ）ヒト血清試料
の入手、（ｆ）試料の前処理は実施例１と同様に行っ
た。
【００３３】ｇ）免疫測定 標準ＩＧＦ−Ｉ及び前処理済み試料各２５μl ずつを試
験管にはかり取り、これにトレーサー溶液３００μl を
添加した。混和後、各試験管に抗体ビーズを１個入れて
室温で２時間撹拌した後、精製水各３mlで２回ずつ洗浄
し、抗体ビーズに結合した放射能をγカウンターで測定
した。標準ＩＧＦ−Ｉの７濃度の結合放射能量から検量
線を作製した（表４及び図２）。
験管にはかり取り、これにトレーサー溶液３００μl を
添加した。混和後、各試験管に抗体ビーズを１個入れて
室温で２時間撹拌した後、精製水各３mlで２回ずつ洗浄
し、抗体ビーズに結合した放射能をγカウンターで測定
した。標準ＩＧＦ−Ｉの７濃度の結合放射能量から検量
線を作製した（表４及び図２）。
【００３４】
【表４】
【００３５】標準曲線と前処理済み試料の結合放射能量
から、前処理済み試料中のＩＧＦ−Ｉ濃度を求め、２１
倍することで処理前の試料中ＩＧＦ−Ｉ濃度を求めた。
結果を表５に示す。
から、前処理済み試料中のＩＧＦ−Ｉ濃度を求め、２１
倍することで処理前の試料中ＩＧＦ−Ｉ濃度を求めた。
結果を表５に示す。
【００３６】
【表５】
【００３７】実施例４（アルカリ剤とエタノールを用い
たインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）の測定） 実施例３と同様に試料中のＩＧＦ−Ｉ濃度を、前処理液
として５０mMＮａＯＨ液単用と、５mMＮａＯＨ＋３
０％エタノール混液を使用した場合と、対照として
０．１M ＨＣｌ＋９０％エタノール混液を使用した場合
とを実施例３と同様に測定し比較した。その結果を表６
に示す。
たインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）の測定） 実施例３と同様に試料中のＩＧＦ−Ｉ濃度を、前処理液
として５０mMＮａＯＨ液単用と、５mMＮａＯＨ＋３
０％エタノール混液を使用した場合と、対照として
０．１M ＨＣｌ＋９０％エタノール混液を使用した場合
とを実施例３と同様に測定し比較した。その結果を表６
に示す。
【００３８】
【表６】
【００３９】ＮａＯＨ濃度を単独使用の５０mMよりも、
併用の５mMに落とすことによって、前処理後の試料の保
存安定性が向上し、また試験者が濃いアルカリ液に暴露
される危険性を低減させることができた。
併用の５mMに落とすことによって、前処理後の試料の保
存安定性が向上し、また試験者が濃いアルカリ液に暴露
される危険性を低減させることができた。
【発明の効果】本発明によれば、測定対象物の活性を損
なうことなく、試料中に共存する結合タンパク質のみが
失活する濃度の界面活性剤を前処理に用いているので、
高価な試薬や毒性の高い試薬、または煩雑な操作や特別
な機器を用いずに、生体試料中の測定対象物濃度を正確
に測定することが可能である。
なうことなく、試料中に共存する結合タンパク質のみが
失活する濃度の界面活性剤を前処理に用いているので、
高価な試薬や毒性の高い試薬、または煩雑な操作や特別
な機器を用いずに、生体試料中の測定対象物濃度を正確
に測定することが可能である。
【図１】標準ＩＧＦ−Ｉの結合放射能の検量線を示す。
【図２】標準ＩＧＦ−Ｉの結合放射能の検量線を示す。
Claims (18)
- 【請求項１】 生体試料に界面活性剤及びアルカリ剤か
ら選ばれた少なくとも１種の前処理剤を混合し、生体試
料中の結合タンパク質の影響を抑制した後、測定に供す
ることを特徴とする、生理活性成分の測定法。 - 【請求項２】 界面活性剤がアニオン性界面活性剤であ
る請求項１記載の測定法。 - 【請求項３】 界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）である請求項１記載の測定法。 - 【請求項４】 アルカリ剤が水酸化ナトリウム、水酸化
カリウム又はアンモニア水溶液である請求項１の方法。 - 【請求項５】 界面活性剤の使用量が０．０１〜５重量
％である請求項１記載の測定法。 - 【請求項６】 アルカリ剤の使用量が０．００１〜１重
量％である請求項１の方法。 - 【請求項７】 前処理剤として、界面活性剤及びアルカ
リ剤を併用することを特徴とする請求項１に記載の測定
法。 - 【請求項８】 前記前処理剤とともに低級脂肪族アルコ
ールを共存させる請求項１の方法。 - 【請求項９】 生体試料が体液である請求項１記載の測
定法。 - 【請求項１０】 測定対象物が、成長因子、ホルモン、
ビタミン又は薬物である請求項１記載の測定法。 - 【請求項１１】 測定対象物の成長因子が、インスリン
様成長因子１又はインスリン様成長因子２である請求項
１０記載の測定法。 - 【請求項１２】 測定対象物が、アミノ酸、アミノ酸代
謝物，ペプチド又はタンパク質である請求項１記載の測
定法。 - 【請求項１３】 前記前処理剤を混合した生体試料混合
物をそのまま測定に供することを特徴とする請求項１の
方法。 - 【請求項１４】 測定法が、抗体、結合タンパク質又は
レセプターを用いた測定法であり、標識として放射性物
質、酵素、蛍光物質もしくは化学発光基質を用いた測定
法；又はラテックス、磁性ラテックスもしくは蛍光標識
ラテックスを用いた測定法である請求項１記載の測定
法。 - 【請求項１５】 少なくとも次の試薬（ａ）、（ｂ）及
び（ｃ）を含み、生体試料中のインスリン様成長因子を
サンドイッチ法により測定するためのキット。 （ａ）界面活性剤を含む前処理液 （ｂ）標識抗ＩＧＦ抗体 （ｃ）固相化抗ＩＧＦ抗体 - 【請求項１６】 少なくとも次の試薬（ａ）、（ｂ）及
び（ｃ）を含み、生体試料中のインスリン様成長因子を
競合法により測定するためのキット。 （ａ）界面活性剤を含む前処理液 （ｂ）標識ＩＧＦ （ｃ）抗ＩＧＦ抗体 - 【請求項１７】 少なくとも次の試薬（ａ）、（ｂ）及
び（ｃ）を含み、生体試料中のインスリン様成長因子を
ラテックス凝集法を用いた競合法により測定するための
キット。 （ａ）界面活性剤を含む前処理液 （ｂ）ＩＧＦ固定ラテックス （ｃ）抗ＩＧＦ抗体 - 【請求項１８】 少なくとも次の試薬（ａ）、（ｂ）及
び（ｃ）を含み、生体試料中のインスリン様成長因子を
蛍光標識ラテックスを用いたサンドイッチ法により測定
するためのキット。 （ａ）界面活性剤を含む前処理液 （ｂ）抗ＩＧＦ抗体固定蛍光標識ラテックス （ｃ）抗ＩＧＦ抗体固定磁性ラテックス
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|---|---|---|---|
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| JP21786498 | 1998-07-31 | ||
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| Publication Number | Publication Date |
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| JP3740898B2 JP3740898B2 (ja) | 2006-02-01 |
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Cited By (12)
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| JP2009216487A (ja) * | 2008-03-10 | 2009-09-24 | Shibayagi:Kk | レプチン測定方法 |
| WO2014122973A1 (ja) * | 2013-02-06 | 2014-08-14 | 富士レビオ株式会社 | 標的物質の測定方法 |
| JP2016208909A (ja) * | 2015-05-08 | 2016-12-15 | 株式会社カネカ | 脂溶性生理活性物質の製造方法 |
| WO2018047792A1 (ja) * | 2016-09-06 | 2018-03-15 | 富士レビオ株式会社 | サイログロブリンの測定方法及び測定試薬 |
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| CN114966030A (zh) * | 2021-12-20 | 2022-08-30 | 上海云泽生物科技有限公司 | 一种药物-蛋白解离组合物、含其的他克莫司检测试剂盒及应用 |
| WO2024034580A1 (ja) * | 2022-08-08 | 2024-02-15 | 株式会社先端生命科学研究所 | Ｃｅａｃａｍ１を検出する方法 |
-
1999
- 1999-07-30 JP JP21632099A patent/JP3740898B2/ja not_active Expired - Fee Related
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